CN103703148B - 在单路或多路测定法中用于检测人细小病毒核酸和用于检测甲型肝炎病毒核酸的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了对人细小病毒基因组DNA特异性的核酸寡聚物。还公开了一种用于在生物标本中扩增和检测人细小病毒基因型1、2和3的核酸的测定法。还公开了用于在人生物标本中扩增和检测人细小病毒基因型1、2和3的基因组DNA的存在的组合物。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119要求2011年7月15日提交的美国专利申请No.61/508,597的优先权，将该专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于检测人传染性病原体的诊断方法和组合物，并且具体地讲涉及用于体外检测人细小病毒基因型1、2和3和/或甲型肝炎病毒的核酸的方法和组合物。
背景技术
多种治疗性蛋白质，包括凝血因子、免疫球蛋白(IVIG)以及白蛋白，是由如基立福(Grifols)、百特(Baxter)以及CSL之类的公司从人血浆中纯化而来的。检验细小病毒B19和HAV是重要的，因为它们是无包膜病毒，这使得这些病毒在纯化（分级分离）过程期间抗灭活。允许相对低水平的B19存在于血浆级分中（现行规定要求在可含有4,000至5,000个单独的血浆单位的制造池中低于10,000IU）。与其冒险集合成一个大型制造池而然后发现其污染有B19，通常用血浆分级分离器来筛选较小的池来鉴定含有高滴度B19的单独的血浆单位。目前不存在关于HAV的规定，但一般也执行检验，因为这样做已经变成一个行业标准。
人细小病毒（红细胞病毒属(Erythrovirus)）是一种血源性无包膜病毒，其具有约5.5kb的单链DNA(ssDNA)基因组（Shade等人，1986,J.Virol.（《病毒学杂志》）58(3):921-936；Brown等人，1997,Ann.Rev.Med.（《医学年评》）48:59-67）。单独的病毒粒子含有一个拷贝的基因组的正链或负链，以大致相等数目表现。该ssDNA基因组具有形成约350nt的5'和3'发夹的反向末端重复序列，所述反向末端重复序列为病毒复制所必需。该基因组在正链上包括两个开放阅读框，其编码结构蛋白（VP1和VP2）和非结构蛋白(NS1)。
曾经认为人细小病毒是高度保守的，遗传多样性小于2%。然而，近来已发现人红细胞病毒属分离株（最初称为V9）与B19相比在基因组序列方面具有大于11%的趋异性，其中最惊人的DNA不相似性>20%，是在p6启动子区域内观察到的。该V9分离株也被测定具有大于11%的临床存在率。现在人红细胞病毒属群体被分成三个不同的病毒基因型：基因型1(B19)、基因型2（A6样和LaLi样）以及基因型3（V9样）。（Servant等人，2002,J.Virol.（《病毒学杂志》）76(18):9124-34；Ekman等人，2007,J.Virol.（《病毒学杂志》）81(13):6927-35）。Servant等人将基因型1称为对应于细小病毒B19的病毒并将基因型2和3称为对应于细小病毒V9相关病毒的病毒。Ekman等人将基因型1-3称为都对应于细小病毒B19。本文为方便起见，将基因型1、2和3称为细小病毒基因型1、2和3或人细小病毒基因型1、2和3。不能精确检测所有细小病毒基因型的核酸检测测定法会导致许多血浆池仍污染有人细小病毒。因此，需要一种可检测人细小病毒基因型1、2和3的核酸检验。
人细小病毒感染可通过呼吸道传播或通过受感染的血液或血液制品而发生。受感染的个体可能不表现出症状，或具有传染性红斑(erythema infectiosum)症状，该症状包括轻度流感样症状、皮疹（“第五病”）、短暂性关节炎样关节疼痛（关节病）、溶血性贫血患者中的再生障碍性危象、持续性细小病毒感染以及约10%的由于胎儿死亡而造成的早期流产。因此，不能检测汇集的血浆样本中的细小病毒或不能诊断感染具有严重的后果。
此外，需要检测测定法提供检测灵敏性，该灵敏性使得能检测如可能在感染早期或在稀释或汇集的样本中出现的低滴度的病毒。可检测适当水平的污染的细小病毒核酸检测测定法可有助于在使用前从血液供给处移除受感染的捐献单位或受污染批次的汇集血浆。
许多免疫诊断方法可检测个体的血清或血浆中存在的抗细小病毒抗体（IgM或IgG）（例如参见Wolf等人的PCT No.WO96/09391和Hedman等人的PCT No.WO96/27799）。这些方法在检测近来或当前的感染时具有局限性，因为它们依赖于检测身体对传染性病原体的响应。在感染后病毒血症的快速增加导致个体的血液中存在高水平的细小病毒而无相应的可检测水平的抗细小病毒抗体（参见例如Brentano等人的美国专利No.7,094,541的实例4）。因此，基于免疫学的检测测定法容易出现假阴性结果。此外，病毒血症经常被迅速清除，然而人可能会在不存在这些感染性粒子的情况下仍保持抗体阳性，因此产生假阳性结果。多达90%的成年人对细小病毒呈血清阳性，这使得精确地免疫学检测近来或当前的感染存在困难。其他类似的测定法通过检测结合于纯化的细胞受体的病毒或空病毒衣壳来检测细小病毒的存在（Young等人的美国专利5,449,608），这些基于免疫的测定法遭遇类似的问题。
DNA杂交和扩增方法也已经用于检测人细小病毒，但这些检验一般是只针对基因型1的检测。然而，美国和欧洲管理机构已经发布标准，规定用于制造抗D免疫球蛋白和其他血浆衍生物的血浆池可含有不超过10,000IU/ml（在欧洲为10IU/微升）的任何人细小病毒。如上文所论述的，治疗性血浆池和诊断检验同样需要可靠地鉴定人细小病毒类型1、2和3。因此，本领域中需要可用于人细小病毒类型1、2和3的体外核酸检测的组合物、试剂盒以及方法。
甲型肝炎病毒(HAV)为一种形式的肝炎的病原体，该种肝炎可在不到两个月内产生包括发热、疲乏、恶心、腹痛、腹泻、食欲不振以及黄疸在内的症状。在HAV感染者中，约10%至15%在感染后六至九个月内具有长期或复发的症状。在有症状感染和无症状感染之后，基于个体内产生抗HAV免疫球蛋白G(IgG)而对HAV具免疫性。
尽管自20世纪90年代末以来在已广泛使用HAV疫苗接种的世界上部分地区的HAV感染发生率已急剧降低，但在存在不良卫生状况（即使暂时地，例如在地震后）的非免疫群体中可能出现HAV感染的流行病（每100,000个人口>700例，并且对于生活在高甲型肝炎比率的地区的儿童来说，该比率增加至每100,000个人口>20例）。传染也可能由接触受HAV污染的血清或血液制品而产生。甚至在美国，每年有约100个人死于因甲型肝炎引起的急性肝功能衰竭（死亡率为约0.015%）。即使在非致命性甲型肝炎病例中，与HAV感染相关的费用也相当大，包括由患者住院、门诊以及误工时所产生的费用。
HAV为含有具有约7.5kb的有义单链RNA基因组的27-nm RNA病毒（细小核糖核酸病毒）。该病毒在急性感染期内于肝脏中复制，于胆汁中排泄并且在于粪便中排出（例如，高达每毫升108个病毒）。在症状出现前的潜伏期通常为两至六周。已在全世界范围内发现单一血清型的HAV。通过症状或其他临床特征（例如，血清转氨酶水平升高）不能将甲型肝炎的诊断与其他类型的病毒性肝炎相区分。通常，通过提供存在抗HAV免疫球蛋白(Ig)的阳性结果的血清学检验来证实甲型肝炎诊断。抗HAV IgM一般在症状发作前的五至十天存在并且六个月后在大部分患者中不可检测，而抗HAV IgG在感染期间早期出现并且在个体终身可检测。通过使用核酸检验方法（例如，通过聚合酶链反应(PCR)扩增）可以在急性感染期内在大部分人的血液和大便中检测到HAV RNA，并且已使用核酸测序来鉴定社区范围内感染后HAV的基因相关性（Dato等人，Morbidity Mortality Wkly.Rpt.（《发病率和死亡率周报》），2003,52(47):1155-57；LaPorte等人，Morbidity Mortality Wkly.Rpt.（《发病率和死亡率周报》），2003,52(24):565-67）。然而，这些方法一般不用于诊断目的。
因此，需要精确地检测生物样本和环境样本中HAV的存在。还需要检测可用于医学治疗的产品（例如，用于输液的血液或血清，或源自人血液或血清的因子）中的HAV污染的存在。此外需要检测可能受污染的物质（例如水或食物）中HAV的存在以防止由于消费了受污染的物质而引起的社区范围疾病爆发或流行病。
本文公开的发明通过描述可用于核酸检验方法中来检测HAV核酸（HAV RNA或自其衍生的序列，例如，cDNA）的存在的寡核苷酸序列来回应这些需要。本申请还描述了检测样本中存在的HAV RNA的存在的核酸检验方法。
发明内容
本发明涉及用于检测甲型肝炎病毒和/或人细小病毒基因型1、2和3的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法被构造用于扩增甲型肝炎病毒和/或人细小病毒核酸的靶序列并且被构造用于检测甲型肝炎病毒和/或人细小病毒核酸或扩增的核酸的靶序列。在某些实施例和方面中，甲型肝炎病毒的靶序列内的特定区域和人细小病毒内的特定区域已经被鉴定为用于样本（包括源自受感染人的生物标本，例如血浆样本）的核酸扩增反应的优选靶标。靶向这些区域的扩增寡聚物或检测寡聚物可具有共同的核心序列，并且因此提供多个特别优选的扩增寡聚物或检测寡聚物。使用此类特别优选的扩增寡聚物所产生的扩增产物将含有可用于特异性检测来自样本的人细小病毒或HAV的靶特异性序列。扩增产物的检测可包括多种方法中的任一种，所述方法包括但不限于基于探针的检测、杂交保护测定法、基于分子炬、分子信标或分子开关的测定法、质谱分析、MALDI-TOF质谱分析、ESI-TOF质谱分析、实时检测测定法、凝胶电泳、SDS-PAGE电泳、桑格测序(Sangersequencing)、第二代测序(Next Generation Sequencing)等。靶序列的这些优选区域可提供关于特异性、灵敏度或检测速度以及高灵敏度检测的改善。使用这些扩增和/或检测寡聚物，所述方法包括扩增人细小病毒基因组或HAV基因组内的靶序列并检测扩增产物的步骤。检测寡聚物优选用于检测扩增产物。
一个实施例为用于检测样本中的人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的寡聚物组合，所述寡聚物组合包含：(I)用于扩增人细小病毒核酸靶区域的第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物，其中，(a)该第一细小病毒扩增寡聚物包含第一靶标杂交序列，该第一靶标杂交序列为SEQ ID NO:181的序列中所含的约14至约27个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:180的序列；并且(b)该第二细小病毒扩增寡聚物包含选自如下的第二靶标杂交序列：(i)为SEQ ID NO:189的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:188的序列的序列；和(ii)为SEQ IDNO:193的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:192的序列的序列；和/或(II)用于扩增HAV核酸靶区域的第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物，其中(a)该第一HAV扩增寡聚物包含第一靶标杂交序列，该第一靶标杂交序列为SEQ ID NO:174的序列中所含的约14至约27个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:173的序列；并且(b)该第二HAV扩增寡聚物包含第二靶标杂交序列，该第二靶标杂交序列具有SEQ ID NO:177的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:175的序列。
在一个方面，该寡聚物组合包含(I)的第一细小病毒扩增寡聚物和第二细小病毒扩增寡聚物。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:182的序列中并且至少包括SEQ ID NO:179的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:183或SEQ ID NO:117的序列。在一个方面，(I)(a)的第一靶标杂交序列具有选自SEQ ID NO:75-80的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:184的序列中。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:81-84。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:185的序列中并且至少包括SEQ ID NO:180的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:82-84。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:187的序列中并且至少包括SEQ ID NO:188的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:186的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:108-113。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:191的序列中。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:190的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列选自SEQID NO:118-121。在一个方面，该第二细小病毒扩增寡聚物为还包含位于靶标杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。在一个方面，该启动子序列为T7启动子序列。在一个方面，该T7启动子序列具有SEQ ID NO:196中示出的序列。在一个方面，该第二细小病毒扩增寡聚物具有选自SEQ ID NO:88-93和98-101的序列。
在一个方面，上述寡聚物组合还包含(III)用于扩增人细小病毒核酸靶区域的第三扩增寡聚物和第四扩增寡聚物，其中：(a)该第三细小病毒扩增寡聚物包含第三靶标杂交序列，该第三靶标杂交序列为SEQ ID NO:181的序列中所含的约14至约27个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:180的序列；并且(b)该第四细小病毒扩增寡聚物包含选自如下的第四靶标杂交序列：(i)为SEQ ID NO:189的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:188的序列的序列；和(ii)为SEQ IDNO:193的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:192的序列的序列；其中(III)(a)的第三靶标杂交序列不同于(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列；并且其中(III)(b)的第四靶标杂交序列不同于(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列。
