DE102006034844B3

DE102006034844B3 - Zusammensetzungen und Verfahren zur Amplifikation von Hepatitis A-Viren (HAV) und/oder Parvoviren B19 (PB19) mittels Multiplex-PCR

Info

Publication number: DE102006034844B3
Application number: DE102006034844A
Authority: DE
Inventors: Kai Michael Hourfar; Michael Dr. Schmidt; Erhard Prof. Dr. Seifried
Original assignee: Drk Blutspendedienst Bw; DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Current assignee: Drk Blutspendedienst Bw; DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Priority date: 2006-07-27
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2026-07-28

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis von Hepatitis A-Viren (HAV) und auf Verfahren zum Nachweis von Parvoviren B19 (PB19) an gepoolten Proben, insbesondere an Blutproben mit Hilfe von TaqMan-Multiplex (Real-time)-PCR. Durch die Verwendung von erfindungsgemäßen spezifischen Primern und Sonden lassen sich sowohl HAV bzw. PB19 als auch eine interne Kontroll-Nukleinsäure in jeweils einem Amplifikationsschritt nachweisen. Durch die Anwendung von verschiedenen erfindungsgemäßen Sonden lässt sich innerhalb einer Amplifikation bereits eine Diskriminierung zwischen dem jeweiligen Virus und der internen Kontroll-Nukleinsäure nachvollziehen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von HAV und PB19 an gepoolten Proben, insbesondere an Blutproben mit Hilfe von TaqMan-Multiplex (Real-time)-PCR. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen spezifischen Primer und Sonden für HAV und PB19 lassen sich beide Viren in einem Amplifikationsschritt nachweisen. Durch die Anwendung der verschiedenen Sonden lässt sich innerhalb einer Amplifikation bereits eine virusspezifische Diskriminierung nachvollziehen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen aus Primern und Sonden sowie die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen somit zum einen eine schnelle Detektion von HAV und/oder PB19 in Einzelproben oder einem Pool-Verfahren bis zu 96 Proben pro Pool, und sind somit besonders zum Screening von Blutspendern geeignet.

Description

1. Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis von Hepatitis A-Viren (HAV) und auf Verfahren zum Nachweis von Parvoviren B 19 (PB 19) an gepoolten Proben, insbesondere an Blutproben mit Hilfe von TaqMan^®-Multiplex (Real-time)-PCR. Durch die Verwendung von erfindungsgemäßen spezifischen Primern und Sonden lassen sich sowohl HAV bzw. PB 19 als auch eine interne Kontroll-Nukleinsäure in jeweils einem Amplifikationsschritt nachweisen. Durch die Anwendung von verschiedenen erfindungsgemäßen Sonden lässt sich innerhalb einer Amplifikation bereits eine Diskriminierung zwischen dem jeweiligen Virus und der internen Kontroll-Nukleinsäure nachvollziehen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von HAV und PB19 an gepoolten Proben, insbesondere an Blutproben mit Hilfe von TaqMan^®Multiplex (Real-time) PCR. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen spezifischen Primer und Sonden für HAV und PB 19 lassen sich beide Viren in einem Amplifikationsschritt nachweisen. Durch die Anwendung der verschiedenen Sonden lässt sich innerhalb einer Amplifikation bereits eine virusspezifische Diskriminierung nachvollziehen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen aus Primern und Sonden sowie die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen somit zum einen eine schnelle Detektion von HAV und/oder PB19 in Einzelproben oder einem Pool-Verfahren bis zu 96 Proben pro Pool, und sind somit besonders zum Screening von Blutspendern geeignet.
2. Hintergrund der Erfindung
Menschliches Blut ist für die Medizin ein sehr wertvoller und bisher unverzichtbarer Rohstoff, aus dem heute eine Vielzahl von Komponenten und Produkten gewonnen bzw. hergestellt wird. Der sogenannte AIDS-Skandal Anfang der 90er Jahre hat die Virussicherheit von Blut und Blutprodukten in der Öffentlichkeit wie in Fachkreisen schlagartig in den Mittelpunkt des Interesses gerückt.
NAT-Technik verringert Infektionsrisiko bei Bluttransfusionen
Das Risiko, sich durch eine Bluttransfusion mit viralen Krankheitserregern, wie HIV 1/2, HCV, HBV oder HAV, zu infizieren, konnte in den letzten Jahren durch verbesserte Methoden bei der Untersuchung der Blutkonserven erheblich gesenkt werden (1). Es wurde gezeigt, dass durch die Einführung der so genannten Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT) die Chance, infizierte Blutkonserven zu entdecken, weiter gestiegen ist (2).
Bevor gespendetes Blut an einen Patienten weitergegeben wird, muss es auf Krankheitserreger hin überprüft werden. Vor Einführung der NAT wurden beispielsweise HIV- und Hepatitis-Viren in Blutkonserven in erster Linie durch den Nachweis von Antikörpern entdeckt. Da solche Antikörper als Reaktion auf eine erfolgte Infektion erst nach einer gewissen Zeit vom Immunsystem gebildet werden, bestand bei den Kontrollen ein offenes Zeitfenster (diagnostisches Fenster): In der Anfangsphase einer Infektion war es nicht möglich, die Erreger in der entsprechenden Blutspende zu entdecken, infiziertes Blut konnte somit in die medizinische Versorgung gelangen. Das Risiko, Blut von frisch infizierten Spender weiterzugeben, ließ sich für Plasma nur dadurch minimieren, dass alle Blutspender zu einer zweiten Spende aufgefordert wurden, die nach einem Mindestabstand von 2-3 Monaten erfolgte. Damit konnten im Falle einer Infektion die in der Zwischenzeit gebildeten Antikörper beim Spender nachgewiesen werden. Das zuerst gespendete Plasma wurde so lange eingefroren, bis der Antiköpertest der zweiten Spende negativ ausgefallen war, und wurde erst dann für eine medizinische Behandlung verwendet.
Seit Mitte der 1990er Jahre wird erfolgreich an Methoden gearbeitet, mit deren Hilfe Viren anhand ihrer Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Durch die Plasma verarbeitende Industrie angeregt, die ihre Produktionspools vor hohen Virusbelastungen schützen wollte, wurden Mitte der 90er Jahre Nukleinsäuretestungen (NAT) für die transfusionsrelevanten Viren und später auch für Parvovirus B19 (PB19) und HAV als Qualitätskontrollmaßnahmen eingeführt. 1999 wurde schließlich die HCV NAT-Testung für Plasma und zelluläre Bestandteile vom Paul-Ehrlich-Institut (PEI) in Deutschland verbindlich eingeführt. Die Blutspendedienste des Deutschen Roten Kreuzes (DRK) haben jedoch von Anfang an alle Spenden, die ersten 1997 beginnend, auf die transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV und HBV mit Hilfe der PCR Screening-Methode getestet. Sie waren auch die ersten, die im Jahre 2000 die NAT-Testung auf PB19 und HAV ausweiteten, was heute bei den DRK- Blutspendediensten Standard ist. Seit Mai 2004 hat das PEI außerdem die HIV-NAT angeordnet.
So wurden zwischen 1997 und 2002 in einer Studie insgesamt 3,6 Mio Blutspendeproben in Mitteleuropa auf HCV und HIV-1 (3) und HBV (4) mittels NAT getestet. Dabei konnten 6 HCV und 2 HIV-1 PCR-positive Spenden mit negativem Antikörper-Test (Häufigkeit 1 in 600.000 bzw. 1 in 1,8 Mio) und 6 HBV PCR-positive Spenden mit negativem HBsAg Ergebnis identifiziert werden.
Das virologische Restrisiko ist aufgrund der verschiedenen Maßnahmen, wie Spenderselektion, ELISA-Testung und NAT-Testung, für die untersuchten transfusionsrelevanten Viren auf ein bisher nicht gekanntes, unvorstellbar geringes Maß gesunken. So ist das Restrisiko, das in Deutschland nach Einführung der PCR für die drei transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV, HBV noch verbleibt, mit 1:5,5 Mio. für HIV, 1:4,4 Mio. für HCV und 1:620.000 Mio. für HBV (mit Pool-PCR) und 1:820.000 für HBV mit einer Einzelproben-PCR so gering geworden, dass man fast von keinem wirklichen virologischen Restrisiko mehr sprechen kann (5).
Generell führte die Einführung der aufwendigen und teuren NAT-Technologie zu einer zusätzlichen finanziellen Belastung der Blutspendedienste. Ein Weg zur Reduzierung der Kosten ist dabei die Zusammenfassung vieler einzelner Spenderproben zu einer einzigen durch Bildung von sogenannten Minipools (6). So werden bis zu 96 Blutspendeproben zu einem Pool zusammengeführt, was zu einem Durchsatz von 2.000 bis 4.000 Proben pro Tag fuhrt (7).
Bei der Bearbeitung der Spenderproben wird ein kommerzielles Extraktionskit (Qiagen Viral RNA Kit) nach einem modifizierten Protokoll angewandt. Nach dem modifizierten Protokoll können sowohl Einzelproben als auch Poolproben (3-96 Proben pro Pool) bearbeitet werden. Am Ende der Extraktion erhält man ein Eluat von 75μl. Dieses Eluat wird derzeit auf 5 Realtime PCR Untersuchungen aufgeteilt (20μl für die HBV PCR, 15μl für die HCV PCR, 10μl für die HIV-1 PCR und die HAV PCR und 5μl für die Parvo B19 PCR). Seit Einführung dieses Verfahrens (1997 für die Viren HIV-1, HCV und HBV; und April 2000 zusätzlich für die Viren HAV und Parvovirus B19) wurden bereits mehr als 10 Millionen Proben im Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen untersucht. Für das Institut Frankfurt waren aus 1.528.505 getesteten Konserven 1 Konserve positiv für HAV (0,00006%) und 198 Konserven positiv für Parvovirus B19 (0,01%). Der Nachweis einer akuten HAV Infektion stellt somit ein extrem seltenes Ereignis dar, wohingegen Parvovirus B19 Infektionen vermehrt im Frühjahr vorkommen (1).
Espy et al., Clin Microbiol Rev., 2006, 19(1):165-256, beschreiben realtime PCR-Verfahren in der klinischen Mikrobiologie. Unter anderem werden HAV- und PB19-Nachweisverhahren beschrieben, die Taqmar^®-Sonden und interne Kontrollen verwenden.
Henriques et al., Transfus Apher Sci., 2005, 33(3):305-9, offenbaren den getrennten Nachweis von PB19 und HAV in Blutspendeproben mittels einer realtime PCR in einem LightCycler^®-Systems.
WO 2005/075686 A1 offenbart Primer und Sonden für die Detektion von Parvovirus B19, die in homogenen PCR-Methoden verwendet werden. Es wird die Verwendung von Paaren von FRET-Sonden beschrieben.
US 6,936,442 B2 offenbart diagnostische Assays für Parvovirus B19. Es werden PB19-spezifische Primer und Sonden, die von konservierten Regionen des humanen PB19-Genoms abgeleitet wurden, sowie Taqman^® basierende PCR-Assays für PB19 beschrieben, die mindestens eine PB19-spezifische Taqman^®-Sonde, eine interne Kontroll-Sequenz und eine darauf gerichtete Taqman^®-Sonde verwenden.
Das Handbuch des artus^® Parvo B19 TM RT-PCR Kit (Qiagen, Hamburg, März 2006) beschreibt einen PCR Assay für PB19, bei dem ein Mastermix bereitgestellt wird und eine interne Kontroll-Sequenz entweder zum Mastermix oder z.B. direkt zum Lysepuffer zugegeben wird.
WO 03/106641 A2 offenbart Hepatitis A-Virus-spezifische Primer und Sonden, die von konservierten Regionen des HAV-Genoms abgeleitet wurden, sowie Taqman^® basierende PCR Assays für HAV, die eine HAV-spezifische Taqman^®-Sonde, eine interne Kontroll-Sequenz und eine darauf gerichtete Taqman^®-Sonde verwenden.
Das Handbuch des artus^® HAV LC RT-PCR Kit (Qiagen, Hamburg, März 2006) beschreibt einen PCR-Assay fÜr HAV, bei dem ein Mastermix bereitgestellt wird und eine interne Kontroll-Sequenz entweder zum Mastermix oder z.B. direkt zum Lysepuffer zugegeben wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, spezifische Primer, Sonden und interne Kontroll-Nuldeinsäuren sowie Verfahren zu entwickeln, die eine simultane Detektion von HAV und/oder von PB19 und einer internen Kontroll-Nuldeinsäure in einer Amplifikation erlauben.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines ersten Verfahrens zur Detektion von Hepatitis A-Viren und Parvoviren PB19 in aus Blut abgeleiteten Proben gelöst.
Das erfindungsgemäß erste Verfahren umfasst die folgenden Schritte: In einem ersten Schritt (a) werden aus Blut abgeleitete Proben zur Verfügung gestellt.
Im nächsten Schritt (b) werden die aus Blut abgeleiteten Proben konzentriert.
Im nächsten Schritt (c) werden die viralen Nukleinsäuren extrahiert unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine erste interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution.
Im nächsten Schritt (d) werden die viralen Nukleinsäure-Extrakte aus dem vorhergehenden Schritt (c) erhalten.
Im nächsten Schritt (e) wird ein PCR-Mastermix hergestellt. Der PCR-Mastermix umfasst einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, und einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst.
Der PCR-Mastermix umfasst weiterhin eine fünfte Sonde, die spezifisch fit die interne Kontroll-Nukleinsäure ist. Die Sonden sind jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert.
Im nächsten Schritt (f) werden die viralen Nuldeinsäure-Extrakte (aus Schritt c) zum PCR-Mastermix zugegeben und die Nukleinsäuren amplifiziert. Im nachfolgenden Schritt (g) erfolgt die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren, d.h., der viralen Nukleinsäuren (wenn vorhanden) und der internen Kontroll-Nuldeinsäure.
Das erste Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:

