-
1. Zusammenfassung
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion
von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere in Thrombozyten-Konzentraten,
mit Hilfe einer generischen Realtime-PCR. Durch die Verwendung von
spezifischen Primern und Sonden lassen sich universell alle transfusionsmedizinisch
relevanten Bakterien in einem Amplifikationsschritt nachweisen.
Es werden eine nicht kompetitive oder eine kompetitive interne Kontroll-Nukleinsäure und
mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Sonden verwendet. Das Verfahren
ermöglicht
somit eine schnelle Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten
Proben, insbesondere Thrombozyten-Einzelproben und ist somit besonders
zum Durchsuchen („Screening") von Blutspendern
geeignet. Es werden Sensitivitäten
von zwischen 2 CFU/ml und 50 CFU/ml in Abhängigkeit vom untersuchten Bakterium
erreicht.
-
2. Hintergrund der Erfindung
-
Menschliches
Blut ist für
die Medizin ein sehr wertvoller und bisher unverzichtbarer Rohstoff,
aus dem heute eine Vielzahl von Komponenten und Produkten gewonnen
bzw. hergestellt wird. Der sogenannte AIDS-Skandal Anfang der 90er
Jahre hat die Virussicherheit von Blut und Blutprodukten in der Öffentlichkeit wie
in Fachkreisen schlagartig in den Mittelpunkt des Interesses gerückt.
-
Das
virologische Restrisiko ist aufgrund der verschiedenen Maßnahmen,
wie Spenderselektion, ELISA-Testung und NAT-Testung, für die untersuchten
transfusionsrelevanten Viren auf ein bisher nicht gekanntes, unvorstellbar
geringes Maß gesunken.
So ist das Restrisiko, das in Deutschland nach Einführung der
PCR für
die drei transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV, HBV noch verbleibt,
mit 1:5,5 Mio. für
HIV, 1:4,4 Mio. für HCV
und 1:620.000 Mio. für
HBV (mit Pool-PCR) und 1:820.000 für HBV mit einer Einzelproben-PCR
so gering geworden, dass man fast von keinem wirklichen virologischen
Restrisiko mehr sprechen kann (1).
-
Demgegenüber steht
jedoch ein bakterielles Restrisiko in Thrombozyten-Konzentraten
von 1:2000 bis 1:3000 (2–4).
Dadurch, dass Thrombozyten-Konzentrate bei Raumtemperatur gelagert
werden, stellen sie für viele
Bakterien ein ideales Nährmedium
dar und sind somit besonders gefährdet.
Ferner unterscheiden sich bakterielle von den viralen Kontaminationen
darin, dass die Ausgangskonzentration zunächst sehr gering ist (< 10 CFU/ml). Darum
benötigt
man ein sehr sensitives Nachweisverfahren für die Bakteriendetektion.
-
Dreier
et al. (J. Clin. Microbiol. 2004; 42(10):4759–4764.) offenbaren ein RT-PCR-Verfahren
zum Nachweis bakterieller Kontamination in Thrombozytenkonzentraten,
bei welchem Primer und Sonden verwendet werden, die spezifisch für konservierte
Regionen eubakterieller 23S rRNA sind. Der PCR-Mastermix, einschließlich der
Primer, wird mit 8-MOP behandelt und anschließend mit UV bestrahlt, um DNA-Kontaminationen,
die z.B. in den PCR-Reagenzien
vorkommen können,
zu entfernen. Bei der von Dreier et al. beschriebenen Behandlung
mit 8-MOP und anschließender
UV-Bestrahlung handelt es sich jedoch nicht um eine schonende Behandlung,
die zudem dazu führen
kann, daß eine
anschließende
Amplifikation nicht mehr möglich
ist.
-
Mohammadi
et al. (Transfusion 2005; 45(5):731–736.) beschreiben ein real
time PCR-Verfahren
zum Nachweis bakterieller Kontamination in Thrombozytenkonzentraten,
bei welchem ein universelles Primerset, das spezifisch für konservierte
Regionen eubakterieller ribosomaler DNA, nämlich der 16S rDNA, ist, verwendet
wird. Eine Vorbehandlung der Reagenzien wird nicht beschrieben.
-
US 6,849,430 B2 beschreibt
quantitative kompetititve und nicht-kompetitive RT-PCR unter der
Verwendung eines internen homologen RNA-Standards für die Überwachung
von Mikroorganismen in Systemen für die biologische Behandlung
von Abwasser.
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu entwickeln,
das eine schnelle und vor allem auch sensitive Detektion von Bakterien
in aus Blut abgeleiteten Proben, insbesondere in Thrombozyten-Konzentraten,
zur Verfügung
stellt.
-
Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das zur Verfügung
stellen eines Verfahrens zur Detektion von Bakterien in aus Blut
abgeleiteten Proben gelöst.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst die folgenden Schritte:
-
In
einem ersten Schritt (a) werden von aus Blut abgeleitete Proben
zur Verfügung
gestellt.
-
Im
nächsten
Schritt (b) werden, gegebenenfalls und bevorzugt, aus den Blut abgeleiteten
Proben Aliquote steril entnommen. Dies wird bevorzugt unter Laminar-Flow-Bedingungen
durchgeführt.
-
Im
nächsten
Schritt (c) werden, gegebenenfalls und bevorzugt, die Aliquote (aus
Schritt b) zu einer Nährbouillon-Lösung zugegeben.
Die Nährbouillon-Lösung umfasst
Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose und
hat einen pH-Wert von 6,8 bis 7,8.
-
Im
nächsten
Schritt (d) erfolgt, gegebenenfalls und bevorzugt, eine Inkubation
der Nährbouillon-Lösung, mit
den zugegebenen Aliquoten, bei 30 bis 40°C für mindestens 2 Stunden.
-
Bevorzugt
ist eine Nährbouillon
(Heipha Diagnostika, Heidelberg, Deutschland) (Artikel-Nummer: 303r) enthaltend:
7,8
g Fleischpepton (meat peptone),
7,8 g Caseinpepton,
2,8
g Hefeextrakt,
5,6 g NaCl,
2,0 g Glukose,
pH 7,3 ± 0,2
-
Angaben
beziehen sich auf einen Liter.
-
Die
Nährbouillon
ist klar und gelblich gefärbt
und als Traubenzucker-Bouillon erhältlich (bei Heipha Diagnostika).
-
Im
nächsten
Schritt (e) werden die aus Blut abgeleiteten Proben konzentriert.
-
Im
nächsten
Schritt (f) werden die Nukleinsäuren
aus den Bakterien extrahiert unter der Verwendung eines Lyse-Puffers,
der eine erste interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der
Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution.