在一个方面，第三细小病毒扩增寡聚物如上所述并且第一细小病毒扩增寡聚物是如下文所述：(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:182的序列中并且至少包括SEQ ID NO:179的序列；(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:183的序列；(I)(a)的第一靶标杂交序列具有选自SEQ ID NO:75-80的序列；(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:184的序列中；(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:81-84；(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:185的序列中并且至少包括SEQ ID NO:180的序列，或(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:82-84。
在一个方面，第四细小病毒扩增寡聚物如上所述并且第二扩增寡聚物是如下文所述：(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:187的序列中并且至少包括SEQID NO:188的序列；(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:186的序列；(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:108-113；(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:191的序列中；(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:190的序列；(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:118-121；第二细小病毒扩增寡聚物为还包含位于靶标杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者；第二细小病毒扩增寡聚物为还包含启动子序列（其为T7启动子序列）的启动子引物或启动子提供者；第二细小病毒扩增寡聚物为还包含T7启动子序列的启动子引物或启动子提供者并且该T7启动子序列具有SEQ ID NO:196中示出的序列；并且第二细小病毒扩增寡聚物具有选自SEQ ID NO:88-93和98-101的序列。
在一个实施例中，提供由任何本文所述的扩增寡聚物组成的寡聚物组合并且该寡聚物组合还包含至少一种细小病毒特异性捕集探针寡聚物，该细小病毒特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自SEQ ID NO:132-135。在一个方面，该细小病毒特异性捕集探针寡聚物具有选自SEQ ID NO:128-131的序列。
在一个实施例中，提供由任何本文所述的扩增寡聚物组成的寡聚物组合并且该寡聚物组合还包含置换体寡聚物(displacer oligomer)，该置换体寡聚物包含被构造用于与第一细小病毒扩增寡聚物或第二细小病毒扩增寡聚物上游的细小病毒靶核酸杂交的靶标杂交序列。在一个方面，该寡聚物组合还包含至少一种细小病毒特异性捕集探针寡聚物，该细小病毒特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自SEQ ID NO:132-135。在一个方面，该细小病毒特异性捕集探针寡聚物具有选自SEQ ID NO:128-131的序列。
在一个实施例中，提供由任何本文所述的扩增寡聚物组成的寡聚物组合并且该寡聚物组合还包含至少一种细小病毒特异性检测探针寡聚物，该细小病毒特异性检测探针寡聚物包含长度为约14至约40个核苷酸并且被构造用于与SEQ ID NO:199内所含的从大约核苷酸位置2921至大约核苷酸位置2966、或从大约核苷酸位置2921至大约核苷酸位置3067的靶序列特异性杂交的靶标杂交序列。在一个方面，该细小病毒特异性检测探针靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:194或195的序列中。在一个方面，该细小病毒特异性检测探针靶标杂交序列选自SEQ ID NO:137-169。在一个方面，该寡聚物组合还包含置换体寡聚物，该置换体寡聚物包含被构造用于与第一细小病毒扩增寡聚物或第二细小病毒扩增寡聚物上游的细小病毒靶核酸杂交的靶标杂交序列。在一个方面，该寡聚物组合还包含至少一种细小病毒特异性捕集探针寡聚物，该细小病毒特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自SEQ ID NO:132-135。在一个方面，该细小病毒特异性捕集探针寡聚物具有选自SEQ ID NO:128-131的序列。
在一个实施例中，寡聚物的组合为任何上述细小病毒寡聚物组合，其还包含(II)的第一HAV扩增寡聚物和第二HAV扩增寡聚物。在一个方面，(II)(a)的第一靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:172的序列中。在一个方面，(II)(a)的第一靶标杂交序列至少包括SEQ IDNO:170的序列。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:1-6和11。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:171的序列。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:1-6。在一个方面，(II)(b)的第二HAV靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:176的序列中。在一个方面，(II)(b)的第二HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:29-38和45。在一个方面，该第二HAV扩增寡聚物为还包含位于靶标杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。在一个方面，该启动子序列为T7启动子序列。在一个方面，该T7启动子序列具有SEQ ID NO:196中示出的序列。在一个方面，该第二HAV扩增寡聚物具有选自SEQ ID NO:12-21和28的序列。
在一个实施例中，寡聚物组合为任何上述细小病毒寡聚物组合和HAV寡聚物组合，其还包括(IV)用于扩增HAV核酸靶区域的第三扩增寡聚物和第四扩增寡聚物，其中(a)该第三HAV扩增寡聚物包含第三靶标杂交序列，该第三靶标杂交序列为SEQ ID NO:174的序列中所含的约14至约27个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:173的序列；和(b)该第四HAV扩增寡聚物包含第四靶标杂交序列，该第三靶标杂交序列为SEQ ID NO:177的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:175的序列；其中(IV)(a)的第三靶标杂交序列不同于(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列；并且其中(IV)(b)的第四靶标杂交序列不同于(II)(b)的第二HAV靶标杂交序列。在一个方面，该第三HAV扩增寡聚物为如权利要求30至34中的任一项中关于第一HAV扩增寡聚物所示的寡聚物。在一个方面，该第四HAV扩增寡聚物为如权利要求35至40中关于第二HAV扩增寡聚物所示的寡聚物。
在一个实施例中，提供一种由任何本文所述的扩增寡聚物组成的寡聚物组合并且该寡聚物组合还包含至少一种HAV特异性捕集探针寡聚物，该HAV特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自SEQ ID NO:52-57。在一个方面，该HAV特异性捕集探针寡聚物具有选自SEQ ID NO:46-51的序列。
在一个实施例中，提供一种由任何本文所述的扩增寡聚物组成的寡聚物组合并且该寡聚物组合还包含置换体寡聚物，该置换体寡聚物包含被构造用于与第一HAV扩增寡聚物或第二HAV扩增寡聚物上游的HAV靶核酸杂交的靶标杂交序列。在一个方面，该寡聚物组合还包含至少一种HAV特异性捕集探针寡聚物，该HAV特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自SEQ IDNO:52-57。在一个方面，该HAV特异性捕集探针寡聚物具有选自SEQ ID NO:46-51的序列。
在一个实施例中，提供一种由任何本文所述的扩增寡聚物组成的寡聚物组合并且该寡聚物组合还包含至少一种细小病毒特异性HAV特异性检测探针寡聚物，该细小病毒特异性HAV特异性检测探针寡聚物包含长度为约14至约40个核苷酸并且被构造用于与SEQ IDNO:198内所含的从大约核苷酸位置5965至大约核苷酸位置6028的靶序列特异性杂交的靶标杂交序列。在一个方面，该HAV特异性捕集探针寡聚物具有选自SEQ ID NO:46-51的序列。在一个方面，该HAV特异性检测探针靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:178的序列中。在一个方面，该HAV特异性检测探针靶标杂交序列选自SEQ ID NO:58-74。在一个方面，该寡聚物组合由任何本文所述的扩增寡聚物组成并且该寡聚物组合还包含置换体寡聚物，该置换体寡聚物包含被构造用于与第一HAV扩增寡聚物或第二HAV扩增寡聚物上游的HAV靶核酸杂交的靶标杂交序列。在一个方面，该寡聚物组合还包含至少一种HAV特异性捕集探针寡聚物，该HAV特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自SEQ ID NO:52-57。
一个实施例为包含任何本文所述的寡聚物组合的试剂盒。一个实施例为包含任何本文所述的寡聚物组合的反应混合物。一个实施例为使用至少一种本文所述的扩增寡聚物来扩增甲型肝炎病毒的单路扩增测定法。在一个方面，该甲型肝炎病毒单路扩增测定法是使用至少一种本文所述的检测探针寡聚物来扩增和检测甲型肝炎病毒。一个实施例为使用至少一种本文所述的扩增寡聚物来扩增细小病毒的单路扩增测定法。在一个方面，该细小病毒单路扩增测定法是使用至少一种本文所述的检测探针寡聚物来扩增和检测细小病毒。一个实施例为使用至少一种本文所述的扩增寡聚物来扩增甲型肝炎病毒和细小病毒的多路扩增测定法。在一个方面，该甲型肝炎病毒和细小病毒多路扩增测定法是使用至少一种本文所述的检测探针寡聚物来扩增和检测甲型肝炎病毒和细小病毒。
一个实施例为用于检测样本中的人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法，该方法包括：(A)提供样本，其中该样本疑似含有人细小病毒和HAV中的至少一者；(B)使所述样本与用于扩增人细小病毒核酸靶区域和HAV核酸靶区域中的至少一者的寡聚物组合接触，所述寡聚物组合包含：(I)对于该细小病毒酸靶区域，(a)第一细小病毒扩增寡聚物包含第一靶标杂交序列，该第一靶标杂交序列为SEQ ID NO:181的序列中所含的约14至约27个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:179或SEQ IDNO:180的序列；和(b)第二细小病毒扩增寡聚物包含选自如下的第二靶标杂交序列：(i)为SEQ ID NO:189的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:188的序列的序列；和(ii)为SEQ ID NO:193的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:192的序列的序列；和/或(II)对于该HAV靶区域，(a)第一HAV扩增寡聚物包含第一靶标杂交序列，该第一靶标杂交序列为SEQ ID NO:174的序列中所含的约14至约27个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:173的序列；和(b)第二HAV扩增寡聚物包含第二靶标杂交序列，该第二靶标杂交序列为SEQ ID NO:177的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:175的序列；(C)执行体外核酸扩增反应，其中所述样本中存在的任何细小病毒和/或HAV靶核酸被用作产生细小病毒和/或HAV扩增产物的模板；以及(D)检测该细小病毒和/或HAV扩增产物的存在或不存在，从而指示所述样本中细小病毒和/或HAV的存在或不存在。
在一个方面，该方法是用于检测人细小病毒靶核酸并且使样本与(I)的第一细小病毒扩增寡聚物和第二细小病毒扩增寡聚物接触。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:182的序列中并且至少包括SEQ ID NO:179的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:183的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列具有选自SEQ ID NO:75-80的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:184的序列中。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:75、76、77和81-84。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:185的序列中并且至少包括SEQID NO:180的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:82-84。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:187的序列中并且至少包括SEQ ID NO:188的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:186的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列选自SEQ IDNO:108-113。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:191的序列中。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:190的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:118-121。在一个方面，该第二细小病毒扩增寡聚物为还包含位于靶标杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。在一个方面，该启动子序列为T7启动子序列。在一个方面，该T7启动子序列具有SEQ IDNO:196中示出的序列。在一个方面，该第二细小病毒扩增寡聚物具有选自SEQID NO:88-93和98-101的序列。