a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nuldeinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde und einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde und weiter umfassend eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die Sonden jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind,
f) Zugabe der viralen Nuldeinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und
g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines zweiten Verfahrens zur Detektion von Hepatitis A-Viren oder Parvoviren PB19 in aus Blut abgeleiteten Proben gelöst.
Das erfindungsgemäß zweite Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend für den Nachweis von HAV einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, wobei die erste und zweite Sonde jeweils auf identische Genomabschnitte gerichtet sind, oder für den Nachweis von PB19 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst, wobei die dritte und vierte Sonde jeweils auf identische Genomabschnitte gerichtet sind, und weiter umfassend eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die Sonden jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind,
f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und
g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines dritten Verfahrens zur Detektion von Hepatitis A-Viren oder Parvoviren PB19 in aus Blut abgeleiteten Proben gelöst.
Das erfindungsgemäß dritte Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
b) Konzentrierender aus Blut abgeleiteten Proben,
c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO.2 hat,
d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend für den Nachweis von HAV einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, oder für den Nachweis von PB19 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst, und weiter umfassend eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die Sonden jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind,
f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und
g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben oder um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere handelt es sich um Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben. Die zelluläre Blutbestandteile enthaltenden Proben sind dabei ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Erythrozyten oder Thrombozyten.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl zum Screening von Einzelproben als auch zum Screening von gepoolten Proben. In einer Ausführungsform werden die aus Blut abgeleiteten Proben zu mindestens einem Probenpool zusammengeführt. Von jeder für das Screening vorgesehenen Probe bzw. Probenpool werden bevorzugt mindestens 3000 μl (3 ml) Probe bzw. Probenpool benötigt. Untersucht werden bevorzugt Plasmaproben mit einem mindest Volumen von 100μl. Hierbei können Minipools bevorzugt von einer Poolgröße zwischen 3 und 96 Proben hergestellt und untersucht werden.
Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure mindestens eine Region, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann. Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure außerdem Regionen, an denen sich Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, spezifisch anlagern können, so dass die interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert werden kann.
Erfindungsgemäß ist die mindestens eine Region der internen Kontroll-Nukleinsäure, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann, unterschiedlich zu Sequenzen des Zieltargets, der Nukleinsäuren der Viren HAV und PB19, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt eine Sonde, die spezifisch für die viralen Nukleinsäuren ist, wird nicht an die interne Kontroll-Nukleinsäure hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine weitere (fünfte) Sonde verwendet, deren Sequenz von der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wurde. Bevorzugt hat die weitere (fünfte) Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 7 oder 12.
Es wird bevorzugt, dass die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz ist bzw. eine Nukleinsäure ist, die eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz umfasst.
Erfindungsgemäß zeichnet sich eine kompetitive Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure dadurch aus, dass sich die Regionen, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, nicht unterscheiden von den respektiven Regionen der Nukleinsäuren der Viren HAV und PB19, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt dieselben Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, führen zur Amplifikation der nachzuweisenden viralen Nukleinsäuren und zur Amplifikation der internen kompetitiven Kontroll-Nukleinsäure.
Dahingegen sind die Regionen einer nicht kompetitiven Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, verschieden zu den respektiven Regionen der viralen Nukleinsäuren. Das heißt die Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, die zur Amplifikation der nachzuweisenden viralen Nukleinsäuren führen, amplifizieren nicht zugleich die interne nicht kompetitive Kontroll-Nukleinsäure.
Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz, deren Zuckerbestandteil Desoxyribose oder Ribose ist. Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz aus DNA, RNA oder modifizierten Nukleotiden, aber auch um DNA- oder RNA-Konstrukte, insbesondere synthetisierte DNA- oder RNA-Konstrukte.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz. Für den Nachweis von HAV hat die interne Kontroll-Nukleinsäure bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder ein Komplementär davon. Weiterhin bevorzugt ist die interne Kontroll-Nukleinsäure für den Nachweis von HAV bevorzugt eine RNA bzw. ein RNA-Konstrukt, bevorzugt mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder einem Komplementär davon. Für den Nachweis von PB19 hat die interne Kontroll-Nukleinsäure bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 2 oder ein Komplementär davon. Weiterhin bevorzugt ist die interne Kontroll-Nukleinsäure für den Nachweis von PB19 bevorzugt eine DNA bzw. ein DNA-Konstrukt, bevorzugt mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder einem Komplementär davon. Für den gleichzeitigen Nachweis von HAV und PB19 wird bevorzugt nur eine interne Kontroll-Nukleinsäure verwendet, die dann ausgewählt ist aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO. 1 und 2 und deren Komplementären.
Unter einer Multiplex-PCR versteht man die Amplifikation von mindestens zwei Nukleinsäuresequenzen in einem Amplifikationsschritt. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nukleinsäuren von HAV und/oder PB19 durch eine geeignete Wahl der Primer- und Sonden-Sequenzen amplifiziert, sofern sie (die Viren) in der Untersuchungsprobe vorhanden sind. Ferner wird die zugegebene interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert und überwacht damit die Amplifikation, vor allem in negativen Untersuchungsproben, in denen keine Amplifikation viraler Nukleinsäuren stattfindet.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet einen PCR-Mastermix.
Für den Nachweis von HAV umfasst der PCR-Mastermix einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, und weiter eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist.
Für den Nachweis von PB19 umfasst der PCR-Mastermix einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst, und weiter eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist.
Für den gleichzeitigen Nachweis von HAV und PB19 umfasst der PCR-Mastermix einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde und weiter einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst, und weiter eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist.
Methoden für die Präparation und Verwendung von Sonden und Primern werden zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Vol. 1-3, Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (mit periodischen Aktualisierungen) und Innis et al., PCR-Protokolle. A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. PCR-Primer-Paare können von einer bekannten Sequenz zum Beispiel unter der Verwendung von Computerprogrammen, welche für diesen Zweck entwickelt wurden, wie zum Beispiel PRIMER3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) abgeleitet werden.
Die erfindungsgemäßen Sitze Oligonukleotide aus je einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und zwei Sonden sind spezifisch für die Nukleinsäuren von HAV bzw. PB19. Die Sequenzen des Sense-Primers, des Antisense-Primers und der Sonden werden bevorzugt abgeleitet von in den Gendatenbanken veröffentlichen Nukleotidsequenzen von HAV und PB19. Bevorzugt korrespondieren die Sequenzen der Primer mit einem Teilbereich von 20 Nukleotiden, der in allen Gentypen sehr konserviert ist. Bevorzugt wurde dabei für HAV eine Sequenz, die in allen bisher bekannten Gentypen (1-6) konserviert ist, sowie für Parvovirus B19 eine Sequenz, die in allen Gentypen (1-3) konserviert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat der Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 3 oder ein Komplementär davon, der Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 4 oder ein Komplementär davon, die erste Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 5 oder ein Komplementär davon und die zweite Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 6 oder ein Komplementär davon. Hier wird das Verfahren zum Nachweis von HAV verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat der Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 8 oder ein Komplementär davon, der Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9 oder ein Komplementär davon, die dritte Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 10 oder ein Komplementär davon und die vierte Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 11 oder ein Komplementär davon. Hier wird das Verfahren zum Nachweis von PB19 verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn HAV und PB19 gleichzeitig nachgewiesen werden sollen, werden der Sense-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 3 oder ein Komplementär davon, der Antisense-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 4 oder ein Komplementär davon, die erste Sonde mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 5 oder ein Komplementär davon und die zweite Sonde mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 6 oder ein Komplementär davon sowie der Sense-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 8 oder ein Komplementär davon, der Antisense-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9 oder ein Komplementär davon, die dritte Sonde mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 10 oder ein Komplementär davon und die vierte Sonde mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 11 oder ein Komplementär verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Nukleotidsequenz der fünften Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, von der Sequenz der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet.
Hat die interne Kontroll-Nukleinsäure die Sequenz SEQ ID NO. 1, dann hat die fünfte Sonde bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 7. Hat die interne Kontroll-Nukleinsäure die Sequenz SEQ ID NO. 2, dann hat die fünfte Sonde bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 12. Zum Nachweis von HAV und zum gleichzeitigen Nachweis von HAV und PB19 werden bevorzugt die interne Kontroll-Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 und die fünfte Sonde mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 7 verwendet. Zum Nachweis von PB19 werden bevorzugt die interne Kontroll-Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die fünfte Sonde mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 12 verwendet.
Die Sonden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, insbesondere solche, die für Realtime-PCR geeignet sind. Dabei handelt es sich bevorzugt um einen Fluoreszenzdonor oder -reporter und einen Fluoreszenzakzeptor oder -quencher sind. Eine Sonde ist bevorzugterweise mit einem Paar aus jeweils einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher (einem FRET-Paar bzw. Fluoreszenzfarbstoffpaar) markiert.
Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend, aus FAM, VIC, Bodipy-TMR, Joe und Hex oder vergleichbaren Fluoreszenzdonoren/-reportern. Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, MBG, Black Hole Quencher 1 (BHQ1), Black Hole Quencher 2 (BHQ2), Black Hole Quencher 3 (BHQ3), BodyPi 564/570 und Cy5 oder vergleichbaren Fluoreszenzakzeptoren/-quenchern.
Es wird bevorzugt, dass die erste und die zweite Sonde jeweils mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert ist. Es wird bevorzugt, dass die dritte und die vierte Sonde jeweils mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert ist.
Es wird weiterhin bevorzugt, dass sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten und zweiten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der fünften Sonde unterscheidet und dass sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der dritten und vierten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der fünften Sonde unterscheidet.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie für den Nachweis von HAV, ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten und zweiten Sonde jeweils FAM und TAMRA und das Fluoreszenzfarbstoffpaar der fünften Sonde VIC und TAMRA.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie für den Nachweis von PB19, ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der dritten und vierten Sonde jeweils FAM und TAMRA und das Fluoreszenzfarbstoffpaar der fünften Sonde VIC und TAMRA.