-
Im
nächsten
Schritt (g) werden die bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte aus dem vorhergehenden Schritt
(f) erhalten.
-
Im
nächsten
Schritt (h) wird ein PCR-Mastermix, ohne DNA-Polymerase, hergestellt.
Der PCR-Mastermix umfasst einen Satz Oligonukleotide von je einem
Sense-Primer, einem Antisense-Primer und einer Sonde, wobei der
eine Satz Oligonukleotide spezifisch für bakterielle Nukleinsäuren ist.
Der PCR-Mastermix umfasst noch eine weitere Sonde, die spezifisch
für die
interne Kontroll-Nukleinsäure
ist. Die zwei Sonden, die vom PCR-Mastermix umfaßt sind, sind jeweils mit zwei
Fluoreszenzfarbstoffen markiert.
-
Im
nächsten
Schritt (i) werden der PCR-Mastermix (von Schritt h) und die (in
Schritt g) erhaltenen bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte durch Zugabe von
DNAse I und nachfolgende Zugabe von Proteinase K behandelt.
-
Im
nächsten
Schritt (j) wird DNA-Polymerase zum behandelten PCR-Mastermix (aus
Schritt i) zugegeben.
-
Im
nächsten
Schritt (k) werden die behandelten bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte
(aus Schritt i) zum behandelten PCR-Mastermix, einschließlich DNA-Polymerase,
zugegeben. Es wird Nukleinsäure-Amplifizierung
und die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren durchgeführt.
-
Das
Verfahren zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben
der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:
- a) zur Verfügung
stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
- e) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
- f) Extraktion der Nukleinsäuren
aus den Bakterien unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine
interne Kontroll-Nukleinsäure
umfaßt,
und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
- g) Erhalten der bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt f),
- h) Herstellen eines PCR-Mastermixes ohne DNA-Polymerase, umfassend
einen Satz Oligonukleotide von je einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer
und einer Sonde, wobei der eine Satz Oligonukleotide spezifisch
für bakterielle
Nukleinsäuren
ist, und weiter umfassend eine weitere Sonde, die spezifisch für die interne
Kontroll-Nukleinsäure
ist, und wobei die zwei Sonden jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen
markiert sind,
- i) Behandlung des PCR-Mastermixes von Schritt h) und der in
Schritt g) erhaltenen bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte durch Zugabe von
DNAse I und nachfolgende Zugabe von Proteinase K,
- j) Zugabe von DNA-Polymerase zum behandelten PCR-Mastermix aus
Schritt i),
- k) Zugabe der behandelten bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte
aus Schritt i) zum behandelten PCR-Mastermix, einschließlich DNA-Polymerase,
und Durchführen
der Nukleinsäure-Amplifizierung,
und
- l) Detektion der amplifizierten bakteriellen Nukleinsäuren.
-
Das
Verfahren zur Detektion von Bakterien in aus Blut abgeleiteten Proben
der vorliegenden E umfasst bevorzugt weiterhin die folgenden Schritte:
- b) sterile Entnahme von Aliquoten der aus Blut
abgeleiteten Proben unter Laminar-Flow-Bedingungen,
- c) Zugabe der Aliquote aus b) zu einer Nährbouillon-Lösung, umfassend
Fleischpepton, Casein-Pepton, Hefeextrakt, NaCl und Glukose, mit
einem pH-Wert von 6,8 bis 7,8,
- d) Inkubation bei 30 bis 40°C
für mindestens
2 Stunden.
-
Erfindungsgemäß handelt
es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben oder
um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere handelt
es sich um Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende
Proben. Die zellulare Blutbestandteile enthaltenden Proben sind
dabei ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Thrombozyten enthaltende Proben, Thrombozyten-Konzentrate,
Einzelproben aus Pool-Thrombozyten-Konzentraten oder Thrombozyten-Apherese-Konzentrate.
-
Das
Verfahren eignet sich sowohl zum Screening von Einzelproben aus
Pool-Thrombozyten-Konzentraten
als auch aus Apherese-Konzentraten. Von jeder für das Screening vorgesehenen
Probe werden bevorzugt mindestens 3000 μl (3 ml) Probe, wie Thrombozyten-Konzentrat-Probe, benötigt.
-
Erfindungsgemäß umfasst
eine interne Kontroll-Nukleinsäure
mindestens eine Region, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich
spezifisch anlagern kann. Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure außerdem Regionen,
an denen sich Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, spezifisch
anlagern können,
so dass die interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert werden kann.
-
Erfindungsgemäß ist die
mindestens eine Region der internen Kontroll-Nukleinsäure, an
die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann,
unterschiedlich zu Sequenzen des Zieltargets, der Nukleinsäuren der
Bakterien, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen
werden sollen. Das heißt eine
Sonde, die spezifisch für
die bakteriellen Nukleinsäuren
ist, wird nicht an die interne Kontroll-Nukleinsäure hybridisieren bzw. sich
spezifisch anlagern. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine weitere
Sonde verwendet, deren Sequenz von der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet
wurde. Bevorzugt hat die weitere Sonde die Nukleotidsequenz von
SEQ ID NO. 8.
-
Es
wird bevorzugt, dass die interne Kontroll-Nukleinsäure eine
kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz ist bzw.
eine Nukleinsäure
ist, die eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz
umfasst.
-
Erfindungsgemäß zeichnet
sich eine kompetitive Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure dadurch
aus, dass sich die Regionen, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation
anlagern können,
nicht unterscheiden von den respektiven Regionen der Nukleinsäuren der
Bakterien, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen
werden sollen. Das heißt
dieselben Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, führen zur
Amplifikation der nachzuweisenden bakteriellen Nukleinsäuren und
zur Amplifikation der internen kompetitiven Kontroll-Nukleinsäure.
-
Dahingegen
sind die Regionen einer nicht kompetitiven Nukleotidsequenz bzw.
Nukleinsäure,
an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern
können,
verschieden zu den respektiven Regionen der bakteriellen Nukleinsäuren. Das
heißt
die Primer, wie Sense-Primer
und Antisense-Primer, die zur Amplifikation der nachzuweisenden
bakteriellen Nukleinsäuren
führen,
amplifizieren nicht zugleich die interne nicht kompetitive Kontroll-Nukleinsäure.
-
Weiter
bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine
Nukleotidsequenz, deren Zuckerbestandteil Ribose ist. Weiter bevorzugt
handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine
Nukleotidsequenz aus RNA, oder modifizierten Nukleoti den, aber auch
um RNA-Konstrukte, insbesondere synthetisierte RNA-Konstrukte. Eine
interne Kontroll-Nukleinsäure
kann auch eine Nukleotidsequenz aus DNA sein.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive
Nukleotidsequenz und hat die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder
ein Komplementär
davon.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz
und hat die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 2 oder ein Komplementär davon.
