EP1029084A2 - Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren - Google Patents

Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren

Info

Publication number
EP1029084A2
EP1029084A2 EP98965653A EP98965653A EP1029084A2 EP 1029084 A2 EP1029084 A2 EP 1029084A2 EP 98965653 A EP98965653 A EP 98965653A EP 98965653 A EP98965653 A EP 98965653A EP 1029084 A2 EP1029084 A2 EP 1029084A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
probe
detected
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98965653A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Kessler
Gerd Haberhausen
Knut Bartl
Henrik Orum
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19748690A external-priority patent/DE19748690A1/de
Priority claimed from DE19814001A external-priority patent/DE19814001A1/de
Priority claimed from DE19814828A external-priority patent/DE19814828A1/de
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP1029084A2 publication Critical patent/EP1029084A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of nucleic acids, in which an amplification of a section of these nucleic acids is carried out and this section must meet certain conditions with regard to its base sequence, and a reagent kit containing two primers and a probe which define this section.
  • nucleic acid sequences are important in the basic area, but of particular importance in various fields of application, e.g. B. in the fields of medical diagnostics, forensic diagnostics, food diagnostics, environmental diagnostics, crop protection and veterinary medicine.
  • oligonucleotides short DNA or RNA
  • polynucleotides longer DNA or RNA
  • the shorter probes have the advantage of greater sequence selectivity compared to the longer probes, but because of the shorter hybridization range, the disadvantage of lower sensitivity.
  • Improved sensitivity and sequence selectivity is achieved with PNA probes (peptide nucleic acids, e.g. WO 92/20702), since these probes have a higher binding affinity for nucleic acids (higher Tm) and are characterized by a higher base discrimination ( ⁇ Tm).
  • probes for nucleic acid detection can carry labeling groups which are suitable either for capturing and / or for detecting hybrid complexes of the probe and the nucleic acid to be detected.
  • one or more probes are used either for hybridization in solution or on solid supports.
  • nucleic acid detection in solution one speaks of homogeneous detection formats, for detection on solid supports and / or mediated by solid supports of heterogeneous detection formats.
  • the nucleic acid to be detected can be pre-bound on the solid support (e.g. dot blot).
  • Hybridization occurs by contacting a solution containing the probe.
  • the probe can be pre-bound on the solid support (e.g.
  • the hybridization takes place by contacting the bound probe with a solution which contains the nucleic acid to be detected.
  • the complex of nucleic acid and probe to be detected can only be formed in solution and the binding to the solid support can only take place afterwards.
  • pairs of probes are used which carry energy-transferring groups and which are brought into direct contact via co-hybridization to the nucleic acid to be detected and thereby generate a signal.
  • probes can also be used which, after binding to the nucleic acid to be detected, are converted from a quenched to an unquenched state by enzymatic 5'-nuclease activity in solution.
  • the detection of nucleic acids by probe hybridization alone has only limited sensitivity. Even with sensitive detection marker groups such as 32 P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA, only sensitivity in the pg to fg range is possible.
  • sensitive detection marker groups such as 32 P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA
  • sensitive detection marker groups such as 32 P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA
  • sensitive detection marker groups such as 32 P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA
  • sensitivities in the ag area and a high detection specificity are necessary. This applies both to the detection of foreign nu
  • infectious agents such as. B. HCV, HIV and HBV can be detected in just a few copies in order to ensure successful medical intervention measures, e.g. B. by early drug treatment.
  • the detection of nucleic acid sequences of the infectious agents is advantageous because, because of the availability of nucleic acid amplification techniques (nucleic acid amplification methods), sensitive detection is possible even in an early infection phase (latency phase).
  • nucleic acid amplification techniques nucleic acid amplification methods
  • sensitive detection is possible even in an early infection phase (latency phase).
  • the possibility of the targeted multiplication of the agent to be detected exists only in the case of nucleic acids, but not in the case of immunological detection methods.
  • the detection of nucleic acid hybridization has the advantage that, for. B. the infectious agent can be detected directly after infection and very sensitive.
  • nucleic acid detection must also be carried out quickly so that targeted therapy can take place immediately. Often it is also important to have several infectious agents such as B. HCV, HIV and HBV side by side, z. B. as part of blood bank screening tests. In the currently common nucleic acid detection tests, this is done by series-connected individual determinations of the infectious agents to be detected. This has the disadvantage that several determinations have to be carried out in succession, which is disadvantageous especially when screening large numbers of specimens. In the context of these nucleic acid determinations, it is desirable to have sensitive and specific test options available which, for. B. enable a rapid parallel determination of several infectious agents side by side in a single sample (multiplex determination).
  • nucleic acid detection methods When detecting the presence or absence of the body's own nucleic acid within certain genomic loci and / or their changes, such as. B. inherited, spontaneous or a mixture of inherited and spontaneous mutations, deletions, inversions, translocations, rearrangements or triplet expansions in the form of specific and / or polymorphic changes, the availability of specific and sensitive nucleic acid detection methods is also advantageous. However, the availability of specific and sensitive nucleic acid detection methods is of great importance not only in the medical sector but also in the other fields of application mentioned.
  • nucleic acid amplification nucleic acid amplification
  • nucleic acid detection reactions detection
  • the nucleic acid to be detected is used in a form that is accessible for the multiplication reactions, for. B. in the form of untreated or treated sample material and / or sample material concentration, for. B. by adsorption of the untreated or treated sample material to the surface of a solid support and subsequent absorption of this solid support.
  • Such solid supports are e.g. B. solid supports with glass-containing surfaces. These solid supports do not Substantial purification and / or isolation of the nucleic acids to be detected, but only a sample material concentration and possibly inactivation and / or elimination of inhibitors for the subsequent nucleic acid amplification and detection reactions. These solid supports also make it possible to provide several nucleic acids to be detected, e.g. B. in the context of multiplexing, in a form accessible for nucleic acid amplification and detection reactions possible.
  • sample preparation methods contain targeted method steps for nucleic acid-specific and / or sequence-specific binding of the nucleic acid to be detected, e.g. B. the use of solid supports with nucleic acid-specific binding groups and / or nucleic acid capture probes for selective binding and release of the nucleic acid to be detected by nucleic acid-specific binding and subsequent dissociation between the binding group and / or carrier-bound capture probe and nucleic acid to be detected.
  • This type of solid support requires nucleic acid-specific binding groups and / or nucleic acid capture probes on the surface of the solid support. Therefore, for
  • nucleic acids to be detected e.g. B. in the context of multiplexing, either several solid supports necessary, which is more complex, or solid supports with one or more binding groups and / or with multiple or more capture probes.
  • Multiple capture probes contain several binding sequences for several nucleic acids to be detected. This carrier with several
  • Binding groups and / or several and / or multiple capture probes are, however, more complex to produce. Likewise, the reaction conditions for the targeted binding of several nucleic acids to be detected to carriers with several binding groups and / or capture probes are more difficult to set, or the binding of several types of nucleic acid to be detected to a nucleic acid-specific binding group or to a capture probe with several complementary hybridization sequences is more difficult to set.
  • the amplification and detection of the provided nucleic acids to be detected takes place in heterogeneous or homogeneous nucleic acid amplification detection formats.
  • the nucleic acid amplification reactions and detection reactions can either take place in succession (heterogeneous test methods) or simultaneously (homogeneous test methods). Either target-specific nucleic acid amplification reactions, target-dependent signal nucleic acid amplification reactions or signal nucleic acid amplification reactions are used as amplification reactions.
  • Detection systems are used to detect the increased nucleic acids either by incorporating nucleotides and / or by using labeled primers or labeled probes.
  • the detection systems used contain either direct or indirect detection markings or coupled secondary and tertiary detection components. However, the detection of the increased nucleic acids to be detected can also be carried out by spectroscopic or physical methods.
  • the previous nucleic acid amplification detection methods with integrated signal nucleic acid amplification reactions have the disadvantages of low sensitivity because of the non-exponential signal amplification, increased susceptibility to interference due to a stronger tendency towards background signal formation due to the large number of probe components and the formation of non-specific detection signals, since not the nucleic acid to be detected itself , only a detection signal coupled to it is propagated independently of the target. Examples are coupled signal cascades (e.g. SELF cycle) or signaling probe tree or brush structures (e.g. branched DNA).
  • coupled signal cascades e.g. SELF cycle
  • signaling probe tree or brush structures e.g. branched DNA
  • the previous nucleic acid amplification detection methods with integrated target-dependent signal nucleic acid amplification reactions are more sensitive than the pure signal nucleic acid amplification methods because of the exponential signal amplification, but in turn have the disadvantage of the formation of unspecific detection signals, since not the nucleic acid to be detected itself, but only a detection signal derived therefrom in an initial target-dependent primary reaction in the form of a nucleic acid reporter molecule is amplified independently of the target sequence.
  • Examples are the Qß replication reaction, in which a Qß reporter molecule is enzymatically expanded, or the ligase Chain reaction in which sections of the nucleic acid reporter molecules are linked enzymatically independently of the sequence.
  • nucleic acid amplification products of the most sensitive and specific exponential target-specific nucleic acid amplification reactions such as. B. PCR (US-A-4,683,202 or EP-B-0 202 362), RT-PCR, SDA, NASBA (EP-A-0 329 822) or TAM (WO 91/01384) have so far been used individually or double-stranded nucleic acid amplification products by target sequence-dependent thermocyclic or isothermal enzymatic elongation opposing primers, which are sequence-specific for the nucleic acid to be detected and to the ends of the nucleic acid amplification unit (amplicon) of the deoxyribo- or ribo-nucleic acids to be detected or their complement and thus bind the nucleic acid and amplification products limit, generated. All 4 base specificities are incorporated in these elongation reactions.
  • the nucleic acid amplification detection methods mentioned with integrated target-specific nucleic acid amplification reaction are most specific because of target sequence-dependent enzymatic nucleic acid amplification cycles. While linear target-specific nucleic acid amplification reactions, such as. B. the cycling probe reaction, lead to limited sensitivity, result in exponential target-specific nucleic acid amplification reactions such as elongation-based reactions such. B. the polymerase chain reaction (PCR, RT-PCR, SDA) or transcription-based reactions such. B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) or Transcription Mediated Amplification (TMA) are the most sensitive and specific signals so far.
  • linear target-specific nucleic acid amplification reactions such as. B. the cycling probe reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR RT-PCR
  • SDA transcription-based reactions
  • B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) or Transcription Mediated Amplification (TMA) are the most sensitive and specific signals so far.
  • Chain reaction (gap-filling LCR, WO 90/01069) have a target-dependent reaction step compared to the unmodified LCR, but this is limited to limited sequence sections consisting of only 1 or 2 base specificities and thus more limited target specificity.
  • Various methods are available for the detection of the resulting nucleic acid. The detection of the nucleic acid amplification products formed by fragment or sequence gel analysis is time-consuming and not quantitative. The detection of carrier-bound dot, slot or reverse dot blot methods is also time-consuming and not quantitative.
  • Quantitative sensitive and specific determinations of the nucleic acids to be detected have so far been possible in the context of heterogeneous or homogeneous target-specific exponential nucleic acid amplification reaction formats in which the nucleic acid amplification product either by built-in labels or by hybridization during or after amplification with or for the nucleic acid to be detected Complement-specific probe is trapped in part of the sequence section created by elongation.