Der Vorteil einer geeigneten Wahl der Paare der Fluoreszenzfarbstoffe ist es, dass aufgrund der unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen gleichzeitig zwei Fluoreszenz-Emissionen (z.B. von FAM und VIC) beobachtet werden können und damit jeweils auf die An- bzw. Abwesenheit von HAV und interner Kontroll-Nukleinsäure oder PB19 und interner Kontroll-Nukleinsäure rückgeschlossen werden kann.
Wenn HAV und PB19 gleichzeitig nachgewiesen werden sollen, wird bevorzugt, dass sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten und zweiten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der dritten und vierten Sonde unterscheidet und dass sich diese Fluoreszenzfarbstoffpaare wiederum von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der fünften Sonde unterscheiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten und zweiten Sonde Bodipy-TMR und BHQ1, ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der dritten und vierte Sonde FAM und BHQ1 und ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der fünften Sonde VIC und MBG.
Der Vorteil einer geeigneten Wahl der Paare der Fluoreszenzfarbstoffe ist es, dass aufgrund der unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen gleichzeitig alle 3 Fluoreszenz-Emissionen (z.B. von Bodipy-TMR, FAM und VIC) beobachtet werden können und damit jeweils auf die An- bzw. Abwesenheit von HAV und PB19 und interner Kontroll-Nukleinsäure rückgeschlossen werden kann.
Es liegt im Können des Fachmanns, jeweils geeignete Fluoreszenzfarbstoffpaare auszuwählen. Dabei sollen die unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt werden, dass eine gegenseitige Überstrahlung bzw. Überlagerung der Fluoreszenzemissionen (bzw. sogenanntes„bleed through") vermieden wird.
Bevorzugterweise umfasst das Konzentrieren der Proben in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens Zentrifugieren. Dabei werden bevorzugterweise, die in der Probe enthaltenen Bestandteile, wie Zellen und Viren, angereichert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mit Barcode etikettierte Gefäße, die die Proben enthalten, zunächst 15 Minuten bei mind. 5000 × g und anschließend 1 Stunde bei mindestens 48.000 × g zentrifugiert. Anschließend wird jeweils der Überstand verworfen.
Die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) ist bevorzugt eine Multiplex-PCR, weiter bevorzugt eine Multiplex-Realtime-PCR. Bevorzugt erfolgt zunächst eine reverse Transkription, bei der die vorhandene virale RNA und die interne Kontroll-RNA in eine cDNA umgeschrieben wird. Im weiteren erfolgt dann die Amplifikation der cDNA durch eine DNA-Polymerase.
Die Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren erfolgt mittels des Realtime-Prinzips. Bindet/hybridisiert dabei eine Sonde an ihrer Zielsequenz, wird der Reporter der Sonde durch die Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase, wie Taq-Polymerase, im Verlauf der Amplifikation abgespalten. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) vom Reporter zum Quencher kann somit aufgrund der räumlichen Distanz nicht mehr erfolgen. Die emittierte Energie des Reporters wird als positives Signal aufgezeichnet. Da der Reporter der für die viralen Nukleinsäuren spezifischen Sonde (z.B. FAM-markierte Sonde) Fluoreszenz in einem anderen Wellenbereich emittiert als der Reporter der weiteren Sonde, die für die interne Kontroll-Nukleinsäure spezifisch ist (z.B. VIC-markierte Sonde), können beide Amplifikationen voneinander unterschieden werden.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Zusammensetzungen, die zum Nachweis von Hepatitis A-Viren und/oder Parvoviren PB19 geeignet sind, gelöst. Diese erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, und/oder einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt eine fünfte Sonde, die spezifisch für eine interne Kontroll-Nukleinsäure ist.
Bei einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann es sich um einen PCR-Mastermix handeln, wie er in Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt und für die Amplifizierung der viralen Nukleinsäuren und der internen Kontroll-Nukleinsäure verwendet wird.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfassen.
Die Auswahl der Nukleotidsequenzen für Primer, Sondern und interne Kontroll-Nukleinsäuren etc. wurde bereits oben bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von Hepatitis A-Viren umfasst Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 3, 4, 5 und 6 oder deren Komplementäre.
Diese erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von Hepatitis A-Viren umfasst bevorzugt weiterhin ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 7 oder ein Komplementär davon.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von Parvoviren B19 umfasst Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 8, 9, 10 und 11 oder deren Komplementäre.
Diese erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von Parvoviren B19 umfasst weiterhin ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 12 oder ein Komplementär davon.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von Hepatitis A-Viren und Parvoviren B19 umfasst Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 3, 4, 5 und 6 oder deren Komplementäre sowie Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 8, 9, 10 und 11 oder deren Komplementäre.
Diese erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von Hepatitis A-Viren und Parvoviren B19 umfasst weiterhin ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 7 oder ein Komplementär davon oder ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 12 oder ein Komplementär davon.
Die Sonden einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind bevorzugt jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Die zwei Fluoreszenzfarbstoffe sind bevorzugt ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher. Der Fluoreszenzdonor oder -reporter ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus FAM, VIC, Bodipy-TMR, Joe und Hex. Der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TAMRA, MBG, Black Hole Quencher 1 (BHQ1), Black Hole Quencher 2 (BHQ2), Black Hole Quencher 3 (BHQ3), BodyPi 564/570 und Cy5. Die Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe etc. wurde bereits oben bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt.
In einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 5, 6, 7, 10, 11 und 12 oder deren Komplementäre mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von HAV Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 5 und 6, die jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und TAMRA markiert sind, und das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 7, das mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und TAMRA markiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von PB19 Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 10 und 11, die jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und TAMRA markiert sind, und das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 12, das mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und TAMRA markiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von HAV und PB19 Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 5 und 6, die jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar Bodipy-TMR und BHQ1 markiert sind, Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 8 und 9, die jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und BHQ1 markiert sind, und ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 7, das mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und MBG markiert ist.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verfahren zum Nachweis von Hepatitis A-Viren (HAV) und auf Verfahren zum Nachweis von Parvoviren B19 (PB19) an gepoolten Proben, insbesondere an Blutproben mit Hilfe von TaqMan^®-Multiplex (Real-time)-PCR. Durch die Verwendung von erfindungsgemäßen spezifischen Primern und Sonden lassen sich sowohl HAV bzw. PB19 als auch eine interne Kontroll-Nuldeinsäure in jeweils einem Amplifikationsschritt nachweisen. Durch die Anwendung von verschiedenen erfindungsgemäßen Sonden lässt sich innerhalb einer Amplifikation bereits eine Diskriminierung zwischen dem jeweiligen Virus und der internen Kontroll-Nukleinsäure nachvollziehen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von HAV und PB19 an gepoolten Proben, insbesondere an Blutproben mit Hilfe von TaqMan^® Multiplex (Real-time) PCR. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen spezifischen Primer und Sonden für HAV und PB19 lassen sich beide Viren in einem Amplifikationsschritt nachweisen. Durch die Anwendung der verschiedenen Sonden lässt sich innerhalb einer Amplifikation bereits eine virusspezifische Diskriminierung nachvollziehen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen aus Primern und Sonden sowie die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen somit zum einen eine schnelle Detektion von HAV und/oder PB19 in Einzelproben oder einem Pool-Verfahren bis zu 96 Proben pro Pool, und sind somit besonders zum Screening von Blutspendern geeignet.
Durch die Verwendung von unterschiedlichen Sonden in der erfindungsgemäßen Kombination von zwei spezifischen Sonden für das HA-Virus (bevorzugt jeweils FAM als Reporter und TAMRA als Quencher) sowie einer Sonde für die interne Kontroll-Nukleinsäure (bevorzugt VIC als Reporter und TAMRA als Quencher) ist eine Amplifikation von HA-Viren und einer internen Kontroll-Nukleinsäure in einem Reaktionsgefäß möglich. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren sowohl für das Screening von Blutspenden in Pools bis zu 96 Einzelproben als auch für das Screening von Einzelproben geeignet. Der Vorteil einer gemeinsamen Amplifikation in einem Reaktionsansatz liegt im geringeren Materialverbrauch an Reagenzien (Enzymen, Primer) sowie dem zwingenden Beweis, dass eine valide Amplifikation einer HAV-negativen Probe durch die Amplifikation der internen Kontroll-Nukleinsäure nachgewiesen werden kann.
Durch die Verwendung von unterschiedlichen Sonden in der erfindungsgemäßen Kombination von zwei spezifischen Sonden für das PB19-Virus (bevorzugt jeweils FAM als Reporter und TAMRA als Quencher) sowie einer Sonde für die interne Kontroll-Nukleinsäure (VIC als Reporter und TAMRA als Quencher) ist eine Amplifikation von PB19-Viren und einer internen Kontroll-Nukleinsäure in einem Reaktionsgefäß möglich. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren sowohl für das Screening von Blutspenden in Pools bis zu 96 Einzelproben als auch für das Screening von Einzelproben geeignet. Der Vorteil einer gemeinsamen Amplifikation in einem Reaktionsansatz liegt im geringeren Materialverbrauch an Reagenzien (Enzymen, Primer) sowie dem zwingenden Beweis, dass eine valide Amplifikation einer PB19nnegativen Probe durch die Amplifikation der internen Kontroll-Nukleinsäure nachgewiesen werden kann.
Durch die Verwendung von unterschiedlichen Sonden in der erfindungsgemäßen Kombination von zwei spezifischen Sonden für das HA-Virus (bevorzugt Bodipy-TMR als Reporter und BHQ1 als Quencher) sowie von zwei spezifischen Sonden für das Parvovirus B19 (bevorzugt FAM als Reporter und BHQ1 als Quencher) und einer Sonde für die interne Kontroll-Nukleinsäure (bevorzugt VIC Reporter und MBG als Quencher) ist eine gleichzeitige Amplifikation von beiden Viren in einem Reaktionsgefäß möglich. Somit ist das neue Verfahren sowohl für das Screening von Blutspenden in Pools bis zu 96 Einzelproben als auch für das Screening von Einzelproben geeignet. Der Vorteil einer gemeinsamen Amplifikation in einem Reaktionsansatz liegt im geringeren Materialverbrauch an Reagenzien (Enzymen, Primer) sowie in einer Reduzierung der Amplifikationsgeräte (Thermocycler).
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen illustriert. Durch die beschriebenen Beispiele/Figuren zeigt sich, dass mittels der erfindungsgemäßen Primer/Sonden-Kombination und der Multiplex-HAV-TaqMar^®-PCR eine gemeinsame Amplifikation von HA-Viren und interner Kontroll-Nukleinsäure erfolgt, ohne dass es zu einer relevanten Kompetition der HA-Viren kommt. Durch die beschriebenen Beispiele/Figuren zeigt sich weiterhin, dass mittels der erfindungsgemäßen Primer/Sonden-Kombination und der PB19-Multiplex-TaqMan^®-PCR eine gemeinsame Amplifikation von PB19-Viren und interner Kontroll-Nukleinsäure erfolgt, ohne dass es zu einer relevanten Kompetition der PB19-Viren kommt. Durch die beschriebenen Beispiele/Figuren zeigt sich auch noch, dass die erfindungsgemäße Primer/Sonden-Kombination und eine Multiplex HAV/PB19-TaqMar^®-PCR äquivalent zu den bestehenden Real-time-PCR Systemen ist, bei denen jeweils nur ein Virusparameter pro Amplifikation bestimmt wird.
Figuren
1. Parvovirus B19-Infektionen von April 2000 bis Dezember 2004.
Die Ergebnisse der letzten Jahren zeigen besonders eine vermehrte Inzidenz von PB19-Infektionen im Frühjahr.
Beispiele
Beispiel 1: Primer, Sonden und interne Kontroll-Nukleinsäuren
1. interne Kontroll-Nukleinsäuren
2. Nachweis von HAV