在一个实施例中，步骤(B)还包括使该样本与(III)用于扩增人细小病毒核酸靶区域的第三扩增寡聚物和第四扩增寡聚物接触，其中(a)该第三细小病毒扩增寡聚物包含第三靶标杂交序列，该第三靶标杂交序列为SEQ ID NO:181的序列中所含的约14至约27个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:180的序列；并且(b)该第四细小病毒扩增寡聚物包含选自如下的第四靶标杂交序列：(i)为SEQ ID NO:189的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:188的序列的序列；和(ii)为SEQ ID NO:193的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:192的序列的序列；其中(III)(a)的第三靶标杂交序列不同于(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列；并且其中(III)(b)的第四靶标杂交序列不同于(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列。在一个方面，该第三细小病毒扩增寡聚物为SEQ ID NO:182的序列中所含的寡聚物并且至少包括SEQ ID NO:179的序列。在一个方面，(I)(a)的第三细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:183的序列。在一个方面，(I)(a)的第三细小病毒靶标杂交序列具有选自SEQ ID NO:75-80的序列。在一个方面，(I)(a)的第三细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:184的序列中。在一个方面，(I)(a)的第三细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:75-77和81-84。在一个方面，(I)(a)的第三细小病毒靶标杂交序列包含于SEQID NO:185的序列中并且至少包括SEQ ID NO:180的序列。在一个方面，(I)(a)的第三细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:82-84。在一个方面，该第四细小病毒扩增寡聚物包含于SEQ ID NO:187的序列中并且至少包括SEQ ID NO:188的序列。在一个方面，(I)(b)的第四细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:186的序列。在一个方面，(I)(b)的第四细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:108-113。在一个方面，(I)(b)的第四细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:191的序列中。在一个方面，(I)(b)的第四细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:190的序列。在一个方面，(I)(b)的第四细小病毒靶标杂交序列选自SEQ IDNO:118-121。在一个方面，该第四细小病毒扩增寡聚物为还包含位于靶标杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。在一个方面，该启动子序列为T7启动子序列。在一个方面，该T7启动子序列具有SEQ ID NO:196中示出的序列。在一个方面，该第四细小病毒扩增寡聚物具有选自SEQ IDNO:88-93和98-101的序列。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括在步骤(B)之前从该样本中的其他成分纯化细小病毒靶核酸。在一个方面，该纯化步骤包括使该样本与至少一种细小病毒特异性捕集探针寡聚物接触，该细小病毒特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自SEQ ID NO:132-135。在一个方面，该细小病毒特异性捕集探针寡聚物具有选自SEQ ID NO:128-131的序列。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，步骤(B)还包括使该样本与置换体寡聚物接触，该置换体寡聚物包含被构造用于与第一细小病毒扩增寡聚物或第二细小病毒扩增寡聚物上游的细小病毒靶核酸杂交的靶标杂交序列。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，检测步骤(D)包括使所述体外核酸扩增反应物与细小病毒特异性检测探针寡聚物接触，该细小病毒特异性检测探针寡聚物被构造用于在借此测定细小病毒扩增产物的存在或不存在的条件下与该细小病毒扩增产物特异性杂交，从而指示所述样本中细小病毒的存在或不存在。在一个方面，细小病毒特异性检测探针寡聚物包含长度为约14至约40个核苷酸并且被构造用于与SEQ ID NO:199内所含的从大约核苷酸位置2921至大约核苷酸位置2966、或从大约核苷酸位置2921至大约核苷酸位置3067的靶序列特异性杂交的靶标杂交序列。在一个方面，该细小病毒特异性检测探针靶标杂交序列包含于SEQ IDNO:194或195的序列中。在一个方面，该细小病毒特异性检测探针靶标杂交序列选自SEQ IDNO:137-169。在一个方面，细小病毒特异性检测探针包含选自如下的标记：(a)化学发光标记；(b)荧光标记；(c)淬灭剂；和(d)(a)、(b)和(c)中的一者或多者的组合。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括使该样本与可使用第一细小病毒扩增寡聚物和第二细小病毒扩增寡聚物在体外核酸扩增反应中扩增以产生第二扩增产物的假靶标寡聚物接触，该第二扩增产物在检测反应条件下不与细小病毒特异性检测探针特异性杂交。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括使该样本与冷探针寡聚物接触，该冷探针寡聚物与细小病毒特异性检测探针寡聚物竞争杂交至细小病毒扩增产物。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括使该样本与调谐体寡聚物(tuner oligomer)接触，该调谐体寡聚物被构造用于与第一细小病毒扩增寡聚物和第二细小病毒扩增寡聚物二者特异性杂交。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，检测步骤(D)发生在扩增步骤(C)期间。在一个方面，细小病毒特异性检测探针包括荧光标记、淬灭剂或这二者。在一个方面，细小病毒特异性检测探针为TaqMan检测探针或分子信标。在一个方面，细小病毒特异性检测探针包含选自如下的标记：(a)化学发光标记；(b)荧光标记；(c)淬灭剂；和(d)(a)、(b)和(c)中的一者或多者的组合。在一个方面，细小病毒特异性检测探针还包含非靶标杂交序列。在一个方面，细小病毒特异性检测探针为发夹检测探针。在一个方面，该发夹检测探针为分子信标或分子炬。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，步骤(C)的扩增反应为等温扩增反应。在一个方面，该扩增反应为实时扩增反应。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，步骤(C)的扩增反应为PCR扩增反应。在一个方面，该扩增反应为实时扩增反应。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，其中该方法是用于检测HAV靶核酸，使该样本与(II)的第一HAV扩增寡聚物和第二HAV扩增寡聚物接触。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:172的序列中。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列至少包括SEQ IDNO:170的序列。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:1-6和11。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:171的序列。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:1-6。在一个方面，(II)(b)的第二HAV靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:176的序列中。在一个方面，(II)(b)的第二HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:29-38和45。在一个方面，该第二HAV扩增寡聚物为还包含位于靶标杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。在一个方面，该启动子序列为T7启动子序列。在一个方面，该T7启动子序列具有SEQ ID NO:196中示出的序列。在一个方面，该第二HAV扩增寡聚物具有选自SEQ ID NO:12-21和28的序列。
在一个实施例中，步骤(B)还包括使样本与(IV)用于扩增HAV核酸靶区域的第三扩增寡聚物和第四扩增寡聚物接触，其中(a)该第三HAV扩增寡聚物包含第三靶标杂交序列，该第三靶标杂交序列为SEQ ID NO:174的序列中所含的约14至约27个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:173的序列；并且(b)该第四HAV扩增寡聚物包含第四靶标杂交序列，该第四靶标杂交序列为SEQ ID NO:177的序列中所含的约14至约30个连续核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:175的序列；其中(IV)(a)的第三靶标杂交序列不同于(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列；并且其中(IV)(b)的第四靶标杂交序列不同于(II)(b)的第二HAV靶标杂交序列。在一个方面，该第三HAV扩增寡聚物为如权利要求96至100中的任一项中关于第一HAV扩增寡聚物所述的寡聚物。在一个方面，该第四HAV扩增寡聚物为如权利要求101至106中关于第二HAV扩增寡聚物所述的寡聚物。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括在步骤(B)之前从该样本中的其他成分纯化HAV靶核酸。在一个方面，该纯化步骤包括使该样本与至少一种HAV特异性捕集探针寡聚物接触，该HAV特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自SEQ ID NO:52-57。在一个方面，该HAV特异性捕集探针寡聚物具有选自SEQ ID NO:46-51的序列。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括在扩增步骤使用置换体寡聚物，该置换体寡聚物包含被构造用于与第一HAV扩增寡聚物或第二HAV扩增寡聚物上游的HAV靶核酸杂交的靶标杂交序列。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，检测步骤(D)包括使所述体外核酸扩增反应物与HAV特异性检测探针寡聚物接触，该HAV特异性检测探针寡聚物被构造用于在借此测定HAV扩增产物的存在或不存在的条件下与该HAV扩增产物特异性杂交，从而指示所述样本中HAV的存在或不存在。在一个方面，HAV特异性检测探针寡聚物包含长度为约14至约40个核苷酸并且被构造用于与SEQ ID NO:198内所含的从大约核苷酸位置5965至大约核苷酸位置6028的靶序列特异性杂交的靶标杂交序列。在一个方面，HAV特异性检测探针靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:178的序列中。在一个方面，该HAV特异性检测探针靶标杂交序列选自SEQ ID NO:58-74。在一个方面，HAV特异性检测探针包含选自如下的标记：(a)化学发光标记；(b)荧光标记；(c)淬灭剂；和(d)(a)、(b)和(c)中的一者或多者的组合。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括使该样本与可使用第一HAV扩增寡聚物和第二HAV扩增寡聚物在体外核酸扩增反应中扩增以产生第二扩增产物的假靶标寡聚物接触，该第二扩增产物在检测反应条件下不与HAV特异性检测探针特异性杂交。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括使该样本与冷探针寡聚物接触，该冷探针寡聚物与HAV特异性检测探针寡聚物竞争杂交至HAV扩增产物。
在一个实施例中，用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法还包括该样本与调谐体寡聚物接触，该调谐体寡聚物被构造用于与第一HAV扩增寡聚物和第二HAV扩增寡聚物特异性杂交。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，检测步骤(D)发生在扩增步骤(C)期间。在一个方面，HAV特异性检测探针包括荧光标记、淬灭剂或这二者。在一个方面，HAV特异性检测探针为TaqMan检测探针或分子信标。在一个方面，HAV特异性检测探针包含选自如下的标记：(a)化学发光标记；(b)荧光标记；(c)淬灭剂；和(d)(a)、(b)和(c)中的一者或多者的组合。在一个方面，HAV特异性检测探针还包含非靶标杂交序列。在一个方面，HAV特异性检测探针为发夹检测探针。在一个方面，该发夹检测探针为分子信标或分子炬。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，步骤(C)的扩增反应为等温扩增反应。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，步骤(C)的扩增反应为PCR扩增反应。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，该扩增反应为实时扩增反应。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，样本来自个体患者。在一个方面，样本是被汇集的。在一个方面，该汇集样本为汇集的血浆样本。在一个方面，样本为用于衍生治疗性化合物的血浆样本。在一个方面，样本为用于衍生化合物的血浆样本，该化合物为人凝血酶、人抗体或其部分、人蛋白、人细胞因子受体、人细胞因子配体或其他衍生自血浆的化合物。