  • Exponential nucleic acid amplification reaction formats in which there is an intercalation of nucleic acid-binding dyes are also sensitive, but are not sequence-specific.
  • the nucleic acid amplification product is e.g. B. either via a primer capture modification or by an immobilized capture probe, which is complementary to an internal sequence section of the nucleic acid amplification product, bound to a solid support and incorporation of a detection-labeled nucleotide, by hybridization with a detection-labeled probe, which is complementary to an internal Sequence section of the nucleic acid amplification product is detected, or via a primer detection modification.
  • detection has so far been carried out e.g. B.
  • the target sequence-dependent enzymatic cancellation of the quenching being carried out by the primer elongation-dependent release of the quenched fluorescence-labeled nucleotide (WO 92/02638), or via the attachment and / or intercalation of a detectable molecule or group.
  • nucleic acid amplification units In all previous quantitative sensitive and specific heterogeneous and homogeneous target-specific exponential nucleic acid amplification reaction formats, nucleic acid amplification units (amplicons) have so far been used which, in addition to the specific primer and probe binding sequences, additional sequences of variable length between the flanking primer binding sequences and the internal one Contained probe binding sequence. This five-part amplicon structure resulted in amplicon lengths greater than the sum of the sequence lengths of the two flanking primers and the internal probe between preferably 100 and 1000 bases (pairs). So far, optimizations of the nucleic acid amplification reaction by means of improved enzyme mixtures have mainly been directed towards longer nucleic acid amplification products.
  • Shorter amplicon lengths have so far only been used to detect special sequences such as e.g. B. in triplet expansions, for in-situ studies or the detection of highly fragmented nucleic acids in the context of antiquity research.
  • these short amplicon lengths were detected in more time-consuming gel formats or in-situ formats, which are characterized by a lack of sensitivity and / or a lack of quantification.
  • Other special short sequences such as short tandem repeats, short interspersed repetitive elements microsatellite sequences or HLA-specific sequences have hitherto only been used as primer or probe binding sequences, or in combination with other sequences.
  • the five-part nucleic acid amplification products have the disadvantage that they contain, in addition to the specific primer and probe binding sequences, additional sequences which extend the amplicon and reduce the overall specificity with regard to the specificity-generating primer and probe binding reactions.
  • the longer five-part nucleic acid amplification products used to date also have the disadvantage of longer primer elongation times and thus longer overall test times.
  • the sensitivity is also limited by the plateau effects of the enzymes and substrates involved, which are achieved earlier with longer amplicons.
  • Another The disadvantage of longer nucleic acid amplification products is increasing competition between the amplicon counter strand and the detector or capture probe and thus reduced sensitivity.
  • Another disadvantage is the increased possibility of non-specific binding due to the additional sequences with the consequence of an increased background and therefore lower sensitivity (lower signal-to-noise ratio).
  • nucleic acid amplification product Another disadvantage of binding the nucleic acid amplification product to carrier-bound capture probes is the steric and kinetic hindrance of longer nucleic acid molecules; therefore nucleic acid amplification products of previous lengths are preferably fragmented before binding by the capture probe. Another disadvantage is the increased susceptibility to fragmentation within the amplicon sequence and thereby destruction of the nucleic acid amplification unit; this leads to lower reproducibility. Another disadvantage is that longer nucleic acid amplification products at low test temperatures of e.g. B. 37 ° C, which are specified in conventional nucleic acid analyzers, hybridize less specifically, since there is a greater difference to the melting temperature. Another disadvantage of five-part nucleic acid amplification products in the detection of several different nucleic acid amplification products is that different nucleic acid amplification lengths are formed, which make multiplex detection more difficult.
  • the aim of the present invention was to provide an alternative detection method for
  • a special object of the invention was to provide a target-dependent exponential nucleic acid amplification method for highly sensitive, highly specific, reproducible and quantifiable detection of one or more single-stranded or double-stranded nucleic acids, which in particular avoids one or more of the disadvantages mentioned.
  • a further object of the invention was to make the selection of the primer and probe sequences so flexible while maintaining the overall specificity that a determination several different nucleic acids to be detected in a unified reaction format using preferably partially identical primer or probe sequences is possible.
  • the invention relates to a method for the detection of a nucleic acid comprising the steps of producing a multiplicity of amplificates of a section of this nucleic acid with the aid of two primers, one of which can bind to a first binding sequence (A) of a strand of the nucleic acid and of which the other to one second binding sequence (C), which is essentially complementary to a sequence C of this strand which does not overlap with A and is located in the 3 ′ direction of A, in the presence of a probe with a binding sequence D which is linked to that between the sequences A and C located third sequence (B) or the complement (B ') thereof, which probe contains a reporter group and a quencher group, using a polymerase with 5'-nuclease activity and detection of the nucleic acid by measuring a signal which by the Release of the reporter group is conditional, characterized in that the amplificates formed with the aid of the primers have a length of less than 100 nucleotides.
  • the invention also relates to a reagent kit for carrying out this method.
  • Fig. 1 is schematically that used in the present description
  • the amplified products can have one or more further regions Y which lie outside the region which contains the sequence information derived from the nucleic acid to be detected.
  • FIG. 3 shows schematically how the binding sequences of the primer and probe are arranged in the case of the present invention.
  • Alternatives I to VI depending on whether and how the binding sequences overlap. Only one strand of the amplificate is shown in each case. The same arrangement (only complementary) can be created for a second strand of the amplificate. A similar picture emerges for the intermediate extension products.
  • cases V and VI the case is shown that, in addition to the binding sequence D, the probe also contains further regions X which do not form base pairs with the amplificate and which may be the same or different.
  • the prior art case is shown as VII; the sequences Z represent the additional sequences of the five-part amplicons.
  • FIG. 4 shows a region of the HCV genome which is particularly suitable for carrying out the method according to the invention, and a sequence from which the primer and probe sequences are preferably selected.
  • This second sequence is taken from the non-human pathogenic virus HGBV-B.
  • the primer and probe sequences selected from this are therefore sequences which are not specific for HCV (J. Med. Virol. 48: 60-67).
  • HCV range 8 shows the particularly preferred HCV range, which should be made available as a template in whole or in part for the amplification. Adjacent sequences should not be included.
  • Nucleic acids that can be detected with the method according to the invention can be of any origin, for example nucleic acids of viroid, viral, bacterial or cellular origin or from yeasts or fungi.
  • Samples in which the nucleic acid sequences to be detected or their complement are contained are e.g. B. human, animal, bacterial or vegetable liquids, or liquids from yeast or fungi, excrement, smears, cell suspensions, cultures or tissue, cell or liquid punctures.
  • the nucleic acids are preferably in solution.
  • the method according to the invention therefore has its advantages can unfold fully, it has proven to be expedient if the nucleic acid to be detected has a size of at least 40 bp.
  • the nucleic acid can also be a nucleic acid produced by cloning, amplification, in vitro and in vivo propagation.
  • the nucleic acid to be detected can be single-stranded (especially in the case of RNA) or completely or partially double-stranded (in particular in the case of DNA). In the case of double-stranded nucleic acids, both strands can be multiplied, or just one. Single or double-stranded amplificates can be formed from both types of nucleic acids, one or both of which can be used for further detection.
  • the sequence of the probe or probes is selected accordingly. It is preferably complementary to the strand of the amplificate which is used for further detection.
  • Positive or negative control nucleic acids or quantification standards can be added to the sample or a control sample, which are treated similarly or identically to the nucleic acids to be detected (internal or external standard, internal or external control).
  • internal or external heterologous or homologous DNA or RNA standards containing primer binding sequences homologous and probe binding sequences heterologous to the sequences of the nucleic acids to be detected can be used as standards.
  • Primef binding sequences and homologous probe binding sequences which are heterologous, particularly in the 3 'priming range.
  • Analog specimens which do not contain the nucleic acids to be detected or their complement are preferably used as negative controls.
  • the sample is preferably subjected to one or more pretreatment steps in order to bring the nucleic acids to be detected into a form capable of replication.
  • the sample is pretreated (specimen), by means of which the sample is brought into a form from which the nucleic acid to be detected is converted into a for the transfer of the pretreated sample is brought into a form suitable for propagation (for example, removal of disruptive constituents from the sample).
  • the type of pretreatment of the sample depends on the type of sample and the complexity of the biological material in the sample.
  • human body fluids such as. B. human blood
  • blood cells are first separated to produce plasma, serum or blood cell concentrates.
  • the complexity of the biological sample material in the resulting fractions is significantly reduced by the sample pretreatment, without the nucleic acid to be detected being substantially isolated.
  • sample pretreatment is carried out, e.g. B. by suspending the sputum or the smear in a liquid, in the case of urine z. B. by centrifugation and further processing of the fractions obtained.
  • sample pretreatment is carried out e.g. B. by suspension and treatment with a cell-aggregating agent.
  • sample pretreatment is carried out e.g. B. by centrifugation and further processing of the fractions obtained. In these cases, too, the sample pretreatment reduces the complexity of the biological sample material.
  • the nucleic acid to be detected is converted from the pretreated sample into a form which is accessible for the multiplication.
  • the pretreated sample is lysed in a first reaction step to release the nucleic acid to be detected, e.g. B. by proteinase K treatment at elevated temperatures or in deoxyribonucleic acids by alkali.
  • the sample pretreated by lysis is added after the addition of chaotropic agents, such as. As guanidinium hydrochloride or urea, in the presence or absence of soluble alcohols, such as. B. isopropanol, concentrated on the surface of a solid support and subsequent absorption of this solid support.
  • Such solid supports are e.g. B. solid supports with glass-containing surfaces (e.g. magnetic particles, glass fleece with glass-containing surfaces, particles, Microtiter plates, reaction vessels, dip sticks or miniaturized reaction chambers, which in turn can also be part of integrated reaction chips).
  • This solid support is preferably used for non-sequence-specific purification, ie no substantial isolation of the nucleic acids to be detected from other nucleic acids, but only a concentration of sample material (nucleic acids) and, if appropriate, inactivation and or elimination of inhibitors for the subsequent nucleic acid amplification and Detection reactions.
  • These solid supports also make it possible to provide several nucleic acids to be detected, e.g. B. in the context of multiplexing, in a form accessible for nucleic acid amplification and detection reactions possible.
  • the lysed, pretreated sample for binding the nucleic acid to be detected is brought into contact with solid supports which have been modified with nucleic acid-specific binding groups and / or capture probes specifically for the selective binding of the nucleic acid to be detected, and then the bound nucleic acid to be detected by dissociation between Binding group and / or carrier-bound capture probe and nucleic acid to be detected again.
  • Nucleic acid specific binding groups are PNA homopyrimidine oligomers such as e.g. B. (T) 7 -PNA or nucleic acid-binding low-molecular substances such as. B. nucleic acid intercalators, major groove binders or minor groove binders.
  • capture probes specific for the nucleic acid to be detected are nucleic acid oligomers or nucleic acid polymers with binding sequences for one or more nucleic acids to be detected.
  • Further examples of capture probes specific for the nucleic acid to be detected are PNA oligomers with binding sequences for one or more nucleic acids to be detected.
  • the nucleic acid-specific binding groups or the capture probes can be bound to the solid support with or without the interposition of spacers either covalently or via binding pairs, such as. B. Bioti streptavidin or Ni.Chelat.