A1 Sense Primer (SEQ ID No. 3)
5' GGT AGG CTA CGG GTG AAA CCT CTT 3'

A2 Antisense Primer (SEQ ID NO. 4)
5' GTC AGT CCT CCG GCG TTG AAT GG 3'

A3 Sonde Wildtyp 1 (SEQ ID NO. 5)
5' TAT GAA GAG ATG CCT TGG ATA GGG T 3'
Markierung:
5' FAM und 3' TAMPA
5' Bodipy-TMR und 3' BHQ1

A4 Sonde Wildtyp 2: (SEQ ID NO. 6)
5' TAT GAA GAG ATG CTT TGG ATA GGG T 3'
Markierung:
5' FAM und 3' TAMRA
5' Bodipy-TMR und 3' BHQ1

A5 Sonde interne Kontroll-Nukleinsäure IC1: (SEQ ID NO. 7)
5' TCG AGT CAG AGG ATG TCA GA 3'
Markierung:
5' VIC und 3' TAMRA
5' VIC und 3' MBG

3. Nachweis von PB19

PB1 Sense Primer: (SEQ ID No. 8)
5' CAT GGA CAG TTA TCT GAC CAC 3'

PB2 Antisense Primer: (SEQ ID No. 9)
5' CAA CAT AGT TAG TAC CGG GTA GTT G 3'

PB3 Sonde Wildtyp 1: (SEQ ID No. 10)
5' AAC CTA GAG GAG AAA ATG CAG TAT TAT C 3'
Markierung:
5' FAM und 3' TAMRA
5' FAM und 3' BHQ1

PB4 Sonde Wildtyp 2: (SEQ ID No. 11)
5' AAC CTA GAG GAG AAG ATG CAG TAT TAT C 3'
Markierung:
5' FAM und 3' TAMRA
5' FAM und 3' BHQ1

PB5 Sonde interne Kontroll-Nukleinsäure IC2: (SEQ ID No. 12)
5' ACG ACG GAC CAC ACT GAC CAG TCA 3'
Markierung:
5' VIC und 3' TAMRA

4. gleichzeitiger Nachweis von HAV und PB19

verwendet werden:
A1 Sense Primer und A2 Antisense Primer (SEQ ID NOs. 3 und 4)
A3 Sonde Wildtyp 1 und A4 Sonde Wildtyp 2 (SEQ ID NOs. 5 und 6)
(Markierung: jeweils 5' Bodipy-TMR und 3' BHQ1)
A5 Sonde interne Kontroll-Nukleinsäure IC1: (SEQ ID NO. 7)
(Markierung: 5' VIC und 3' MBG)
PB1 Sense Primer und PB2 Antisense Primer (SEQ ID NOs. 8 und 9)
PB3 Sonde Wildtyp 1 und PB4 Sonde Wildtyp 2 (SEQ ID NOs. 10 und 11)
(Markierung: jeweils 5' FAM und 3' BHQ1)

Beispiel 2: Multiplex-PCR
Die Abkürzungen „μM" und „nM" stehen im Folgenden für die Einheiten μmol/l bzw. nmol/l; „rpm" steht für U/min.
1. Herstellung der Mastermixe
1.1. Nachweis von HAV
Für jede Probe werden 15μl Mastermix und 10μl Eluat benötigt. Für die NTCs (no template control) werden 15μl Mastermix und 10μl Aqua benötigt. 1.2. Nachweis von PB19
Für jede Probe werden 20μl Mastermix und 5μl Eluat benötigt. Für die NTCs (no template control) werden 20μl Mastermix und 5μl Aqua benötigt. 1.3. Gleichzeitiger Nachweis von HAV und PB19
Für jede Probe werden 15μl Mastermix und 10μl Eluat benötigt. Für die NTCs (no template control) werden 15μl Mastermix und 10μl Aqua benötigt. 2. Cycler-Programme (sowohl für den ABI 7000 als auch ABI 7700)
Beispiel 3 Beschreibung des Verfahrens (Prozessbeschreibung)
1. Zur Verfügung stellen von Blutproben
Das Verfahren eignet sich sowohl zum Screening von Einzelproben, als auch zum Screening von Poolproben. Von jeder für das Screening vorgesehenen Probe werden mindestens 100μl EDTA Plasma benötigt.
2. Zusammenführung (Pooling) der Blutproben zu mindestens einem Probenpool, oder Alternativbearbeitung von Einzelproben
Mit Hilfe eines Pipettierroboters werden jeweils 100μl in ein Poolgefäß pipettiert bis zu einer maximalen Poolgröße von 96 Einzelproben (9,6ml Probenvolumen).
3. Anreicherung des mindestens einen Probenpools