在用于检测样本中人细小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一个实施例中，其中该方法是用于检测人细小病毒靶核酸和HAV靶核酸，并且其中检测步骤(D)包括使所述体外核酸扩增反应物与细小病毒特异性检测探针寡聚物和HAV特异性检测探针寡聚物接触，该细小病毒特异性检测探针寡聚物和HAV特异性检测探针寡聚物被构造用于在借此测定细小病毒扩增产物和HAV扩增产物的存在或不存在的条件下分别与该细小病毒扩增产物和该HAV扩增特异性杂交，从而指示所述样本中细小病毒和HAV的存在或不存在。在一个方面，细小病毒特异性检测探针寡聚物和HAV特异性检测探针寡聚物被区别标记。在其中细小病毒特异性检测探针寡聚物和HAV特异性检测探针寡聚物各包含标记的一个方面，所述标记独立地选自(a)化学发光标记和(b)荧光标记。在一个方面，细小病毒特异性检测探针寡聚物和HAV特异性检测探针寡聚物各包含化学发光标记。在一个方面，用于细小病毒特异性检测探针寡聚物和HAV特异性检测探针寡聚物的化学发光标记的特征为不同的发光动力学，其足以区分细小病毒特异性化学发光信号与HAV特异性化学发光信号。在一个方面，用于细小病毒特异性检测探针寡聚物和HAV特异性检测探针寡聚物的化学发光标记各包含吖啶酯(AE)。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQID NO:182的序列中并且至少包括SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:179的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:183的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列具有选自SEQ ID NO:75-80的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:184的序列中。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:81-84。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:185的序列中并且至少包括SEQ ID NO:180的序列。在一个方面，(I)(a)的第一细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:82-84。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:187的序列中并且至少包括SEQ ID NO:188的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:186的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:108-113。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:191的序列中。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:190的序列。在一个方面，(I)(b)的第二细小病毒靶标杂交序列选自SEQ ID NO:118-121。在一个方面，该第二细小病毒扩增寡聚物为还包含位于靶标杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。在一个方面，该启动子序列为T7启动子序列。在一个方面，该T7启动子序列具有SEQ ID NO:196中示出的序列。在一个方面，该第二细小病毒扩增寡聚物具有选自SEQ ID NO:88-93和98-101的序列。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:172的序列中。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:170的序列。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:1-6和11。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列至少包括SEQ ID NO:171的序列。在一个方面，(II)(a)的第一HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:1-6。在一个方面，(II)(b)的第二HAV靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:176的序列中。在一个方面，(II)(b)的第二HAV靶标杂交序列选自SEQ ID NO:29-38和45。在一个方面，该第二HAV扩增寡聚物为还包含位于靶标杂交序列的5'的启动子序列的启动子引物或启动子提供者。在一个方面，该启动子序列为T7启动子序列。在一个方面，该T7启动子序列具有SEQ ID NO:196中示出的序列。在一个方面，该第二HAV扩增寡聚物具有选自SEQ IDNO:12-21和28的序列。在一个方面，细小病毒特异性检测探针寡聚物包含长度为约14至约40个核苷酸并且被构造用于与SEQ ID NO:199内所含的从大约核苷酸位置2921至大约核苷酸位置2966、或从大约核苷酸位置2921至大约核苷酸位置3067的靶序列特异性杂交的靶标杂交序列。在一个方面，该细小病毒特异性检测探针靶标杂交序列包含于SEQ ID NO:194或195的序列中。在一个方面，该细小病毒特异性检测探针靶标杂交序列选自SEQ ID NO:137-169。在一个方面，HAV特异性检测探针寡聚物包含长度为约14至约40个核苷酸并且被构造用于与SEQ ID NO:198内所含的从大约核苷酸位置5965至大约核苷酸位置6028的靶序列特异性杂交的靶标杂交序列。在一个方面，HAV特异性检测探针靶标杂交序列包含于SEQ IDNO:178的序列中。在一个方面，该HAV特异性检测探针靶标杂交序列选自SEQ ID NO:58-74。
在一个实施例中，提供用于从样本中多路扩增和检测人细小病毒基因型1、2和3靶核酸以及甲型肝炎病毒靶核酸的方法。在该实施例的一个方面，用于扩增和检测人细小病毒基因型1、2和3的扩增寡聚物包括一种或多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，两种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，三种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，四种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，五种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，六种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，七种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在该实施例的一个方面，用于扩增和检测HAV的扩增寡聚物包括一种或多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，两种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，三种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，四种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，五种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，六种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在另一方面，七种或更多种于表3中所述的扩增寡聚物。在该实施例的一个方面，用于检测由人细小病毒基因型1、2和3产生的扩增产物和用于检测由HAV产生的扩增产物的检测探针寡聚物包括一种或多种于表3中所述的细小病毒检测探针和一种或多种于表3中所述的HAV检测探针。在另一方面，在用于实时检测的扩增期间存在检测探针寡聚物。在另一方面，在用于终点检测的扩增反应之后将检测探针寡聚物与扩增产物组合。在该实施例的一个方面，人细小病毒基因型1、2和3靶核酸、HAV靶核酸的多路扩增和检测为定量多路扩增和检测反应。在该实施例的一个方面，将人细小病毒基因型1、2和3靶核酸与其他样本组分分离。在另一方面，该分离是使用靶标捕集寡聚物执行的。在该实施例的一个方面，将HAV靶核酸与其他样本组分分离。在另一方面，该分离是使用靶标捕集寡聚物执行的。在该实施例的一个方面，扩增和检测反应包括内部对照。
具体实施方式
本申请公开了被构造用作用于通过体外核酸扩增测定法检测生物样本中存在的甲型肝炎病毒和/或细小病毒类型1、2和3的核酸序列的扩增寡聚物和检测探针寡聚物的寡核苷酸序列。该方法的一个实施例使用转录介导的核酸扩增（如先前在Kacian等人的美国专利No.5,399,491和No.5,554,516中所详细公开的）。用于检测扩增核酸的方法使用与扩增序列的一部分特异性杂交的序列特异性探针。在一个方面，该方法使用任何已知的均相检测步骤来检测混合物中结合至扩增核酸的标记探针（例如，如由Arnold等人，Clin.Chem.（《临床化学》）35:1588-1594(1989)；颁给Nelson等人的美国专利No.5,658,737以及颁给Lizardi等人的美国专利No.5,118,801和No.5,312,728所公开的）。本申请还公开了可通过使用核酸杂交技术用于捕集甲型肝炎病毒靶标DNA或细小病毒类型1、2和3的靶标DNA的寡核苷酸序列。捕集步骤的一个实施例使用磁性粒子来分离所捕集的靶标（参见颁给Weisburg等人的美国专利No.6,110,678）。
应注意，术语“一个/种”实体是指一个/种或多个/种所述实体；例如，“一种核酸”应理解为表示一种或多种核酸。因而，术语“一个/种”、“一个/种或多个/种”以及“至少一个/种”在本文可互换使用。
“样本”或“生物样本”意指源自可能含有细小病毒核酸和/或甲型肝炎病毒核酸的活人或死人的任何材料，包括例如痰液、外周血、血浆、血清、包括淋巴结、呼吸组织或分泌物在内的活检组织、或其他体液、组织或材料。样本可被处理以通过物理、化学和/或机械方式破坏组织或细胞结构，从而释放细胞内组分。样本制备可使用含有被用于制备供分析用的样本的缓冲剂、盐、酶、洗涤剂等的溶液。样本可从两个或更多个来源汇集（例如，从两个或更多个供体汇集的血浆样本）。样本可能经过分级分离（例如，样本如汇集样本的级分）。样本可为制造商的用于从中分离组分的血浆池。
“核酸”是指包含两种或更多种共价键合的由糖部分和含氮杂环碱基或碱基类似物构成的核苷或核苷类似物的多聚化合物。核苷通过磷酸二酯键或其他键联连接在一起以形成RNA、DNA、或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸，以及其类似物。核酸“主链”可由多种键联构成，（参见例如国际专利申请公开No.WO95/32305）。核酸中的一个或多个残基的糖部分可为核糖或脱氧核糖，或具有已知取代例如2'-甲氧基取代和2'-卤基取代（例如，2'-F）的类似化合物。核酸中的一个或多个残基的含氮碱基可为常规碱基（A、G、C、T、U）、其类似物（参见例如The Biochemistry of the Nucleic Acids（《核酸的生物化学》）5-36,Adams等人编，第11版，1992；Abraham等人，2007，BioTechniques（《生物技术》）43:617-24），其包括嘌呤或嘧啶碱基的衍生物（参见例如美国专利No.5,378,825、No.6,949,367以及国际专利申请公开No.WO93/13121），或“无碱基”，其中核苷单元缺乏含氮碱基（参见例如美国专利No.5,585,481）。核酸可包括一个或多个“锁定核酸”(LNA)残基（Vester等人，Biochemistry（《生物化学》）43:13233-41,2004）。核酸可包括3'端二脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸添加至该核酸中。用于体外制备核酸的合成方法在本领域中是众所周知的，但可使用常规技术从天然来源纯化核酸。寡聚物的主链可影响杂交复合体（例如，捕集寡聚物与其靶核酸之间形成的）的稳定性。此类实施例包括肽键、2'-O-甲氧基键联以及糖-磷酸二酯型键联。肽核酸有利于与RNA形成杂交复合体。具有2'-甲氧基取代的RNA基团或2'-氟取代的RNA的寡聚物可具有相对于标准DNA或RNA增强的杂交复合体稳定性并且优选与互补2'-OH RNA形成杂交复合体。接合两个糖基的键联可通过影响总电荷或电荷密度、或通过影响空间相互作用来影响杂交复合体稳定性（例如，大体积的键联可降低杂交复合体稳定性）。优选的键联包括具有中性基团（例如，甲基膦酸酯基）或带电荷基团（例如，硫代膦酸酯基）以影响复合体稳定性的那些。
如本文所用的术语“多核苷酸”表示核酸链。在本申请通篇中，核酸是以5'端至3'端指示。
如本文所用的“核苷酸”为由磷酸酯基、5-碳糖以及含氮碱基组成的核酸的亚单元。RNA中存在的5-碳糖为核糖。在DNA中，5-碳糖为2'-脱氧核糖。该术语还包括此类亚单元的类似物，例如在核糖的2'位置的甲氧基(2'-O-Me)。如本文所用，含有“T”残基的甲氧基寡核苷酸在核糖部分的2'位置具有甲氧基，并且在核苷酸的碱基位置具有尿嘧啶。
如本文所用的“非核苷酸单元”为未显著地参与聚合物的杂交的单元。此类单元不应例如参与与核苷酸的任何显著氢键键合，并且将排除具有五种核苷酸碱基或它们的类似物中的一种作为组分的单元。
可互换的术语“寡聚物”、“寡聚体”以及“寡核苷酸”是指具有从1,000nt到少至5nt的连续核苷酸残基(nt)长度的多核苷酸。应理解，从1000到少至5的范围为包涵性范围，因此1000nt、5nt以及其间每一整数个nt都包括在该范围内。寡核苷酸可从天然存在的来源纯化或可使用多种众所周知的酶促或化学方法中的任一者合成。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能；而是，其一般用于涵盖本文所述的所有此类试剂。
所谓“扩增寡核苷酸”或“扩增寡聚物”意指至少其3'端与靶核酸互补并且与靶核酸或其互补序列杂交并参与核酸扩增的寡核苷酸。扩增寡聚物的例子包括引物和启动子引物。扩增寡核苷酸优选含有至少10个连续碱基，并且更优选至少约12个连续碱基但少于约70个碱基，其在标准杂交条件下与靶核酸序列的区域特异性杂交。与靶序列杂交的连续碱基与扩增寡核苷酸所杂交的序列至少约80%、优选至少约90%并且更优选约100%互补。至少约X%是指从X%到100%的所有整数和分数的全部范围。扩增寡核苷酸任选可包括被修饰的核苷酸。
扩增寡聚物可被称为“引物”或“启动子引物”。“引物”是指与模板核酸杂交并具有可在已知聚合反应中延伸的3'端的寡核苷酸。该引物的5'区域可与靶核酸是非互补的，例如，5'非互补区域可包括启动子序列并且该寡聚物被称为“启动子引物”或其可包括标签序列，或其可包括接头序列(adapter sequence)。如本文所用，“启动子”为被DNA依赖性RNA聚合酶（“转录酶”）识别为结合至核酸并在特定位点开始RNA转录的信号的特定核酸序列。此外，启动子引物可包含封端的3'端以防止它们被用作引物，并且在这些情况下，扩增寡聚物被称为启动子提供者。在一些实施例中，封端部分替代寡聚物的3'OH以防止寡聚物在扩增反应中进行酶介导的延伸。在可选择的实施例中，封端部分可能在3'端的五种残基内并且足够大以限制聚合酶与寡聚物的结合。在其他实施例中，封端部分共价连接至寡聚物的3'端。可使用许多不同的化学基团对寡聚物的3'端进行封端，包括但不限于烷基、非核苷酸接头、烷烃-二醇二脱氧核苷酸残基以及虫草素(cordycepin)。本领域技术人员应进一步了解，可充当引物的任何寡聚物（即，与靶序列特异性杂交并具有可利用聚合酶延伸的3'端的扩增寡核苷酸）可被修饰以包括5'启动子序列，并且因此充当启动子引物。类似地，任何启动子引物可通过去除启动子序列或在无启动子序列下合成来修饰并充当引物。
本文所用的“靶核酸”为包含待扩增的“靶序列”的核酸。靶核酸可为如本文所述的DNA或RNA，并且可为单链或双链。除靶序列之外，靶核酸还可包括其他序列，其可能未被扩增。靶核酸包括基因组核酸、基因产物（例如，mRNA）以及其扩增产物。本文的靶核酸为人细小病毒核酸和HAV核酸。
“分离的”意指含有靶核酸的样本是从其天然环境中提取的，但该术语并不意味着任何程度的纯化。
本文所用的术语“靶序列”是指待扩增和/或检测的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包括在扩增过程期间与寡核苷酸（例如，引导性寡核苷酸和/或启动子寡核苷酸）复合的复合序列。当靶核酸最初为单链时，术语“靶序列”还将指与靶核酸中存在的“靶序列”互补的序列。当靶核酸最初为双链时，术语“靶序列”是指有义(+)和反义(-)链。