  • the nucleic acid sequences used for amplification can be linear or circular and can sequence modifications and / or other modifications, such as. B. natural or artificial nucleotide analogs or equivalents thereof or base analogs or equivalents thereof, contain or / and be methylated, capped, polyadenylated or modified in some other way.
  • the nucleic acids used for the multiplication or their complement can be of natural origin, fragmented, modified or enzymatic, e.g. B. with the enzyme uracil deglycosylase (UNG), or physically pretreated, propagated, or chemically, photochemically or enzymatically generated, for. B. by chemical oligonucleotide synthesis or in vitro replication, in vitro reverse transcription or in vitro transcription.
  • UNG uracil deglycosylase
  • a section of the nucleic acid to be detected is amplified.
  • this section is also called the amplicon.
  • This contains the sequence region between the outer ends of the binding sequences A and C or the complement thereof, the primer (the Prirner binding regions), and contains the binding region E of the probe or the complement thereof.
  • the amplicon (preferably the total length of the sequences of regions A, B and C) is shorter than 100 nucleotides, particularly preferably shorter than 60 nucleotides, but preferably longer than 40 nucleotides. However, this does not mean that the total length of the amplificates cannot be longer, e.g. B. if the primers additionally have nucleotides that are not within the binding areas.
  • Such propagation methods are used which permit an amplification of the nucleic acid sequence to be detected or its complement, which result in the formation of
  • Tripartite mini nucleic acid amplification products lead to [Mini Chain Reaction (MCR)].
  • Target-specific nucleic acid amplification reactions are preferably used.
  • Be particularly preferred theoretically exponential target-specific nucleic acid amplification reactions are used in which there is an antiparallel replication of the nucleic acid to be detected or its complement, such as.
  • B. elongation-based reactions such.
  • B. the polymerase chain reaction PCR for deoxyribonucleic acids, RT-PCR for ribonucleic acids.
  • Thermocyclic exponential elongation-based nucleic acid amplification reactions such as, for. B. uses the polymerase chain reaction.
  • the nucleic acids to be detected or their complement used for the amplification can be in the form of single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids or ribonucleic acids.
  • the aim of the multiplication reactions is to produce a large number of amplificates of a section of the nucleic acid to be detected.
  • An amplificate is therefore understood to mean any molecular species produced using sequence information of the nucleic acid.
  • they are nucleic acids.
  • the term "amplificates" includes both single-stranded and double-stranded nucleic acids.
  • an amplificate can also contain further regions outside the mutually pointing ends of the primer binding sites, which regions are not directly related to sequences of the nucleic acid to be amplified.
  • Such sequences with a length of more than 15 nucleotides preferably do not occur on the nucleic acid to be detected or its complement and cannot hybridize with it by direct base pairing.
  • Amplificates can thus hybridize either with the nucleic acid to be detected itself or with its complement. Amplificates are, for example, also the products of an asymmetrical amplification, ie an amplification in which the two strands are formed in different amounts (e.g. by using different amounts of primers) or one of the two strands is destroyed again (e.g. by RNase).
  • a primer in the sense of the present invention is understood to be a molecule which can bind to a nucleic acid T or its complement via base pairings and which can be extended, preferably enzymatically.
  • Oligonucleotides that can be extended at their 3 'end using the nucleic acid to be detected or a complement thereof as a template nucleic acid.
  • Monovalent or multivalent or monofunctional or multifunctional agents which permit nucleic acid-dependent elongation can be used as primers. These agents can also be composed of different types of molecules, e.g. B. Chimeras from PNA and nucleotide (s) or from protein / peptide and nucleotide (s).
  • Oligomers or polymers with a binding length of between 9 and 30 nt, particularly preferably between 11 and 22 nt, which bind antiparallel to the nucleic acid T to be detected or its complement and which act as one of several reaction partners for an enzymatic replication of the ones to be detected can preferably be used as primers Nucleic acid or its complement act. Oligomers are particularly preferably used as primers which, after addition of a multiplication reagent by addition of at least a part of the primer to the nucleic acid to be detected or its complement, initiates a directed replication of one or both strands of the nucleic acid to be detected or their complement.
  • An example of a particularly preferred primer is a deoxyribooligonucleotide with a free 3 ' hydroxyl end.
  • the agents used as primers can in principle contain further groups, such as. B. markings.
  • the primers preferably do not contain any modification which would later be used for the detection or immobilization of the amplificates. It is necessary that the primers have the required binding properties for the nucleic acid to be detected or their complement and can be extended.
  • a probe is understood to be a molecule which can hybridize to nucleic acids on the basis of base-base interactions and which with the aid of the 5 'nuclease activity of Taq polymerase, Tth polymerase or other polymerases with 5' nuclease activity or cloned, mutated or chimeric polymerases with 5 'nuclease activity can be broken down piece by piece.
  • Preferred probes are therefore oligodeoxyribonucleotides.
  • the length of a probe is based on the Binding sequence D, preferably between 9 and 30 bases.
  • the probe preferably has, on different nucleotides, a reporter group that can absorb light of a wavelength and a quencher that can take over the radiated energy and absorbed by the reporter group in whole or in part, so that emission of light by the reporter group is suppressed.
  • a reporter group that can absorb light of a wavelength
  • a quencher that can take over the radiated energy and absorbed by the reporter group in whole or in part, so that emission of light by the reporter group is suppressed.
  • a binding sequence is preferably understood to mean the sequence of bases which lies between the outermost bases of a particular nucleic acid, a primer or a probe which bind with a particular nucleic acid, a primer or a probe via base-base interaction, including these outermost bases.
  • the agents used as a probe may contain one or more binding sequences D for one or more nucleic acids to be detected or their complement, but in particular for one strand of the amplificate, and may include sequence modifications, terminal and / or internal sequence additions and / or other modifications such as, for. B. natural or artificial nucleotide analogs or equivalents thereof, non-functional nucleotide analogs or equivalents thereof or base analogs or equivalents thereof or be methylated, capped or polyadenylated or otherwise modified as long as binding to a strand of the amplificate is possible, and a Degradation by a 5'-nuclease is possible.
  • the reporter group is preferably in the 5 'direction from the quencher group at a distance which still allows effective quenching.
  • the portion of the nucleic acid from which a large number of amplicons are to be produced is selected so that it contains three regions A, B and C.
  • the areas A and C are areas that are selected so that one primer can use sequence A as a binding sequence and the complement of region C can serve as a binding sequence for the other primer.
  • a complement is used to form a certain other nucleic acid, e.g. B. a sequence area z.
  • an amplificate or the nucleic acid to be detected is essentially complementary nucleic acid or nucleic acid sequence.
  • Essentially complementary means that the base pairings are chosen such that (in the event that hybridization with another nucleic acid, e.g. a probe or a primer) hybridization can still take place under the test conditions or (in the case an extension product of a primer in relation to the template used) the nucleic acid could be formed due to a primer extension reaction using the corresponding nucleic acid.
  • Essentially complementary therefore often means that, under stringent conditions, more than 90% of the bases of the nucleic acid or sequence under consideration form base pairings with the specific nucleic acid or sequence.
  • Regions A and C are preferably long enough according to the invention that conditions can be found under which primers of a corresponding length can hybridize with the bases in these regions.
  • the regions are therefore preferably longer than 8, particularly preferably longer than 12 nucleotides.
  • preferred ranges also result with regard to the upper limit of the length of the regions A and C.
  • the regions A and C are each preferably less than 30, particularly preferably less than 20 nucleotides.
  • the length of the regions is limited by the fact that the primers should be able to hybridize to them in a manner that is not specific to the nucleic acid to be detected. Therefore, the particularly preferred length of the binding sequences A and C is 12 to 20 nucleotides.
  • the areas A and C on the nucleic acid to be detected do not overlap.
  • the section of the nucleic acid to be detected (which corresponds to the amplicon) and thus the amplificates formed therefrom contain a sequence B located between regions A and C (FIGS. 1 to 3).
  • has this sequence a length of one or more nucleotides, preferably more than 4, particularly preferably more than 8 nucleotides.
  • sequence B is limited at the top by the required total length of the amplificate.
  • sequence B contains no nucleotides that do not belong to the binding sequence of the probe.
  • Sequence B is therefore preferably less than 30, particularly preferably less than 15 nucleotides.
  • Sequence B preferably has a length of between 4 and 30 nucleotides.
  • the length of the sequence B is particularly preferably between 8 and 15 nucleotides.
  • this sequence or the complement thereof also serves to bind the probe.
  • the length of the probe is chosen so that hybridization with the amplificate is possible.
  • the sequence of the probe is selected such that it contains a binding sequence D which is defined by the nucleotides of the probe which form base-base interaction with the amplicon, in particular the nucleotides of the probe which form base interaction between the outermost bases with corresponding bases of the amplicon.
  • the probe is preferably essentially complementary to the nucleotides of the binding sequence E of the amplificate.
  • the binding sequence D or D ' can be 100% complementary to the amplificate, but can also have mismatches between the outer ends of the binding sequence.
  • the probe can contain further groups or residues or also nucleic acid-binding regions (FIG. 3, V, VI).
  • the binding sequence D or D ' is longer than the region B or B' of the amplicon.
  • the binding sequence D or D ' extends into one or both regions A or A' and C or C of the amplicon.
  • Fig. 3, II to IV the amplificate between the mutually pointing ends of regions A and C contains no nucleotides which do not belong to the binding sequence E or the binding sequences of the primers.
  • the binding sequence D of the probe overlaps with one of the two binding sequences of the primers in FIGS. 3, II and III.
  • the length of area B corresponds to the length of area D, so that the binding sequence of the probe does not overlap with the binding sequences of the primers (FIGS. 3, 1).
  • the area D or D ' preferably does not overlap with the area A, A', C or C located in the 5 'direction.
  • the method according to the invention includes the formation of three-part mini amplicons (tripartite mini amplicon) which, in addition to the primer and probe binding sequences, have no additional sequences and thus avoid the disadvantages in the formation of longer nucleic acid amplification products, on the other hand
  • three-part mini amplicons tripartite mini amplicon
  • the specificity of the entire amplification format is ensured by binding the primers, by binding the probe and by running the target-dependent enzymatic elongation reaction with all 4 nucleotide or base specificities or natural or artificial analogs, isomers or equivalents thereof.
  • the propagation method according to the invention is therefore also referred to as a mini-chain reaction (MCR).
  • Enzymes that are active as enzymes eg enzymes
  • suitable ones can preferably be used as propagation reagents
  • elongation substrates are nucleic acid building blocks or natural or artificial analogs or isomers or equivalents thereof. Agents which are suitable for building up a counter strand of the nucleic acid to be detected are used as elongation substrates. Nucleotides are preferably used as elongation substrates.
  • Preferred nucleotides are dATP, dGTP, dCTP, dTTP and / or dUTP, dITP, iso-dGTP, iso-dCTP, deaza-dGTP and ATP, GTP, CTP, UTP and / or ITP, deazaGTP, iso-GTP, iso-CTP .
  • mixtures of meta- or thermostable enzymatic DNA polymerase are particularly preferred as nucleic acid amplification reagents.
  • thermocyclic multiplication reactions e.g. PCR, RT-PCR
  • 2- or 3-phase cycles are carried out, preferably 2-phase cycles.