– Die Barcode etikettierten Poolgefäße werden 15 min. bei mind. 5000xg vorzentrifugiert und die Überstände jeweils in ein etikettiertes 16 ml Zentrifugenröhrchen überführt und mit einem Deckel verschlossen.
– Diese Röhrchen werden 1 Std. bei 4°C mit mindestens 48.000xg zentrifugiert. (Einstellung bei der Beckman Avanti J-25I, Rotor JA 25.15 : 22.200 rpm = 58.510 xg). Pro Rotor ist mindestens eine Pelletionskontrolle mitzuführen. Die Pelletionskontrolle dient dem Nachweis der erfolgreichen Pelletion der Viren. Sie besteht aus Negativplasma, das mit HIV-1 positivem Plasma jeweils in der ca. 3-fachen Konzentration der 95%igen Nachweisgrenze gespickt wurde. Die Positivkontrolle wurde an einem WHO-Standard kalibriert.
– Es können die Beckman Avanti J-25I mit dem Rotor JA 25.15 und die Heraeus Suprafuge 22 mit dem Rotor 20-16 (Einstellung 20.000rpm) verwendet werden. Beim Rotor 20-16 in Verbindung mit der Suprafuge 22 darf nur der äußere Ring bestückt werden.
– Nach der Zentrifugation wird der Überstand in das dazugehörige Poolgefäß dekantiert und die Röhrchen zum Abtropfen des restl. Überstandes in eine Abtropfwanne gestellt. Alternativ kann der Überstand mit einer Vakuumapparatur abgesaugt werden.
– Die Röhrchen werden mit einem Wattestäbchen innen in der oberen Hälfte von groben Verschmutzungen (Fettfilm) gereinigt und der Deckel wieder lose aufgesetzt. Es ist darauf zu achten, dass nur der dazugehörige Deckel aufgelegt wird. Bei Verwendung des QIAamp Ultrasens Virus Kits entfällt dieser Schritt.

4. Extraktion mit Hilfe des Qiagen Viral Extraktions Kits nach einem modifizierten Protokolls
Vorbereiten der Extraktionsreagenzien
Alle Extraktionsreagenzien entsprechend den Herstellerangaben vorbereiten.
Aliquots des nukleasefreien Wassers werden bei 2-8°C aufbewahrt und nur einmal verwendet. Alle anderen Reagenzien werden bei Raumtemperatur gelagert. Der Puffer AVL wird bei 2-8°C im Kühlschrank aufbewahrt. Vor Verwendung müssen durch Erwärmen auf 80°C für maximal 5 Minuten die präzipitierten Salze gelöst werden.
Spiken der internen Kontroll-Nukleinsäure (IC) zum Lysispuffer AC
Die interne Kontroll-Nukleinsäure monitort die Effizienz der Extraktion und vor allem der späteren Amplifikation. Die Zugabe der internen Kontroll-Nukleinsäure (IC1 oder IC2) muss mit gestopften Pipettenspitzen durchgeführt werden.
Extraktion von Poolproben
Nach jedem Arbeitsschritt sollen die Handschuhe gewechselt werden.

– 350μl mit IC gespiktes AVL zum Pellet pipettieren und auf einen Schüttler IKA Vibrax stellen. 5 min. bei 1000rpm und 5 min. bei 1400rpm schütteln lassen.
– 350μl Ethanol in das Röhrchen pipettieren, kurz vortexen.
– Mit einer Einmaltransferpipette die Gesamtmenge der Lösung aus dem Röhrchen aufnehmen und auf die Säule geben, 1 min. bei 8000rpm (6082xg) zentrifugieren, Collection Tube verwerfen und Säule in ein neues Collection Tube geben.
– 500μl AW 1 auf die Säule pipettieren, 1 min. bei 8000rpm zentrifugieren, Collection Tube verwerfen und Säule in ein neues Collection Tube geben.
– 500μl AW 2 auf die Säule pipettieren, 1 min. bei 8000rpm zentrifugieren, Collection Tube verwerfen und Säule in ein neues Collection Tube geben.
– 2 min. bei 13.000rpm (16.060xg) zentrifugieren und Collection Tube verwerfen.
– Säulen auf vorbereitete etikettierte RNase freie Reaktionsgefäße setzen.
– 75μl 80°C heißes nuklease freies Aqua auf die Säule pipettieren, 1 min. bei 8000rpm zentrifugieren – nicht mehr als 6-8 Proben auf einmal
– Säule verwerfen, Eluat = Extrakt

Die Extrakte werden bis zur Weiterverarbeitung maximal 1 Stunde bei Kühlschranktemperatur aufbewahrt. Bei längerfristiger Aufbewahrung sind die Extrakte bei –20°C zu lagern.
Extraktion von Einzelproben

– Zu 100μl vorzentrifugierter Plasmaprobe 350μl mit IC gespiktes und 50μl ungespiktes AVL pipettieren, gut vortexen, in der Minifuge kurz herunterzentrifugieren und 10 min. bei RT stehen lassen.
– 400μl Ethanol zur Probe pipettieren, gut vortexen und herunterzentrifugieren (Minifuge).
– Die Hälfte der Lösung mit einer Einmaltransferpipette auf die Säule geben, 1 min. bei 8000rpm (6082xg) zentrifugieren, Collection Tube verwerfen und Säule in ein neues Collection Tube geben.
– Die zweite Hälfte der Lösung mit einer Einmaltransferpipette auf die Säule geben, 1 min. bei 8000rpm (6082xg) zentrifugieren, Collection Tube verwerfen und Säule in ein neues Collection Tube geben.
– 500μl AW 1 auf die Säule pipettieren, 1 min. bei 8000rpm zentrifugieren, Collection Tube verwerfen und Säule in ein neues Collection Tube geben.
– 500μl AW 2 auf die Säule pipettieren, 1 min. bei 8000rpm zentrifugieren, Collection Tube verwerfen und Säule in ein neues Collection Tube geben.
– 2 min. bei 13.000rpm (16.060xg) zentrifugieren und Collection Tube verwerfen.
– Säulen auf vorbereitete etikettierte RNase-freie Reaktionsgefäße setzen.
– 75μl 180°C heißes nuklease freies Aqua auf die Säule pipettieren, 1 min. bei 8000rpm zentrifugieren – nicht mehr als 6-8 Proben auf einmal
– Säule verwerfen, Eluat = Extrakt

