DE10320519A1

DE10320519A1 - Verfahren zum Nachweis infektiöser (+)-Strang-RNA-Viren, insbesondere infektiöser Enteroviren

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Publication number: DE10320519A1
Application number: DE2003120519
Authority: DE
Inventors: Despina Dr. Tougianidou; Thomas Dr. Maier; Manfred G. Dr. Bayer
Original assignee: 4base Lab Advanced Molecu GmbH; 4base Lab Advanced Molecular Analysis GmbH
Current assignee: 4base Lab Advanced Molecu GmbH; 4base Lab Advanced Molecular Analysis GmbH
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2004-11-25
Also published as: WO2004097040A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Nachweis infektiöser (+)-Strang-RNA-Viren, insbesondere Enteroviren, in einer Probe beschrieben. Hierbei wird zunächst eine Zellkultur mit der Probe beimpft, anschließend die beimpfte Zellkultur für einen Zeitraum von 0,5 bis 24 Stunden, vorzugsweise von 4 bis 6 Stunden, inkubiert. Anschließend wird die Zellkultur lysiert, RNA aus dem zellkultur-Lysat isoliert und virale (-)-Strang-RNA nachgewiesen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis infektiöser (+)-Strang-RNA-Viren, insbesondere infektiöser Enteroviren, in einer Probe.

Verfahren zum Nachweis von (+)-Strang-RNA-Viren in verschiedenen Proben sind im Stand der Technik vielfältig bekannt.

Zu den (+)-Strang-RNA-Viren zählen u.a. die Picornaviridae, die zu den kleinsten RNA-enthaltenden Viren zählen und eine der größten und wichtigsten Familie humanpathogener Viren darstel len. Unter die Picornaviridae fällt u.a. die Gruppe der Enteroviren, die wiederum in die Polio-, Coxsackie-A- und -B- sowie die Echoviren eingeteilt werden. Diese Viren sind allesamt humanpathogene Viren, die zu unterschiedlichen Krankheitssymptomen führen können. Sie werden per os aufgenommen und vermehren sich zunächst im lymphatischen Gewebe des Rachenraumes und später vor allem in der Darmwand, wo sie jedoch in der Regel keine Symptome verursachen. Über den Blutweg erreichen sie ihr „Zielorgan" und es kommt zur Organmanifestation, wobei jedoch die meisten Enterovirusinfektionen asymptomatisch verlaufen. Manifeste Enterovirusinfektionen verlaufen häufig uncharakteristisch mit schwach ausgeprägten klinischen Symptomen. Die Viren werden meist über einen längeren Zeitraum mit dem Stuhl ausgeschieden und können damit isoliert werden.

Da bei diesen Viren der Mensch das Wirtsreservoir darstellt, erfolgt die Übertragung direkt durch Schmutz- und Schmierinfektion oder aber über Lebensmittel und insbesondere Wasser. Üblicherweise kommen die meisten Enterovirusinfektionen mit lokalen Epidemien im Sommer und im Herbst vor. Die Inkubationszeit beträgt gewöhnlich ein bis zwei Wochen. Eine Virusausscheidung kann bereits kurz nach Beginn der Infektion erfolgen und über mehrere Wochen anhalten.

Da die Symptomatik gewöhnlich nicht erregerspezifisch ist, kann die Diagnose nur durch den Erregernachweis im Labor gesichert werden.

Prophylaktische Maßnahmen gegen Enterovireninfektionen sind nicht bekannt, rein präventiv wirken hygienische Maßnahmen, wobei ein großer Nachteil die hohe Resistenz der Viren gegenüber Desinfektionsmitteln ist.

Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf an Möglichkeiten zum Nachweis von Enteroviren, bspw. in wässrigen Proben wie Konzentrate aus Abwässern oder Trinkwasser, um rechtzeitig Vorsorgemaßnahmen treffen zu können, sollte der Erreger in den Proben vorhanden sein.

Zur Labordiagnostik für Enteroviren gehört die klassische Virusisolierung durch Anzüchten der Viren in Zellkultur. Dabei werden meist permanente Zelllinien mit den zu testenden Proben beimpft. Sind Viren in dieser Probe vorhanden, so kann sich das Virus vermehren, was zu einer charakteristischen Veränderung der beimpften Kulturen führt, die bereits lichtmikroskopisch in Form eines zytopathischen Effekts als Zellabrundungen erkennbar sind.

Nachteilig an dieser konventionellen Methode ist insbesondere die lange Zeitspanne, die abgewartet werden muss, um infektiöse Viren nachweisen zu können.

Daneben sind auch molekulare Nachweismethoden für Enteroviren bekannt, wozu insbesondere die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zählt, mit welcher für den Nachweis von Viren DNA-Abschnitte dieser Viren vervielfältigt werden können. Da das virale Genom der Enteroviren insgesamt als Plus-Strang-RNA vorliegt, muss für einen Nachweis über die PCR die RNA zunächst über eine reverse Transkription in DNA überführt werden, was als RT-PCR bezeichnet wird. Nach reverser Transkription der RNA in DNA kann diese dann über die Polymerase-Kettenreaktion amplifi ziert, also vervielfältigt werden. Dies ist notwendig, da die Mengen an vorliegender RNA für einen direkten Nachweis zu gering sind, und da DNA über die PCR einfach und schnell vervielfältigt werden kann. Erst die amplifizierte DNA ist dann für einen Nachweis in ausreichenden Mengen vorhanden.

Diese Techniken bieten den Vorteil, dass die virale DNA oder RNA sehr schnell – oft innerhalb weniger Stunden – nachgewiesen werden kann.

Ein großer Nachteil bei den eben genannten Nachweismethoden ist jedoch, dass durch diese Methoden nicht nur infektiöse Erreger nachgewiesen werden, sondern möglicherweise auch Erreger, die nicht mehr infektiös sind.

Dies kann insbesondere dann kritisch sein, wenn die Erreger bzw. die Probe, die möglicherweise die Erreger enthält, zuvor einer Desinfektion unterzogen wurden. In den desinfizierten Proben können demnach sowohl infektiöse Erreger vorliegen, als auch solche, die während der Desinfektion inaktiviert wurden und somit nicht mehr infektiös sind. Dies liegt darin, dass über die PCR oder RT-PCR lediglich nachgeprüft wird, ob generell Viren-DNA (bzw. indirekt Viren-RNA) vorhanden ist oder nicht. Dadurch lässt sich – sollte ein positiver Nachweis erfolgen – keine Aussage darüber machen, ob die amplifizierten Gensequenzen von Viren stammen, die noch infektiös sind, und somit eine Gefahr für den Menschen darstellen, oder nicht. Diese Frage ist u.a. im Bereich der Wasservirologie von großer Bedeutung, bspw. bei der Untersuchung von Trinkwasser, Wasser in Schwimmbädern oder anderen Gewässern, Abwässern etc. Daneben ist der Viren-Nachweis aber auch bei der Untersuchung von bspw. Patientenproben (bspw. Urin) oder Lebensmitteln erforderlich.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem schnell und ohne großen Aufwand infektiöse (+)-Strang-RNA-Viren, insbesondere infektiöse Enteroviren in Proben nachgewiesen werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass bei dem eingangs genannten Verfahren der Nachweis infektiöser (+)-Strang-RNA-Viren, insbesondere Enteroviren, in einer Probe mit den folgenden Schritten erfolgt:

a) Beimpfen einer Zellkultur mit der Probe,
b) Inkubieren der beimpften Zellkultur für einen Zeitraum von 0,5 bis 24 Stunden, vorzugsweise von vier bis sechs Stunden,
c) Lysieren der Zellkultur,
d) Isolieren von RNA aus dem Zellkultur-Lysat, und
e) Nachweisen der viralen (–)-Strang-RNA.