  • the strand separation of the nucleic acid amplification products is carried out at high temperature, preferably 85 ° C.-95 ° C., the common primer and probe annealing and primer elongation at temperatures close to the melting point between primer and elongation counter strand or Primer and probe and elongation counter strand, preferably between 48 ° C and 72 ° C.
  • the strand separation is carried out by supplying energy and / or enzymatically, preferably by means of elevated temperature, microwaves or applying a voltage via a microelectrode, particularly preferably by means of elevated temperature.
  • Up to 80 thermal cycles are carried out, preferably up to 60 cycles. It is incubated for up to 4 hours, preferably 30-120 minutes.
  • the multiplication reaction can take place in reaction vessels, capillaries or miniaturized reaction chambers, which can also be part of an integrated reaction chip.
  • the fluorescence measurement is carried out continuously or within short time intervals during the amplification reaction, preferably several times during a temperature cycle, particularly preferably three times or more during a temperature cycle.
  • the propagation reaction can include an internal control and / or calibrator. The control can also be carried out externally by an additional propagation reaction.
  • Nucleic acid sequence or its complement incorporated.
  • the enzyme activity uracil deglycosylase, preferably with a thermolabile embodiment of the enzyme activity, in which the renaturation after thermal denaturation of the enzyme activity takes place more slowly, the amplification product and thus its property as a nucleic acid amplification unit can be fragmented.
  • the UMP-containing amplification product can be incubated following the nucleic acid amplification and detection reaction (sterilization) and / or before a new nucleic acid amplification reaction (carry-over prevention).
  • psoralen and / or isopsoral and derivatives thereof and irradiation with UV light can also be used for the functional inactivation of the nucleic acid amplification product.
  • the formation of the amplificates is detected with the probe, which binds to the binding sequence B of the amplicon to form a hybrid.
  • This acts as a substrate for releasing a reporter group from it.
  • the ends of the probe binding sequence lie between the outer ends of the primer binding sequences. The probe can thus be hybridized with one strand of the amplificate.
  • the probe can be bound using known conditions.
  • the method according to the invention is a special embodiment of the so-called hybridization tests, the basic features of which are known to the person skilled in the art in the field of nucleic acid diagnosis.
  • the full content of this is "Nucleic acid hybridization", editors BD Harnes and SJ Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in Chapters 1 (Hybridization Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridization) and 4 (Quantitative Filter Hybridization), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. FM Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, and Molecular Cloning, Ed. J.
  • the known methods also include the chemical synthesis of modified and unmodified oligonucleotides and the selection of hybridization conditions by means of which a specificity can be achieved which depends, among other things, on the extent of the homology between the nucleic acids to be hybridized, their GC content and their length.
  • the probe is added either before or during the amplification reaction, preferably in the form of a solution, if desired together with the primers.
  • Reagent conditions are set which allow hybridization of the probe with an amplificate.
  • the binding between the amplified nucleic acid sequence of the amplicon and / or its complement and the probe takes place during the amplification, so that the enzyme can degrade the probe from its 5 'end when a primer is extended, thereby releasing the reporter group, preferably in the form of mononucleoside building blocks. This prevents the quench process and the reporter group can emit light, which is measured as a signal and used as a sign of the presence of the nucleic acid.
  • a multiplex amplification method is usually understood to mean a method in which either different sequences on a nucleic acid (e.g.
  • the amplicon lengths preferably differ by no more than 20%, particularly preferably by no more than 5 nucleotides.
  • amplicons of the different sequences are produced and the sum of the amplicons formed is then determined.
  • a detection method is preferably used in which a marking can be used for all the detections; for example, all probes for the individual amplificates can be labeled identically, e.g. B. with the same ruthenium complex. This procedure is particularly advantageous for tests in samples from blood banks, since the type of infection is not important for the further usability of the samples for blood donations, but the sample is no longer suitable as blood donation material if any tested infection (e.g. B. HIV or HBV) is present.
  • any tested infection e.g. B. HIV or HBV
  • the primers are selected from highly conserved regions of the analyte nucleic acids in such a way that all of the nucleic acid sequences to be detected are amplified with the one set of (2) primers.
  • a mixture of more than 2 primers is used, of which at least 2 have a different selectivity.
  • One or more of the primers can be specific for all or a subset of the nucleic acids to be detected. This method is particularly preferable when little-related sequences are to be amplified next to each other.
  • Multiplex methods can be used to amplify a wide variety of combinations of the nucleic acid sequences to be detected, e.g. B. different subtypes of a virus or bacteria of different genera or species.
  • the released reporter group can be detected in methods known to the person skilled in the art, in particular in various embodiments, preferably based on fluorescence measurements.
  • fluorescence is activated by dequenching after binding the detection probe to the resulting tripartite mini amplicon and 5'-nucleolytic degradation and release of the fluorescent dye-modified nucleotide. The measurement of the resulting
  • Fluorescence signals are preferably given by real-time measurements.
  • fluorescein and rhodamine or derivatives thereof are used as fluorescence and quencher components in the quenched detector probes.
  • ruthenium or rhenium chelates and quinones or derivatives thereof are used as electrochemiluminescent and quencher components in the quenched detector probes.
  • a sequence is specific in the sense of the invention if it would in principle be able due to a continuous sequence of nucleobases, under stringent conditions only with a sequence on the nucleic acid to be detected, but not with nucleic acids of other, undetectable organisms or species or groups of To bind organisms.
  • a sequence is preferably not specific for a sequence if it hybridizes with other nucleic acids under the conditions which are set for carrying out the detection.
  • GenBank GenBank, EMBL, DDJB, PDB, PIR and Swiss-Prot.
  • the search methods are also stored on sequence databases such as the EMBL sequence databases, preferably also viral sequence databases such as e.g. em-vrl applied.
  • the blast program offers the user numerous customization options in order to be able to carry out an individual search.
  • H. identify those sequences that are specific for one or more analytes or that are not specific, d. H. also occur in other organisms or not. Reference is also made to Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, David J. Lipman (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 403-410.
  • the selectivity of the detection method does not result solely from the selectivity of the individual primers for a specific target, but from the cumulative selectivity of the overall system. Thus, even two primers or two primers and one probe, individually, can be completely unselective, i. H. individually with one
  • the invention also relates to a reagent kit for carrying out this method.
  • This contains the primers and preferably also a detection probe.
  • other reagents such as buffers and enzymes, e.g. B. contain a polymerase.
  • the primers bind to the binding sequences A or C, as described above, and the probe to a region B between the ends of the binding sequences A and C or the complement thereof.
  • the overall specificity of the detection method is retained. If one of the primer sequences is not specific for the nucleic acid to be detected, but also binds to other nucleic acids, no specific nucleic acid amplification product can be formed on the other nucleic acid since the second primer binding sequence is missing. Unspecific nucleic acid amplification products on the other nucleic acid are not detected because the specific binding sequence for the probe is missing.
  • the second primer sequence is also not specific for the nucleic acid to be detected, a specific nucleic acid amplification product can only be formed on the other nucleic acid if both primer binding sequences are in the same nucleic acid amplification unit. This nucleic acid amplification product is also not detected because the specific binding sequence for the probe is missing. If the probe sequence is not specific for the nucleic acid to be detected, but the two primers are specific, no nucleic acid amplification products of the other nucleic acid are formed. If, in addition to the probe sequence, one of the two primer sequences is also not specific for the nucleic acid to be detected, no specific nucleic acid amplification product of the other nucleic acid can be formed.
  • Nonspecific nucleic acid amplification products of the other nucleic acid that may be formed contain other sequences in the probe binding area and are therefore not detected. Are all three binding sequences for the two primers and the No probe specific for the nucleic acid to be detected, no nucleic acid amplification product is formed if at least one of the two primer sequences is not in a nucleic acid amplification unit of the other nucleic acid. If the probe sequence is not in the nucleic acid amplification unit of the two primer sequences for the other nucleic acid, a specific nucleic acid amplification product of the other nucleic acid can be formed, but it cannot be detected.
  • nucleic acid amplification product of the other nucleic acid can be formed and detected is when all three sequences lie within a nucleic acid amplification area.
  • this can be avoided by selecting the appropriate sequence of the nucleic acid amplification unit, eg. B. by not selecting the primer hybridization sites simultaneously from the same locus of the same undetectable organism.
  • Another way to specifically make primers and probes non-selective is to use degenerate bases within the sequence.
  • the region in which the hybridization of the target nucleic acid with the primer or the probe is to take place is expediently chosen in such a way that there are relatively few differences between the target sequence and another sequence which cannot be detected (e.g. another microorganism).
  • the differences that still exist can be largely compensated for by using degenerate bases at the different base positions.
  • Differences in primers (A and G) can be achieved by incorporating the base P (6H, 8H-3,4-dihydro-pyrimido [9,5-C] [1,2] oxazin-7-one, e.g. B. Nucleic Acids Research, Vol.
  • the amplificates are produced using nucleotides, particularly preferably mononucleotides, which are in each case complementary to A, G, C and / or T.
  • Region B or B 'of the nucleic acid to be detected preferably contains all 4 natural nucleobases.
  • a technical advantage of the method according to the invention is that a high degree of agreement of the measured values is achieved with multiple determinations of a sample.
  • FIG. 4 shows a section of an HCV genome, which forms the basis of the method shown by way of example.
  • the sequence from HGBV-B, which corresponds to the HCV sequence and from which the sequences for the primers and probes are taken, are also shown in FIG. 4.
  • HCV-RNA is surprisingly also possible specifically and reproducibly in positive HCV plasma samples, in which the HCV-RNA was not pre-cleaned in a sequence-specific manner, but was used directly from lysed plasma samples that were concentrated over glass surfaces. HCV-negative plasma samples give no signal. This is surprising in that the HCV RNA genome is very unstable to fragmentation in plasma lysates. With z. B. HTV plasma samples,
  • HBV serum samples Chlamydia samples from urine or human DNA samples from whole blood, which were also concentrated over glass surfaces, also receive no signal with the primers and probes used.
  • the method according to the invention can be used to avoid one or more of the disadvantages described for the prior art or to realize one or more of the following advantages.
  • the PCR cycles can be much shorter. This can shorten the total time of the verification procedures.
  • the sensitivity of the detection can be increased because there is less competition / displacement can take place between the short counterstring of the amplicon and the detector probe.
  • the specificity of the detection is increased because the relative proportion of the internal detector region is increased compared to the total amplicon length.
  • the differentiability of subtypes can be increased.
  • the detection background can be reduced because short amplicons have less potential for unspecific hybridization. For this reason, the signal-to-noise ratio can be increased.
  • the reproducibility of the results can be increased since smaller target regions on RNA genomes are less sensitive to RNA degradation. The possibilities for the formation of secondary structures are reduced.
  • oligonucleotides used are linear and single-stranded.
  • wash buffer 20 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl pH 7.5; 70% ethanol
  • the wild-type standard "pHCV-wt” was first amplified by amplifying a section of the HCV genome with the primers KY80 (5 '-gcagaaagcgtctagccatggcgt-3',
  • the RNA was quantified by photometric measurement of the absorption at 260 nm.