“靶标结合序列”在本文用于指被构造用于与靶核酸序列杂交的寡聚物的部分。优选地，靶标结合序列被构造用于与靶核酸序列特异性杂交。靶标结合序列可与它们被构造用于进行杂交的靶序列的部分100%互补；但未必如此。靶标结合序列还可以包括相对于靶序列插入、缺失和/或取代的核苷酸残基。可能出现靶标结合序列与靶序列的互补性小于100%，例如，当靶核酸为一个物种内的多个菌株时，例如被构造用于与人细小病毒的不同菌株和基因型杂交的寡聚物将出现这种情形。应理解，构造靶标结合序列以与靶核酸具有小于100%互补性存在其他原因。
本文关于人细小病毒核酸的区域所用的术语“靶向一个序列”是指借此使寡核苷酸与靶序列以允许如本文所述的扩增和检测的方式杂交的过程。在一个实施例中，寡核苷酸与所靶向的人细小病毒核酸序列互补并且不含错配。在另一个实施例中，寡核苷酸与所靶向的人细小病毒核酸序列互补但含有1个、或2个、或3个、或4个、或5个错配。优选地，与人细小病毒核酸序列杂交的寡核苷酸包括至少10个至多达50个与靶序列互补的核苷酸。应理解，至少10个并且多达50个为包涵性范围，因此10、50以及其间每一个整数都被公开。优选地，寡聚物与靶序列特异性杂交。本文所用的术语“被构造用于靶向一个序列”意指扩增寡核苷酸的靶标杂交区域被设计成具有可与所提及的人细小病毒区域或所提及的HAV区域特异性杂交的多核苷酸序列。此种扩增寡核苷酸不限于只靶向所述序列，而是可用作试剂盒或方法中的组合物，用于靶向如本文所述的人细小病毒靶核酸（包括基因型1、2和/或3）或HAV靶核酸。术语“被构造为”表示扩增寡核苷酸靶标杂交序列的多核苷酸序列构造的实际布置。
本文所用的术语“区域”是指核酸的一部分，其中所述部分小于完整核酸。例如，当所提到的核酸为寡核苷酸启动子引物时，术语“区域”可用于指完整寡核苷酸的较小启动子部分。类似地，并且也只作为例子，当核酸为人细小病毒基因组时，术语“区域”可用于指核酸的较小区域，其中该较小区域被一种或多种本发明的寡核苷酸靶向。寡核苷酸的靶标结合序列可与区域的全部或一部分杂交。与区域的一部分杂交的靶标结合序列为在所提及的区域内杂交的靶标结合序列。作为术语“区域”的使用的另一个非限制性例子，当所提到的核酸为扩增子时，术语“区域”可用于指鉴定用于通过探针的靶标结合序列杂交的较小核苷酸序列。
“扩增”是指用于获得靶核酸序列或其互补序列或其片段的多个拷贝的任何已知程序，并且优选的实施例通过使用序列特异性方法来特异性扩增靶标。已知的扩增方法包括例如转录介导的扩增、复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(PCR)扩增（包括RT-PCR）、连接酶链反应(LCR)扩增以及链置换扩增(SDA)。复制酶介导的扩增使用自我复制RNA分子，以及复制酶如QB-复制酶（例如，参见Kramer等人的美国专利No.4,786,600和PCT No.WO90/14439）。PCR扩增为众所周知的并且使用DNA聚合酶、序列特异性引物以及热循环来合成多个拷贝的两个互补链的DNA或cDNA（例如，颁给Mullis等人的美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.4,800,159，以及Methods in Enzymology（《酶学方法》），1987，第155卷：335-350）。LCR扩增使用至少四个单独的寡核苷酸通过使用多个循环的杂交、连接以及变性来扩增靶标及其互补链（欧洲专利No.0320308）。通过使用含有限制性内切酶（其切断包括靶序列的半修饰DNA双链的一条链）的识别位点的引物，接着在一系列引物延伸和链置换步骤中扩增来进行SDA扩增（颁给Walker等人的美国专利No.5,422,252）。如下文所说明，优选的实施例使用转录相关的扩增。本领域技术人员应显而易见，本发明的方法步骤和扩增寡核苷酸可容易适合于多种基于利用聚合酶活性的引物延伸的核酸扩增程序。
靶序列的“片段”或“部分”的扩增是指包含小于完整靶区域核酸序列的扩增核酸的产生。此类片段可通过例如使用与靶序列杂交并从靶序列中的内部位置起始聚合的扩增寡核苷酸来扩增靶序列的一部分而产生。
所谓“转录介导的扩增”(TMA)或“转录相关的扩增”意指使用RNA聚合酶从核酸模板产生多个RNA转录物的核酸扩增。转录相关的扩增一般使用RNA聚合酶和DNA聚合酶活性、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸以及启动子引物，并且任选可包括一个或多个其他扩增寡核苷酸，包括“辅助”寡聚物。转录相关的扩增的变化在本领域中是众所周知的并且在他处详细地描述（参见颁给Kacian等人的美国专利No.5,399,491和No.5,554,516、颁给Burg等人的美国专利No.5,437,990、颁给Malek等人的美国专利No.5,130,238、颁给Urdea等人的美国专利No.4,868,105和No.5,124,246、Kacian等人的PCT No.WO93/22461、Gingeras等人的PCT No.WO88/01302和WO88/10315、McDonough等人的PCT No.WO94/03472以及Ryder等人的PCT No.WO95/03430）。美国专利No.5,399,491和No.5,554,516的程序是优选的扩增实施例。如本文所用，术语“实时TMA”是指通过实时检测手段监测的靶核酸的单引物转录介导的扩增（“TMA”）。
所谓“探针”、“检测探针”或“检测探针寡聚物”其意指在允许杂交的条件下与核酸中、优选扩增核酸中的靶序列特异性杂交，从而允许检测该靶标或该扩增核酸的核酸寡聚物。检测可为直接的（即，由直接与序列杂交的探针产生）或间接的（即，由与连接探针与靶标的中间分子结构杂交的探针产生）。探针的“靶标”一般是指通过标准氢键键合（即，碱基配对）与探针寡聚物的至少一部分特异性杂交的扩增核酸序列内的序列或其子集。探针可包含靶特异性序列和有助于探针的三维构象的其他序列（例如，颁给Lizardi等人的美国专利No.5,118,801和No.5,312,728以及颁给Becker等人的美国专利No.6,361,945B1）。探针可为DNA、RNA、其类似物或它们的组合并且它们可能被标记或未被标记。如果探针序列和它们的靶序列被构造为允许探针寡聚物和不与探针的靶特异性序列完全互补的靶序列在适当的杂交条件下稳定杂交的话，则所述探针序列和它们的靶序列充分互补。
“冷探针”是指相比于检测探针寡聚物具有实质上类似或相同的寡核苷酸序列的寡核苷酸。冷探针与检测探针之间的主要差异在于冷探针缺乏可检测标记，而检测探针寡聚物具有可检测标记。冷探针寡聚物被用于在检测反应中与检测探针寡聚物竞争，从而降低在检测步骤中接收到的总体信号。检测信号经常因多路扩增和检测测定法的一个靶标而降低，其中一个或多个、但非全部的靶核酸相比于多路测定法中的一个或多个其他成员具有稳健的扩增动力学。将冷探针用于在较强扩增上与检测探针竞争，因此在某种意义上使稳健的扩增“失调”。因而使失调的扩增进入与多路测定法中较弱的扩增种类更相当的范围内。类似地，假靶标为应用于多路扩增反应以使较强扩增种类失调从而使其反应动力学更类似于较弱扩增种类的反应动力学的核酸。假靶标为通常含有较强扩增种类的引物的结合位点，但其间几乎没有另外的序列的核酸。因而使引物从产生较强扩增种类的扩增产物分流。
所谓“互补的”意指两个单链核酸的相似区域的核苷酸序列或同一单链核酸的不同区域具有允许单链区域在严格的杂交或扩增条件下在稳定的双链氢键键合的区域中杂交在一起的核苷酸碱基组成。彼此杂交的序列可通过标准的核酸碱基配对（例如G:C、A:T或A:U配对）与预期靶序列完全互补或部分互补。所谓“充分互补”意指能够通过一系列互补碱基之间的氢键键合与另一个序列杂交的连续序列，其可通过标准的碱基配对在序列中的每一位置互补或可含有一个或多个非互补残基，包括无碱基残基。充分互补的连续序列通常与寡聚物预期特异性杂交的序列至少80%、或至少90%互补（包括至多100%的所有整数和有理数并包括100%）。“充分互补”的序列允许核酸寡聚物与它的靶序列在适当的杂交条件下稳定的杂交，即使这些序列并不完全互补。当一个单链区域的核苷酸的连续序列能够与另一个单链区域的核苷酸的类似序列形成一系列“典型的”氢键键合的碱基对，使得A与U或T配对并且C与G配对时，所述核苷酸序列为“完全”互补的，（例如，Sambrook等人，MolecularCloning,ALaboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》），第2版（纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),1989)的§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51以及11.47-11.57，特别是§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47以及11.55-11.57）。
所谓“优先杂交”或“特异性杂交”意指在严格的杂交测定法条件下，探针与它们的靶序列或其复制物杂交，以形成稳定的探针：靶标杂交体，而同时稳定的探针：非靶标杂交体的形成降至最少。因此，探针与靶序列或其复制物杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度充分更大，以使得本领域的普通技术人员能够精确地检测在扩增期间形成的靶序列的RNA复制物或互补DNA(cDNA)。适当的杂交条件在本领域中是众所周知的，可根据序列组成进行预测，或可以通过使用常规测试方法来确定（例如，Sambrook等人，MolecularCloning,A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》），第2版(纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),1989)的§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51以及11.47-11.57，特别是§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47以及11.55-11.57）。
所谓“捕集寡核苷酸”或“捕集寡聚物”或“捕集探针”意指与待捕集的靶核酸特异性杂交并提供一种用于从其他样本组分分离和/或浓缩该靶标的手段的核酸寡聚物。捕集寡聚物的实施例包括两个结合区域：靶标结合区域和固定化探针结合区域，由此该捕集寡聚物可形成杂交复合体，其中捕集寡聚物的靶标结合区域结合于靶序列并且固定化探针结合区域结合于固定在固体载体上的寡聚物（参见Weisburg等人的美国专利No.6,110,678和6,280,952）。尽管靶标结合区域和固定化探针结合区域通常在同一捕集寡聚物上，但这两个功能性区域可存在于通过一个或多个接头接合在一起的两种不同寡聚物上。例如，固定化探针结合区域可存在于第一寡聚物上，靶标结合区域可存在于第二寡聚物上，并且这两种寡聚物与作为与该第一寡聚物和该第二寡聚物的序列特异性杂交的接头的第三寡聚物通过氢键键合而接合。捕集探针的靶标结合区域还可被称为捕集探针的靶标特异性部分并且固定化探针结合区域可被称为尾部分。尾部分的实施例包括均聚物（例如，聚dT或聚dA）或非均聚物（例如，T0-3A15-30），优选连接至寡聚物的靶标特异性部分的3'端。
所谓“固定化探针”或“固定化寡聚物”意指将捕集寡聚物直接或间接接合至固定化载体的核酸寡聚物。接合至固体载体的固定化探针有助于样本中被结合的靶序列与未结合的物质分离。可使用任何已知的固体载体，例如于溶液中的基质和粒子，例如，硝酸纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯以及金属粒子，优选磁性吸引粒子。优选的载体为单分散顺磁球体（例如，均一尺寸±5%），以提供一致的结果，固定化探针直接地（例如，通过直接共价键联、螯合或离子相互作用）或间接地（例如，通过一个或多个接头）接合至所述载体，其中该键联或相互作用在核酸杂交条件期间是稳定的。
“样本制备”是指对于样本中存在的人细小病毒核酸的后续扩增和/或检测而处理样本的任何步骤或方法。样本可为多种组分的复杂混合物，其中靶核酸为少数组分。样本制备可包括从较大样本体积浓缩成分（例如微生物或核酸）的任何已知方法，例如通过从较大体积样本过滤气载或水载的粒子或通过使用标准的微生物学方法从样本分离微生物。样本制备可包括对细胞组分的物理破坏和/或化学溶解以使细胞内组分释放进实质上的水相或有机相中并移除碎片，例如通过使用过滤、离心或吸附。样本制备可包括使用选择性或非特异性捕集靶核酸并将其与其他样本成分分离的核酸寡核苷酸（例如，如美国专利6,110,678和PCT公开No.WO2008/016988中所述）。
所谓“分离”或“纯化”意指将生物样本的一种或多种组分从样本的至少一种其他组分中移出。样本组分一般包括核酸、盐、蛋白质、碳水化合物以及脂质的水溶液。分离或纯化核酸的步骤可除去样本中至少约70%、优选至少约90%并且更优选至少约95%的其他组分。
所谓“标记”意指可以被检测或可以产生可检测信号的分子部分或化合物。标记被直接或间接接合至核酸探针。直接标记利用将标记连接至探针的键或相互作用，包括共价键或非共价相互作用，例如氢键、疏水和离子相互作用，或通过形成螯合物或配位络合物。间接标记利用桥联部分或“接头”（例如，寡核苷酸或抗体），来连接标记与探针。可使用接头来扩增可检测信号。标记为任何已知的可检测部分，例如，放射性核素、配体（例如，生物素、抗生物素蛋白）、酶或酶底物、反应性基团或发色团，例如染料或可检测粒子（例如，乳胶小珠或金属粒子）、发光化合物（例如，生物发光、磷光或化学发光标记）以及荧光化合物。优选地，标记探针上的标记是在均相反应中可检测的（即，在混合物中，结合的标记探针与未结合的标记探针相比展现可检测的变化，例如稳定性或差示降解）。用于均相测定法中的标记的一个实施例为化学发光化合物（例如，详细描述于颁给Woodhead等人的美国专利No.5,656,207、颁给Nelson等人的美国专利No.5,658,737以及颁给Arnold,Jr.,等人的美国专利No.5,639,604中）。优选的化学发光标记为吖啶酯(AE)化合物，例如标准的AE或其衍生物（如萘基-AE、邻位-AE、1-或3-甲基-AE、2,7-二甲基-AE、4,5-二甲基-AE、邻位-二溴-AE、邻位-二甲基-AE、间位-二甲基-AE、邻位-甲氧基-AE、邻位-甲氧基(桂皮酰基)-AE、邻位-甲基-AE、邻位-氟-AE、1-或3-甲基-邻位-氟-AE、1-或3-甲基-间位-二氟-AE和2-甲基-AE）。将标记连接至核酸以及检测标记的合成和方法在本领域中是众所周知的（例如，Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》），第2版（纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHabor,NY),1989），第10章；颁给Kourilsky等人的美国专利No.4,581,333、颁给Nelson等人的美国专利No.5,658,737、颁给Woodhead等人的美国专利No.5,656,207、颁给Hogan等人的美国专利No.5,547,842、颁给Arnold,Jr.等人的美国专利No.5,283,174以及Becker等人的欧洲专利公开No.0747706）。用于均相测定法中的标记的另一个实施例为连接至探针的荧光化合物，其中当该探针未与其靶标杂交时淬灭剂化合物在官能邻近于该荧光标记（例如，颁给Lizardi等人的美国专利No.5,118,801和No.5,312,728以及颁给Becker等人的美国专利No.6,361,945B1）。