-
Unter
einer Multiplex-PCR versteht man die Amplifikation von mindestens
zwei Nukleinsäuresequenzen
in einem Amplifikationsschritt. In einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
alle bekannten Bakterien universell durch eine geeignete Wahl der
Primer- und Sonden-Sequenzen amplifiziert, sofern sie (die Bakterien)
in der Untersuchungsprobe vorhanden sind. Ferner wird die zugegebene interne
Kontroll-Nukleinsäure
amplifiziert und überwacht
damit die Amplifikation, vor allem in negativen Untersuchungsproben,
in denen keine Amplifikation bakterieller Nukleinsäuren stattfindet.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
verwendet einen PCR-Mastermix, umfassend einen Satz Oligonukleotide
von je einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und einer Sonde
und umfassend eine weitere Sonde.
-
Methoden
für die
Präparation
und Verwendung von Sonden und Primern werden zum Beispiel beschrieben
in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl.,
Vol. 1–3,
Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology,
Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience,
New York, 1987 (mit periodischen Aktualisierungen) und Innis et
al., PCR-Protokolle. A Guide to Methods and Applications, Academic
Press: San Diego, 1990. PCR-Primer-Paare können von einer bekannten Sequenz
zum Beispiel unter der Verwendung von Computerprogrammen, welche
für diesen
Zweck entwickelt wurden, wie zum Beispiel PRIMER3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)
abgeleitet werden.
-
Der
eine erfindungsgemäße Satz
Oligonukleotide aus je einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer
und einer Sonde ist spezifisch für
bakterielle Nukleinsäuren.
Die Sequenzen des Sense-Primers, des Antisense-Primers und der Sonde
werden bevorzugt abgeleitet von der 16S RNA-Region von Bakterien.
Dabei wurden die in den Gendatenbanken veröffentlichen Nukleotidsequenzen
der Bakterien zugrundegelegt. Bevorzugt entsprechen die Sequenzen
der Primer einem Teilbereich der 16S rRNA, der in allen bekannten
Bakterien sehr konserviert ist.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
hat der 1. Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 3 oder
ein Komplementär
davon, der 1. Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO.
4 oder ein Komplementär
davon und die Sonde 1 die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 5 oder
ein Komplementär
davon.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform,
wenn eine nicht kompetitive Kontroll-Nukleinsäure verwendet wird, umfaßt der PCR-Mastermix
einen weiteren Satz Oligonukleotide, der aus einem weiteren Sense-Primer,
einem weiteren Antisense-Primer und der weiteren Sonde besteht,
die jeweils spezifisch für
die interne (nicht kompetitive) Kontroll-Nukleinsäure sind. Die Sequenzen des
Sense-Primers, des Antisense-Primers und der Sonde werden bevorzugt
abgeleitet von der Sequenz der internen (nicht kompetitiven) Kontroll-Nukleinsäure, wie
SEQ ID NO. 1.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
hat der weitere Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO.
6 oder ein Komplementär
davon, der weitere Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ
ID NO. 6 oder ein Komplementär
davon und die weitere Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO.
8 oder ein Komplementär
davon.
-
Bei
der internen (nicht kompetitiven) Kontroll-Nukleinsäure mit
SEQ ID NO. 1 handelt es sich um ein synthetisiertes RNA-Konstrukt,
welches als Target für
die Primer mit den SEQ ID NOs. 6 und 7 sowie für die zugehörige Sonde mit SEQ ID NO. 8
dient.
-
Die
weitere Sonde mit SEQ ID NO. 8 erkennt sowohl die interne Kontroll-Nukleinsäure mit
SEQ ID NO. 1 als auch die interne Kontroll-Nukleinsäure mit
SEQ ID NO. 2.
-
Die
erfindungsgemäß jeweils
verwendeten Sense-Primer, Antisense-Primer, Sonden und internen Kontroll-Nukleinsäuren, wie
SEQ ID NOs. 1 bis 8, sind bevorzugt Nukleinsäuren, deren Zucker eine Ribose
ist, insbesondere handelt es sich um RNA.
-
Die
Sonden, die im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, sind mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, insbesondere
solche, die für
Realtime-PCR geeignet sind. Dabei handelt es sich bevorzugt um einen Fluoreszenzdonor
oder -reporter und einen Fluoreszenzakzeptor oder -quencher sind.
Eine Sonde ist bevorzugterweise mit einem Paar aus jeweils einem
Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder
-quencher markiert.
-
Erfindungsgemäß geeignete
Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend,
aus FAM, VIC, Joe, und Hex oder vergleichbaren Fluoreszenzdonoren/-reportern. Erfindungsgemäß geeignete
Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus TAMRA, BodyPi 564/570, Cy5, Black Hole Quencher 2, Black Hole
Quencher 3 oder vergleichbaren Fluoreszenzakzeptoren/-quenchern.
-
In
einer besonderen Ausführungsform
ist eine Sonde mit FAM und TAMRA markiert und die andere Sonde ist
mit VIC und TAMRA markiert. Weiter bevorzugt ist die Sonde, die
für die
bakteriellen Nukleinsäuren spezifisch
ist, mit FAM/TAMRA markiert, und die weitere Sonde, die für die interne
Kontroll-Nukleinsäure
spezifisch ist, mit VIC/TAMRA (5).
-
Bevorzugterweise
umfasst das Konzentrieren der Proben in Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens
Zentrifugieren. Dabei werden bevorzugterweise, die in der Probe
enthaltenen Bestandteile, wie Thrombozyten und Bakterien, angereichert.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden mit Barcode etikettierte Gefäße, die die Proben enthalten,
15 Minuten bei mind. 5000 × g
zentrifugiert. Anschließend
wird der Überstand
verworfen.
-
Erfindungsgemäß werden
der PCR-Mastermix vor Zugabe der DNA-Polymerase (aus Schritt h)
und die bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte
(aus Schritt g) vor der Nukleinsäure-Amplififizierung
behandelt. Durch diese Behandlung wird die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens
bei der Detektion von bakteriellen Nukleinsäuren in der nachfolgenden Realtime-PCR
signifikant erhöht.
Die erreichte Sensitivität
ist abhängig vom
untersuchten Bakterium und schwankt zwischen 2 CFU/ml und 50 CFU/ml.
-
Im
Gegensatz dazu erreichen bisherige Verfahren eine Sensitivität von 1000
CFU/ml (wie ScansystemTM, Hemosystem, Marseille,
Frankreich).