  • the amplification was carried out analogously to the method described in EP-A-0 699 768. Further details on the construction of probes for fluorogenously labeled probes for the TaqMan TM method are described in the product description for the TaqMan TM LS-50B and ABI Prism 7700 from Perkin Elmer. The tests were carried out with the following primer and probe sequences:
  • forward primer selected from the sequence between positions 390 and 417
  • reverse primer selected from the sequence between positions 421 and 448
  • probe selected from the sequence between positions 408 and 440, all based on the HGBV-B sequence the sequence HG22304 available from the EMBL database em-vrl, or from Proc. Natl. Acad. Be USA 1995, 92, 3401-3405 and or from J. Virlo. 69: 5621-5630.
  • the sequence shown in Figure 4 corresponds to the positions 390 to 448 of this sequence, so that the primer and probe positions can be converted directly.
  • Preferred primer / probe combinations result as follows: forward primer selected from one of the sequences: 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, and 392-408, reverse primer selected from one of the sequences: 427-448, 427-447, 427-446, 428-
  • 448, 428-447, 428-446, 429-448 and 429-447 probe selected from one of the sequences: 408-436, 408-435, 408-434, 408-433, 408- 432, 408-431, 408 -430, 408-429, 408-428, 409-436, 409-435, 409-434, 409-433, 409- 432, 409-431, 409-430, 409-429, 409-428, 410-436 , 410-435, 410-434, 410-433, 410- 432, 410-431, 410-430, 410-429, and 410-428, or, preferably:
  • forward primer sequence of 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, and 392-
  • reverse primer selected from one of the sequences: 423-448, 423-447, 423-446, 423- 445, 423-444,
  • Probe selected from one of the sequences: 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410- 432,, 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409 -429, 409-428, 408-433, 408- 432, 408-431, 408-430, 408-429, and 408-428 or, particularly preferably:
  • forward primer sequence of 390-406, 391-406, and 392-406
  • reverse primer selected from one of the sequences: 423-448, 423-447, 423-446, 423-445, 423-444
  • probe selected from one of the sequences: 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410- 432,, 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409-429, 409 -428, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430, 408-429, and 408-428.
  • Example 2 Example 2:
  • Example 1 the primers and probes shown in FIG. 5 were also used.
  • the last 3 sequences are given as their complement (probes or reverse primers).
  • the first sequence is the forward primer
  • the 2nd to 4th line shows the sequence of the Taq Man probes.
  • Lines 5-8 show the amplicons.
  • primer combinations and an HCV genome sequence corresponding to the amplicon formed therefrom are shown in FIGS. 6 and 7.
  • the combinations CK12-2 / CK23-1 / CK42 as well as CK11-1 / CK21-1 and CK22-1 / CK39 are preferred.
  • the HCV genome sequence shown has proven to be particularly preferred for the construction of primers and probes in the sense of the invention.
  • the corresponding HGBV-B sequence is also shown in the last line.
  • the primers and probes contain nucleotides with targeted degeneration. However, this does not mean that the oligonucleotides cannot be suitable for the amplification of HCV without degeneration.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure enthaltend die Schritte Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit einer Länge von weniger als 100 Nukleotiden mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine erste Bindesequenz (A) eines Strangs der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine zweite Bindesequenz (C'), die zu einer mit (A) nicht überlappenden, in 3'-Richtung von (A) gelegenen Sequenz (C) im wesentlichen komplementär ist, binden kann, in Anwesenheit einer Sonde mit einer Bindesequenz (D), welche an die zwischen den Sequenzen (A) und (C) gelegene dritte Sequenz (B) oder das Komplement (B') davon binden kann, wobei diese Sonde eine Reportergruppe und eine Quenchergruppe enthält, unter Verwendung einer Polymerase mit 5'-Nukleaseaktivität und Nachweis der Nukleinsäure durch Messung eines Signals, welches durch die Freisetzung der Reportergruppe bedingt ist.

Description

Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, bei dem eine Amplifikation eines Teilstückes dieser Nukleinsäuren vorgenommen wird und wobei dieses Teilstück im Hinblick auf seine Basensequenz bestimmte Bedingungen erfüllen muß, sowie ein Reagenzkit enthaltend zwei Primer und eine Sonde, die dieses Teilstück definieren.
Eine der meist angewandten molekularbiologischen Techniken zum Nachweis von Nukleinsäuren ist Hybridisierung mit sequenzspezifischen Sonden zum Nachweis homologer Nukleinsäure-Sequenzen. Der Nachweis von Nukleinsäure-Sequenzen ist von Bedeutung im Grundlagenbereich, jedoch von besonderer Bedeutung in verschiedenen Anwendungsfeldern, z. B. in den Bereichen medizinische Diagnostik, forensische Diagnostik, Lebensmitteldiagnostik, Umweltdiagnostik, Pflanzenschutz und Tiermedizin.
Als Sonde werden dabei entweder Oligonukleotide (kurze DNA oder RNA) oder Polynukleotide (längere DNA oder RNA) verwendet. Dabei haben die kürzeren Sonden gegenüber den längeren Sonden den Vorteil größerer Sequenzselektivität, wegen des kürzeren Hybridisierungsbereichs aber den Nachteil geringerer Sensitivität. Eine verbesserte Sensitivität und Sequenzselektivität wird mit PNA-Sonden (Peptidnukleinsäuren, z. B. WO 92/20702) erreicht, da diese Sonden eine höhere Bindungsaffinität zu Nukleinsäuren haben (höherer Tm) und durch eine höhere Basendiskriminierung gekennzeichnet sind (ΔTm). Zusätzlich können Sonden zum Nukleinsäure-Nachweis Markierungsgruppen tragen, die entweder zum Fangen und/oder zur Detektion von Hybridkomplexen aus Sonde und nachzuweisender Nukleinsaure geeignet sind. Zum Nukleinsäure-Nachweis durch Hybridisierung werden eine oder mehrere Sonden entweder zur Hybridisierung in Lösung oder auf festen Trägern verwendet. Bei Nukleinsäure-Nachweisen in Lösung spricht man von homogenen Nachweisformaten, bei Nachweis auf festen Trägern und/oder vermittelt durch feste Träger von heterogenen Nachweisformaten. Bei den heterogenen Nachweisverfahren kann die nachzuweisende Nukleinsaure auf dem festen Träger vorgebunden sein (z. B. dot blot). Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen mit einer Lösung, die die Sonde enthält. Umgekehrt kann die Sonde auf dem festen Träger vorgebunden sein (z. B. reverse dot blot). Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen der gebundenen Sonde mit einer Lösung, welche die nachzuweisende Nukleinsaure enthält. Alternativ dazu kann der Komplex aus nachzuweisender Nukleinsaure und Sonde erst in Lösung gebildet werden und die Bindung an den festen Träger erst anschließend erfolgen. Bei homogenen Testformaten werden z. B. Sondenpaare verwendet, die endständig energieübertragende Gruppen tragen und die über Co-Hybridisierung an die nachzuweisende Nukleinsaure in unmittelbaren Kontakt gebracht werden und dadurch ein Signal erzeugen. Alternativ dazu können auch Sonden verwendet werden, die nach Bindung an die nachzuweisende Nukleinsaure durch enzymatische 5'-Nukleaseaktivität in Lösung von einem gequenchten in einen ungequenchten Zustand überfuhrt werden.
Der Nachweis von Nukleinsäuren durch alleinige Sonden-Hybridisierung hat nur begrenzte Sensitivität. So ist selbst mit empfindlichen Detektions-Markierungsgruppen wie 32P, Digoxigenin, Biotin, Fluorescein, Ruthenium-Chelate, Fluorescein, Rhodamin oder AMCA allein nur eine Sensitivität in pg- bis fg-Bereich möglich. Zum empfindlichen Nukleinsäure-Nachweis gerade im medizinisch-diagnostischen Bereich sind jedoch Sensitivitäten im ag-Bereich und eine hohe Nachweisspezifität notwendig. Dies gilt sowohl für den Nachweis von körperfremden Nukleinsäuren z. B. in Form von Infektionserregern, als auch für den Nachweis der An- oder Abwesenheit oder Veränderung körpereigener Nukleinsäuren. Hohe Nachweissensitivität und Nachweisspezifität ist aber auch in den anderen genannten Anwendungsbereichen von hoher Wichtigkeit. So müssen manche Infektionserreger, wie z. B. HCV, HIV und HBV schon in wenigen Kopien nachgewiesen werden, um rechtzeitig erfolgreiche medizinische Interventionsmaßnahmen, z. B. durch frühzeitige Arzneimittelbehandlung, ansetzen zu können. Für solch frühzeitige Nachweise von Infektionserregen ist der Nachweis von Nukleinsäure-Sequenzen der Infektionserreger von Vorteil, da wegen der Verfügbarkeit von Nukleinsaure- Vervielfältigungstechniken (Nukleinsäure-Vermehrungsverfahren) ein empfindlicher Nachweis schon in einer frühen Infektionsphase (Latenzphase) möglich ist. Die Möglichkeit der gezielten Vermehrung des nachzuweisenden Agens gibt es nur im Fall von Nukleinsäuren, nicht aber im Fall von immunologischen Nachweisverfahren. Bei diesen Verfahren ist eine Steigerung der nachzuweisenden Infektionserreger-spezifischen Partikel nur über die humorale Immunantwort über Bildung von entsprechenden Infektionserreger-spezifischen Antikörpern möglich; diese Immunantwort erfolgt jedoch erst nach Ablauf der Latenzzeit und ist eine Sekundärreaktion nach Infektion durch den Errger. Daher hat der Nachweis über Nukleinsäure-Hybridisierung den Vorteil, daß z. B. der Infektionserreger direkt nach Infektion und sehr empfindlich nachgewiesen werden kann.
Der Erfolg von medizinischen Interventionsmaßnahmen ist jedoch auch davon abhängig, daß der Infektionserreger nicht nur frühzeitig mit hoher Sensitivität, sondern auch sehr spezifisch nachgewiesen werden kann. Zur gezielten Behandlung ist daher eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Infektionserregern, wie z. B. HAV, HBV, HCV, HTV, verschiedene Herpes- Viren, HPV, sowie die Unterscheidung einzelner Subtypen, wie z. B. HTV-1 und HIV-2, von Bedeutung. Dabei ist aber auch entscheidend, daß quantitative Aussagen gemacht werden können und keine falschpositiven oder falsch-negativen Ergebnisse erhalten werden, da solche falschen Ergebnisse u.U. gravierende therapeutische Konsequenzen nach sich ziehen können. Dies setzt Richtigkeit und hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse voraus. Daher muß der Nukleinsäure-Nachweis nicht nur sehr sensitiv, sondern auch sehr spezifisch und reproduzierbar sein. Der spezifische und sensitive Nukleinsäure-Nachweis muß auch rasch erfolgen, damit eine gezielte Therapie umgehend erfolgen kann. Oftmals ist auch von Bedeutung, mehrere Infektionserreger wie z. B. HCV, HIV und HBV nebeneinander nachzuweisen, z. B. im Rahmen von Blutbanken-Screeningtests. Dies erfolgt bei derzeit gängigen Nukleinsäure-Nachweistests durch hintereinandergeschaltete Einzelbestimmungen der nachzuweisenden Infektionserreger. Dies hat den Nachteil, daß mehrere Bestimmungen hintereinander durchgeführt werden müssen, was gerade beim Screening von großen Specimen-Stückzahlen nachteilig ist. Im Rahmen dieser Nukleinsäure-Bestimmungen ist wünschenswert, sensitive und spezifische Testmöglichkeiten verfugbar zu haben, die z. B. eine rasche parallele Bestimmung mehrerer Infektionserreger nebeneinander in einer einzigen Probe ermöglichen (Multiplex-Bestimmung).