“均相可检测标记”是指其存在可基于被标记的探针是否与靶序列杂交而以均相方式检测（即，可以在未物理去除未杂交的标记或被标记的探针的情况下被检测）的标记。均相可检测标记以及检测它们的方法的实施例已经被描述（颁给Arnold等人的美国专利No.5,283,174、颁给Woodhead等人的美国专利No.5,656,207、颁给Nelson等人的美国专利No.5,658,737、颁给Lizardi等人的美国专利No.5,118,801和No.5,312,728以及颁给Becker等人的美国专利No.6,361,945B1）。
所谓“基本上由…组成”意指可包括不会在实质上改变本发明的基本和新颖特性的另外的组分和方法步骤。此类特征包括不会对本文所述的检测甲型肝炎病毒和/或细小病毒类型1、2和3的核酸序列的要求权利保护的组分或方法步骤的特性具有实质影响的盐、缓冲剂、核酸寡聚物以及类似的生物化学试剂。类似地，可包括不会对测定法的基本性质具有实质影响的另外的方法步骤。
如本文所用，具有“包含选自一组特定序列的序列”或“由选自一组特定序列的序列组成”或“基本上由选自一组特定序列的序列组成”的核酸序列的寡核苷酸意指作为基本和新颖的特性，寡核苷酸能够在严格的杂交条件下与具有所列群组的核酸序列中的一者的精确互补序列的核酸稳定杂交。精确的互补序列包括相应的DNA或RNA序列。
如本文所用，“对应于”指定的核酸序列的寡核苷酸意指所提到的寡核苷酸与参考核酸序列充分类似以使得该寡核苷酸具有与该参考核酸序列类似的杂交特性，因而其将在严格的杂交条件下与相同的靶核酸序列杂交。本领域技术人员应理解“相应的寡核苷酸”可与所提到的序列有所变化并且仍与相同的靶核酸序列杂交。还应理解，对应于第二核酸的第一核酸包括其互补序列并且包括其RNA和DNA。这种与核酸相比的变化可以探针或引物与它的靶序列之间的序列内相同碱基百分比或完全互补碱基百分比来说明。因此，如果这些碱基同一性或互补性百分比为100%至约80%，则寡核苷酸“对应于”参考核酸序列。在优选的实施例中，百分比为100%至约85%。在更优选的实施例中，该百分比可以为100%至约90%；在其他优选的实施例中，该百分比为100%至约95%。类似地，核酸或扩增核酸的区域在本文可被称为对应于参考核酸序列。本领域技术人员应理解，在不同的互补性百分比下可能需要对杂交条件的不同修改以允许与特定靶序列杂交而不会产生不可接受水平的非特异性杂交。
本文所用的术语“扩增子”或术语“扩增产物”是指在扩增程序期间产生的与靶序列内所含的序列互补或同源的核酸分子。扩增子的这种互补或同源序列有时在本文被称为“靶特异性序列”。扩增子可为双链或单链并且可包括DNA、RNA或这二者。例如，DNA依赖性RNA聚合酶在转录介导的扩增程序期间从双链DNA转录单链扩增子。这些单链扩增子为RNA扩增子并且可为双链复合体的任一条链；这取决于如何设计扩增寡聚物。因此，扩增子可为单链RNA。RNA依赖性DNA聚合酶合成与RNA模板互补的DNA链。因此，扩增子可为双链DNA和RNA杂交体。RNA依赖性DNA聚合酶常常包括RNA酶活性，或者与降解RNA链的RNA酶结合使用。因此，扩增子可为单链DNA。RNA依赖性DNA聚合酶和DNA依赖性DNA聚合酶从DNA模板合成互补的DNA链。因此，扩增子可为双链DNA。RNA依赖性RNA聚合酶从RNA模板合成RNA。因此，扩增子可为双链RNA。DNA依赖性RNA聚合酶从双链DNA模板合成RNA，也称为转录。因此，扩增子可为单链RNA。扩增子和用于产生扩增子的方法为本领域技术人员已知的。本文为方便起见，RNA的单链或DNA的单链可表示由本发明的扩增寡聚物组合所产生的扩增子。此种陈述并不意欲将扩增子局限为所示的陈述。拥有本公开内容的熟练技术人员将使用扩增寡聚物和聚合酶来产生众多类型的扩增子中的任一种；全部都在本发明的精神内。
本文所用的“非靶特异性序列”是指寡聚物序列的区域，其中所述区域在标准的杂交条件下不与靶序列稳定地杂交。具有非靶特异性序列的寡聚物包括但不限于启动子引物和分子信标。扩增寡聚物可含有不与靶标或模板序列互补的序列；例如，引物的5'区域可包括与靶核酸不互补的启动子序列（称为“启动子引物”）。本领域技术人员应理解，充当引物的扩增寡聚物可被修饰以包括5'启动子序列，并且因此充当启动子引物。类似地，启动子引物可通过去除启动子序列或在启动子序列不存在下合成来进行修饰并且仍充当引物。3'封端的扩增寡聚物可提供启动子序列并且充当聚合模板（称作“启动子提供者”）。因此，由扩增寡聚物成员如启动子引物所产生的扩增子将包含靶特异性序列和非靶特异性序列。
如本文所用，术语“相对光单位”(“RLU”)为指示样本在给定的波长或波长带下发射的光子相对数目的任意测量单位。RLU随着测量所用的检测手段的特性而变化。
在扩增和/或检测系统的上下文中的术语“特异性”在本文用于指描述系统取决于序列和测定法条件来区分靶标与非靶序列的能力的系统特性。就核酸扩增来说，特异性一般是指所产生的特异性扩增子的数目与副产物数目的比率（例如，信噪比）。就检测来说，特异性一般是指由靶核酸产生的信号与由非靶核酸产生的信号的比率。
术语“灵敏度”在本文用于指核酸扩增反应可以被检测或定量的精确度。扩增反应的灵敏度一般为可以在扩增系统中可靠地检测的靶核酸的最小拷贝数目的量度，并且将取决于例如所使用的检测测定法以及扩增反应的特异性，例如，特异性扩增子与副产物的比率。
本发明的测定法检测生物样本（例如，血液、血清、血浆、痰液、支气管灌洗液）中存在的人细小病毒。在一个实施例中，该测定法检测来自单独的供体或来自供体样本的汇集收集物的血浆样本中的细小病毒和/或HAV靶核酸。为了制备血浆标本，使用标准方法离心全血样本，并且在测试之前将血浆在4℃或-20℃下储存。为了裂解标本中的病毒粒子，将含有洗涤剂的裂解试剂与标本混合以从病毒粒子中释放靶核酸。标本处理可通过在裂解试剂中包括捕集寡聚物和固定化寡聚物而将病毒裂解与病毒靶核酸的纯化组合在一起。因而该方法包括靶标捕集步骤，其中将靶核酸与捕集寡聚物特异性杂交，然后与固定化寡聚物杂交，并且每一结合复合体（即，固定化寡聚物、捕集寡聚物以及靶核酸）实质上与其他样本组分分离。用含细小病毒结合复合体洗涤固体载体可将残余样本组分洗出。因此，靶核酸与其他样本组分分离并于浓缩于结合复合体中，而未从固体载体中释放出结合的靶核酸。
典型的样本处理涉及如下步骤（详细描述于美国专利No.6,110,678、国际申请公开No.WO2008/016988以及美国专利申请No.2006/0068417中）。体液（例如，0.5ml血浆）中的病毒粒子在60℃下与靶标捕集试剂（790mM HEPES、680mM LiOH、10%十二烷基硫酸锂(LLS)、230mM琥珀酸盐、至少一种7pm/ml的捕集探针以及100μg/ml结合于磁性粒子的聚dT14（SERADYNTM，印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN)））接触时溶解。捕集寡聚物包含5'靶标结合区域序列。捕集寡聚物还包含与连接至固体载体的互补寡聚物（例如，连接至固体载体的寡聚dT以及捕集寡聚物的寡聚dA尾部分）杂交的均聚物或非均聚物3'尾序列。通过在第一温度（60℃）下温育混合物而在这种反应混合物中发生靶标捕集杂交，使得捕集寡聚物特异性结合至靶核酸中的其互补靶序列。然后，将混合物冷却至40℃或更低温度（例如，室温）以使得捕集寡聚物的3'尾与粒子上的其互补寡聚物杂交。在第二次杂交之后，例如通过使用重力、离心或磁性分离来处理混合物以将固体载体和其结合的核酸复合体与其他样本组分分离。通常，分离使用含有磁体的架子将具有结合的核酸复合体的磁性粒子吸引到管侧。然后通过将磁性粒子悬浮于洗涤缓冲液中，将粒子分离至管侧并且去除上清液，来去除上清液并且用1ml洗涤缓冲液（10mM HEPES、6.5mM NaOH、1mM EDTA、0.3%(v/v)无水乙醇、0.02%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01%(w/v)对羟基苯甲酸丙酯、150mM NaCl、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)，pH7.5）来洗涤粒子上的结合复合体。
在样本制备之后，通过使用限定通过体外酶介导的核酸合成而扩增的区域的5'端和3'端的扩增寡聚物来实现甲型肝炎病毒和/或细小病毒靶核酸的扩增以产生扩增子。一个实施例使用转录介导的扩增(TMA)方法，基本上如美国专利No.5,399,491和No.5,554,516中所述，其为产生大量的可检测的扩增产物（RNA转录物）的实质上等温系统。该方法的优选实施例使用扩增寡聚物的混合物，其中将至少一种启动子引物与至少一种引物组合。
扩增寡聚物组合的一个优选实施例包含引物寡聚物成员和基于启动子的寡聚物成员。优选地，基于启动子的扩增寡聚物为包含5'RNA聚合酶启动子序列和3'靶标结合序列的启动子引物。RNA聚合酶启动子序列在本领域中已知包括但不限于sp6RNA聚合酶启动子序列、T3RNA聚合酶启动子序列以及T7RNA聚合酶启动子序列。在优选的实施例中，启动子引物包含5'T7RNA聚合酶启动子序列和3'靶标结合序列。最优选地，5'T7RNA聚合酶启动子序列为SEQ ID NO:196。
在一个优选的实施例中，基于启动子的扩增寡聚物的3'靶标结合序列的长度为约10至约40个核酸碱基并且包含被构造为与人细小病毒核酸或甲型肝炎病毒靶核酸的靶序列内的区域特异性杂交的核酸序列。其他优选的启动子引物包含内部标签序列，其被启动子序列侧接于它的5'端并且被靶标结合序列侧接于它的3'端。内部标签序列在本文中也被称为插入序列。内部标签序列为优选不与靶核酸稳定杂交或干扰靶标结合序列与靶核酸杂交的任何核酸序列。此外，内部标签序列优选具有足够长度和组成以使得一旦掺入扩增产物中，标签特异性扩增寡聚物就可以用于参与后续回合以产生扩增产物。一个优选的标签序列的长度为约10个核苷酸至约50个核苷酸。此外，认识到插入序列可包括任何本发明的基于启动子的寡聚物成员。
在一个优选实施例中，扩增寡聚物组合包含至少一个引物扩增寡聚物成员。优选的引物扩增寡聚物具有约10个核酸碱基至约50个核酸碱基的长度，并且具有被构造为当用于本发明的扩增反应中时与甲型肝炎病毒或人细小病毒类型1、2和3特异性杂交以产生可检测扩增产物的核苷酸组成。一个优选的引物寡聚物的长度为约10至约50个核酸碱基。本发明的引物寡聚物成员描述于本文中。这些描述不需在此重复。其他优选的引物寡聚物成员包含5'标签序列。5'标签序列为优选不与靶核酸稳定杂交或干扰靶标结合序列与靶核酸杂交的任何核酸序列。此外，5'标签序列优选具有足够长度和组成以使得一旦掺入扩增产物中，标签特异性扩增寡聚物就可以用于参与后续回合以产生扩增产物。一个优选的5'标签序列的长度为约10个核苷酸至约50个核苷酸。另一个优选的标签序列的长度为约12个核苷酸。此外，认识到5'标签序列可包括任何本发明的引物寡聚物成员。
通过转录介导的扩增来扩增靶核酸可从靶核酸的单一拷贝产生许多核酸链，因而允许通过检测与扩增产物的序列杂交的探针来检测靶标。通常，反应混合物包括靶核酸和至少两种扩增寡聚物，所述扩增寡聚物包含至少一种引物、至少一种启动子引物、逆转录酶和RNA聚合酶活性、核酸合成底物（脱氧核糖核苷三磷酸和核糖核苷三磷酸）以及适当的含盐和缓冲剂的溶液以从核酸模板产生多个RNA转录物。简而言之，启动子引物与靶序列的一部分特异性杂交。包括RNA酶活性的逆转录酶通过启动子引物的3'延伸产生第一链cDNA。该cDNA与启动子引物下游的引物杂交并且使用逆转录酶从引物的3'端合成新的DNA链以产生在一端具有功能性启动子序列的dsDNA。RNA聚合酶结合至dsDNA的启动子序列处并转录多个转录物或扩增子。这些扩增子进一步用于扩增过程中，用作新一轮复制的模板，以最终从初始靶序列产生大量的单链扩增核酸（例如，从单一模板合成的100至3,000个拷贝的RNA）。该过程使用基本上恒定的反应条件（即，实质上等温）。典型的100μl扩增反应物使用75μl的扩增试剂混合物（11.6mM Tris碱、15.0mM Tris-HCl、22.7mM MgCl2、23.3mM KCl、3.33%甘油、0.05mM醋酸锌（二水合物）、各0.665mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、各5.32mM的ATP、CTP、GTP和UTP，pH7）和25μl酶试剂混合物（700U的T7RNA聚合酶、1400U的来自莫罗尼鼠科白血病病毒的逆转录酶(MMLV-RT)、16mM HEPES（游离酸，二水合物）、70mMN-乙酰基-L-半胱氨酸、3mM EDTA、0.05%(w/v)叠氮化钠、20mM Tris碱、50mM KCl、20%(v/v)无水甘油、10%(v/v)
X-102以及150mM海藻糖（二水合物），pH7），优选与保留在固体粒子上的被捕集靶的核酸混合。对于酶促活性，1U的T7RNA聚合酶在37℃下使用含T7启动子的DNA模板在1小时内将1nmol ATP掺入RNA中，而1U的MMLV-RT在37℃下使用200-400μmol寡聚dT引导的聚(A)作为模板在10分钟内将1nmol dTTP掺入DNA中。扩增寡聚物在约5-20皮摩尔/反应、或更通常约7-15皮摩尔/反应、或更通常约5-15皮摩尔/反应或更通常约5-10皮摩尔/反应的范围内，这些范围包括其中所有整数和分数。
在一个优选的实施例中，使用扩增寡聚物的组合进行TMA反应，其中所述组合包括至少一个启动子引物寡聚物成员和至少一个引物寡聚物成员，并且其中所述组合被构造用于产生用于检测甲型肝炎病毒和/或人细小病毒类型1、2和3的扩增产物。在一个特定方面，使用至少一种甲型肝炎病毒非T7扩增寡聚物(SEQ ID NO:1-11)和至少一种基于甲型肝炎病毒启动子的扩增寡聚物(SEQ ID NO:12-28)执行TMA反应。在一个特定方面，使用至少一种细小病毒非T7扩增寡聚物(SEQ ID NO:75-87)和至少一种基于细小病毒启动子的扩增寡聚物(SEQ ID NO:88-107)执行TMA反应。在一个特定方面，使用至少一种甲型肝炎病毒非T7扩增寡聚物(SEQ ID NO:1-11)和至少一种基于甲型肝炎病毒启动子的扩增寡聚物(SEQ IDNO:12-28)执行多路TMA反应。在一个特定方面，使用至少一种细小病毒非T7扩增寡聚物(SEQ ID NO:75-87)和至少一种基于细小病毒启动子的扩增寡聚物(SEQ ID NO:88-107)执行多路TMA反应。在一个特定方面，使用至少一种细小病毒非T7扩增寡聚物(SEQ ID NO:75-87)、至少一种基于细小病毒启动子的扩增寡聚物(SEQ ID NO:88-107)、至少一种甲型肝炎病毒非T7扩增寡聚物(SEQ ID NO:1-11)以及至少一种基于甲型肝炎病毒启动子的扩增寡聚物(SEQ ID NO:12-28)执行多路TMA反应。在该实施例的一个方面，扩增寡聚物组合包含至少一种包含5'启动子序列、内部标签序列以及3'靶标结合序列的启动子引物寡聚物成员。在该实施例的一个方面，扩增寡聚物组合包含至少一种包含5'启动子序列、内部标签序列以及3'靶标结合序列的启动子引物寡聚物成员，并且还包括至少一种包含5'启动子序列和3'靶标结合序列的启动子引物寡聚物成员。在该实施例的一个方面，扩增寡聚物组合包含至少一种包含5'标签序列和3'靶标结合序列的引物寡聚物成员。在该实施例的一个方面，扩增寡聚物组合包含至少一种包含5'标签序列和3'靶标结合序列的引物寡聚物成员，并且还包括至少一种包含3'靶标结合序列的引物寡聚物成员。
在另一个优选实施例中，利用包含至少一种启动子引物寡聚物成员和至少一种引物寡聚物成员的扩增寡聚物组合执行TMA反应，其中该组合被构造用于产生用于检测人细小病毒类型1、2和3的扩增产物，和/或利用包括至少一种启动子引物寡聚物成员和至少一种引物寡聚物成员的扩增寡聚物组合执行TMA反应，其中该组合被构造用于产生用于检测甲型肝炎病毒的扩增产物。在一个实施例中，用于细小病毒的TMA反应为定量扩增和检测反应。在一个实施例中，用于甲型肝炎病毒的TMA反应为定量扩增和检测反应。在一个实施例中，用于细小病毒的TMA反应和用于甲型肝炎病毒的TMA反应为定量扩增和检测反应。在一个方面，这些扩增反应为多路扩增反应，并且在使用一个或多个SEQ ID NO:58-74的检测探针和/或一个或多个SEQ ID NO:137-169的检测探针的检测步骤中执行扩增产物的检测。在一个方面，扩增反应为单路扩增反应，并且在使用一个或多个SEQ ID NO:58-74的检测探针和/或一个或多个SEQ ID NO:137-169的检测探针的检测步骤中执行扩增产物的检测。