-
Diese
Behandlung (in Schritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens) umfasst zum
einen die Zugabe von DNAse I und eine Inkubation bei 30 bis 40°C, weiter
bevorzugt bei 37°C,
und ein anschließendes
Erhitzen auf über
90°C bis
110°C, weiter
bevorzugt auf 95°C.
Die Inkubation bei 30 bis 40°C,
weiter bevorzugt bei 37°C, erfolgt
bevorzugt über
einen Zeitraum von mindestens 60 min, weiter bevorzugt 30–120 min,
noch weiter bevorzugt 60 min. Das Erhitzen auf über 90°C, weiter bevorzugt auf 95°C, wird über einen
Zeitraum von 5–30 min,
weiter bevorzugt 10 min, durchgeführt.
-
Diese
Behandlung (in Schritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens) umfasst weiterhin
die nachfolgende Zugabe von Proteinase K und eine Inkubation bei
50 bis 60°C,
weiter bevorzugt bei 56°C,
und anschließendes
Erhitzen auf über
90°C bis
110°C, weiter
bevorzugt auf 95°C.
Die Inkubation bei 50 bis 60°C,
weiter bevorzugt bei 56°C,
erfolgt bevorzugt über
einen Zeitraum von mindestens 10 min, weiter bevorzugt 5–30 min, noch
weiter bevorzugt 10 min. Das Erhitzen auf über 90°C, weiter bevorzugt auf 95°C, wird über einen
Zeitraum von 5–30
min, weiter bevorzugt 10 min, durchgeführt.
-
In
Schritt j) wird die DNA-Polymerase zum behandelten PCR-Mastermix
zugegeben. Geeignete RNA-Polymerasen und DNA-Polymerasen sind dem
Fachmann bekannt. Besonders geeignet sind Taq-Polymerase, Superscript
III, Tth, Superscript I.
-
Die
Nukleinsäure-Amplifizierung
in Schritt k) ist bevorzugt eine Multiplex-PCR, weiter bevorzugt
eine Multiplex-Realtime-PCR. Bevorzugt erfolgt zunächst eine
reverse Transkription, bei der die vorhandene bakterielle RNA und
die interne Kontroll-RNA in eine cDNA umgeschrieben wird. Im weiteren
erfolgt dann die Amplifikation der cDNA durch eine DNA-Polymerase.
-
Die
Detektion der amplifizierten bakteriellen Nukleinsäuren erfolgt
mittels des Realtime-Prinzips.
Bindet/hybridisiert dabei eine Sonde an ihrer Zielsequenz, wird
der Reporter der Sonde durch die Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase,
wie Taq-Polymerase, im Verlauf der Amplifikation abgespalten. Der
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) vom Reporter zum Quencher
kann somit aufgrund der räumlichen Distanz
nicht mehr erfol gen. Die emittierte Energie des Reporters wird als
positives Signal aufgezeichnet. Da der Reporter der für die bakteriellen
Nukleinsäuren
spezifischen Sonde (z.B. FAM-markierte Sonde) Fluoreszenz in einem
anderen Wellenbereich emittiert als der Reporter der weiteren Sonde,
die für
die interne Kontroll-Nukleinsäure
spezifisch ist (z.B. VIC-markierte Sonde), können beide Amplifikationen
voneinander unterschieden werden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt es, alle transfusionsrelevanten Bakterien (z. B. Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Bacillus cereus
und Klebsiella pneumoniae) zu detektieren.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
amplifizieren die verwendeten Primer und Sonden in einem sehr konservierten
Bereich der bakteriellen 16S mRNA. Von daher ist eine universelle
Amplifikation in allen Bakterien möglich. Gezeigt werden konnte
dies bisher für
folgende Bakterien:
- – Staphylococcus chonii
- – Streptococcus
saccharolyticus
- – Bacillus
suppecies
- – Micrococcus
luteus
- – Propionibakterium
acnes
- – Klebsiella
pneumoniae
- – Escherichia
coli
- – Staphylococcus
aureus
- – Staphylococcus
epidermidis
-
Weiter
bevorzugt kann die Anwesenheit dieser Bakterien, insbesondere Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Bacillus cereus
und Klebsiella pneumoniae, gleichzeitig detektiert werden, d.h.
die Bakterien bzw. deren bakterielle Nukleinsäuren werden in nur einem Verfahren,
das einen Amplifikationsschritt (Schritt k) umfasst, nachgewiesen.
-
Es
werden dabei Sensitivitäten
von zwischen 2 CFU/ml und 50 CFU/ml in Abhängigkeit vom untersuchten Bakterium
erreicht.
-
Durch
die Verwendung von unterschiedlichen Sonden in der erfindungsgemäßen Kombination
von einer spezifischen Sonde für
die Bakterien und einer Sonde für
die interne Kontroll-Nukleinsäure (mit
VIC als Reporter und TAMRA als Quencher) ist eine generische Amplifikation
von transfusionsmedizinisch relevanten Bakterien (wie zum Beispiel
S. aureus, S. epidermidis, K. pneumoniae, B. Cereus) möglich. Somit
ist das erfindungsgemäße Verfahren
für das
Screening von Thrombozytenproben von Einzelproben geeignet.
-
Der
Vorteil einer gemeinsamen Amplifikation in einem Reaktionsansatz
liegt im geringeren Materialverbrauch an Reagenzien (Enzymen, Primer)
sowie in einer Reduzierung der Amplifikationsgeräte (Thermocycler). Die Anwendung
des erfindungsgemäßen Primerdesigns
ermöglicht
die parallele Amplifikation von Bakterien und einer internen Kontroll-Nukleinsäure, ohne
dass die Amplifikationseffizienz bei Bakterien relevant reduziert
wird.
-
Durch
die spezielle Vorbehandlung des PCR-Mastermixes sowie der bakteriellen
Nukleinsäure-Extrakte
kann eine unspezifische Amplifikation bei den Negativkontrollen
sowie bei den Wasserkontrollen vermieden werden. Eine Reduzierung
der Amplifikationseffizienz würde
deutlich werden in einer Verschiebung des CT-Wertes (Cycle Treshold-Wert
= der Amplifikationscyclus, in dem das spezifische Fluoreszenzsignal
gegenüber
dem Hintergrund detektiert wird). Eine Verschiebung des CT-Wertes
bei den Positivkontrollen tritt nicht auf. Durch die spezielle Behandlung
wurde die Sensitivität
des Bakterien-Realtime-PCR signifikant erhöht.