Beim Nachweis der An- oder Abwesenheit von körpereigener Nukleinsaure innerhalb bestimmter genomischer Loci und/oder deren Veränderungen, wie z. B. ererbte, spontane oder eine Mischung aus ererbten und spontanen Mutationen, Deletionen, Inversionen, Translokationen, Rearrangements oder Triplett-Expansionen in Form von spezifischen und/oder polymorphen Veränderungen, ist ebenfalls die Verfügbarkeit spezifischer und sensitiver Nukleinsäure-Nachweisverfahren von Vorteil. Die Verfügbarkeit spezifischer und sensitiver Nukleinsäure-Nachweisverfahren ist jedoch nicht nur im medizinischen Sektor sondern auch in den anderen genannten Anwendungsbereichen von hoher Wichtigkeit.
Die bisherigen Testverfahren zum sensitiven und spezifischen Nachweis der An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuren basieren auf der kombinierten Durchführung von Nukleinsaure- Vermehrungsreaktionen (Nukleinsäure-Vermehrung) und Nukleinsäure- Nachweisreaktionen (Detektion).
Die nachzuweisende Nukleinsaure wird dabei in einer für die Vermehrungsreaktionen zugänglichen Form eingesetzt, z. B. in Form von unbehandeltem oder behandeltem Probenmaterial und/oder Probenmaterial-Konzentrierung, z. B. durch Adsorption des unbehandelten oder behandelten Probenmaterials an die Oberfläche eines festen Trägers und anschließende Resorption von diesem festen Träger. Solche festen Träger sind z. B. feste Träger mit glashaltigen Oberflächen. Durch diese festen Träger erfolgt keine substantielle Reinigung und/oder Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren, sondern lediglich eine Probenmaterial-Konzentrierang und ggf. Inaktivierung und/oder Eliminierung von Inhibitoren für die darauffolgenden Nukleinsaure- Vermehrungs- und Nachweisreaktionen. Durch diese festen Träger ist auch die Bereitstellung mehrer nachzuweisender Nukleinsäuren, z. B. im Rahmen von Multiplex- Verfahren, in für die Nukleinsäure-Vermehrungs- und -Nachweis-Reaktionen zugänglichen Form möglich.
Andere Probenvorbereitungs- Verfahren enthalten gezielte Verfahrensschritte zur Nukleinsäure-spezifischen und/oder sequenzspezifischen Bindung der nachzuweisenden Nukleinsaure, z. B. die Verwendung von festen Trägern mit Nukleinsäure-spezifischen Bindungsgruppen und/oder Nukleinsäure-Fangsonden zur selektiven Bindung und Freisetzung der nachzuweisenden Nukleinsaure durch Nukleinsäure-spezifische Bindung und anschließende Dissoziation zwischen Bindungsgruppe und/oder trägergebundener Fangsonde und nachzuweisender Nukleinsaure. Bei dieser Art von festen Trägern sind Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppen und/oder Nukleinsäure- Fangsonden an der Oberfläche der festen Träger notwendig. Daher sind zur
Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäuren, z. B. im Rahmen von Multiplex-Verfahren, entweder mehrere feste Träger notwendig, was aufwendiger ist, oder feste Träger mit einer oder mehreren Bindungsgruppen und/oder mit multiplen oder mehreren Fangsonden. Multiple Fangsonden enthalten mehrere Bindungs- Sequenzen für mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Diese Träger mit mehreren
Bindungsgruppen und/oder mehreren und/oder multiplen Fangsonden sind jedoch aufwendiger herzustellen. Ebenfalls sind die Reaktionsbedingungen zur gezielten Bindung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäuren an Träger mit mehreren Bindungsgruppen und/oder Fangsonden schwieriger einzustellen bzw. die Bindung mehrer nachzuweisender Nukleinsäurearten an eine Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppe oder an eine Fangsonde mit mehreren komplementären Hybridisierungssequenzen schwieriger einzustellen.
Die Vermehrung und der Nachweis der bereitgestellten nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt in heterogenen oder homogenen Nukleinsäure-Vermehrungs-Nachweisformaten. Die Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen und Detektionreaktionen können entweder hintereinander (heterogene Testverfahren) oder gleichzeitig (homogene Testverfahren) erfolgen. Als Vermehrungsreaktionen werden entweder targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen, targetabhängige Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen oder Signal-Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen verwendet. Die Verwendung von Detektionssystemen zum Nachweis der vermehrten Nukleinsäuren erfolgt entweder über den Einbau von Nukleotiden und/der die Verwendung von markierten Primern oder markierten Sonden. Die verwendeten Detektionssysteme enthalten entweder direkte oder indirekte Detektionsmarkierungen bzw. gekoppelte sekundäre und tertiäre Nachweiskomponenten. Die Detektion der vermehrten nachzuweisenden Nukleinsäuren kann jedoch auch durch spektroskopische oder pyhsikalische Methoden erfolgen.
Die bisherigen Nukleinsäure-Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierten Signal- Nukleinsäure- Vermehrungereaktionen haben den Nachteil geringer Sensitivität wegen der nicht-exponentiellen Signalvermehrung, erhöhten Störanfälligkeit durch stärkere Tendenz zur Hintergrundsignalbildung durch die Vielzahl der Sondenkomponenten und der Bildung unspezifischer Detektionssignale, da nicht die nachzuweisende Nukleinsaure selbst, sonden lediglich ein daran gekoppeltes Detektionssignal targetunabhängig vermehrt wird. Beispiele sind gekoppelte Signalkaskaden (z. B. SELF- Zyklus) oder signalgebende Sonden-Baum- oder -Bürstenstrukturen (z. B. branched DNA).
Die bisherigen Nukleinsaure- Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierten targetabhängigen Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen sind wegen der exponentiellen Signalvermehrung zwar sensitiver als die reinen Signal-Nukleinsäure- Vermehrungsverfahren, haben aber wiederum den Nachteil der Bildung unspezifischer Detektionssignale, da nicht die nachzuweisende Nukleinsaure selbst, sondern lediglich ein davon in einer einleitenden targetabhängigen Primärrektion abgeleitetes Detektionssignal in Form eines Nukleinsäure-Reportermoleküls Targetsequenz- unabhängig enzymatisch vermehrt wird. Beispiele sind die Qß-Replikationsreaktion, bei der ein Qß-Reportermolekül enzymatisch vermehrt wird, oder die Ligase- Kettenreaktion, bei der Teilstücke der Nukleinsäure-Reportermoleküle sequenzunabhängig enzymatisch verknüpft werden.
Als Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte der bisher sensitivsten und spezifischsten ex- ponentiellen targetspezifischen Nukleinsaure- Vermehrungsreaktionen wie z. B. PCR (US-A-4,683,202 bzw EP-B-0 202 362), RT-PCR, SDA, NASBA (EP-A-0 329 822) oder TAM (WO 91/01384), wurden bisher jeweils einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte durch targetsequenzabhängige thermozyklische oder isotherme enzymatische Elongation gegenläufige Primer, die sequenzpezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure sind und an die Enden der Nukleinsäure- Vermehrungseinheit (Amplikon) der nachzuweisenden Desoxyribo- oder Ribo- Nukleinsäuren oder deren Komplemente binden und somit die Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte begrenzen, erzeugt. Bei diesen Elongationsreaktionen werden alle 4 Basenspezifitäten eingebaut.
Die genannten Nukleinsaure- Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierter targetspezifischer Nukleinsaure- Vermehrungsreaktion sind wegen Targetsequenz- abhängiger enzymatischer Nukleinsäure-Vermehrungszyklen am spezifischsten. Während lineare targetspezifische Nukleinsaure- Vermehrungsreaktionen, wie z. B. die Cycling-Probe-Reaktion, nur zu begrenzter Sensitivität führen, ergeben exponentielle targetspezifische Nukleinsaure- Vermehrungsrektionen wie Elongations-basierte Reaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, RT-PCR, SDA) oder Transkriptions-basierte Reaktionen wie z. B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) oder Transcription Mediated Amplification (TMA) bisher die sensitivsten und spezifischsten Signale.
Mischformen zwischen targetabhängiger Signal-Nukleinsäure-Vermehrung und targetspezifischer Nukleinsaure- Vermehrung, wie z. B. die Gap-filling Ligase-
Kettenreaktion (gap-filling LCR, WO 90/01069), haben zwar gegenüber der nicht- modifizierten LCR einen targetabhängigen Reaktionsschritt, dieser ist aber begrenzt auf limitierte Sequenzabschnitte bestehend aus lediglich 1 oder 2 Basenspezifitäten und damit limitierterer Target-Spezifität. Für den Nachweis der entstandenen Nukleinsaure stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Der Nachweis der gebildeten Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte über Fragment- oder Sequenz-Gelanalyse ist zeitaufwendig und nicht quantitativ. Der Nachweis über trägergebundene Dot-, Slot- oder Reverse-Dot-Blot- Verfahren ist ebenfalls zeitaufwendig und nicht quantitativ.
Quantitative sensitive und spezifische Bestimmungen der nachzuweisenden Nukleinsäuren wurden bisher im Rahmen von heterogenen oder homogenen targetspezifischen exponentiellen Nukleinsäure-Vermehrungs-Reaktionsformaten möglich, bei denen das Nukleinsaure- Vermehrungsprodukt entweder durch eingebaute Label oder durch Hybridisierung während oder nach Amplifikation mit einer für die nachzuweisende Nukleinsaure oder deren Komplement spezifischen Sonde in einem Teil des durch Elongation entstandenen Sequenzabschnitts abgefangen wird. Ex- ponentielle Nukleinsaure- Vermehrungs-Reaktionsformate, bei denen eine Interkalation von Nukleinsäure-bindenden Farbstoffen erfolgt, sind zwar auch sensitiv, aber nicht sequenzspezifisch.
Bei den heterogenen Reaktionsformaten wird das Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt z. B. entweder über eine Primer-Fangmodifikation oder durch eine immobilisierte Fangsonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts ist, auf einen festen Träger gebunden und über Einbau eines detektionsmarkierten Nukleotids, durch Hybridisierung mit einer detektionsmarkierten Sonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts ist, oder über eine Primer-Detektionsmodifikation nachgewiesen. In homogenen Reaktionsformaten erfolgte bisher der Nachweis z. B. über die Hybridisierung einer Sonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure-Vermehrungsprodukts ist und die einen gequenchten Fluoreszenz-Label trägt, wobei die Targetsequenz-abhängige enzymatische Aufhebung der Quenchung durch die Primer-Elongations-bedingte Freisetzung des gequenchten Fluoreszenzmarkierten Nukleotids erfolgt (WO 92/02638), oder über die Anlagerung und/oder Interkalation eines detektierbaren Moleküls oder Gruppe. Bei allen bisherigen quantitativen sensitiven und spezifischen heterogenen und homogenen targetspezifischen exponentiellen Nukleinsäure-Vermehrungs- Reaktionsformaten wurden bisher Nukleinsäure-Vermehrungseinheiten (Amplikons) verwendet, die neben den spezifischen Primer- und Sonden-Bindungssequenzen zusätzliche Sequenzen variabler Länge zwischen den flankierenden Primer- Bindungssequenzen und der internen Sonden-Bindungssequenz enthielten. Diese fünfgeteilte Amplikonsstruktur resultierte in Amplikonlängen größer als die Summe der Sequenzlängen der beiden flankierenden Primer und der internen Sonde zwischen vorzugsweise 100 und 1000 Basen(paaren). Optimierungen der Nukleinsäure- Vermehrungsreaktion durch verbesserte Enzymmischungen gingen bisher vielmehr hauptsächlich in Richtung längere Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte.