Ferner wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Oligonukleotiden mit den in dem beiliegenden Sequenzprotokoll aufgeführten Oligonukleotiden mit den SEQ-ID-Nrn. 1 bis 5 zum Nachweis von infektiösen Enteroviren in einer Probe.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird dadurch vollkommen gelöst.

Die Erfinder haben erkannt, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren eine Methode geschaffen wird, mit der durch die Kom bination des Verfahrens der Zellkultur und der RT-PCR replikative RNA-Formen von bspw. Enteroviren nachgewiesen werden können. Diese replikativen RNA-Formen sind nur während der Replikation (also der Virusvermehrung) der viralen RNA in den Zellen vorzufinden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden daher nur infektiöse Erreger identifiziert, so dass ein eindeutiger Nachweis von bspw. Enteroviren erfolgen kann, welche gefährlich für den Menschen sind.

Akhteruzzaman et al., „Cell-free, de novo Synthesis of Poliovirus", Science 254: 1647–1651 (1991), offenbaren zwar ein Verfahren, bei welchem sie Poliovirus-spezifische (–)-Strang-RNA nachwiesen. Dazu stellten sie einen zellfreien Extrakt aus nicht-infizierten HeLa-Zellen her und wiesen mittels RT-PCR nach, dass in diesem zellfreien Extrakt Poliovirus-RNA translatiert wurde und dass sich während der Translation Poliovirusspezifische (–)-Strang-RNA bildete. Die US 5,674,729 basiert auf diesen Daten und offenbart demnach ein Verfahren zur in vitro Synthese eines Picornavirus.

Diese Veröffentlichungen offenbaren jedoch ein Verfahren, mit welchem – im Gegensatz zu dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren – lediglich in vitro, d.h. in einem Zellextrakt, Picornavirus-spezifische RNA synthetisiert wird. Die Zellen, die von Akhteruzzaman et al. zur Herstellung des Zellextraktes verwendet wurden, waren nicht infiziert, das Virus wird vielmehr in den vorgefertigten Virus-freien Zellextrakt gegeben.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können zwei große Nachteile des Standes der Technik überwunden werden, nämlich die lange Zeitspanne beim direkten Viren-Nachweis über Zellkulturen und der mögliche Nachweis von Gensequenzen nichtinfektiöser Viren bei der RT-PCR. Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, dass es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich ist, innerhalb kurzer Zeit infektiöse Viren nachzuweisen und von nicht-infektiöse Viren zu unterscheiden.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können darüber hinaus unter Verwendung neuester Techniken viele Proben gleichzeitig getestet werden. Dies hat einerseits den Vorteil, dass eine Probe schnell, einfach und unter den gleichen Versuchsbedingungen mehrfach getestet werden kann. Andererseits kann mit dem Verfahren ein großer Probendurchsatz stattfinden, wodurch mehrere Proben unter den gleichen Versuchsbedingungen getestet werden können.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst zumindest eine Zellkultur mit den zu testenden Proben beimpft, wodurch eventuell in den Proben vorhandenes Virusmaterial hochverstärkt wird.

Hierbei ist bevorzugt, wenn als Zellkultur Affennierenzellen oder menschliche Zelllinien verwendet werden. So können bspw. als Affennierenzellen die Zelllinien AGMK (African Green Monkey Kidney) und BGMK (Buffalo Green Monkey Kidney) eingesetzt werden. Weitere geeignete Zelllinien sind bspw. RD (Rhabdomyosarcom-Zelllinie) oder Caco (Colon-Karzinom-Zelllinie). Alle Zelllinien sind bspw. bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) oder bei der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich.

In einem weiteren Schritt wird die beimpfte Zellkultur für einen bestimmten Zeitraum inkubiert, wobei vorzugsweise ein Zeitraum von vier bis sechs Stunden bei 37°C und 5% CO₂ gewählt wird. Dabei wird der Zeitraum derart gewählt, dass ausreichend Zeit für die Replikation der RNA bleibt, das Verfahren jedoch insgesamt gegenüber dem Stand der Technik beschleunigt wird.

Im nächsten Schritt erfolgt dann zunächst die Lyse der Zellkultur mit anschließender RNA-Isolierung. Beide Schritte können mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden und sind im Stand der Technik hinreichend beschrieben.

Die RNA-Isolierung wird bspw. durch Zellaufschluss unter denaturierenden Bedingungen vollzogen. Hierzu kann z.B. ein chaotropes Salz, insbesondere Guanidinium-Salze, wie bspw. Guanidinium-Isothiocyanat und Guanidinium-Hydrochlorid, eingesetzt verwendet werden. Das Verfahren unter Verwendung von Guanidinium-Isothiocyanat wurde bspw. beschrieben von Chomczynski und Sacchi, „Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanat-phenole-chloroforme extraction", Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987), wobei hier eine Mischung aus Guanidinium-Thiocyanat und Phenol-Chloroform verwendet wird. Dieses Verfahren ist insbesondere bei der Verarbeitung von vielen Proben oder zur Isolierung von RNA aus kleinen Mengen von Zellen oder Geweben nützlich. Durch die chaotropen Salze werden die infizierten Zellen lysiert, wodurch die in der Zelle enthaltenen Nukleinsäuren und Proteine freigesetzt werden. Durch den Einsatz von Phenol werden Proteine ausgefällt, wodurch lediglich RNA und DNA isoliert werden kann, wobei die DNA bspw. durch einen anschließenden DNAse-Verdau beseitigt werden kann. Der Einsatz von Phenol ist jedoch nicht zwingend erforderlich.

Ähnliche Verfahren, die angewendet werden können, sind bspw. beschrieben in der US 6,204,375 und der US 5,234,809 .

Durch den letztendlichen Nachweis von (–)-Strang-RNA erfolgt der eindeutige Nachweis von infektiösen Enteroviren. Da die Enteroviren „Plus-Strang"-RNA-Viren sind, d.h. Viren, deren Nukleinsäure direkt als mRNA wirkt, findet sich (–)-Strang-RNA auch nur nachdem infektiöse Viren eine Zelle infiziert haben. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist somit gesichert, dass auch nur infektiösen Viren eindeutig nachgewiesen werden. Daneben kann gleichzeitig mit dem Nachweis von (–)-Strang-RNA auch der Nachweis von (+)-Strang-RNA erfolgen.

In einer Ausführungsform des Verfahrens ist bevorzugt, wenn die Probe eine wässrige Probe ist.

Diese wässrige Probe kann bspw. eine Abwasser- oder Trinkwasserprobe sein, insbesondere Probenkonzentrate, ferner Proben oder Probenkonzentrate aus Teichen, Seen, Schwimmbädern etc., in welchen infektiöse Enteroviren nachgewiesen werden sollen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können jedoch auch bspw. Viren „direkt" im Patienten nachgewiesen werden, bspw. in Stuhl- oder Urinproben, oder aber auf und in Lebensmitteln, welche möglicherweise mit den Erregern kontaminiert sind.