Die Extrakte werden bis zur Weiterverarbeitung maximal 1 Stunde bei Kühlschranktemperatur aufbewahrt. Bei längerfristiger Aufbewahrung sind die Extrakte bei –20°C zu lagern.
5. Gemeinsame Amplifikation auf dem TaqMan^® ABI 7000 (9600 Emulation Mode) oder TaqMan^® ABI 7700
Voreinstellungen bei der Erstellung eines neuen PCR-Laufs am ABI 7000
Wählen Sie auf dem ABI PRISM^® 7000 SDS den unter File befindlichen Menüpunkt New an und stellen Sie für das neue Dokument die folgenden Grundeinstellungen ein: Assay: Absolute Quantitation; Container: 96-Well Clear; Template: Blank Document. Bestätigen Sie Ihre Eingaben (OK).
Es ist sinnvoll alle Einstellungen der Programmierung eines HAV/PB19-PCR-Laufs in Form eines Templates (SDS Template [*.sdf]) zu speichern, das dann jederzeit zur Verfügung steht.
Auswahl der Detektoren
Im Hauptmenü unter dem Punkt Tools – Detector Manager wählen Sie unter der Option File den Menüpunkt New an und nehmen folgende Einstellungen vor: 1. Nachweis von HAV
2. Nachweis von PB19
3. gleichzeitiger Nachweis von HAV und PB19
Durch Bestätigung der Eingaben mit OK kehren Sie zum Detector Manager zurück. Markieren Sie die erstellten Detektoren und diese durch Anklicken der Option Add to Plate Document zum Well Inspector. Mit Done schließen Sie das Fenster.
Zuordnung der notwendigen Informationen zu den Plattenpositionen
Die unter View befindliche Option Well Inspector wird geöffnet. Markieren Sie die zum HAV/PB19 Nachweis belegten Plattenpositionen und ordnen Sie diesen Positionen die ausgewählten Detektoren zu, indem Sie die Use-Option beider Detektoren aktivieren. Unter Sample Name können Sie die Probenbezeichnung eingeben. Wählen Sie dann für jeden Probentyp die Funktion (Task) fest: 1. Nachweis von HAV
2. Nachweis von PB19
3. gleichzeitiger Nachweis von HAV und PB19
Alternativ können Sie ein extern erstelltes Sample Setup mit allen Informationen zu Detektoren und Probenbezeichnungen importieren, indem Sie im Menü File die Menüpunkte Import und Sample Setup die entsprechende Excel-Datei anwählen. Zur genauen Struktur dieser Liste lesen Sie bitte im ABI-7000 User Guide nach.
Außerdem muß darauf geachtet werden, dass als passive Referenz der Farbstoff ROX im Well Inspector eingestellt ist.
Es muss darauf geachtet werden, dass der Emulation Mode aktiviert ist und ein Reaktionsvolumen von 25μl eingestellt wurde.
Speichern des PCR-Laufs
An dieser Stelle können Sie die eingegebenen Einstellungen (Setup) als Maske abspeichern, um sie für spätere Anwendungen in veränderter oder unveränderter Form erneut zu nutzen. Durch das Abspeichern der Einstellungen als SDS Template (*.sdt) in dem Ordner Template Directory (Lokales Laufwerk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, angelegt von Applied Biosystems) ist diese Datei aus der Template Drop-down-Liste in dem New Document-Fenster direkt anwählbar. In anderen Ordnern gesicherte Vorlagen müssen über Browse geöffnet werden. Vor dem Starten des PCR-Laufs achten Sie bitte darauf, diesen erneut als SDS Document (*.sds) abzuspeichern. Damit stellen Sie die Speicherung der sich im Verlauf der PCR gesammelten Daten sicher.
Starten des PCR-Laufs
Starten Sie den PCR-Lauf durch Anwählen der Option Start unter dem Menüpunkt Instrument oder des Feldes Start auf der Instrument-Ebene.
Voreinstellungen bei der Erstellung eines neuen PCR-Laufs am ABI 7700
Wählen Sie auf dem ABI PRISM^® 7700 SDS den unter File befindlichen Menüpunkt New Plate an und stellen Sie für das neue Dokument die folgenden Grundeinstellungen ein: Plate Type: Single Reporter: Plate Format: tandard Plate; Run: Real-time. Bestätigen Sie Ihre Eingaben (OK).
Es ist sinnvoll, alle Einstellungen der Programmierung eines HAV/PB19-PCR-Laufs in Form eines Templates (SDS Template [*.sdf]) zu speichern, das dann jederzeit zur Verfügung steht.
Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe und Zuordnung des Probentyps
Mit Hilfe des Sample Type Setup (Setup-Ebene: Sample Type/Sample Type Setup) ordnen Sie dem Dokument die entsprechenden Detektorfarbstoffe und den entsprechenden Probentyp zu. 1. Nachweis von HAV
2. Nachweis von PB19
3. gleichzeitiger Nachweis von HAV und PB19
Die Zuordnung des Probentyps zu einer entsprechenden Funktion (Acronym) erfolgt nach der folgenden Tabelle: 1. Nachweis von HAV
2. Nachweis von PB19
3. gleichzeitiger Nachweis von HAV und PB19
Zuordnung der notwendigen Informationen zu den Plattenpositionen
Für die Zuordnung der Detektoren und Probentypen zu den einzelnen Plattenpositionen wählen sie die entsprechenden Felder an. Öffnen Sie dann auf der Setup-Ebene das Dialogfenster Dye Lager und ordnen Sie den zugehörigen Reporter zu. Aktivieren Sie nun das Pop-up Menü Sample Type, in dem Sie in der erscheinenden Liste die dem Reporter im Sample Type Setup zugeordneten Probentypen wiederfinden. Wählen Sie den passenden Probentyp aus und bestimmen sie nun mit Hilfe des Dye Lagers und des Sample Type-Menüs die Zuordnung zu den restlichen Plattenpositionen. In dem Feld Sample Name kann jeder Probe ein Name zugeordnet werden.
Alternativ können Sie ein extern erstelltes Sample Setup mit allen Informationen zu Detektoren und Probenbezeichnung importieren, indem Sie im Menü File – Import – Sample Setup die entsprechende Excel-Datei anwählen. Zur genauen Struktur dieser Liste lesen Sie bitte im ABI-7700 User Guide nach.
Es muss darauf geachtet werden, dass der Emulation Mode aktiviert ist und ein Reaktionsvolumen von 25μl eingestellt wurde.
Die Voreinstellungen der Ramp-Zeiten und des Auto Increments bleiben unverändert (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0°C, 0.0 Seconds).
Des Weiteren befindet sich in dem Thermal Cycler Conditions-Menü die Option Show Data Collection. Jede Ramp- und jede Plateau-Temperatur ist mit einem Symbol der Datenaufnahme versehen (Dato Collection Icon), das die Aufnahme der Daten zu diesem Zeitpunkt des Laufs veranschaulicht. Entfernen Sie durch Anklicken alle Symbole, bis auf das zum Zeitpunkt des Annealing-Extension-Schrittes, um unnötige Fluoreszenz-Messungen auszusparen. Damit werden Gesamtlaufzeit und Datenmenge so gering wie möglich gehalten.
Wichtige Zusatzeinstellungen
Zur Einstellung der Belichtungszeit (Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe) sowie zur Auswahl der Pure Spectra/Background-Dateien wechseln Sie bitte von der Setup-Ebene zur Analysis-Ebene. Wählen Sie den nun aktivierten, im Menü Instrument unter Diagnostics befindlichen Unterpunkt Advanced Option an. Folgende Einstellungen müssen aktiviert sein: Display mse in Multicomponent View, Display best fit in Raw Spectra View, Set 7700 Exposure Time for Plates: 10, Reference ROX. Die Einstellungen unter Analysis: Spectra Components und unter Miscellaneous – Use Spectral Compensation for Real Time sowie Use Spectral Compensation for Endpoint sollen nicht aktiviert sein.
Beachte:
Die Belichtungszeit (Exposure Time) bei Nutzung von 96-well Reaktionsplatten für optische Messungen in Verbindung mit optischen Klebefolien (optical adhesive covers) beträgt zehn Millisekunden. Sollten Sie optische Reaktionsgefäße mit Deckeln verwenden, so stellen sie diese Zeitangabe bitte auf 25 Millisekunden um.
Speichern des PCR-Laufs
An dieser Stelle können Sie die eingegebenen Einstellungen (Setup) als Maske abspeichern, um sie für spätere Anwendungen in veränderter oder unveränderter Form erneut zu nutzen. Dafür speichern Sie diese Datei im Stationary File Format ab. Vor dem Starten des aktuell programmierten PCR-Laufs achten Sie bitte darauf, diesen erneut im Normal File Format abzuspeichern. Damit stellen Sie die Speicherung der sich im Verlauf der PCR ansammelnden Daten sicher.
Starten des PCR-Laufs
Starten Sie den PCR-Lauf durch Anwählen der Option Run unter dem Menüpunkt Instrument oder des Feldes Run auf der Analysis-Ebene.
6. Auswertung der Multiplex Real-time PCR
Eine vorliegende, gültige Kalibrierung der Farbstoffe (Pure Spectra Component File) und des Hintergrundes (Background Component File) ist bei Inbetriebnahme der Geräte unbedingt erforderlich. Diese Kalibrierungsdateien werden wie folgt zur exakten Berechnung der Ergebnisse benötigt:
Sämtliche die Messung beeinflussenden gerätebedingten Störsignale werden von der Sequence Detection Software der ABI PRISM^® Sequence Detection Systems mit Hilfe des Background Component Files eliminiert.
Zudem treten bei Multicolor-Analysen Interferenzen zwischen den Emissionsspektren der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe auf. Die Software der ABI PRISM^® SDS kompensiert diese Interferenzen durch Verrechnung mit den im Pure Spectra Component File gespeicherten Spektraldaten der einzelnen Farbstoffe. Die Zuordnung der im Verlauf der PCR über das gesamte messbare Spektrum gesammelten Fluoreszenzdaten zu den programmierten Detektoren nimmt die Software ebenfalls mit Hilfe der Pure Spectra Components vor. Anschließend werden die ermittelten Fluoreszenzdaten der einzelnen Farbstoffe zur Verrechnung von tube-to-tube Variationen (Fluoreszenzunterschiede zwischen verschiedenen PCR-Ansätzen) durch das Signal der passiven Referenz (ROX) geteilt. Die auf diese Weise normalisierten Signale können mit Hilfe des Amplification Plots ausgewertet werden.
Die bei der Auswertung eines PCR-Laufs genutzten Kalibrierungsdateien werden beim Abspeichern automatisch mitgesichert. Sollten keine Kalibrierungsdateien installiert sein, erstellen Sie diese Dateien bitte unter Beachtung der Anleitung im ABI PRISM^® SDS User Guide/Manual.
Beispiel 4 Sensitivität, Robustheit und Spezifität des Nachweises von HAV
1. Sensitivitätstest
Verwendetes HAV-Standardplasma:

WHO International Standard for HAV-RNA, NIBSC Code 00/560
Konzentration: 5 × 10⁴ IU/vial

Herstellung der Poolproben:
Zur Herstellung der Negativpools wurde Humanplasma, das in der PCR HCV-, HIV-, HBV-, HAV- und Parvo B19- negativ getestet wurde, verwendet. Das Plasma wurde in einem großen Gefäß gemischt, in 50 ml Falcons gefüllt und vorzentrifugiert (15 min, 6000 rpm). Anschließend wurden 48 × 9,5 ml dieses Poolmaterials in Zentrifugenröhrchen pipettiert und mit je 100 μl eines positiven Plasmas aus der Verdünnungsreihe versetzt.
Herstellung der Verdünnungen:
Ein Lyophilisat des HAV-RNA -WHO-Standards wurde am 26.10.05 in 0,5 ml Nukleasefreiem Aqua gelöst, daraus ergibt sich eine Konzentration von 10⁵ IU/ml (x). Es wurde eine Vorverdünnung des WHO-Standards wie folgt hergestellt:
90 μl Plasma des WHO-Standards (x) wurden mit 810 μl eines negativen Plasmas verdünnt, woraus sich eine Konzentration von 10⁴ IU/ml (y) ergibt.
Der verdünnte WHO-Standard (y) wurde in Aliquots zu je 200 μl aufgeteilt und bei –80°C eingefroren. An drei Tagen wurde von drei verschiedenen TA's ein Aliquot aufgetaut und eine Verdünnungsreihe wie folgt hergestellt (Serien A – C): (z) 180 μl (y) + 1620 μl Negativplasma = 1000 IU/ml
Verdünnungen zum Spicken der Pools:

(1) 900 μl (z) + 900 μl Negativplasma = 500 IU/ml
(2) 900 μl (1) + 900 μl Negativplasma = 250 IU/ml
(3) 900 μl (2) + 900 μl Negativplasma = 125 IU/ml
(4) 900 μl (3) + 900 μl Negativplasma = 62,5 IU/ml
(5) 900 μl (4) + 900 μl Negativplasma = 31,25 IU/ml
(6) 900 μl (5) + 900 μl Negativplasma = 15,7 IU/ml

Für jeweils Serien A, B und C:

8 × 9,5 ml Negativpool + je 100 μl Verdünnung (1)
8 × 9,5 ml Negativpool + je 100 μl Verdünnung (2)
8 × 9,5 ml Negativpool + je 100 μl Verdünnung (3)
8 × 9,5 ml Negativpool + je 100 μl Verdünnung (4)
8 × 9,5 ml Negativpool + je 100 μl Verdünnung (5)
8 × 9,5 ml Negativpool + je 100 μl Verdünnung (6)

A. Ergebnisse – HAV-RT-PCR am ABI Prism 7000 SDS, 9600 Emulation Mode, Serie A:
Tabelle 1
Kontrollen
Tabelle 2
Kontrollen:
Tabelle 3
Kontrollen:

CT: Cycle Thresohold (der Zyklus, bei dem das erste messbare Signal auftritt); Rn/ΔRn: Endsignal im Aplifikation Plot Undet.: nicht detektierbar, kein CT

B. Ergebnisse – HAV-RT-PCR am ABI Prism 7000 SDS, 9600 Emulation Mode, Serie B:
Tabelle 4
Kontrollen:
Tabelle 5
Kontrollen:
Tabelle 6
Kontrollen:

CT: Cycle Threshold (der Zyklus, bei dem das erste messbare Signal auftritt); Rn/ΔRn: Endsignal im Aplifikation Plot Undet.: nicht detektierbar, kein CT

C. Ergebnisse – HAV-RT-PCR am ABI Prism 7000 SDS, 9600 Emulation Mode, Serie C:
Tabelle 7
Kontrollen:
Tabelle 8
Kontrollen:
Tabelle 9
Kontrollen:

Auswertungskriterien für valide Ergebnisse:

– Positiv bewertet wurden Proben mit einem CT < 40 und einem Rn/ΔRn
– Negativ bewertet wurden Proben mit einem CT > 40 und einem Rn/ΔRn
– Die interne Kontroll-Nukleinsäure muss bei allen negativen Proben positiv sein.