在扩增反应之后或在扩增反应期间，优选通过与至少一种与扩增序列的一部分特异性杂交的被标记核酸探针杂交，检测到由甲型肝炎病毒靶核酸和/或由细小病毒靶核酸产生的扩增序列。探针实施例包括具有在约80℃至约85℃范围内的Tm的那些。一些优选的探针实施例包括具有约15至约40个核苷酸的核苷酸长度和作为DNA、RNA或其组合并且被构造用于与甲型肝炎病毒核酸或人细小病毒核酸或扩增核酸的靶序列的全部或一部分区域特异性杂交的核酸序列的寡聚物。本发明的检测寡聚物还可包含一个或多个LNA残基。通过检测可以在均相反应中检测到的标记来实现探针的检测。因此，一些优选的实施例还包含使用众所周知的允许均相检测的方法用吖啶酯(AE)化合物标记的探针（例如，标记和检测方法详细描述于颁给Arnold,Jr.等人的美国专利No.5,283,174、颁给Woodhead等人的美国专利No.5,656,207以及颁给Nelson等人的美国专利No.5,658,737中）。化学发光AE化合物通过接头化合物连接至探针序列（实质上如颁给Arnold,Jr.等人的美国专利No.5,585,481和No.5,639,604中所述，例如参见第10列第6行至第11列第3行，以及实例8）。在一个实施例中，被标记的探针寡聚物在核酸主链中具有至少一个2'-O-甲氧基键联。在典型的检测步骤的一个实施例中，探针试剂包括100mM琥珀酸盐、2%(w/v)LLS、230mMLiOH（一水合物）、15mM2,2'-二硫基二吡啶(ALDRITHIOL-2)、1.2MLiCl、20mM EDTA、20mM EGTA、3%(v/v)无水乙醇，用LiOH达到约pH4.7，并且用于水解未结合探针上的标记的选择试剂包括600mM硼酸、182mM NaOH、1%(v/v)
X-100。将检测探针以每一反应约1E7-5E7相对光单位(RLU)、更通常每一反应约1E7-3E7RLU、更通常每一反应2E7-5E7RLU或更通常每一反应2E7-4E7RLU的范围添加至检测反应；其中所述范围包括其中所有整数和分数。使用光度计（例如，LEADERTM450HC+，加利福尼亚州圣地亚哥的基因探针公司(Gen-Probe Incorporated,San Diego,CA)）以RLU形式检测信号。
为了选择适用作捕集寡聚物、扩增寡聚物以及检测探针的DNA序列，通过匹配相同或类似序列的区域来比对可获自公共访问数据库（例如，GenBank）的DNA序列（包括部分或互补序列）并使用众所周知的分子生物学技术进行比较。尽管通过使用算法可促进序列比较，但本领域技术人员可容易地通过手动和目测执行此类比较。通常，选择在所比较序列之间含有相对较少变体的序列的部分作为设计本发明中所用的合成寡聚物的基础。设计寡聚物的其他考虑包括相对CG含量（其影响Tm）和序列内相对不存在所预测的二级结构（其可能形成分子内杂交体），如通过使用众所周知的方法所测定。
在一个实施例中，在单个管中使用0.5至1ml体液（如血浆）样本进行测定法来以每反应约100至500个拷贝/ml靶标DNA的灵敏度检测靶核酸。在其他实施例中，该测定法检测样本中较高数目的靶核酸，该样本可为单独的样本的汇集样本。
除非另外定义，否则本文所用的所有科学和技术术语具有与相关领域的技术人员所通常理解相同的含义。本文所用的许多术语的一般定义提供于Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology（《微生物学和分子生物学词典》），第2版.（Singleton等人，1994，纽约州纽约市的约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons,NewYork,NY)）；The Harper Collins Dictionary of Biology（《哈珀柯林斯生物学词典》）（Hale和Marham，1991，纽约州纽约市的哈珀出版社(Harper Perennial,New York,NY))；以及Taber's Cyclopedic Medical Dictionary（《泰伯尔医学百科词典》），第17版（宾夕法尼亚州费城的戴维斯出版社(F.A.Davis Co.,Philadelphia,PA,1993)）中。除非另外提及，否则本文使用或涵盖的技术为本领域的普通技术人员众所周知的标准方法。以下实例说明本发明的一些优选的实施例并且仅为说明而提供。
实例1：使用引物和启动子提供者并且不使用靶标捕集的HAV靶标的扩增。
使用每一反应1.25IU的HAV和以下两种扩增条件中的一种来设定甲型肝炎病毒扩增测定法：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:18，或SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:13。使用分离凝胶和溴化乙锭染色剂来执行扩增产物的检测。通过对HAV靶标储备液（来自国家生物标准和控制研究所(National Institute for Biologic Standards and Controls)的WHO第一国际标准品（NIBSC#00/560，每一小瓶5E4IU））进行连续稀释来设定测定法，然后将稀释液添加至96孔板的单独的孔。然后将两种扩增条件中的每一者添加至单独的含有稀释液的孔。执行等温扩增反应并在反应结束时，将每一反应的等分试样转移至单独的凝胶孔并然后用EtBr染色。这项研究的结果显示，每一扩增条件可检测少至1.25IU的甲型肝炎病毒核酸。
实例2：使用引物和启动子提供者并且使用靶标捕集的HAV靶标的扩增。
如实例1中设定甲型肝炎病毒扩增测定法，不同的是该测定法包括不同稀释液的初始靶标捕集步骤并且不同的是使用检测探针(SEQ ID NO:62)进行扩增产物的检测。通过首先从每一单独的稀释液中捕集HAV靶标并将所捕集的HAV靶核酸添加至96孔板上的单独孔来设定测定法。所用的靶标捕集寡聚物来自具有dT3dA30尾和K18靶标捕集区域的寡聚物池。合成靶标捕集寡聚物的靶标捕集区域以各具有G和U残基的随机组合，因此该实例中所用的靶标捕集寡聚物的群体为序列的混合收集物。检测步骤为终点检测反应并且结果显示该测定法系统对至少3.87IU/mL的HAV靶核酸具有95%检出率（表1）。
表1。
该实验显示，使用非特异性靶标捕集系统与扩增和检测条件组合，提供了HAV靶核酸的灵敏性扩增和检测，但扩增和检测不如其中直接向扩增反应添加已知量的靶标的实例1中所见的灵敏。
实例3：使用引物和启动子提供者并且使用靶标捕集的细小病毒基因型1、2和3的 扩增。
设定扩增反应以测试多个用于扩增不同浓度的细小病毒基因型1的扩增寡聚物组合。设定扩增测定法，其中所有的非T7扩增寡聚物和T7扩增寡聚物的组合可从如下得到：将SEQ ID NO:75-87中的每一者与SEQ ID NO:88-99中的每一者组合，其中每一组合正好为单种非T7和单种T7。设计每一扩增寡聚物来扩增细小病毒基因型1、2和3。靶核酸为SEQ IDNO:203。稀释储备核酸并且以每一反应0个拷贝、每一反应10个拷贝、每一反应100个拷贝以及每一反应100,000个拷贝添加至反应板的各孔。如上文一般描述制备无引物的扩增试剂并添加至0、10、100以及100,000个拷贝的反应的各反应板的各孔。将来自非T7和T7扩增寡聚物的上述组合的各种引物条件添加至这些板上的单独的孔。扩增反应为等温的并且包括在约62℃和约42℃下分别10分钟和20分钟的初始温育步骤，接着在42℃下在聚合酶存在下扩增50分钟。使用SEQ ID NO:145和Leader HC光度计来执行扩增产物的检测。对于具有0个拷贝的细小病毒的板所检测到的RLU为934RLU至14698RLU。对于每个反应具有10个拷贝的细小病毒的板所检测到的RLU为2,015RLU至8,040,373RLU，其中一半以上的组合提供远高于背景的信号孔。对于每个反应具有100个拷贝的细小病毒的板所检测到的RLU为2,439RLU至8,114,133RLU。对于每个反应具有100,000个拷贝的细小病毒的板所检测到的RLU为495,680RLU至8,308,252RLU。根据这些测定法的结果，鉴定出可用于可扩增少至10个拷贝的细小病毒的细小病毒扩增反应的多种扩增寡聚物组合。
设定另一种测定法用于细小病毒基因型1、2和3中的每一者的扩增和检测。这些扩增反应使用下列扩增寡聚物条件：SEQ ID NO:80和92；SEQ ID NO:80和91；以及SEQ ID NO:81和92，其中每一者被设计用于扩增三种细小病毒基因型。靶核酸为每一细小病毒基因型1-3的一部分的体外转录物（分别为SEQ ID NO:200、201和202）并且以来自储备浓度的连续稀释液形式提供于测定法中。使用实例2中所讨论的非特异性靶标捕集系统来执行靶标捕集。检测为使用SEQ ID NO:146的终点检测。该扩增和检测测定法的结果显示，三种系统具有降至每毫升至少80个拷贝的靶标的一致灵敏度，并且具有降至5个拷贝/毫升的良好灵敏度，但三种基因型之间存在检测的变化（例如，在5个拷贝/毫升下，40%的具有基因型1的孔具反应性，而仅约20%的基因型3的孔具反应性）。
执行另一个扩增反应来扩增和检测细小病毒核酸，其中扩增寡聚物组合包含非T7扩增寡聚物和两种T7扩增寡聚物。扩增寡聚物的组合如下：SEQ ID NO:80、90和99；SEQ IDNO:80、91和99；SEQ ID NO:80、92和99；SEQ ID NO:81、90和99；SEQ ID NO:81、91和99；SEQID NO:81、92和99；SEQ ID NO:82、90和99；SEQ ID NO:82、91和99；以及SEQ ID NO:82、92和99。如上文一般描述设定扩增和检测反应，并且于10个孔中执行每一反应。靶核酸为SEQ IDNO:203。结果显示SEQ ID NO:80、90和99；SEQ ID NO:80、91和99；SEQ ID NO:80、92和99；以及SEQ ID NO:81、91和99都以对于各孔的100%反应性检测到降至50个拷贝的靶核酸，而其他组合为约80%反应性至非反应性。
然后针对SEQ ID NO:200-202测试如下组合：SEQ ID NO:80、91和99；SEQ ID NO:80、92和99；以及SEQ ID NO:82、90和99，每一靶核酸是以每一反应45个拷贝、每一反应15个拷贝以及每一反应5个拷贝提供。在10个单独的孔中测试每一反应条件。如上文一般描述设定扩增和检测反应。所有三种扩增寡聚物组合对于检测45个拷贝的每一细小病毒基因型具100%反应性。三种扩增寡聚物组合对于检测15个拷贝的三种细小病毒基因型为100%反应性至70%反应性。三种扩增寡聚物组合对于检测5个拷贝的三种细小病毒基因型为70%反应性至40%反应性。因此，细小病毒扩增寡聚物的组合能够以约40%-70%效率检测少至5个拷贝的每一基因型。
实例4：在细小病毒存在下扩增和检测甲型肝炎病毒。
在细小病毒核酸存在下执行扩增测定法来扩增和检测甲型肝炎病毒靶核酸。该HAV靶核酸为在实例1中所述的WHO标准品。对该HAV标准品进行连续稀释并且将每一稀释液添加至96孔板上的单独的孔。将5E6个拷贝的SEQ ID NO:200添加进每个孔。制备HAV扩增反应混合物以包括5-10pM/rxn的SEQ ID NO:2和18。制备终点检测反应混合物以包括每一反应5E6RLU的SEQ ID NO:62。执行扩增反应，然后终止反应并执行检测反应。该测定法的结果显示，在5E6个拷贝的细小病毒存在下可检测100%的含有低至40个拷贝的HAV的孔和90%的含有低至20个拷贝的HAV的孔。
实例5：细小病毒靶核酸的定量扩增和检测。
执行用于扩增和检测细小病毒基因型1、2和3的定量测定法。所述细小病毒靶核酸为来自细小病毒B19基因型的WHO国际参考小组(WHO International Reference Panel)的核酸（NIBSC99/800，其为5.98log10IU/mL基因型1、5.94log10IU/mL基因型2、5.97log10IU/mL基因型3，其中一IU为约0.12个拷贝的各基因型）。将细小病毒靶核酸稀释降至10,000IU/mL和1,000IU/mL并将每一稀释液添加至单独的96孔板的不同的孔。细小病毒扩增寡聚物为SEQ ID NO:91和131。检测探针寡聚物为SEQ ID NO:144。将细小病毒竞争序列(SEQ ID NO:197)加至扩增反应混合物中。结果显示于表2中。
表2
这些结果显示，本发明的定量测定法显示与WHO标准靶核酸良好的线性，但基因型2测定法定量相比于标准品相对较高的变化。
实例6：掺杂进细小病毒阴性人血浆样本中的细小病毒靶核酸的定量扩增和检测。
根据上文实例5设定该定量扩增和检测测定法，不同的是将10,000IU/lM的靶核酸重新悬浮于来自被测定为细小病毒阴性的供体的人血浆中。每一样本中检测的细小病毒的预期量为4Log（拷贝/毫升），并且所观测到的平均结果为3.92(±0.059)Log（拷贝/毫升）。因此，该定量细小病毒测定法提供在人血浆样本中扩增和检测所有细小病毒靶核酸的精确结果。
实例7：使用特异性靶标捕集的甲型肝炎病毒核酸和细小病毒靶核酸的扩增和检 测。
使用靶标特异性靶标捕集寡聚物对从样本中分离的靶核酸执行扩增和检测反应。用于捕集甲型肝炎病毒核酸的靶标捕集寡聚物为SEQ ID NO:46-51，并且用于捕集细小病毒核酸的靶标捕集寡聚物为SEQ ID NO:128-131。在靶标捕集反应中单独以及组合（意指两种或更多种靶向甲型肝炎病毒的靶标捕集寡聚物或者两种或更多种靶向细小病毒的靶标捕集寡聚物）使用靶标捕集寡聚物。样本和反应条件如上文对于甲型肝炎病毒单路反应和对于细小病毒单路反应所述。单个和组合的特异性靶标捕集寡聚物相比于非特异性靶标捕集方法显示出改进的灵敏度和捕集效率。
表3：示例性寡聚物、参考序列和区域
已经在特定实例和优选实施例的上下文中描述了本发明。本领域技术人员应认识到，在由以下权利要求书所限定的本发明内涵盖其他实施例。
Claims (86)
1.一种用于检测样本中人细小病毒靶核酸的寡聚物组合，所述寡聚物组合包含：
(I)用于扩增人细小病毒核酸靶区域的第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物，其中
(a)所述第一细小病毒扩增寡聚物为SEQ ID NO:80所示；以及
(b)所述第二细小病毒扩增寡聚物为SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92所示。
2.根据权利要求1所述的寡聚物组合，其进一步包含第三细小病毒扩增寡聚物，所述第三细小病毒扩增寡聚物为SEQ ID NO:99所示。
3.根据权利要求2所述的寡聚物组合，其中第一细小病毒扩增寡聚物序列、第二细小病毒扩增寡聚物序列和第三细小病毒扩增寡聚物序列的组合包含下述之一：SEQ ID NO:80，91，和99；或SEQ ID NO:80，92，和99。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的寡聚物组合，还包含至少一种细小病毒特异性捕集探针寡聚物，所述细小病毒特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自由SEQ ID NO:132-135组成的组。
5.根据权利要求4所述的寡聚物组合，其中所述细小病毒特异性捕集探针寡聚物选自由SEQ ID NO:128-131组成的组。
6.根据权利要求1-3和5中任一项所述的寡聚物组合，还包含至少一种细小病毒特异性检测探针寡聚物，其中所述细小病毒特异性检测探针的序列选自由SEQ ID NO:137-168组成的组。