Ferner können auch bereits desinfizierte Proben untersucht werden, da auf Grund der großen Resistenz der Enteroviren die große Möglichkeit besteht, dass trotz der Desinfektion infektiöse Viren in einer Probe vorliegen. Derartige Proben können daher bspw. Proben von bereits desinfizierter Haut sein, ferner von desinfizierten Oberflächen wie bspw. Böden, Wände, WC's, Instrumenten, außerdem von Textilien und von Trinkwasser und von Wasser in Schwimmbädern. Hierbei sind insbesondere Proben aus bspw. Krankenhäusern, Schwimmbädern und Kläranlagen interessant, die mit den üblicherweise verwendeten chemischen, physikalischen, oder sonstigen Desinfektionsmitteln behandelt wurden. Zu den üblicherweise verwendeten Desinfektionsmitteln zählen bspw. chemische Stoffe, wie Chlor und Jod und deren Verbindungen, ferner Äthyl- und Propylalkohol, Form- und Glutaraldehyd, usw. Als physikalische Desinfektionsmittel werden z.B. trockene oder feuchte Hitze, Ozon, UV-, Kathoden- und Röntgenstrahlen, Ultraschall usw. eingesetzt.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn in Schritt d) zunächst Gesamt-RNA und daraus virale RNA isoliert wird.

Mit diesem Verfahren wird somit zunächst jegliche RNA, die in den Zellen enthalten ist, isoliert, also sowohl virale RNA als auch zelleigene RNA. In einem weiteren Schritt kann schließlich virale und insbesondere die (–)-Strang-RNA aus der Gesamt-RNA isoliert und nachgewiesen werden, sollte in der zu testenden Probe infektiöses Enteroviren-Material vorhanden gewesen sein. Die Gesamt-RNA kann bspw. mit dem oben geschilderten Verfahren unter Verwendung chaotroper Salze gewonnen werden. Die RNA kann ferner bspw. durch Fast-prep mit Trizol^® (Gibco, USA) oder mit CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid; siehe Cheung et al., „A method to isolate RNA from gram-positive bacteria and mycobacteria", Anal. Biochem. 222: 511–514) isoliert werden.

Anschließend wird aus der Gesamt-RNA virale RNA isoliert. Die virale RNA kann dabei bspw. durch magnetische Trennung isoliert werden. Dieses Verfahren ist im Stand der Technik hinreichend bekannt und hat zum Vorteil, dass die virale RNA einfach und schnell von der Gesamt-RNA der Zellkulturen abgetrennt werden kann. Dabei werden Moleküle mit spezifischen biologischen Affinitäten über funktionale Gruppen an magnetische Partikel angebracht. Die entsprechenden, an die Moleküle bindenden Substanzen binden aufgrund ihrer Affinität an das mit den magnetischen Teilchen konjugierte Molekül und durch Anlegung eines Magnetfeldes kann dieser Komplex aus der Suspension entfernt werden. Ein derartiges System für die magnetische Trennung ist bspw. erhältlich von Dynal Biotech, Norwegen.

Beispiele für derartige Moleküle mit spezifischen biologischen Affinitäten sind Streptavidin und Biotin. In dem erwähnten Verfahren wird Streptavidin an magnetische Partikel gebunden. Biotin, mit welchem bspw. Oligonukleotide markiert werden können, bindet daraufhin an diese Komplexe. Über die mit Biotin markierten Oligonukleotide können dann die hierzu komplementären RNAs „gefischt" bzw. isoliert werden. Die komplementären RNAs binden an die biotinylierten Oligonukleotide und hierüber an die Streptavidin-Komplexe. Nach Anlegen des Magnetfelds können die gebundenen RNAs aus dem betreffenden Gemisch isoliert und in weiteren Schritten gereinigt werden.

Die virale RNA kann aber auch mit anderen Verfahren isoliert werden, bspw. mittels Immobilisierung der entsprechenden Oligonukleotide an Matrizes, die bspw, aus Cellulose besteht. Nach Zugabe des Zelllysates zu der Matrix binden die (zumindest teilweise) komplementären RNA-Sequenzen an die an die Matrix gebundenen Oligonukleotide und können anschließend eluiert werden.

In anderen Ausführungsformen ist bevorzugt, wenn in Schritt d) virale RNA isoliert wird.

Diese Maßnahmen haben zum Vorteil, dass die nachzuweisende virale RNA direkt aus den Zellkulturen isoliert wird, und die zelleigene RNA der Zellkulturen verworfen wird. Zur Isolierung können die oben erwähnten Techniken eingesetzt werden, oder aber andere im Stand der Technik hinreichend bekannte.

In einer weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, wenn zur Isolierung der viralen RNA zumindest eines der in dem beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführten Oligonukleotide mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 1 und 2 eingesetzt wird.

Die Sequenzen der Oligonukleotide sind nachfolgend wiedergegeben:

Diese Oligonukleotide, die jeweils zu einer bestimmten RNA-Sequenz komplementär sind, haben sich in eigenen Versuchen der Erfinder als besonders geeignet erwiesen. Die Oligonukleotide binden dabei an einen bestimmten Bereich der viralen Poliovirus-RNA, genauer gesagt an Position 531 bis 560 von PV1 (Datenbanknummer ACC J02281, siehe bspw. in der „Entrez Nucleotides"- Datenbank des NCBI, National Center for Biotechnology Information), wobei das Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 1 an den (–)-Strang bindet und das Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 2 an den (+)-Strang. Durch die Bindung der viralen RNA-Stränge an die Oligonukleotide können diese aus dem RNA-Gemisch isoliert werden. Die Oligonukleotide können bspw. mit Biotin markiert sein, wodurch sie an magnetische Streptavidin-Beads binden.

Bei einer weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, wenn Schritt e) über eine RT-PCR der viralen RNA und eine Detektion der Amplifikationsprodukte erfolgt.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die (–)-Strang-RNA – sollten infektiöse Enteroviren in der zu testenden Probe enthalten gewesen sein – auf besonders einfache und schnelle Weise nachgewiesen werden kann. Bei dieser Ausführungsform wird die isolierte virale RNA durch reverse Transkription zunächst in DNA umgeschrieben. Diese DNA kann im nächsten Schritt, nämlich durch die PCR, amplifiziert werden, so dass ausreichende Mengen der betreffenden Sequenzen vorliegen. Diese amplifizierten Sequenzen können anschließend durch weitere Verfahren nachgewiesen werden.

Als Enzym kann dabei bspw. die AMV (Avian Myoblastosis Virusreverse Transkriptase eingesetzt werden (bspw. erhältlich von Stratagene, USA), die beim Denaturierungsschritt der PCR inaktiviert wird. Ferner kann bspw. auch das Enzym Tth eingesetzt werden, das sowohl als DNA-Polymerase als auch – allerdings nur unter Vorliegen einer bestimmten Mangan-Konzentration (1 bis 4 mM) – als reverse Transkriptase arbeitet. Über eine niedrige Mangan-Konzentration (also unter 1 mM) bei den PCR-Schritten kann die reverse-Transkriptase-Funktion des Enzyms inaktiviert werden. Die RT-Aktivität des Enzyms erlischt daneben gänzlich, sobald Magnesium-Ionen vorliegen (siehe Myers et al., „Reverse Transcription and DNA Amplification by a Thermus thermophilus DNA Polymerase", Biochemistry 6; 30(31): 7661–7666 (1991)). Vorteilhaft an diesem Enzym ist dessen Thermostabilität, wonach die reverse Transkriptase auch bei höheren Temperaturen stattfinden kann.