Zur endgültigen Entscheidung ob ein Pool positiv oder negativ ist, wird der Muiticomponent herangezogen. Tabelle 10: Gesamtzusammenstellung der Ergebnisse der HAV-RT-PCR am ABI Prism 7000 SDS, 9600 Emulation Mode:

*1: bei 100%iger Effizienz der Pelletierung
*2: bei 100%iger Effizienz der Extraktion
*3: bei 100%iger Effizienz der Extraktion; in die PCR wird 10 μl Extrakt eingesetzt

Nachweisgrenzen der HAV-RT-PCR am ABI Prism 7000 SDS, 9600 Emulation Mode:
Entsprechend der Probitanalyse:

P (0,95): 37 IU/ml
P (0,5): 18 IU/ml

2. Robustheitstest
Verwendetes Material:
Es wurde das Plasma des HAV-positiven Zellkulturüberstands Kü-2 mit einer Konzentration von 2 × 10⁶ IU/ml auf die Konzentrationsstufe von 2 × 10⁵ IU/ml in NHP verdünnt und mittels QIAamp Viral RNA Kit extrahiert. Dieser Zellkulturüberstand wurde am 02.10.03 am WHO International Standard for HAV-RNA, NIBSC Code 00/560 quantifiziert und bei –80°C gelagert.
Als Negativmaterial wurden die extrahierten Negativpools des Spezifitätstests vom 25.10.05 verwendet.
Testansatz:
Zur Austestung des eventuellen Auftretens von Kontaminationen wurden nach Pipettieren des Mastermixes 32 positive Extrakte (2 × 10⁵ IU/ml) und 32 negative Pool-Extrakte nach Pipettierschema auf einer TaqMan^®-Plalte (MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate) verteilt.
Durchführungszeitraum:

Extraktion des positiven Zellkulturüberstands und Ansetzen der PCR
M. Schmidt am 09.11.05

PCR und Detektion:
In house-HAV-RT-PCR für das ABI Prism 7000 und 7700 Sequence Detection System (TaqMan^®). Es wurde ein PCR-Mastermix angesetzt, 10 μl der jeweiligen Extrakte zugegebenen und auf dem ABI Prism 7000 SDS detektiert Pipettierschema:
Ergebnisse des Robustheitstests: Tabelle 11

FAM: Wildtyp-Signal, VIC: Signal der internen Kontroll-Nukleinsäure; CT: Cycle Threshold (der Zyklus, bei dem das erste meßbare Signal auftritt); Rn/ΔRn: Endsignal im Aplifikation Plot

Auswertung des Robustheitstests:
Proben mit einem CT und/oder einem erhöhten Endsignal sind nach Betrachtung des Multicomponent deutlich negativ auszuwerten. Eine Verschleppung oder Kreuzkontamination fand nicht statt.
3. Spezifitätstest
Verwendetes Material:
Für diesen Test wurden 94 in der Routine HAV-PCR-negativ-getestete Pools (mit jeweils 96 Konserven, ergibt 9,6 ml) und 2 Positivpools (KA-8, 3000 IU/ml) verwendet.
Auswertung des Spezifitätstests:
Proben mit einem CT und/oder einem erhöhten Endsignal sind nach Betrachtung des Multicomponent deutlich negativ auszuwerten.
Es traten keine unspezifischen Reaktionen auf.
Beispiel 5 Sensitivität, Robustheit und Spezifität des Nachweises von PB19
1. Sensitivitätstest
Verwendetes Parvo B19-Standardplasma:
WHO International Standard for PB19 DNA, NIBSC Code 99/800, Konzentration: 5×10⁵IU/vial (Gelöst in 500 μl nukleasefreiem Wasser, ergibt dies eine Konzentration von 1 × 10⁶IU/ml)
Herstellung der Poolproben:
Zur Herstellung der Negativpools wurde Humanplasma, das in der PCR HCV-, HIV-, HBV-, HAV- und Parvo B19- negativ getestet wurde, verwendet. Das Plasma wurde in einem großen Gefäß gemischt, in 50 ml Falcons gefüllt und vorzentrifugiert (15 min, 6000 rpm; mind. 5000 g) Anschließend wurden 48 × 9,5 ml dieses Poolmaterials in Zentrifugenröhrchen pipettiert und mit je 100 μl eines positiven Plasmas aus der Verdünnungsreihe versetzt.
Herstellung der Verdünnungen:
Ein Lyophilisat des PB19 DNA – WHO-Standards wurde am 06.03.2006 in 500 μl nukleasefreiem Wasser gelöst → Konzentration: 10⁶ IU/ml. Der vorverdünnte WHO-Standard wurde zu je 60μl aliqoutiert und bis zur Herstellung der Verdünnungsreihen bei –80°C eingefroren.
An drei Tagen wurde von drei verschiedenen TA's ein Aliquot aufgetaut und eine Verdünnungsreihe wie folgt hergestellt (Serien A – C):
50 μl Plasma des WHO-Standards wurden mit 450 μl negativen Humanplasma verdünnt, woraus sich eine Konzentration von 1 × 10⁵ IU/ml ergibt.
200 μl der WHO-Verdünnungsstufe 1 × 10⁵ IU/ml wurden mit 2300 μl negative Humanplasma verdünnt, woraus sich eine Konzentration von 8000 IU/ml ergibt.
Verdünnungen zum Spicken der Pools:

(1) 1000 μl (8000IU/ml) + 1000 μl Negativplasma = 4000 IU/ml
(2) 1000 μl(1) + 1000 μl Negativplasma = 2000 IU/ml
(3) 1000 μl (2) + 1000 μl Negativplasma = 1000 IU/ml
(4) 1000 μl (3) + 1000 μl Negativplasma = 500 IU/ml
(5) 1000 μl (4) + 1000 μl Negativplasma = 250 IU/ml
(6) 1000 μl (5) + 1000 μl Negativplasma = 125 IU/ml

Für jeweils Serien A, B und C:

A. Ergebnisse – PB19-PCR am ABI Prism 7000 SDS Serie A:
Tabelle 12
Kontrollen:
Tabelle 13
Kontrollen:
Tabelle 14
Kontrollen:

CT: Cycle Threshold (der Zyklus, bei dem das erste meßbare Signal auftritt); Rn/ΔRn: Endsignal im Aplifikation Plot Undet.: nicht detektierbar, kein CT

B. Ergebnisse – PB19-PCR am ABI Prism 7000 SDS Serie B:
Tabelle 15
Kontrollen:

* Extrakt durch Ansetzen der PCR kontaminiert, gleiches Extrakt am ABI Prism 7700 SDS negativ!!

Tabelle 16
Kontrollen:
Tabelle 17
Kontrollen:

C. Ergebnisse – PB19-PCR am ABI Prism 7000 SDS Serie C:
Tabelle 18
Kontrollen:
Tabelle 19
Kontrollen:
Tabelle 20
Kontrollen:

* Extrakt durch Ansetzen der PCR kontaminiert, gleiches Extrakt am ABI Prism 7700 SDS negativ!!
CT: Cycle Threshold (der Zyklus, bei dem das erste meßbare Signal auftritt); Rn/ΔRn: Endsignal im Aplifikation Plot Undet.: nicht detektierbar, kein CT

Auswertungskriterien für valide Ergebnisse:

– Positiv bewertet wurden Proben mit einem CT < 40 und einem Rn/ΔRn
– Negativ bewertet wurden Proben mit einem CT > 40 und einem Rn/ΔRn
– Die interne Kontroll-Nukleinsäure muß bei allen negativen Proben positiv sein.

Zur endgültigen Entscheidung ob ein Pool positiv oder negativ ist, wird der Multicomponent herangezogen. Tabelle 21 Gesamtzusammenstellung der Ergebnisse der PB19-PCR am ABI Prism 7000 SDS

*1: bei 100%iger Effizienz der Pelletierung
*2: bei 100%iger Effizienz der Extraktion
*3: bei 100%iger Effizienz der Extraktion; in die PCR wird 5 μl Extrakt eingesetzt

Nachweisgrenzen der PB19-PCR am ABI Prism 7000 SDS
Entsprechend der Probitanalyse:

P (0,95): 982 IU/ml Konfidenzintervall (724 – 1811 IU/ml)
P (0,5): 62 IU/ml Konfidenzintervall (–391 – 237 IU/ml)

D. Ergebnisse – PB19-PCR am ABI Prism 7700 SDS, Serie A:
Tabelle 22
Kontrollen:

Anmerkung: Extraktion invalide, auch Ausfall der internen Kontroll-Nukleinsäure. Dieser Wert wird aus der Endbewertung herausgenommen.

Tabelle 23
Kontrollen:
Tabelle 24
Kontrollen:

E. Ergebnisse – PB19-PCR am ABI Prism 7700 SDS, Serie B:
Tabelle 25
Kontrollen:
Tabelle 26
Kontrollen:
Tabelle 27
Kontrollen:

F. Ergebnisse – PB19-PCR am ABI Prism 7700 SDS, Serie C:
Tabelle 28
Kontrollen:
Tabelle 29
Kontrollen:

* Anmerkung: Extraktion invalide, auch Ausfall der internen Kontroll-Nukleinsäure. Dieser Wert wird aus der Endbewertung herausgenommen.