-
Die
vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen
illustriert. Durch die beschriebenen Beispiele/Figuren wird gezeigt,
dass die erfindungsgemäßen Primer/Sonden-Kombinationen der
Bakterien-Multiplex-PCR zuverlässig
alle untersuchten transfusionsmedizinisch relevanten Bakterien nachweist. Ferner
ist die Durchführung
der beschriebenen Kombination aus spezifischen Primern, Sonden und
interner Kontrolle zum Screening von Thrombozyteneinzelproben geeignet.
Die Sensitivität
ist abhängig
vom untersuchten Bakterium und schwankt zwischen 2 CFU/ml und 50
CFU/ml.
-
Figuren
-
1. Amplifikationsblot
einer Realtime-Multiplex-Amplifikation ohne Inaktivierung des PCR-Mastermixes.
-
Untersucht
wurde das Bakterium Staphylococcus aureus (PEI-23-03). Proben mit
einer Bakterienkonzentration von 104 CFU/ml
und 105 CFU/ml zeigen einen stärkeren Signalanstieg
als Proben mit einer geringeren Bakterienkonzentration. Aufgrund
dessen, dass auch negative Kontrollproben einen Signalanstieg zeigen,
liegt die Nachweisgrenze für
diese PCR bei > 1000
CFU/ml.
-
2. Amplifikationsblots
von Realtime-Multiplex-Amplifikation mit Inaktivierung des PCR-Mastermixes.
-
Untersucht
wurde das Bakterium Klebsiella pneumoniae (PEI-08-07).
- A
- ohne DNAse I-Behandlung.
- B
- mit DNAse I-Behandlung
und nachfolgender Proteinase K-Behandlung.
-
Durch
die Behandlung mit DNAse I und Proteinase K kommt es zu einer Reduktion
des unspezifischen Signals bei den Negativkontrollproben sowie bei
den Wasserkontrollenproben (NTC = No Template Control), ohne dass
dadurch der CT-Wert der Positivproben verschoben wird.
-
3. Vergleichende
Untersuchung zwischen der Realtime-Multiplex-PCR sowie zwei weiteren
Nachweisverfahren für
Bakterien (FACS-Methode und ScansystemTM)
in Thrombozytenkonzentraten.
-
Untersucht
wurden 4 transfusionsrelevante Bakterien: Staphylococcus aureus
(S. aureus), Escherichia coli (E. coli), Bacillus cereus (B. cereus)
und Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae). Die Thrombozytenkonzentrate
wurden mit zwei unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen gespikt,
10 CFU/ml (A und B) und 10 CFU/Beutel (C und D).
-
Beispiele
-
Materialien:
-
1. Enzyme
-
Folgende
Enzyme wurden verwendet:
| Produkt | RNasin | DNAse 1 | Proteinase K | Superscript III |
| Lieferant | Promega | Roche | Fermentas | Invitrogen |
| Katalognr. Lieferant | N2515 | 776785/001 | EO049 | 18080-085 |
| Inhaltsstoffe | Ribonuklease-Inhibitor | DNAse I | Proteinase K | M-MLV RT mit RNase H Aktivität |
| Konzentration | 40 IU/μl | 10000 U/ml | 600u/ml | 200 IU/μl |
| | | (10U/μl) | (20mg/ml) | |
-
2. Interne Kontroll-Nukleinsäuren
-
Folgendes
Oligonukleotid wurde als interne Kontroll-Nukleinsäure verwendet
und zu dem Lyse-Puffer vor der Extraktion addiert wird („gespikt"). Dabei handelt
es sich bevorzugt um ein RNA-Konstrukt, das als nicht kompetitive
Kontrolle fungiert.
| Produkt | Interne Kontrolle |
| Hersteller | BSD BaWüHe |
| Stocklösung Lotnr. | Bak-IC |
| Inhaltsstoffe | Oligonukleotid (RNA) |
| Sequenz | 5'-GGG AGA AAC CCA CUG CUU AAG CCU CAA
UAA AGC UUG |
| | CCU UGA GCU AGA CUC CCU
AGC AAU CAA UGC AUU UCU CUA |
| GCA GUG GCG CCC GAA CAG
GGA CCU GAA AAA AAA AAA AAA |
| = SEQ ID NO. 1 | AAA AAA AAA AAA AA-3' |
| Konz. Stammlösung | 3,84 × 1012 Kopien/μl |
| Konz. Aliquot | Soll Ct 24 ± 4 Ct |
| Konz. pro PCR-Ansatz | ca. 150 Kopien/PCR |
-
Folgendes
Oligonukleotid kann als interne Kontroll-Nukleinsäure verwendet
und zu dem Lyse-Puffer vor der Extraktion addiert werden („gespikt"). Dabei handelt
es sich um ein RNA-Konstrukt,
das als kompetitive Kontrolle fungiert.
| Produkt | Interne Kontrolle |
| Hersteller | BSD BaWüHe |
| Stocklösung Lotnr. | |
| Inhaltsstoffe | Oligonukleotid (RNA) |
| Sequenz | 5'-GGG AGA AAC CCA CUG CUU AAC UCA AAG
GAA UUG ACG |
| | GG GCU AGA CUC CCU AGC
AAU CAA UGC AUU UCU GUC GUC |
| AGC UCG UGU CGU GGA CCU
GAA AAA AAA AAA AAA AAA |
| = SEQ ID NO. 2 | AAA AAA AAA AA-3' |
| Konz. Stammlösung | 3,84 × 1012 Kopien/μl |
| Konz. Aliquot | Soll Ct 24 ± 4 Ct |
| Konz. pro PCR-Ansatz | ca. 150 Kopien/PCR |
-
3. Primer und Sonden
-
Folgende
Primer und Sonden wurden für
eine Multiplex-PCR verwendet, bei welcher eine nicht kompetitive
interne Kontroll-Nukleinsäure
(SEQ ID NO. 1) verwendet wurde. Bei den Primern und Sonden handelt es
sich bevorzugt um RNA (Nukleotid T entspricht dann U).