Kürzere Amplikonlängen wurden bisher lediglich zum Nachweis spezieller Sequenzen wie z. B. bei Triplett-Expansionen, für In-situ-Untersuchungen oder den Nachweis stark fragmentierter Nukleinsäuren im Rahmen der Altertumsforschung erzeugt. Diese kurzen Amplikon-Längen wurden jedoch in zeitaufwendigeren Gelformaten oder In-situ- Formaten detektiert, die durch mangelnde Sensitivität und/oder fehlende Quantifizierung gekennzeichnet sind. Andere spezielle kurze Sequenzen wie Short Tandem Repeats, Short Interspersed Repetitive Elements Microsatellite Sequences oder HLA-spezifische Sequenzen wurden bisher lediglich als Primer- oder Sonden- Bindungssequenzen verwendet, bzw. in Kombination mit anderen Sequenzen.
Die fünfgeteilten Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte haben den Nachteil, daß sie neben den spezifisch Primer und Sonde bindenden Sequenzen noch zusätzliche Sequenzen beinhalten, die das Amplikon verlängern und die Gesamtspezifität im Hinblick auf die Spezifitäts-generierenden Primer- und Sonden-Bindungsreaktionen reduzieren.
Die bisher verwendeten längeren fünfteiligen Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte haben ferner den Nachteil längerer Primer-Elongationszeiten und damit längere Gesamt- Testzeiten. Die Sensitivität ist auch begrenzt durch Plateaueffekte der beteiligten Enzyme und Substrate, die bei längeren Amplikons früher erreicht werden. Ein weiterer Nachteil längerer Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte ist eine zunehmende Kompetition zwischen Amplikon-Gegenstrang und Detektor- oder Fangsonde und somit reduzierter Sensitivität. Ein weiterer Nachteil ist die erhöhte Möglichkeit der unspezifischen Bindung bedingt durch die zusätzlichen Sequenzen mit der Folge eines erhöhten Hintergrunds und dadurch geringerer Sensitivität (geringeres Signal-Rausch- Verhältnis). Ein weiterer Nachteil bei der Bindung des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts an trägergebundene Fangsonden ist die sterische und kinetische Hinderung längerer Nukleinsäure-Moleküle; daher werden Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte bisheriger Länge vor der Bindung durch die Fangsonde vorzugsweise fragmentiert. Ein weiterer Nachteil ist die erhöhte Anfälligkeit gegenüber Fragmentierung innerhalb der Amplikonsequenz und dadurch Zerstörung der Nukleinsaure- Vermehrungseinheit; dies führt zu geringerer Reproduzierbarkeit. Ein weiterer Nachteil ist, daß längere Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte bei niedrigen Testtemperaturen von z. B. 37 °C, die bei gängigen Nukleinsäure-Analysegeräten vorgegeben sind, weniger spezifisch hybridisieren, da eine größere Differenz zur Schmelztemperatur besteht. Ein weiterer Nachteil von fünfteiligen Nukleinsäure- Vermehrungsprodukten ist beim Nachweis mehrerer verschiedener Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte, daß unterschiedliche Nukleinsäure-Vermehrungslängen gebildet werden, die einen Multiplex-Nachweis erschweren.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein alternatives Nachweisverfahren für
Nukleinsäuren bereitzustellen, welches Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Verfahren hat.
Eine spezielle Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein targetabhängiges exponentielles Nukleinsäure-Vermehrungsverfahren zum hochsensitiven, hochspezifischen, reproduzierbaren und quantifizierbaren Nachweis einer oder mehrerer einzelsträngiger oder doppelsträngiger Nukleinsäuren bereitzustellen, welches insbesondere einen oder mehrere der genannten Nachteile vermeidet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war, unter Erhalt der Gesamtspezifität die Auswahl der Primer- und Sondensequenzen so flexibel zu gestalten, daß eine Bestimmung mehrerer verschiedener nachzuweisender Nukleinsäuren in einem vereinheitlichten Reaktionsformat unter Verwendung von vorzugsweise teilweise gleichen Primer- oder Sonden-Sequenzen möglich ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsaure enthaltend die Schritte Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsaure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine erste Bindesequenz (A) eines Strangs der Nukleinsaure binden kann und von denen der andere an eine zweite Bindesequenz (C), die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'- Richtung von A gelegenen Sequenz C dieses Stranges im wesentlichen komplementär ist, binden kann, in Anwesenheit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an die zwischen den Sequenzen A und C gelegene dritte Sequenz (B) oder das Komplement (B') davon binden kann, wobei diese Sonde eine Reportergruppe und eine Quenchergruppe enthält, unter Verwendung einer Polymerase mit 5'-Nukleaseaktivität und Nachweis der Nukleinsaure durch Messung eines Signals, welches durch die Freisetzung der Reportergruppe bedingt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Hilfe der Primer gebildeten Amplifikate eine Länge von weniger als 100 Nukleotide aufweisen.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens.
In Fig. 1 ist schematisch die in der vorliegenden Beschreibung verwendete
Bezeichnungsweise für die Bereiche auf der nachzuweisenden Nukleinsaure gezeigt.
In Fig. 2 ist die entsprechende Bezeichnungsweise für die intermediär gebildeten Verlängerungsprodukte der Primer sowie die Amplifikate (Amplikons) gezeigt. Ebenfalls ist gezeigt, daß die Amplifikate ein oder mehrere weitere Bereiche Y aufweisen können, die außerhalb des Bereiches liegen, der die von der nachzuweisenden Nukleinsaure stammende Sequenzinformation enthält.
In Fig. 3 ist schematisch gezeigt, wie im Falle der vorliegenden Erfindung die Bindesequenzen der Primer und Sonde angeordnet sind. Es ergeben sich verschiedene Alternativen I bis VI, je nachdem, ob und wie die Bindesequenzen überlappen. Es ist jeweils nur ein Strang des Amplifikats gezeigt. Dieselbe Anordnung (nur komplementär) kann für einen zweiten Strang des Amplifikats erstellt werden. Für die intermediär gebildeten Verlängerungsprodukte ergibt sich ein ähnliches Bild. Als Fall V und VI ist der Fall gezeigt, daß die Sonde neben der Bindesequenz D noch weitere, nicht mit dem Amplifikat Basenpaarungen ausbildende Bereiche X enthält, die gleich oder verschieden sein können. Zum Vergleich ist der Fall des Standes der Technik als VII gezeigt; die Sequenzen Z repräsentieren die zusätzlichen Sequenzen der fünfteiligen Amplikons.
In Fig. 4 ist eine für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignete Region des HCV-Genoms gezeigt, sowie eine Sequenz, aus welcher die Primer- und Sonden- Sequenzen bevorzugt ausgewählt werden. Diese zweite Sequenz ist dem nicht humanpathogenen Virus HGBV-B entnommen. Bei den hieraus gewählten Primer- und Sondensequenzen handelt es sich daher um nicht für HCV spezifische Sequenzen (J. Med. Virol. 48: 60-67).
In Fig. 5 sind weitere bevorzugte Primer und Sonden gezeigt.
In Fig. 6 und 7 sind weitere Primer und Sonden gezeigt.
Fig. 8 zeigt den besonders bevorzugten HCV-Bereich, der ganz oder teilweise der Amplifikation als Templat zur Verfügung gestellt werden sollte. Danebenliegende Sequenzen sollten nicht enthalten sein.
Nukleinsäuren, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können, können beliebigen Ursprungs sein, beispielsweise Nukleinsäuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs oder von Hefen oder Pilzen. Proben, in denen die nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen oder deren Komplement enthalten sind, sind z. B. humane, tierische, bakterielle oder pflanzliche Flüssigkeiten, oder Flüssigkeiten aus Hefen oder Pilzen, Exkremente, Abstriche, Zellsuspensionen, Kulturen oder Gewebs-, Zeil- oder Flüssigkeits-Punktionen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren in Lösung vor. Damit das erfindungsgemäße Verfahren seine Vorteile voll entfalten kann, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn die nachzuweisende Nukleinsaure eine Größe von mindestens 40 bp aufweist. Die Nukleinsaure kann jedoch auch eine durch Klonierung, Amplifikation, in-vitro- und in-vivo-Vermehrung hergestellte Nukleinsaure sein.
Die nachzuweisende Nukleinsaure kann einzelsträngig (insbesondere bei RNA) oder ganz- oder teilweise oppelsträngig (insbesondere bei DNA) sein. Für den Fall doppelsträngiger Nukleinsäuren können beide Stränge vermehrt werden oder aber auch nur einer. Aus beiden Sorten von Nukleinsäuren können einzel- oder doppelsträngige Amplifikate gebildet werden, wovon einer oder beide zum weiteren Nachweis verwendet werden können. Entsprechend wird die Sequenz der Sonde oder der Sonden ausgewählt. Sie ist bevorzugt komplementär zu dem Strang des Amplifikats, der zum weiteren Nachweis verwendet wird.
Der Probe oder einer Kontrollprobe können positive oder negative Kontrollnukleinsäuren oder Quantifizierungsstandards zugesetzt sein, die ähnlich oder gleich behandelt werden wie die nachzuweisenden Nukleinsäuren (interner bzw. externer Standard, interne bzw. externe Kontrolle). Als Standards können beispielsweise interne oder externe heterologe oder homologe DNA- oder RNA-Standards, enthaltend Primer-Bindesequenzen homologe und zu den Sequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäuren heterologe Sonden-Bindesequenzen, verwendet werden. Umgekehrt ist aber auch die Verwendung von besonders im 3 '-Priming-Bereich heterologen Primef- Bindesequenzen und homologen Sonden-Bindesequenzen möglich. Als Negativ- Kontrollen werden bevorzugt analoge Specimen eingesetzt, welche die nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplement nicht enthalten.
Vor der Vermehrung wird die Probe bevorzugt einem oder mehreren Vorbehandlungs- schritten unterzogen, um die nachzuweisenden Nukleinsäuren in eine vermehrungsfähige Form zu bringen. In einem ersten optionalen Schritt findet eine Vorbehandlung der Probe (Specimen) statt, durch welche die Probe in eine Form gebracht wird, aus der die nachzuweisende Nukleinsaure in eine für die Überführung der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrung geeignete Form gebracht wird (z.B. eine Abtrennung störender Bestandteile aus der Probe).