7.根据权利要求4所述的寡聚物组合，还包含至少一种细小病毒特异性检测探针寡聚物，其中所述细小病毒特异性检测探针的序列选自由SEQ ID NO:137-168组成的组。
8.根据权利要求1-3、5和7中任一项所述的寡聚物组合，其中所述寡聚物组合进一步包含
(II)用于扩增HAV核酸靶区域的第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物，其中
(a)所述第一HAV扩增寡聚物为SEQ ID NO:2所示；以及
(b)所述第二HAV扩增寡聚物为SEQ ID NO:18所示。
9.根据权利要求4所述的寡聚物组合，其中所述寡聚物组合进一步包含(II)用于扩增HAV核酸靶区域的第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物，其中
(a)所述第一HAV扩增寡聚物为SEQ ID NO:2所示；以及
(b)所述第二HAV扩增寡聚物为SEQ ID NO:18所示。
10.根据权利要求6所述的寡聚物组合，其中所述寡聚物组合进一步包含(II)用于扩增HAV核酸靶区域的第一扩增寡聚物和第二扩增寡聚物，其中
(a)所述第一HAV扩增寡聚物为SEQ ID NO:2所示；以及
(b)所述第二HAV扩增寡聚物为SEQ ID NO:18所示。
11.根据权利要求8所述的寡聚物组合，还包含至少一种HAV特异性捕集探针寡聚物，所述HAV特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自由SEQ ID NO:52-57组成的组。
12.根据权利要求9或10所述的寡聚物组合，还包含至少一种HAV特异性捕集探针寡聚物，所述HAV特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自由SEQ ID NO:52-57组成的组。
13.根据权利要求11所述的寡聚物组合，其中所述HAV特异性捕集探针寡聚物选自由SEQ ID NO:46-51组成的组。
14.根据权利要求12所述的寡聚物组合，其中所述HAV特异性捕集探针寡聚物选自由SEQ ID NO:46-51组成的组。
15.根据权利要求8所述的寡聚物组合，还包含至少一种HAV特异性检测探针寡聚物，其中所述HAV特异性检测探针的序列选自由SEQ ID NO:61-65组成的组。
16.根据权利要求12所述的寡聚物组合，还包含至少一种HAV特异性检测探针寡聚物，其中所述HAV特异性检测探针的序列选自由SEQ ID NO:61-65组成的组。
17.根据权利要求9-11和13-14中任一项所述的寡聚物组合，还包含至少一种HAV特异性检测探针寡聚物，其中所述HAV特异性检测探针的序列选自由SEQ ID NO:61-65组成的组。
18.一种试剂盒，包含根据权利要求1至17中任一项所述的寡聚物组合。
19.一种反应混合物，包含根据权利要求1至17中任一项所述的寡聚物组合。
20.寡聚物组合制备供一种用于检测样本中人细小病毒靶核酸的方法使用的试剂盒的用途，所述方法包括：
(A)提供样本，其中所述样本疑似含有人细小病毒；
(B)使所述样本与用于扩增人细小病毒核酸靶区域的寡聚物组合接触，所述寡聚物组合包含：
(I)(a)第一细小病毒扩增寡聚物，其为SEQ ID NO:80所示；和(b)第二细小病毒扩增寡聚物，其为SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92所示；
(C)执行体外核酸扩增反应，其中所述样本中存在的任何细小病毒靶核酸被用作产生细小病毒扩增产物的模板；以及
(D)检测所述细小病毒扩增产物的存在或不存在，从而指示所述样本中细小病毒的存在或不存在。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述寡聚物组合进一步包含第三细小病毒扩增寡聚物，所述第三细小病毒扩增寡聚物为SEQ ID NO:99所示。
22.根据权利要求20所述的用途，其中第一细小病毒扩增寡聚物序列、第二细小病毒扩增寡聚物序列和第三细小病毒扩增寡聚物序列的组合包含下述之一：SEQ ID NO:80，91，和99；或SEQ ID NO:80，92，和99。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的用途，其中所述方法还包括在步骤(B)之前从所述样本的其他组分纯化所述细小病毒靶核酸。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述纯化步骤包括使所述样本与至少一种细小病毒特异性捕集探针寡聚物接触，所述细小病毒特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自由SEQ ID NO:132-135组成的组。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述细小病毒特异性捕集探针寡聚物选自由SEQID NO:128-131组成的组。
26.根据权利要求20所述的用途，其中所述检测步骤(D)包括使所述体外核酸扩增反应物与细小病毒特异性检测探针寡聚物接触，所述细小病毒特异性检测探针寡聚物被构造用于在借此测定细小病毒扩增产物的存在或不存在的条件下与所述细小病毒扩增产物特异性杂交，从而指示所述样本中细小病毒的存在或不存在，其中所述细小病毒特异性检测探针选自由SEQ ID NO:137-168组成的组。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述细小病毒特异性检测探针包括选自如下的标记：
(a)化学发光标记；
(b)荧光标记；
(c)淬灭剂；和
(d)(a)、(b)和(c)中的一者或多者的组合。
28.根据权利要求26或27所述的用途，其中所述检测步骤(D)在所述扩增步骤(C)期间发生。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述细小病毒特异性检测探针包含荧光标记、淬灭剂或这二者。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述细小病毒特异性检测探针为TaqMan检测探针或分子信标。
31.根据权利要求20至22、24-27和29-30中任一项所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为等温扩增反应。
32.根据权利要求23所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为等温扩增反应。
33.根据权利要求28所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为等温扩增反应。
34.根据权利要求20至22、24-27和29-30中任一项所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为PCR扩增反应。
35.根据权利要求23所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为PCR扩增反应。
36.根据权利要求28所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为PCR扩增反应。
37.根据权利要求31所述的用途，其中所述扩增反应为实时扩增反应。
38.根据权利要求34所述的用途，其中所述扩增反应为实时扩增反应。
39.根据权利要求32-33和35-36中任一项所述的用途，其中所述扩增反应为实时扩增反应。
40.根据权利要求20所述的用途，其中所述方法与用于检测HAV靶核酸的方法组合并且还使所述样本与(II)第一HAV扩增寡聚物和第二HAV扩增寡聚物接触，其中(a)所述第一HAV扩增寡聚物为SEQ ID NO:2所示；以及(b)所述第二HAV扩增寡聚物为SEQ ID NO:18所示。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述方法还包括在步骤(B)之前从所述样本的其他组分纯化所述HAV靶核酸。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述纯化步骤包括使所述样本与至少一种HAV特异性捕集探针寡聚物接触，所述HAV特异性捕集探针寡聚物包含共价连接至与固定化探针结合的序列或部分的靶标杂交序列，其中所述靶标杂交序列选自由SEQ ID NO:52-57组成的组。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述HAV特异性捕集探针寡聚物选自由SEQ IDNO:46-51组成的组。
44.根据权利要求40所述的用途，其中所述检测步骤(D)包括使所述体外核酸扩增反应物与HAV特异性检测探针寡聚物接触，所述HAV特异性检测探针寡聚物被构造用于在借此测定HAV扩增产物的存在或不存在的条件下与所述HAV扩增产物特异性杂交，从而指示所述样本中HAV的存在或不存在，其中所述HAV特异性检测探针选自由SEQ ID NO:61-65组成的组。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述HAV特异性检测探针包括选自如下的标记：
(a)化学发光标记；
(b)荧光标记；
(c)淬灭剂；和
(d)(a)、(b)和(c)中的一者或多者的组合。
46.根据权利要求44或45所述的用途，其中所述检测步骤(D)在所述扩增步骤(C)期间发生。
47.根据权利要求46所述的用途，其中所述HAV特异性检测探针包含荧光标记、淬灭剂或这二者。
48.根据权利要求47所述的用途，其中所述HAV特异性检测探针为TaqMan检测探针或分子信标。
49.根据权利要求40-45和47-48中任一项所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为等温扩增反应。
50.根据权利要求46所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为等温扩增反应。
51.根据权利要求40-45和47-48中任一项所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为PCR扩增反应。
52.根据权利要求46所述的用途，其中步骤(C)的所述扩增反应为PCR扩增反应。
53.根据权利要求50或52所述的用途，其中所述扩增反应为实时扩增反应。
54.根据权利要求49所述的用途，其中所述扩增反应为实时扩增反应。
55.根据权利要求51所述的用途，其中所述扩增反应为实时扩增反应。
56.根据权利要求20-22、24-27、29-30、32-33、35-38、40-45、47-48、50和52中任一项所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
57.根据权利要求23所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
58.根据权利要求28所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
59.根据权利要求31所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
60.根据权利要求34所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
61.根据权利要求39所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
62.根据权利要求46所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
63.根据权利要求49所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
64.根据权利要求51所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
65.根据权利要求53所述的用途，其中所述样本来自个体患者。
66.根据权利要求20-22、24-27、29-30、32-33、35-38、40-45、47-48、50和52中任一项所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
67.根据权利要求23所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
68.根据权利要求28所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
69.根据权利要求31所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
70.根据权利要求34所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
71.根据权利要求39所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
72.根据权利要求46所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
73.根据权利要求49所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
74.根据权利要求51所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
75.根据权利要求53所述的用途，其中所述样本是被汇集的。
76.根据权利要求66所述的用途，其中所述汇集样本为汇集的血浆样本。
77.根据权利要求67-75中任一项所述的用途，其中所述汇集样本为汇集的血浆样本。
78.根据权利要求40所述的用途，其中所述检测步骤(D)包括使所述体外核酸扩增反应物与细小病毒特异性检测探针寡聚物和HAV特异性检测探针寡聚物接触，所述细小病毒特异性检测探针寡聚物和所述HAV特异性检测探针寡聚物被构造用于在借此测定细小病毒扩增产物和HAV扩增产物的存在或不存在的条件下分别与所述细小病毒扩增产物和所述HAV扩增产物特异性杂交，从而指示所述样本中细小病毒和HAV的存在或不存在。
79.根据权利要求78所述的用途，其中所述细小病毒特异性检测探针寡聚物和所述HAV特异性检测探针寡聚物被区别标记。
80.根据权利要求79所述的用途，其中所述细小病毒特异性检测探针寡聚物和所述HAV特异性检测探针寡聚物各包含独立地选自(a)化学发光标记和(b)荧光标记的标记。
81.根据权利要求79所述的用途，其中所述细小病毒特异性检测探针寡聚物和所述HAV特异性检测探针寡聚物各包含化学发光标记。
82.根据权利要求81所述的用途，其中用于所述细小病毒特异性检测探针寡聚物和所述HAV特异性检测探针寡聚物的所述化学发光标记的特征为不同的发光动力学，其足以区分细小病毒特异性化学发光信号与HAV特异性化学发光信号。
83.根据权利要求82所述的用途，其中用于所述细小病毒特异性检测探针寡聚物和所述HAV特异性检测探针寡聚物的所述化学发光标记各包含吖啶酯(AE)。
84.根据权利要求78至83中任一项所述的用途，其中所述细小病毒特异性检测探针寡聚物的序列选自由SEQ ID NO:137-168组成的组。
85.根据权利要求78至83中任一项所述的用途，其中所述HAV特异性检测探针寡聚物选自由SEQ ID NO:61-65组成的组。
86.根据权利要求84所述的用途，其中所述HAV特异性检测探针寡聚物选自由SEQ IDNO:61-65组成的组。
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