Die Detektion des amplifizierten Produktes kann dabei bspw. durch FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) erfolgen. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner Schnelligkeit zum direkten Nachweis der amplifizierten Sequenzen besonders geeignet. So kann die PCR einerseits schnell durchgeführt werden und andererseits die Ergebnisse der PCR durch Aufzeichnung der Fluoreszenz während der Amplifikation simultan quantifiziert und analysiert werden. Dies gelingt durch die Verwendung von Hybridisierungssonden, die zu dem PCR-Ansatz gegeben werden und welche an die amplifizierten Sequenzen binden. Die Sonden sind dabei an ihren Enden mit Farbstoffen markiert, die als Donor- und Akzeptorfarbstoff fungieren. Ein Donor-Fluorophor, welches mit einer Lichtquelle angeregt wird, überträgt seine Emissionsenergie nur dann auf ein Akzeptor-Fluorophor, wenn letzterer sich in unmittelbarer Nähe zum Donor-Fluorophor befindet. Der Akzeptor wiederum emittiert Licht mit einer höheren Wellenlänge, die in vorgesehenen Kanälen gemessen wird. Die Lichtquelle kann den Akzeptor-Farbstoff selbst nicht anregen. Dieser Vorgang wird als Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) bezeichnet und wurde u.a. von Cardullo et al., „Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy tranfer", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790–8794 (1988), beschrieben.

Kits und Gerätschaften zur Durchführung dieses Verfahrens sind bspw. erhältlich von Roche-Applied Science, Deutschland (siehe „LightCycler^TM" und verwandte Produkte; Wittwer et al., „Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification", Biotechniques 22: 130–138 (1997)). Hier wird der Vorteil ausgenutzt, dass das emittierte Licht direkt im PCR-Gerät gemessen und ausgewertet werden kann, so dass keine unnötigen Zwischenschritte geschaltet werden müssen.

Über die Verwendung von spezifischen Oligonukleotid-Sonden können darüber hinaus auch mehrere Fragmente in einem Gefäß amplifiziert und nachgewiesen werden.

Die Detektion der Amplifikationsprodukte kann auch bspw. durch Gelelektrophorese mit Sichtbarmachung der amplifizierten DNA durch herkömmliche Methoden, wie bspw. mit Ethidiumbromid erfolgen, oder durch Southern-Transfer der Amplifikate auf Membranen und nachfolgender Oligonukleotidhybridisierung. Eine weitere Methode ist der PCR-ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), bei welchem die PCR mit einem markierten Oligonukleotid (bspw. Digoxigenin) durchgeführt wird. Anschließend werden Biotin-markierte Sonden an die Amplifikate hybridisiert und die Hybride an Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten immobilisiert. Der Nachweis der gebundenen Hybride erfolgt dann mit einem geeigneten Substrat (Anti-Digoxigenin-Peroxidase-Konjugat und ABTS^®, erhältlich von Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland).

In einer besonderen Ausführungsform ist bevorzugt, wenn für die RT-PCR ein Bereich in dem 5'-nicht kodierenden Bereich der viralen RNA amplifiziert wird.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass durch die Amplifikation eines Bereiches in dem 5'-nicht kodierenden Bereich eine Region nachgewiesen werden kann, die in den Genomen insbesondere der Enteroviren stark konserviert ist, so dass durch den Nachweis dieses Bereiches immer mehrere Prototypen von enteroviralen Stämmen erfasst werden können.

Dabei können bspw. im 5'-nicht kodierenden Bereich des Poliovirus PV1 (ACC J02281) bestimmte Bereiche amplifiziert werden, und insbesondere der Bereich 159 bis 478.

In einer weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, wenn in Schritt e) zum Nachweis der viralen RNA zumindest eines der in dem beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführten Oligonukleotide mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 3 bis 5 verwendet wird.

Die Oligonukleotide weisen die folgenden Sequenzen und Bezeichnungen auf:

Die aufgeführten Oligonukleotide haben sich in eigenen Versuchen für die Durchführung dieses Verfahrens als besonders geeignet gezeigt.

Das degenerierte Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 3 (EVmod) trägt an Position 3 eine Wobble-Base („W"), die standardgemäß für Adenosin oder Thymidin steht. EVmod (SEQ-ID-Nr. 3) ist der Primer für die reverse Transkription der (–)-Strang-RNA sowie einer der beiden PCR-Primer. Die Bindungsposition des Primers in der Sequenz des Poliovirus ist PV1 (ACC J02281, s.o.) ist 159–179.

Das Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 4 (EV-FL2) ist ebenfalls degeneriert, wobei die verwendeten Buchstaben dem konventionellen Code folgen: Das „S" an Position 7 steht für Cytosin oder Guanosin, und das „N" an Position 8 für Adenosin, Cytosin, Guanosin oder Thymidin. Dieses Oligonukleotid hybridisiert unter Bezugnahme auf ACC J02281 (s.o.) an die Positionen 429 bis 453.

Bei dem degenerierten Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 5 (EV-iLC2) steht das an den Positionen 2 und 4 verwendete „Y" standardgemäß für Cytosin oder Thymidin, das an Position 3 verwendete „R" für Adenosin oder Guanosin. Dieses Oligonukleotid dient als Primer für die reversen Transkription der (+)-Strang-RNA und hybridisiert dort an die Positionen 455 bis 478.

Ferner ist bevorzugt, wenn das Oligonukleotid, welches eine der Nukleotidsequenzen SEQ-ID-Nr. 1 bis 5 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll umfasst, zumindest eine Markierung aufweist.

Markierungen, die hierfür in Frage kommen, sind bspw. Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, Light-Cycler-Red 640, 6-Carboxyfluorescein (FAM), 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Dabcyl.

So kann bspw. das Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 5 mit dem Farbstoff Light-Cycler-Red 640 markiert sein, und dadurch als Sonde (Akzeptor) beim FRET während der PCR im LightCycler fungieren. Das Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 4 kann in diesem Zusammenhang bspw. mit Fluorescein markiert sein, so dass es beim FRET als Sonde (Donor) dient. Die Farbstoffe, durch welche die Oligonukleotide in diesem Beispielfall markiert sind, emittieren – wie oben dargestellt – nach Anregung Fluoreszenz.

Danach kann ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens folgendermaßen durchgeführt werden: Mit dem Oligonukleotid EVmod (SEQ-ID-Nr. 3) lässt sich zum einen die reverse Transkription der (–)-Strang-RNA in DNA durchführen. Dieses Oligonukleotid fungiert gleichzeitig als einer der beiden PCR-Primer, so dass unter Zugabe des anderen PCR-Primers EV-iLC2 (SEQ-ID-Nr. 5) eine Sequenz der aus der reversen Transkription entstandenen DNA amplifiziert wird, wobei zuvor oder gleichzeitig die reverse Transkriptase inaktiviert wird. Wie oben erwähnt, wird dabei eine Sequenz amplifiziert, die in der Gruppe der Enteroviren stark konserviert ist und daher die Möglichkeit zum Nachweis verschiedener Enteroviren-Stämme bietet. Das Oligonukleotid EV-FL2 (SEQ-ID-Nr. 4), welches als Hybridisierungssonde fungiert und das ggf. im PCR-Reaktionsansatz vorliegt, bindet an die amplifizierten Produkte in unmittelbarer Nähe (Position 429–453) zu dem als Primer fungierenden Oligonukleotid EV-iLC2 (SEQ-ID-Nr. 5), welches in seiner Funktion als Primer in die amplifizierten Produkte eingebaut ist (Position 455–478). Durch FRET ist somit ein direkter Nachweis von amplifizierten Sequenzen über die Fluoreszenz möglich ist.