| Produkt | 1. Sense
Primer | 1. Antisense
Primer | Sonde 1 | 2. Sense
Primer IC | 2. Anti-Sense
Primer
IC | Sonde 2
IC |
| Kennzeichnung | BAC 1 | BAC 2 | BAC 3 | IC 1 | IC 2 | IC 3 |
| Lieferant | variabel | Variabel | variabel | variabel | variabel | ABI |
| Katalognr. | online | online | online | online | online | online |
| | Bestellung | Bestellung | Bestellung | Bestellung | Bestellung | Bestellung |
| Inhaltsstoffe | Oligo | Oligo | Oligo | Oligo | Oligo | Oligo |
| | nukleotid | nukleotid | nukleotid | nukleotid | nukleotid | nukleotid |
| Sequenz | 5' AAC | 5' ACG | 5' CAC | 5' AAG | 5' GTT | 5' CTA |
| | TCA | ACA | AAG | CCT | CGG | GAC |
| | AAG | CGA | CGG | CAA | GCG | TCC |
| | GAA | GCT | TGG | TAA | CCA | CTA |
| | TTG | GAC | AGC | AGC | CTG | GCA |
| | ACG | GAC 3' | ATG | TTG | CTA G 3' | ATC |
| | GG 3' | | TGG T 3' | CCT | | AAT |
| | | | | TGA 3' | | GCA |
| | | | | | | TT 3' |
| SEQ ID NO. | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Fluoreszenzfarbstoffe | n. a. | n. a. | 5'FAM
3'TAMRA | n. a. | n. a. | 5'VIC
3'TAMRA |
| Aufreinigung | HPLC | HPLC | HPLC | HPLC | HPLC | HPLC |
-
Der
1. Sense-Primer, der 1. Antisense-Primer und Sonde 1 bilden einen
Satz Oligonukleotide. Der weitere (2.) Sense-Primer, der weitere
(2.) Antisense-Primer und die weitere Sonde (2) bilden einen weiteren
Satz Oligonukleotide, der spezifisch für die interne Kontroll- Nukleinsäure ist
und deren Sequenzen von der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet
wurden.
-
4. Positivkontrollen
-
Folgende
bakterielle Positivkontrolle wurde verwendet:
| Produkt | Positivkontrollen (100
CFU/ml) |
| Hersteller | BSD BaWüHe |
| Inhaltsstoffe | K. pneumoniae (PEI-08-07) |
| Plasmakonservennr. | 020150871 |
| Konz der Plasmakonserve | 2,77 × 108 CFU/ml |
| Kalibriert | PEI Standard |
-
Beispiel 1 Extraktion der Nukleinsäuren aus
den Bakterien in den untersuchten Proben
-
Dazu
wird ein kommerzieller Extraktionskit verwendet, bevorzugt ein Qiagen
Viral Extraktions Kit [Qiagen 52904 Qiamp Viral RNA mini Kit (5)].
Es wird nach dem folgenden modifizierten Protokoll verfahren:
-
1. Vorbereiten der Extraktionsreagenzien
-
Alle
Extraktionsreagenzien werden entsprechend der Herstellerangaben
(Qiagen) vorbereitet. Aliquote des Nuklease-freien Wassers werden
bei 2–8°C aufbewahrt
und nur einmal verwendet. Alle anderen Reagenzien werden bei Raumtemperatur
gelagert. Der Puffer AVL (Bestandteil des Qiagen-Kits) wird bei
2–8°C im Kühlschrank
aufbewahrt. Vor Verwendung müssen
durch Erwärmen
auf 80°C
für maximal
5 Minuten die präzipitierten
Salze gelöst
werden.
-
2. Spiken der internen Kontroll-Nukleinsäure (IC)
zum Lyse-Puffer
-
Die
interne Kontroll-Nukleinsäure überwacht
die Effizienz der Extraktion und vor allem der späteren Amplifikation.
Die Zugabe der internen Kontroll-Nukleinsäure (IC) muss mit gestopften
Pipettenspitzen durchgeführt
werden. Es wurde die interne Kontroll-Nukleinsäure SEQ ID NO. 1 verwendet.
-
3. Extraktion von Einzelproben
-
- • Zu
dem Zellpellet werden 400μl
mit IC gespiktes AVL pipettiert, es wird gut gevortext, in der Minifuge
wird kurz herunter zentrifugiert und 10 min. bei RT stehen gelassen.
- • 400μl Ethanol
werden zur Probe pipettiert, es wird gut ge-vortext und herunter
zentrifugiert (Minifuge).
- • Die
Hälfte
der Lösung
wird mit einer Einmaltransferpipette auf die Säule gegeben, 1 min. bei 8000
U/min (6082 × g)
zentrifugiert, Collection Tube wird verworfen und Säule in ein
neues Collection Tube gegeben.
- • Die
zweite Hälfte
der Lösung
wird mit einer Einmaltransferpipette auf die Säule gegeben, 1 min. bei 8000 U/min
(6082 × g)
zentrifugiert, Collection Tube wird verworfen und Säule in ein
neues Collection Tube gegeben.
- • 500μl AW 1 (Waschlösung Kit
Bestandteil des Qiamp Viral RNA min Kit) wird auf die Säule pipettiert,
1 min. bei 8000 U/min zentrifugiert, Collection Tube wird verwerfen
und Säule
in ein neues Collection Tube gegeben.
- • 500μl AW 2 (Waschlösung Kit
Bestandteil des Qiamp Viral RNA min Kit) wird auf die Säule pipettiert,
1 min. bei 8000 U/min zentrifugiert, Collection Tube wird verworfen
und Säule
in ein neues Collection Tube gegeben.
- • Es
wird 2 min. bei 13.000 U/min (16.060 × g) zentrifugiert und Collection
Tube wird verworfen.
- • Säulen werden
auf vorbereitete etikettierte RNase-freie Reaktionsgefäße gesetzt.
- • Es
wird 40μl
80°C heißes Nuklease-freies
Wasser auf die Säule
pipettiert, 1 min. bei 8000 U/min zentrifugiert – nicht mehr als 6–8 Proben
auf einmal
- • Säule wird
verworfen, Eluat = bakterielles Nukleinsäure-Extrakt
-
Die
Extrakte werden bis zur Weiterverarbeitung maximal 1 Stunde bei
Kühlschranktemperatur
aufbewahrt. Bei längerfristiger
Aufbewahrung sind die Extrakte bei –20°C zu lagern.
-
Beispiel 2 Vorbereitung und Behandlung
des PCR-Mastermixes und der bakteriellen Nukleinsäure-Extrakte
-
Dabei
wird wie folgt vorgegangen:
- 1. Herstellen des
Mastermixes (Zusammensetzung, siehe Tabelle 1) ohne die DNA-Polymerase (z.B.
Taq)
- 2. Zugabe von 1μl
DNAse I zu dem Mastermix sowie zu den bakteriellen Nukleinsäure-Eluaten der Proben
- 3. Inkubation bei 37°C
für 60
min, anschließend
Erhitzen auf 95°C
für 10
min
- 4. Zugabe von Proteinase K (1μl
[20mg/ml]), Inkubation bei 56°C
10 min, anschließend
Erhitzen auf 95°C für 10 min
-
5. Zugabe der DNA-Polymerase (z.B. Taq)
zu dem Mastermix
-
Die
Einheiten „mM" und „μM" stehen im Folgenden
für die
Einheiten mmol/l bzw. mmol/l. Tabelle 1 Zusammensetzung des PCR-Mastermixes
| Material | 1facher
Mix
[μl] | 60facher
Mix
[μl] |
| MgCl2
(3mM) | 7,67 | 460,2 |
| TB-Puffer | 5 | 300 |
| U-Mix
(200μM) | 4 | 240 |
| 1.