Tabelle 30
Kontrollen:

Auswertungskriterien für valide Ergebnisse:

Zur endgültigen Entscheidung ob ein Pool positiv oder negativ ist, wird der Multicomponent herangezogen Tabelle 31: Gesamtzusammenstellung der Ergebnisse der PB19-PCR am ABI Prism 7700 SDS

Nachweisgrenzen der PB19-PCR am ABI Prism 7700 SDS
Entsprechend der Probitanalyse:

P (0,95): 971 IU/ml Konfidenzintervall (716 – 1794 IU/ml)
P (0,5): 68 IU/ml Konfidenzintervall (–372 – 239 IU/ml)

2. Robustheitstest
Verwendetes Material:
Es wurde das Plasma der PB19-positiven Konserve 9504408 mit einer Konzentration von 10⁷ IU/ml mittels QIAamp^® Viral RNA Kit extrahiert. Dieses Plasma wurde am 16.09.05 am WHO International Standard for PB19-DNA, NIBSC Code 99/800 quantifziert und bei –80°C gelagert.
Als Negativmaterial wurden 3 Einzelproben NHP 17 mittels QIAmp^® Viral RNA Kit extrahiert.
Testansatz:
Zur Austestung des eventuellen Auftretens von Kontaminationen, wurden nach Pipettieren des Mastermixes 32 positive Extrakte (10⁷IU/ml) und 32 negative NHP-Extrakte nach Pipettierschema auf einer TaqMan^®-Platte (MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate) verteilt. Pipettierschema:
Ergebnisse des Robustheitstest:
Tabelle 32

Auswertung des Robustheitstests:
Eine Verschleppung oder Kreuzkontamination fand nicht statt.
3. Spezifitätstest
Verwendetes Material:
Für diesen Test wurden 94 in der Routine PB19-PCR-negativ-getestete Pools (mit jeweils 96 Konserven, ergibt 9,6 ml) und 2 Positivpools (KP-8, 3000 IU/ml) verwendet.
Auswertung des Spezifitätstests:
Proben mit einem CT und/oder einem erhöhten Endsignal sind nach Betrachtung des Multicomponent deutlich negativ auszuwerten.
Es traten keine unspezifischen Reaktionen auf.
Beispiel 6 Testung der HAV/PB19- Multiplex-PCR
1. Testung der Fluorophore
Es werden die verschiedenen Fluochrome miteinander verglichen. Dabei zeigt sich, dass Bodipy-TMR als Reporterfarbstoff für HAV, FAM als Reporterfarbstoff für PB19 und VIC als Reporterfarbstoff für die interne Kontroll-Nukleinsäure geeignet ist. Somit werden diese Sonden für die weiteren Versuche verwendet.
2. Testung von schwach positiven HAV in Gegenwart von hochkonzentrierten PB19 Proben mit der HAV/PB19 Multiplex PCR
Die Amplifikation von schwach positiven HAV Proben (2000 IU/ml) wird durch die Gegenwart von hochkonzentrierten PB19 Proben nicht beeinflusst. Tabelle 33
3. Testung einer HAV-Endpunktverdünnung in Gegenwart von hochkonzentrierten PB19-Proben mit der HAV/PB19 Multiplex PCR
Es wurde eine Endpunktverdünnung für HAV Proben in Gegenwart von hochkonzentrierten PB19 Proben (10¹¹ IU/ml) durchgeführt. Es zeigt sich eine 95%ige Nachweisgrenze für HAV ohne PB19 Proben von 75,6 IU/ml und für HAV in Gegenwart von PB19 Proben von 148 IU/ml.
4. Testung einer PB19-Endpunktverdünnung mit der HAV/PB19-Multiplex-PCR mit unterschiedlichen PB19-Primerkonzentrationen
Es wurde eine Endpunktverdünnung für PB19 Proben durchgeführt. Es zeigt sich eine 95%ige Nachweisgrenze für PB19 zwischen 70 IU/ml und 233 IU/ml.
5. Vergleich zur HAV-Routine-PCR, Version 2.0
Bei der kompletten Validierung mit sechs Verdünnungsstufen und 24 Replikaten pro Verdünnungsstufe ergibt sich eine 95%ige Nachweisgrenze von 58 IU/ml.
6. Vergleich zur PB19-Routine-PCR, Version 2.0
Bei der kompletten Validierung mit sechs Verdünnungsstufen und 24 Replikaten pro Verdünnungsstufe ergibt sich eine 95%ige Nachweisgrenze von 971 IU/ml.
Referenzen

1. AuBuchon JP, Birkmeyer JD, Busch MP. Safety of the blood supply in the United States: opportunities and controversies. Ann Intern Med 1997;127(10):904-9.
2. Roth WK, Seifried E. Yield and future issues of nucleic acid testing. Transfus Clin Biol 2001;8(3):282-4.
3. Roth WK, Weber M, Buhr S, et al. Yield of HCV and HIV-1 NAT after screening of 3.6 million blood donations in central Europe. Transfusion 2002;42(7):862-8.
4. Roth WK, Weber M, Petersen D, et al. NAT for HBV and anti-HBc testing increase blood safety. Transfusion 2002;42(7):869-75.
5. Offergeld R, Ritter S, Faensen D, Hamouda O. [Infection epidemiological data among blood donors in Germany 2003-2004. Report of the Robert Koch Institute in accordance with Article 22 of the Transfusion Act]. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz 2005;48(11):1273-87.
6. Roth WK, Seifried E. The German experience with NAT. Transfus Med 2002;12(4):255-8.
7. Roth WK, Buhr S, Drosten C, Seifried E. NAT and viral safety in blood transfusion. Vox Sang 2000;78 Suppl 2(257-9).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Detektion von Hepatitis A-Viren und Parvoviren PB19 in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben, b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben, c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution, d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c), e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, und einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer; einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst, und weiter umfassend eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die Sonden jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.
Verfahren zur Detektion von Hepatitis A-Viren oder Parvoviren PB19 in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben, b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben, c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution, d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c), e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend für den Nachweis von HAV einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, wobei die erste und zweite Sonde jeweils auf identische Genomabschnitte gerichtet sind, oder für den Nachweis von PB19 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst, wobei die dritte und vierte Sonde jeweils auf identische Genomabschnitte gerichtet sind, und weiter umfassend eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die Sonden jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive oder eine kompetitive Nukleotidsequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz ist und die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 hat.
Verfahren zur Detektion von Hepatitis A-Viren oder Parvoviren PB19 in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben, b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben, c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO.2 hat, d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c), e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend für den Nachweis von HAV einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, oder für den Nachweis von PB19 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst, und weiter umfassend eine fünfte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die Sonden jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben, Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben handelt.
Verfahren einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die in Schritt a) zur Verfügung gestellten aus Blut abgeleiteten Proben zu mindestens einem Probenpool zusammengeführt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Konzentrieren der Proben in Schritt b) Zentrifugieren umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei dem Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HAV-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, die Nukleotidsequenzen von konservierten Regionen der bekannten HAV-Genotypen abgeleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 3, der Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 4, die erste Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 5 und die zweite Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 6 hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei dem Satz Oligonukleotide, der spezifisch für PB19-Nukleinsäuren ist und jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine dritte Sonde und eine vierte Sonde umfasst, die Nukleotidsequenzen von konservierten Regionen der bekannten Parvoviren B19-Genotypen abgeleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 8, der Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9, die dritte Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 10 und die vierte Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 11 hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz der fünften Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, von der Sequenz der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die fünfte Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 12 hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die zwei Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Sonden markiert sind, ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher, sind.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Fluoreszenzdonor oder -reporter ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus FAM, VIC, Bodipy-TMR, Joe und Hex.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus TAMRA, MBG, Black Hole Quencher 1 (BHQ1), Black Hole Quencher 2 (BHQ2), Black Hole Quencher 3 (BHQ3), BodyPi 564/570 und Cy5.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die erste und die zweite Sonde mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert sind, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem die fünfte Sonde markiert ist, unterscheidet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die dritte und die vierte Sonde mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert sind, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem die fünfte Sonde markiert ist, unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die erste und die zweite Sonde jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und TAMRA und die fünfte Sonde mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und TAMRA markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die dritte und die vierte Sonde jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und TAMRA und die fünfte Sonde mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und TAMRA markiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die erste und die zweite Sonde jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar Bodipy-TMR und BHQ1, die dritte und die vierte Sonde jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und BHQ1 und die fünfte Sonde mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und MBG oder VIC und TAMRA markiert sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) eine Multiplex-PCR, insbesondere eine Multiplex-Realtime-PCR ist.
Zusammensetzung zum Nachweis von Hepatitis A-Viren, umfassend Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 3, 4, 5 und 6.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, weiterhin umfassend ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 7.
Zusammensetzung zum Nachweis von Parvoviren B19, umfassend Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 8, 9, 10 und 11.
Zusammensetzung nach Anspruch 26, weiterhin umfassend ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 12.
Zusammensetzung zum Nachweis von Hepatitis A-Viren und Parvoviren B19, umfassend Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 3, 4, 5 und 6 sowie Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 8, 9, 10 und 11.
Zusammensetzung nach Anspruch 28, weiterhin umfassend ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 7 oder ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 12.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 5, 6, 7, 10, 11 und 12 mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei die zwei Fluoreszenzfarbstoffe ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher, sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 31, wobei der Fluoreszenzdonor oder -reporter ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus FAM, VIC, Bodipy-TMR, Joe und Hex.
Zusammensetzung nach Anspruch 31, wobei der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus TAMRA, MBG, Black Hole Quencher 1 (BHQ1), Black Hole Quencher 2 (BHQ2), Black Hole Quencher 3 (BHQ3), BodyPi 564/570 und Cy5.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 5 und 6 jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und TAMRA und das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 7 mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und TAMRA markiert sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 10 und 11 jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und TAMRA und das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 12 mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und TAMRA markiert sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 5 und 6 jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar Bodipy-TMR und BHQ1, die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 8 und 9 jeweils mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar FAM und BHQ1 und das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 7 mit dem Fluoreszenzfarbstoffpaar VIC und MBG markiert sind.