Darüber hinaus ist bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Überprüfung der Wirkung von Desinfektionsmaßnahmen und/oder Desinfektionsmitteln eingesetzt wird. Dies hat den Vorteil, dass insbesondere Proben, die bereits einer Desinfektion unterzogen wurden, schnell und reproduzierbar auf das Vorhandensein infektiöser Viren getestet werden können.

Wie weiter oben erwähnt, können derartige Desinfektionsmaßnahmen oder -mittel chemische oder physikalische Mittel oder Maßnahmen darstellen, wie bspw. Chlorierung, Iodierung, Ozonung, UV-Bestrahlung, Behandlung mit trockener oder feuchter Hitze u.a. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet insbesondere bei der Kontrolle von bspw. Abwässern und Trinkwasser sowie von Krankenhauseinrichtungen eine zuverlässige Kontrolle, ob auch nach einer Desinfektion noch infektiöse Viren vorliegen oder nicht.

Die Erfindung betrifft ferner ein Oligonukleotid, das eine der Nukleotidsequenzen SEQ-ID-Nr. 1 bis SEQ-ID-Nr. 5 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll umfasst, sowie die Verwendung von zumindest einem dieser Oligonukleotide zum Nachweis von infektiösen Enteroviren in einer Probe.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung zumindest eines der Oligonukleotide, die eine der Nukleotidsequenzen SEQ-ID-Nr. 1 bis SEQ-ID-Nr. 5 des beigefügten Sequenzprotokolls umfassen, in dem oben geschilderten erfindungsgemäßen Verfahren.

Dabei ist bevorzugt, wenn zumindest eines der Oligonukleotide mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 1 oder SEQ-ID-Nr. 2 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll zum Isolieren viraler RNA eingesetzt wird, und insbesondere das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 1 zum Isolieren enteroviraler (–)-Strang-RNA und das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 2 zum Isolieren enteroviraler (+)-Strang-RNA.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Oligonukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 3 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll als Primer für die reverse Transkription und/oder für die PCR von enteroviraler (–)-Strang-RNA.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des Oligonukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 4 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll als Sonde bei der Detektion von RT-PCR-Produkten viraler (–)-Strang-RNA und des Oligonukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 5 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll als Primer für die PCR und/oder Sonde für die Detektion von RT-PCR-Produkten viraler (–)-Strang-RNA. Bei den erfindungsgemäßen Verwendungen können die Oligonukleotide ggf. markiert sein.

Weitere Vorteile ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den Figuren.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Ausführungsbeispiele und -ergebnisse der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden in der nachstehenden Beispielsbeschreibung näher erläutert. Es zeigen:

1 den Nachweis von (–)-Strang- und (+)-Strang-RNA nach Inkubation von Buffalo Green Monkey Kidney Cells mit 40.000 Plaque forming Units Virusmaterial durch RT-PCR im LightCycler^TM;

2a den Nachweis von (+)-Strang-RNA nach Inkubation (6 h) von Buffalo Green Monkey Kidney Cells mit unterschiedlichen Mengen an Plaque-forming Units Virusmaterial durch RT-PCR im LightCycler^TM;

2b den Nachweis von (–)-Strang-RNA nach Inkubation (6 h) von Buffalo Green Monkey Kidney Cells mit unterschiedlichen Mengen an Plaque-forming Units Virusmaterial durch RT-PCR im LightCycler^TM;

3 den Nachweis von (–)-Strang- und (+)-Strang-RNA nach Inkubation von Buffalo Green Monkey Kidney Cells (Stoppen nach 12 h) mit 40.000 Plaque-forming Units Virusmaterial durch RT-PCR im LightCycler^TM (fünf Parallelwerte);

4a + 4b den Gruppen-spezifischen Nachweis enteroviraler (–)-Strang-RNA durch Amplifikation eines Bereichs im 5'nichtkodierenden Bereich in der RT-PCR.

Anhand des nachstehend beschriebenen Beispiels wird die Anwendung des Verfahrens gezeigt.

Beispiel 1: Zellkultur

a) Einfrieren und Lagern der Zellen

Für die Zellkultur wurde die Zelllinie Buffalo Green Monkey Kidney Cells der Firma Flow, Rockville, USA eingesetzt. Für die Langzeitlagerung wurden die Zellen abtrypsinisiert, einmal durch Zentrifugieren bei 2.000 rpm , 4°C, und durch Wiederaufnahme in MEME (Minimal Essential Medium with Earle's Salts) mit 10% fetalem Kälberserum gewaschen. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurden die Zellen in MEME mit 20-%igem fetalem Kälberserum und 20% Dimethylsulfoxid aufgenommen. Die dadurch vorbereitete Zellsuspension wurde in 1,5 ml-haltige Kryoröhrchen abgefüllt und für einige Tage bei –70°C gelagert. Die Langzeitlagerung erfolgte in flüssigem Stickstoff.

b) Umsetzen der Zellen

Die Buffalo Green Monkey Kidney Cells wurden in 250 ml-Zellkulturflaschen kultiviert und alle sieben Tage umgesetzt. Hierfür wurde das Medium abgezogen und die Zellmonolayer mit ca. 3 ml 37°C-warmer Trypsin-Lösung (0,2 g Trypsin in 1 l phosphatgepufferter Saline (PBS)) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 2 ml Trypsin-Lösung 2 min bei 37°C vorinkubiert. Das Trypsin wurde anschließend abgezogen und durch frisches (1,5 ml) ersetzt. Nach einer weiteren Inkubation bei 37°C für 3 bis 5 min löst sich die Monolayer von der Flasche ab und das Trypsin wurde mit 5 ml Wachstumsmedium (MEME, 8% fetalem Käl berserum, 1% nicht essentielle Aminosäuren) neutralisiert. Die Vereinzelung der Zellen erfolgte durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Die Zellsuspension wurde in einem Verhältnis von 1:6 bis 1:8 in Wachstumsmedium (siehe oben) verdünnt und 20 bis 25 ml in kleine Zellkulturflaschen überführt. Je nach Bedarf wurden die Zellen auch in 6-Well-Platten (3 ml pro Well) oder in 24-Well-Platten (0,6 μl pro Well) ausgesät und bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die Zellmonolayer bildete sich innerhalb der folgenden drei bis vier Tage. Je nach Bedarf wurde das Medium mit Erhaltungsmedium ausgewechselt (MEME, 2% fetales Kälberserum, 1% nicht essentielle Aminosäuren).

c) Beimpfen der Zellen

Zur Beimpfung wurde das Medium aus den Zellkulturplatten abgezogen und die Zellen mit PBS gewaschen und mit 0,2 bis 0,5 ml der zu testenden Suspension bzw. Verdünnung beimpft. Getestet wurden hierbei folgende Virus-Typen: Poliovirus Sabin 1, -2, Coxsackie A Virus Typ 7 und 9, ECHO Virus Typ 4, 15 und 20 und der Polio-Virus-Impfstoff (Polio-Typen 1 bis 3). Während einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C erfolgte die Adsorption der Viren an die Zellen. Anschließend wurde der Überstand abgezogen und zu den Zellen 2 bis 3 ml Erhaltungsmedium (siehe oben) gegeben. Die Beimpfung der Zellkulturen in den Zellkulturflaschen erfolgte folgendermaßen: Die Zellmonolayer wurde beimpft, sobald sie dicht war (ca. 3 bis 4 Tage nach Aussaat der Zellen). Dafür wurde der Überstand abgezogen, die Zellen mit PBS gewaschen und die Virussuspension auf die Zellen pipettiert. Nach einer Adsorptionszeit von einer Stunde wurde die Suspension abgezogen, die Zellen mit Erhaltungsmedium überschichtet und für die notwendige Inkubationszeit (bspw. sechs Stunden) bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Vor der anschließenden RNA-Isolierung wurde der Überstand abgezogen und die Zellen mit temperiertem PBS drei Mal gewaschen.