Sense-Primer
(10μM)
SEQ
ID NO. 3 | 3 | 180 |
| 1.
Antisense-Primer
(10μM)
SEQ
ID NO. 4 | 3 | 180 |
| Sonde
1
(10μM)
SEQ
ID NO. 5 | 0,5 | 30 |
| 2.
Sense-Primer
(10μM)
SEQ
ID NO. 6 | 3 | 180 |
| 2.
Antisense-Primer (10μM)
SEQ
ID NO. 7 | 3 | 180 |
| Sonde
2
(10μM)
SEQ
ID NO. 8 | 0,5 | 30 |
| Taq-Polymerase
(1U/μl) | 0,15 | 9 |
| Rnase
out (RNasin)
(40 IU/μl) | 0,15 | 9 |
| RT
SS III
(200 IU/μl) | 0,03 | 1,8 |
| Gesamtvolumen | 30 | 1800 |
-
Beispiel 3 Amplifikation auf dem TaqMan
ABI 7000 (9600 Emulation Mode) oder Taq-Man ABI 7700
-
1. Voreinstellungen bei der Erstellung
eines neuen PCR-Laufs am ABI 7000
-
Wählen Sie
auf dem ABI PRISM® 7000 SDS den unter File
befindlichen Menüpunkt
New an und stellen Sie für
das neue Dokument die folgenden Grundeinstellungen ein: Assay: Absolute
Quantitation; Container: 96-Well Clear; Template: Blank Document.
Bestätigen
Sie Ihre Eingaben (OK).
-
Es
ist sinnvoll alle Einstellungen der Programmierung eines Bak-PCR-Laufs
in Form eines Templates (SDS Template [*.sdf]) zu speichern, das
dann jederzeit zur Verfügung
steht.
-
2. Auswahl der Detektoren
-
Im
Hauptmenü unter
dem Punkt Tools-Detector Manger wählen Sie unter der Option File-New an und nehmen
folgende Einstellungen vor:
| Nachweis | Reporter | Quencher |
| Bakterien-RNA | FAM | TAMRA |
| Interne Kontrolle (Bak-IC) | VIC | TAMRA |
-
Durch
Bestätigung
der Eingaben mit OK kehren Sie zum Detector Mangager zurück. Markieren
Sie die erstellten Detektoren und diese durch Anklicken der Option
Add to Plate Document zum Well Inspector. Mit Done schließen Sie
das Fenster.
-
3. Zuordnung der notwendigen
Informationen zu den Plattenpositionen
-
Die
unter View befindliche Option Well Inspector wird geöffnet. Markieren
Sie die zum Bak Nachweis belegten Plattenpositionen und ordnen Sie
diesen Positionen die ausgewählten
Detektoren zu, indem Sie die Use-Option beider Detektoren aktivieren.
Unter Sample Name können
Sie die Probenbezeichnung eingeben. Wählen Sie dann für jeden
Probentyp die Funktion (Task) fest:
| Probentyp | Funktion (Task) | Konzentration | Reporter | Quencher |
| | | (Quantity) | | |
| Probe | Unknown | – | FAM | TAMRA |
| Negativkontrolle | NTC | – | FAM | TAMRA |
-
Alternativ
können
Sie ein extern erstelltes Sample Setup mit allen Informationen zu
Detektoren und Probenbezeichnung importieren indem Sie im Menü File-Import-Sample
Setup die entsprechende Excel-Datei anwählen. Zur genauen Struktur
dieser Liste lesen Sie bitte im ABI-7000 User Guide nach.
-
Außerdem muß darauf
geachtet werden, dass als passive Referenz der Farbstoff ROX im
Well Inspector eingestellt ist.
-
4. Eingabe des Temperaturprofils
-
In
der SDS-Software erfolgt die Programmierung der Thermocyclerbedingungen
auf der Instrument-Ebene. Folgendes Temperaturprofil ist für die DRK
Bak PCR zu verwenden:
-
Es
muss darauf geachtet werden, dass der Emulation Mode aktiviert ist
und ein Reaktionsvolumen von 50μl
eingestellt wurde.
-
5. Speichern des PCR-Laufs
-
An
dieser Stelle können
Sie die eingegebenen Einstellungen (Setup) als Maske abspeichern,
um sie für
spätere
Anwendungen in veränderter
oder unveränderter
Form erneut zu nutzen. Durch das Abspeichern der Einstellungen als
SDS Template (*.sdt) in dem Ordner Template Directory (Lokales Laufwerk
[C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, angelegt von Applied
Biosystems) ist diese Datei aus der Template Drop-down-Liste in
dem New Document-Fenster direkt anwählbar. In anderen Ordnern gesicherte
Vorlagen müssen über Browse
geöffnet
werden. Vor dem Starten des PCR-Laufs achten Sie bitte darauf, diesen
erneut als SDS Document (*.sds) abzuspeichern. Damit stellen Sie
die Speicherung der sich im Verlauf der PCR gesammelten Daten sicher.
-
6. Starten des PCR-Laufs
-
Starten
Sie den PCR-Lauf durch Anwählen
der Option Start unter dem Menüpunkt
Instrument oder des Feldes Start auf der Instrument-Ebene.
-
7. Auswertung der Bakterien Multiplex
Realtime PCR
-
Eine
vorliegende, gültige
Kalbrierung der Farbstoffe (Pure Spectra Component File) und des
Hintergrundes (Background Component File) ist bei Inbetriebnahme
der Geräte
unbedingt erforderlich. Diese Kalibrierungsdateien werden wie folgt
zur exakten Berechnung der Ergebnisse benötigt:
Sämtliche
die Messung beeinflussenden gerätebedingten
Störsignale
werden von der Sequence Detection Software der ABI PRISM® Sequence
Detection Systems mit Hilfe des Background Component Files eliminiert.