Beispiel 2: RNA-Isolierung

Die RNA-Isolierung wurde mit verschiedenen Methoden durchgeführt. Als Beispiele sind nachstehend die RNA-Isolierung a) mit dem High Pure RNA Tissue Kit von Roche sowie b) mit magnetic beads von Dynal Biotech angeführt:

a) RNA-Isolierung mit dem High Pure System

Zur Isolierung der viralen RNA wurden die Zellen in einem stark proteindenaturierendem Puffer und in Anwesenheit von chaotropen Agenzien (Guanidinium-Isothiocyanat-Salze) lysiert. Dazu wurde der Kulturüberstand der infizierten Zellen abgezogen und mit 1×PBS gewaschen. Nach Zugabe von Lysispuffer auf die Zellen wurde diese durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren lysiert. Die Zellsuspension wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und 20 sec stark gevortext. Nach einer 2-minütigen Zentrifugation bei 13.000 g bei Raumtemperatur wurde das 0,5fache Probenvolumen zum Überstand gegeben und das Gemisch auf ein Silica-Vlies pipettiert. Die freigesetzten Nukleinsäuren wurden durch diesen Schritt an das Silica-Vlies gebunden, der Durchlauf wurde verworfen. Nach einer Zugabe von RNAse freier DNAse auf das Silica-Vlies wurde dieser Ansatz für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von Waschpuffer (5 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris-HC1, pH 6,6; vor Gebrauch 20 ml absolutes Ethanol zu 33 ml Puffer geben) wurde der Ansatz für 15 sec bei 8.000 g zentrifugiert. Nach Zugabe von Waschpuffer II (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5; vor Gebrauch 40 ml absolutes Ethanol zu 10 ml Puffer geben) wurde der Ansatz anschließend für 15 sec bei 8.000 g zentrifugiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde die RNA mit nukleasefreiem, sterilem Wasser eluiert.

b) RNA-Isolierung mit Hilfe von magnetic beads (Dynal Biotech, Norwegen)

Der Kulturüberstand der infizierten Zellen wurde abgezogen und die Zellen zwei Mal mit PBS gewaschen. Abhängig von der Monolayerfläche werden 100 bis 200 μl Lysispuffer (4,5 M Guanidinium-HCl, 100 mM Natriumphosphat, pH 6,6) auf die Zellen gegeben. Die Zellen begannen sich abzulösen und wurden durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in Suspension gebracht. Die abgelösten Zellen wurden in ein Reaktionsgefäß überführt, 8 min bei 95°C inkubiert und anschließend auf Eis gestellt.

Zum Isolieren, bzw. „Fischen" eines RNA-Stranges aus dem Lysat wurden 40 μl Lysat mit 120 μl 8× SSPE (20× SSPE: 0, 2 M NaHP₂O₄, pH 7,4; 2,98 M NaCl; 0,02 M EDTA) und 48 pmol Biotin-Oligonukleotid gemischt und 15 min bei 55°C inkubiert. Zum Isolieren der (–)-Strang-RNA wurde folgendes biotinmarkiertes Oligonukleotid eingesetzt:

Zum Isolieren der (+)-Strang-RNA wurde folgendes biotinmarkiertes Oligonukleotid verwendet:

Die Oligonukleotide wurden von der Firma BioSpring, Frankfurt, auftragsgemäß hergestellt. Sie tragen an ihren 5'-Enden jeweils eine Biotin-Markierung und binden an folgenden Position des viralen RNA-Stranges (J02281, s.o.): 531 bis 560.

Anschließend wurden 16 μl magnetic beads (Dynabeads^® Streptavidin, Dynal Biotech, Norwegen) zugegeben, gemischt und weitere 10 min bei 55°C inkubiert.

Auf Grund der Affinität von Streptavidin zu Biotin banden die biotinmarkierten Oligonukleotide, an welche die entsprechenden RNA-Stränge gebunden wurden, an die Dynabeads^®. Die Bead-Komplexe wurden am Magneten separiert und der Überstand abgezogen. Die Beads wurden jeweils zwei Mal mit je 400 μl Waschpuffer (10 mM Tris Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA; 2 M NaCl; 0, 05% Tween 20) resuspendiert und gewaschen und jeweils in ein neues Cup überführt. Anschließend folgte jeweils ein Waschschritt mit 400 μl Waschpuffer und 400 μl 1× SSPE. Nach einem kurzen Zentrifugationsschritt wurden noch vorhandene Reste abgezogen und die RNA zwei Mal mit je 10 μl bei 80°C für 2 min eluiert.

Beispiel 3: RT-PCR an LightCycler^TM

Für eine strangspezifische RT-PCR wurde die reverse Transkription im vollständigen Mastermix („LC-RNA Master Kit Hybridization Probes", Roche, Mannheim, Deutschland) in einem konventionellen Cycler (bspw. PTC-2000 MJ-Research, Biozym, Deutschland) durchgeführt.

Für die reverse Transkription der (–)-Strang-RNA wurde als strangspezifischer Primer das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 3 eingesetzt, während für die reverse Transkription der (+)-Strang-RNA das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 5 eingesetzt wurde. Die Sequenzen der Primer sind nachstehend wiedergegeben:

Wie oben erwähnt, trägt das degenerierte Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 3 (EVmod) an Position 3 eine Wobble-Base („W"), wobei diese Wobble-Base standardgemäß für Adenosin oder Thymidin steht. Wie weiter oben erwähnt bindet das Oligonukleotid mit Bezug auf ACC J02281 an die Positionen 159 bis 179. Das Oligonukleotid EVmod wurde wie die Biotin-markierten Sonden (SEQ-ID-Nr. 1 und 2) von der Firma Bio Spring, Frankfurt, Deutschland, nach Auftrag hergestellt.

Bei dem degenerierten Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 5 (EV-iLC2) steht das an den Positionen 2 und 4 verwendete „Y" standardgemäß für Cytosin oder Thymidin, das an Position 3 verwendete „R" für Adenosin oder Guanosin. Dieses Oligonukleotid ist intern am Thymidin der Position 22 mit dem Farbstoff Light-Cycler-Rot 640 markiert. Dieses Oligonukleotid fungiert als Primer bei der reversen Transkription der (+)-Strang-RNA und hybridisiert unter Bezug auf ACC J02281 an die Positionen 455 bis 478.

Nach der reversen Transkription wurde der fehlende Primer zugegeben, das Gemisch in die Kapillaren transferiert und die PCR im LightCycler^TM durchlaufen. Dabei wurde das „LC-RNA Amplification Kit Hybridization Probes" von Roche, Deutschland, eingesetzt. Demnach fand die Amplifikation mittels der Primer EVmod (SEQ-ID-Nr. 3) und EV-iLC2 (SEQ-ID-Nr. 5) statt, die Detektion erfolgte über die Sonde EV-FL2 (SEQ-ID-Nr. 4) (Donor) und über das auch als Sonde fungierende Oligonukleotid EV-iLC2 (SEQ-ID-Nr. 5) (Akzeptor). Die Sequenz des Oligonukleotids EV-FL2 ist nachfolgend wiedergegeben:

Dieses Oligonukleotid ist ebenfalls degeneriert, wobei die verwendeten Buchstaben dem konventionellen Code folgen: Das „S" an Position 7 steht für Cytosin oder Guanosin, und das „N" an Position 8 für Adenosin, Cytosin, Guanosin oder Thymidin. Dieses Oligonukleotid ist darüber hinaus an seinem 3'-Ende mit Fluorescein markiert. Dieses Oligonukleotid dient als Sonde und hybridisiert unter Bezug auf J02281 an die Positionen 429 bis 453.

Die Oligonukleotide EV-FL2 und EV-iLC2 wurden von der Firma Tib Molbiol, Berlin, Deutschland, auftragsgemäß synthetisiert.

Die Reaktionsansätze sowie die Bedingungen für die reverse Transkription lauteten wie folgt: Reaktionsansatz:

0,7 μl	H₂O
0,5 μl	Oligonukleotid (10 pmol/μl) (Endkonzentration: 0,25 μM) (EVmodfür die (–)-Strang-RNA und iLC2 für die (+)-Strang-RNA)
7,5 μl	Tth Master (2,7 ×) (Endkonzentration: 1 ×)
1,3 μl	Mn(OAC)₂ (50 mM) (Endkonzentration: 3,25 mM
10 μl	RNA-Eluat

Reaktionszeiten:

20 min. 61°C, 2 min. 94°C, auf 4°C halten (MJ-Research-Cycler)

Nach der reversen Transkription wurde der fehlende Primer zugegeben, das Gemisch in die Kapillaren transferiert und die PCR im LightCycler^TM durchlaufen. Dabei wurde das LC-RNA-Amplification-Kit Hybridization Probes von Roche Diagenostics, Deutschland, eingesetzt.

Der Ansatz für die PCR lautete wie folgt: Reaktionsansatz:

6,8 μl	H₂O
1 μl	EVmod (10 pmol/μl) Endkonzentration: 0,5 μM
1 μl	EV-FL2 (4 pmol/μl) Endkonzentration: 0,2 μM
1 μl	ilC2 (10 pmol/μl) Endkonzentration: 0,5 μM
4 μl	Reaktionspuffer (5×) Endkonzentration: 1×
0,8 μl	MgCl₂ (25 mM) Endkonzentration: 4 mM
0,4 μl	Enzym Endkonzentration: 1×
5 μl	cDNA aus Tth-RT-Reaktion

Dieser Ansatz wurde für die PCR im LightCycler in Kapillaren pipettiert. Zunächst erfolgte ein einmaliger Denaturierungs-Schritt bei 95°C für 120 s. Die weiteren Bedingungen für die PCR-Amplifikation sind nachstehend wiedergegeben.

Die Detektion des Amplifikationsproduktes erfolgt online mit Hilfe spezifischer Hybridisierungssonden, die während der PCR an das entstehende Amplifikat binden.

Dabei dienen der antisense-Primer SEQ-ID-Nr. 5 mit seiner internen LC640-Markierung sowie das Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 4 dem Fluoreszenztransfer. Der LightCycler^TM ist ein kleinlumiges Fluorometer, das integriert einen thermischen Cycler aufweist, welcher insgesamt eine schnellzyklische PCR mit einer Realtime Fluoreszenz-Messung kombiniert. Mit diesem LightCycler^TM ist es möglich, über sequenzspezifische Hybridisierungssonden PCR-Produkte zu detektieren und zu analysieren, ohne dass die Notwendigkeit besteht, dass die Proben nach der PCR weiter bearbeitet werden müssen. Die Fluoreszenzkontrolle der Amplifikation unter Verwendung von Hybridisierungssonden basiert auf dem Konzept, dass ein Fluoreszenzsignal generiert wird, wenn zwischen zwei benachbarten Fluorophoren ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) stattfindet. Im vorliegenden Fall war der antisense-Primer intern mit dem Farbstoff LightCycler^TM-Red 640 markiert. Dadurch ist die Zugabe von lediglich einer Hybridisierungssonde notwendig, die benachbart zu dem Primer auf dem anderen Strang bindet.

Beispiel 4: Ergebnisse

a) Nachweis der (–)-Strang-RNA mit Hilfe einer strangspezifischen RT-PCR

Nach Beimpfen und Inkubation der Buffalo Green Monkey Kidney Cells mit dem Poliovirus konnte die virale (–)-Strang-RNA bereits drei Stunden über strangspezifische RT-PCR nachgewiesen werden.

1 zeigt den Nachweis von (–)-Strang- und (+)-Strang-RNA nach Inkubation von Buffalo Green Monkey Kidney Cells mit 40.000 Plaque forming Units Virusmaterial durch RT-PCR im LightCycler^TM. Dazu wurden die Zellen mit 40.000 Plaque-forming Units an Poliovirus-Material infiziert, und zwar über 3, 3,5 und 4 Stunden hinweg. In der 1 ist mit 1 die Kurve der (+)-Strang-RNA nach drei Stunden, mit 2 die Kurve der (+)-Strang-RNA nach 3,5 und mit 3 die Kurve der (+)-Strang-RNA nach vier Stunden dargestellt. Die Kurven 4, 5 und 6 zeigen jeweils die Entwicklung der (–)-Strang-RNA nach 3, 3,5 und 4 Stunden Inkubation der Zellen mit dem Virusmaterial. Die. Kurve 7 zeigt den Nachweis von (–)-Strang-RNA ohne Inkubation auf Zellen und Kurve 8 die (+)-Strang-RNA ohne Inkubation auf Zellen. Wie in 1 zu erkennen ist, waren die Signale der (–)-Strang-RNA erst nach vier Stunden stark genug (siehe 1: Kurve 6).

Wie aus der 1 (Kurve 7) ferner zu ersehen ist, lief die RT-PCR der (–)-Strang-RNA mit dem upstream-Primer (Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 3) strangspezifisch ab, d.h. ohne vorherige Inkubation der Viren auf den Zellen wurde die (+)-Strang-RNA (Kurve 8) und nicht die (–)-Strang-RNA (Kurve 7) amplifiziert. Mit Hilfe des thermostabilen Enzyms Tth kann die reverse Transkription bei hohen Temperaturen stattfinden (61°C), wodurch unspezifische Reaktionen bei der Amplifikation von (–)-Strang-RNA vermieden werden konnte. Wie weiter oben erwähnt, erlosch die RT-Aktivität des Enzyms Tth gänzlich, sobald Mg-Ionen vorlagen und die Mn-Konzentration weniger als 1 mM betrug. In der PCR-Reaktion war dies vorliegend der Fall (siehe Reaktionsansätze).

In 2a sind Signale der RT-PCR der (+)-Strang-RNR von Poliovirus nach Inokulation auf den Zellen nach sechs Stunden dargestellt: mit der Kurve 1 sind die Daten mit 100 Plaqueforming Units (im Folgenden PFU) an Poliovirus-Material pro Reaktion dargestellt; mit 2 für 20 PFU, mit 3 für 4 PFU, mit der Kurve 4 für 0,8 PFU, mit Kurve 5 für 40 PFU ohne Zellen und Kurve 6 stellt die Negativkontrolle dar, bei welcher kein Virusmaterial eingesetzt wurde. Wie in 2a zu sehen ist, liegt ein geeigneter Zeitpunkt, um die Replikation in den Zellen zu stoppen, bei sechs Stunden nach Inokulation der Zellen (siehe 2a und 2b).