-
Zudem
treten bei Multicolor-Analysen Interferenzen zwischen den Emissionssprektren
der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe auf. Die Software der ABI PRISM® SDS
kompensiert diese Interferenzen durch Verrechnung mit den im Pure
Spectra Component File gespeicherten Spektraldaten der einzelnen
Farbstoffe. Die Zuordnung der im Verlauf der PCR über das
gesamte messbare Spektrum gesammelten Fluoreszenzdaten zu den programmierten
Detektoren nimmt die Software ebenfalls mit Hilfe der Pure Spectra
Components vor. Anschließend
werden die ermittelten Fluoreszenzdaten der einzelnen Farbstoffe
zur Verrechnung von tube-to-tube Variationen (Fluoreszenzunterschiede
zwischen verschiedenen PCR-Ansätzen)
durch das Signal der passiven Referenz (ROX) geteilt. Die auf diese
Weise normalisierten Signale können
mit Hilfe des Amplification Plots ausgewertet werden.
-
Die
bei der Auswertung eines PCR-Laufs genutzten Kalibrierungsdateien
werden beim Abspeichern automatisch mitgesichert. Sollten keine
Kalibrierungsdateien installiert sein, erstellen Sie diese Dateien
bitte unter Beachtung der Anleitung im ABI PRISM® SDS
User Guide/Manual.
-
Beispiel 4 Realtime-Multiplex-Amplifikation
ohne Inaktivierung des PCR-Mastermixes
-
Untersucht
wurde das Bakterium Staphylococcus aureus (PEI-23-03). Es erfolgte
die in Beispielen 1 und 3 beschriebene Extraktion und Amplifikation,
ohne dass der Master-Mix, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit DNAse
I und Proteinase K vorbehandelt wurde.
-
Der
Amplifikationsblot (1) zeigt einen spezifischen
Signalanstieg für
alle Proben. Proben mit einer Bakterienkonzentration von 104 CFU/ml und 105 CFU/ml
zeigen einen stärkeren
Signalanstieg als Proben mit einer geringeren Bakterienkonzentration.
Aufgrund dessen, dass auch negative Kontrollproben einen Signalanstieg
zeigen, liegt die Nachweisgrenze für diese PCR bei > 1000 CFU/ml.
-
Beispiel 5 Realtime-Multiplex-Amplifikation
mit Inaktivierung des PCR-Mastermixes
-
Untersucht
wurde das Bakterium Klebsiella pneumoniae (PEI-08-07). Es erfolgte
die in Beispielen 1 und 3 beschriebene Extraktion und Amplifikation.
Vor der Durchführung
der PCR wurden jedoch sowohl der Master-Mix als auch die extrahierten
Eluate der Untersuchungsproben (= bakterielle Nukleinsäure-Extrakte), die
Negativkontrollen und auch das Untersuchungswasser, wie in Beispiel
2 beschrieben, mit DNAse I und anschließend mit Proteinase K behandelt.
-
In
diesem Experiment zeigt sich (siehe 2), dass
es durch die Behandlung mit DNAse I und Protinase K zu einer Reduktion
des unspezifischen Signals bei den Negativkontrollproben sowie bei
den Wasserkontrollenproben kommt, ohne dass dadurch der CT-Wert
(Cycle-Treshhold
Wert) der Positivproben verschoben wird.
-
Beispiel 6 Sensitvität der Realtime-Multiplex-PCR.
-
Es
wird eine Verdünnungsstufe
des Bakteriums Klebsiella pneumoniae (PEI-08-07) von 2 × 106 CFU/ml bis 2 × 100 CFU/ml
pipettiert und anschließend
extrahiert, behandelt und amplifiziert, wie in den Beispielen 1
bis 3 beschrieben.
-
Ergebnis:
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Realtime-Bakterien-Multiplex-PCR
lässt sich
noch bei 2 CFU/ml eine spezifische Amplifikation des untersuchten
Bakteriums nachweisen und von den Negativkontrollen und den Wasserkontrollen
unterscheiden.
-
Beispiel 7 Vergleichende Untersuchung
zwischen der Realtime-Multiplex-PCR sowie zwei weiteren Nachweisverfahren
für Bakterien
(FACS-Methode und ScansystemTM) in Thrombozytenkonzentraten.
-
Untersucht
wurde in einer abschließenden
Vergleichsstudie die vorliegende Bakterien-PCR mit zwei weiteren
bakteriellen Nachweisverfahren, und zwar der FACS-Methode und ScansystemTM [Hemosystem, Marseille, Frankreich]. Untersucht
wurden 4 transfusionsrelevante Bakterien, und zwar
- – Staphylococcus
aureus (S. aureus)
- – Escherichia
coli (E. coli)
- – Bacillus
cereus (B. cereus) und
- – Klebsiella
pneumoniae (K. pneumoniae)
-
Die
Thrombozytenkonzentrate wurden mit zwei unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen
gespikt (10 CFU/ml und 10 CFU/Beutel). Jeder Versuch wurde in 10
Replikaten getestet. Bei den Beuteln handelt es sich um Beutel von
Terumo Corporation, 051005S2, steriler Lagerungsbeutel für Thrombozyten.
-
Die 3A–D zeigen
unabhängig
vom Bakterium bezogen auf die untersuchten Nachweismethoden die
höchste
Sensitivität
für die
Realtime-Bakterien-Multiplex-PCR.
-
Referenzen
-
- 1. Offergeld R, Ritter S, Faensen D, Hamouda
O. [Infection epidemiological data among blond donors in Germany
2003–2004.
Report of the Robert Koch Institute in accordance with Article 22
of the Transfusion Act]. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung
Gesundheitsschutz 2005; 48(11):1273–87.
- 2. Schmidt M HM, Heck J, Weis C, Montag T, Nicol SB, Seifried
E. ScansystemTM Enables Rapid and Sensitive Bacterial
Detection in Platelets Stored in Additive Solution with Implementation
of Standard Positive Control Capsules. Transfus Med Hemother 2006.
- 3. Schmidt M HM, Wahl A, Nicol SB, Montag T, Roth WK, Seifried
E. Fluorescence quencher improves Scansystem for rapid bacterial
detection. Vox Sang 2006.
- 4. Schmidt M, Weis C, Heck J, et al. Optimized Scansystem platelet
kit for bacterial detection with enhanced sensitivity: detection
within 24 h after spiking. Vox Sang 2005; 89(3):135–9.
- 5. Schmidt M, Hourfar MK, Nicol SB, Wahl A, Heck J, Weis C,
Tonn T, Spengler HP, Montag T, Seifried E and Roth WK. A comparison
of three rapid bacterial detection methods under simulated real-life
conditions. Transfusion 2006, accepted.
- 6. McDonald C, Pearce S, Wilkins K, Colvin J, Robbins S, Colley
L, Taylor J and Barbara J. Pall eBDS: an enhanced bacterial detection
system for screening platelet concentrates. Transfusion Medicine
2005; 15: 259–268.
-
-