In 2b sind die Signale der RT-PCR der (–)-Strang-RNA von Poliovirus nach Inokulation auf Zellen nach sechs Stunden mit unterschiedlichen Verdünnungen gezeigt: Hierbei geben die Kurven 7, 8, 9 und 10 jeweils 100, 20, 4 und 0, 8 PFU Poliovirus-Material pro Reaktion wieder, die Kurve 11 zeigt die Positivkontrolle, d.h. 40 PFU Poliovirus-Material ohne Zellen und die Kurve 12 die Negativkontrolle ohne Poliovirus-Material.

In 3 ist die Inkubation von Zellen mit 40.000 PFU Poliovirus-Material gezeigt, wobei die Inokulation nach zwölf Stunden gestoppt wurde. In der Abbildung sind jeweils fünf Parallelwerte gezeigt: Die Kurvenschar 1 zeigt (+)-Strang-RNA, Kurvenschar 2 (–)-Strang-RNA, die Kurve 3 (+)-Strang-RNA ohne Inkubation auf Zellen, die Kurve 4 (–)-Strang-RNA ohne Inkubation auf Zellen und die Kurve 5 stellt die Negativkontrolle dar.

Mit zunehmender Verdünnung des Ausgangsvirusmaterials nehmen die Amplifikationssignale der (+)-Strang-RNA ab (siehe 2a). Diese Regelmäßigkeit ist bei der Detektion der (–)-Strang-RNA nicht immer zu beobachten (siehe 2b).

Generell ist um den Faktor 10 bis 100 weniger (–)-Strang-RNA als (+)-Strang-RNA vorhanden, eine Beobachtung, die sich mit den Literaturangaben zur Replikation von (+)-Strang-RNA-Viren deckt.

So lange noch nicht infizierte Zellen vorhanden sind, die mit frisch gebildetem und ausgeschleustem Virus infiziert werden können, lässt sich (–)-Strang-RNA nachweisen, selbst nach zwölf Stunden, was in 3 zu sehen ist.

b) Gruppenspezifischer Nachweis von enteroviraler (–)-Strang-RNA

Das hier eingesetzte Primer-Sondensystem amplifiziert einen Bereich auf der 5'-nicht kodierenden Region (5'-NTR) des Enterovirus-Genoms (Position 159 bis 478 mit Bezug auf ACC J02281). Dieser Bereich ist innerhalb der Enterovirusgruppe stark konserviert, so dass das beschriebene Primer-Sondensystem für einen gruppenspezifischen Nachweis von Enteroviren ausgezeichnet geeignet ist. In den 4a und 4b sind die RT-PCR-Ergebnisse der (+)- und (–)-Strang-RNA verschiedener Vertreter der Gruppe der Enteroviren dargestellt (Sabin, Polioviren Typ 1 und 2, Coxsackie-Viren A7 und A9, sowie Echoviren Typ 15, 17 und 20).

Zusammenfassend lässt sich somit sagen, dass ein System beschrieben wurde, welches mit Hilfe der Kombination von Zellkultur, nachfolgender ggf. strangspezifischer RNA-Isolierung und anschließender strangspezifischer RT-PCR den selektiven Nachweis von Enteroviren ermöglicht, die, wegen ihres Potentials, in eine Zelle einzudringen und sich zu replizieren, als infektiös zu bezeichnen sind. Das System basiert somit auf dem Nachweis von (–)-Strang-RNA-Replikationsintermediaten, welche nur während der RNA-Replikation in der Zelle vorliegen. Da Enteroviren eine (+)-Strang-RNA besitzen, ist die Differenzierung zwischen (+)- und (–)-Strang-RNA mit Hilfe des beschriebenen und speziell dafür geeigneten Primer-Sondensystems in einer strangspezifischen RT-PCR möglich.

Das beschriebene Testverfahren ist zur allgemeinen Überprüfung der Infektiosität von Viren, bspw. bei der Aktivitätsbestimmung von Desinfektionsmitteln geeignet.

Insbesondere aber im Bereich der Umweltwasservirologie ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet, wobei hier mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zwischen inaktivierten und nicht inaktivierten und folglich potentiell infektiösen Viren differenziert werden kann. Dies ist vor allem zur Abschätzung der Gefährdung exponierter Personen von großer Bedeutung. Verschiedene Virus inaktivierende Umwelteinflüsse oder aber auch Desinfektionsmaßnahmen, die bei der Trinkwasseraufbereitung eingesetzt werden (wie bspw. Chlorung, Ozonung oder UV-Bestrahlung), beseitigen zwar die Infektiosität.

Andererseits kann das genetische Material der Viren durch die virale Proteinhülle weiterhin geschützt und unversehrt vorliegen. Über die Zellkultur sind die Viren dann zwar nicht mehr nachweisbar, wohl aber durch die herkömmliche Amplifikation ihrer Nukleinsäure, so dass mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren auch nicht-infektiöse, aber intakte Viren nachgewiesen werden. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es nun erstmals möglich, über den Nachweis des Vorliegens von (–)-Strang-RNA lediglich infektiöse Viren aufzuspüren.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis infektiöser (+)-Strang-RNA-Viren, insbesondere Enteroviren, in einer Probe, mit den folgenden Schritten: a) Beimpfen einer Zellkultur mit der Probe; b) Inkubieren der beimpften Zellkultur für einen Zeitraum von 0,5 bis 24 Stunden, vorzugsweise von 4 bis 6 Stunden; c) Lysieren der Zellkultur; d) Isolieren von RNA aus dem Zellkultur-Lysat; e) Nachweisen der viralen (–)-Strang-RNA.
Verfahren nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine wässrige Probe eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) zunächst Gesamt-RNA und daraus virale RNA isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) direkt virale RNA isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolierung der viralen RNA zumindest eines der in dem beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführten Oligonukleotide mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 1 oder 2 eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt e) über eine RT-PCR der viralen RNA und eine Detektion der Amplifikationsprodukte erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion über FRET erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass für die RT-PCR ein Bereich im 5'-nicht kodierenden Bereich der viralen RNA, insbesondere enteroviraler RNA amplifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) zum Nachweis der viralen RNA zumindest eines der in dem beigefügten Sequenzprotokoll aufgeführten Oligonukleotide mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 3 bis 5 verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Überprüfung der Wirkung von Desinfektionsmaßnahmen und/oder Desinfektionsmitteln eingesetzt wird.
Oligonukleotid, das eine der Nukleotidsequenzen SEQ-ID-Nr. 1 bis SEQ-ID-Nr. 5 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll umfasst.
Oligonukleotid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest eine Markierung aufweist.
Verwendung von zumindest einem der Oligonukleotide nach Anspruch 11 oder 12, zum Nachweis von infektiösen Enteroviren in einer Probe.
Verwendung von zumindest einem der Oligonukleotide nach Anspruch 11 oder 12 in einem Verfahren zum Nachweis von infektiösen Enteroviren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Verwendung des Oligonukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 1 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll zum Isolieren enteroviraler (–)-Strang-RNA.
Verwendung des Oligonukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 2 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll zum Isolieren enteroviraler (+)-Strang-RNA.
Verwendung des Oligonukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 3 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll als Primer für die reverse Transkription und/oder für die PCR von enteroviraler (–)-Strang-RNA.
Verwendung des Oligonukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 4 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll als Sonde bei der Detektion von RT-PCR-Produkten enteroviraler (–)-Strang-RNA.
Verwendung des Oligonukleotids mit der Nukleotidsequenz SEQ-ID-Nr. 5 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll als Primer für die PCR und/oder Sonde für die Detektion von RT-PCR-Produkten enteroviraler (–)-Strang-RNA.