Die Art der Vorbehandlung der Probe hängt von der Art der Probe und der Komplexität des biologischen Materials in der Probe ab. Bei humanen Körperflüssigkeiten, wie z. B. Human-Blut, erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform zunächst eine Abtrennung von Blutzellen zur Erzeugung von Plasma, Serum oder Blutzellkonzentraten. Durch diesen Trennschritt wird durch die Probenvorbehandlung die Komplexität des biologischen Probenmaterials in den resultierenden Fraktionen deutlich reduziert, ohne daß eine substantielle Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsaure erfolgt. Im Fall von Sputum oder Abstrichen erfolgt eine Probenvorbehandlung, z. B. durch Suspendieren des Sputums bzw. des Abstrichs in einer Flüssigkeit, im Fall von Urin z. B. durch Zentrifugation und Weiterverarbeitung der erhaltenen Fraktionen. Im Fall von Gewebspunktionen erfolgt eine Probenvorbehandlung z. B. durch Suspendierung und Behandlung mit einem Zellverbands-auflösenden Agens. Bei Cerebrosidal-Flüssigkeit erfolgt die Probenvorbehandlung z. B. durch Zentrifugation und Weiterverarbeitung der erhaltenen Fraktionen. Auch in diesen Fällen erfolgt durch die Probenvorbehandlung eine Reduktion der Komplexität des biologischen Probenmaterials.
Danach kann sich ein Schritt anschließen, in dem die nachzuweisende Nukleinsaure aus der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrung zugängliche Form überführt wird. Dabei werden bevorzugt bekannte Methoden angewandt. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt in einem ersten Reaktionsschritt eine Lysebehandlung der vorbehandelten Probe zur Freisetzung der nachzuweisenden Nukleinsaure, z. B. durch Proteinase K-Behandlung bei erhöhten Temperaturen oder bei Desoxyribonukleinsäuren durch Alkali. In einem zweiten Schritt wird die durch Lyse vorbehandelte Probe nach Zugabe von chaotropen Agentien, wie z. B. Guanidinium-Hydrochlorid oder Harnstoff, in An- oder Abwesenheit von löslichen Alkoholen, wie z. B. Isopropanol, an die Oberfläche eines festen Trägers und anschließende Resorption von diesem festen Träger konzentriert. Solche festen Träger sind z. B. feste Träger mit glashaltigen Oberflächen (z. B. Magnetpartikel, Glasvließe mit glashaltigen Oberflächen, Partikel, Mikrotiterplatten, Reaktionsgefäße, Dip-sticks oder miniaturisierte Reaktionskammern, die wiederum auch Teil von integrierten Reaktionschips sein können). Durch diesen festen Träger erfolgt bevorzugt eine nicht-sequenzspezifische Reinigung, d.h. keine substantielle Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren von anderen Nukleinsäuren, sondern lediglich eine Probenmaterial-(Nukleinsäuren-)Konzentrierung und ggf. Inaktivierung und oder Eliminierung von Inhibitoren für die darauffolgenden Nukleinsäure-Vermehrungs- und Nachweisreaktionen. Durch diese festen Träger ist auch die Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsaure, z. B. im Rahmen von Multiplex-Verfahren, in für die Nukleinsäure-Vermehrungs- und -Nachweis-Reaktionen zugängliche Form möglich.
In einer anderen Ausführung kann die Überführung der nachzuweisenden Nukleinsaure aus der vorbehandelten Probe nach Nukleinsäure-Freisetzung in einem ersten Schritt durch z. B. Proteinase K-Behandlung bei erhöhten Temperaturen oder bei Desoxyribonukleinsäuren durch Alkali erfolgen. In einem zweiten Schritt wird die lysierte vorbehandelte Probe zur Bindung der nachzuweisenden Nukleinsaure mit festen Trägern in Kontakt gebracht, die mit Nukleinsäure-spezifischen Bindungsgruppen und/oder Fangsonden spezifisch zur selektiven Bindung der nachzuweisenden Nukleinsaure modifiziert sind, und anschließend die gebundene nachzuweisende Nukleinsaure durch Dissoziation zwischen Bindungsgruppe und/oder trägergebundener Fangsonde und nachzuweisender Nukleinsaure wieder eruiert. Beispiele für
Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppen sind PNA-Homopyrimidin-Oligomere wie z. B. (T)7-PNA oder Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Substanzen wie z. B. Nukleinsäure-Interkalatoren, Major groove-Binder oder Minor groove-Binder. Beispiele für Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure sind Nukleinsäure- Oligomere oder Nukleinsäure-Polymere mit Bindungssequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Weitere Beispiele für Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure sind PNA-Oligomere mit Bindungssequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Die Bindung der Nukleinsäure- spezifischen Bindungsgruppen oder der Fangsonden an den festen Träger kann mit oder ohne Zwischenschaltung von Abstandshaltern (Spacern) entweder kovalent oder über Bindungspaare, wie z. B. Bioti Streptavidin oder Ni.Chelat, erfolgen.
Die zur Vermehrung eingesetzten Nukleinsäurensequenzen können linear oder zirkulär sein und können Sequenz-Modifikationen und/oder sonstige Modifikationen, wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen- Analoga oder Äquivalente davon, enthalten oder/und methyliert, gecappt, polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein. Die zur Vermehrung eingesetzten Nukleinsäuren oder deren Komplement können natürlichen Ursprungs sein, fragmentiert, modifiziert oder enzymatisch, z. B. mit dem Enzym Uracil-Deglykosylase (UNG), oder physikalisch vorbehandelt, vorvermehrt, oder chemisch, photochemisch oder enzymatisch erzeugt sein, z. B. durch chemische Oligonukleotidsynthese oder in- vitro-Replikation, in-vitro-Reverse Transkription oder in-vitro-Transkription.
In dem ersten essentiellen Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Teilstück der nachzuweisenden Nukleinsaure amplifiziert. Im folgenden wird dieses Teilstück auch Amplikon genannt. Dieses enthält zwingend den Sequenzbereich zwischen den äußeren Enden der Bindesequenzen A und C bzw. des Komplements davon der Primer (den Prirnerbindungsbereichen), und enthält den Bindebereich E der Sonde bzw. das Komplement davon. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Amplikon (bevorzugt die Gesamtlänge der Sequenzen der Bereiche A, B und C) kürzer als 100 Nukleotide, besonders bevorzugt kürzer als 60 Nukleotide, jedoch bevorzugt länger als 40 Nukleotide. Dies bedeutet jedoch nicht, daß die Gesamtlänge der Amplifikate nicht doch größer sein kann, z. B. wenn die Primer zusätzlich Nukleotide aufweisen, die nicht innerhalb der Bindebereiche liegen. Es werden solche Vermehrungsmethoden eingesetzt, die eine Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz oder deren Komplement erlauben, die in der Bildung von
Tripartite-Mini-Nukleinsäure- Vermehrungsprodukten münden [Mini Chain Reaction (MCR)]. Hierfür stehen prinzipiell alle Nukleinsäureamplifikationsverfahren zur Verfügung, die im Stand der Technik bekannt sind. Bevorzugt werden targetspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen verwendet. Besonders bevorzugt werden theoretisch exponentielle targetspezifische Nukleinsaure- Vermehrungsreaktionen verwendet, bei denen eine antiparallele Replikation der nachzuweisenden Nukleinsaure oder deren Komplement erfolgt, wie z. B. Elongations-basierte Reaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR für Desoxyribonukleinsäuren, RT-PCR für Ribonukleinsäuren). In besonderer Weise bevorzugt werden thermozyklische exponentielle Elongations-basierte Nukleinsaure- Vermehrungsreaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenrektion verwendet. Die zur Vermehrung eingesetzten nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplement können in Form von einzelsträngigen oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäuren oder Ribonukleinsäuren vorliegen. Ziel der Vermehrungsreaktionen ist die Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks der nachzuweisenden Nukleinsaure. Unter einem Amplifikat wird daher jede unter Verwendung von Sequenzinformation der Nukleinsaure hergestellte Molekülspezies verstanden. Insbesondere handelt es sich um Nukleinsäuren. Der Begriff "Amplifikate" beinhaltet sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäuren. Ein Amplifikat kann neben den die Sequenzinformationen der zugrunde liegenden Nukleinsaure enthaltenden Bereichen (Amplikon) außerhalb der voneinander wegweisenden Enden der Primerbindungsstellen noch weitere Bereiche enthalten, welche nicht in direkter Relation mit Sequenzen der zu amplifizierenden Nukleinsaure stehen. Bevorzugt kommen gerade solche Sequenzen einer Länge von mehr als 15 Nukleotiden nicht auf der nachzuweisenden Nukleinsaure oder ihrem Komplement vor und können mit dieser nicht durch direkte Basenpaarung hybridisieren. Amplifikate können somit entweder mit der nachzuweisenden Nukleinsaure selbst oder mit deren Komplement hybridisieren. Amplifikate sind beispielsweise auch die Produkte einer asymmetrischen Amplifikation, d. h. einer Amplifikation, bei der die beiden Stränge in unterschiedlicher Menge gebildet werden (z. B. durch Einsatz unterschiedlicher Mengen an Primern) oder einer der beiden Stränge wieder zerstört wird (z. B. durch RNase).
Unter einem Primer im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül verstanden, welches über Basenpaarungen an eine Nukleinsaure T oder deren Komplement binden kann und welches, bevorzugt enzymatisch, verlängert werden kann. Bevorzugt sind Oligonukleotide, die an ihrem 3 '-Ende unter Verwendung der nachzuweisenden Nukleinsaure oder einem Komplement hiervon als Templatnukleinsäure verlängert werden können. Als Primer können monovalente oder multivalente oder monofunktionelle oder multifunktionelle Agentien eingesetzt werden, die eine Nukleinsäure-abhängige Elongation zulassen. Diese Agentien können auch aus verschiedenen Molekülarten zusammengesetzt sein, z. B. Chimären aus PNA und Nukleotid(en) oder aus Protein/Peptid und Nukleotid(en). Bevorzugt können als Primer Oligomere oder Polymere einer Bindelänge von zwischen 9 und 30 nt, besonders bevorzugt zwischen 11 und 22 nt verwendet werden, die an die nachzuweisende Nukleinsaure T oder deren Komplement antiparallel binden und die als ein von mehreren Reaktionspartnern für eine enzymatische Replikation der nachzuweisenden Nukleinsaure oder deren Komplement wirken. Besonders bevorzugt werden als Primer Oligomere verwendet, die nach Zugabe eines Vermehrungsreagenzes durch Anlagerung zumindest eines Teils des Primers an die nachzuweisende Nukleinsaure oder deren Komplement eine gerichtete Replikation einer oder beider Stränge der nachzuweisenden Nukleinsaure oder deren Komplement initiiert. Ein Beispiel für einen besonders bevorzugten Primer ist ein Desoxyribooligonukleotid mit einem freien 3 '-Hydroxyl- Ende.
Die als Primer eingesetzten Agentien können prinzipiell weitere Gruppen enthalten, wie z. B. Markierungen. Bevorzugt enthalten die Primer keine Modifikation, die später zur Detektion oder zur Immobilisierung der Amplifikate eingesetzt würde. Erforderlich ist, daß die Primer die geforderten Bindeeigenschaften zur nachzuweisenden Nukleinsaure bzw. ihrem Komplement haben und verlängerbar sind.
Unter einer Sonde wird ein Molekül verstanden, welches aufgrund von Basen-Basen- Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren hybridisieren kann und welches mit Hilfe der 5 '- Nuclease- Aktivität der Taq-Polymerase, Tth-Polymerase oder anderer Polymerasen mit 5 '-Nuclease- Aktivität oder clonierte, mutierte oder chimäre Polymerasen mit 5 '- Nuclease- Aktivität stückweise abgebaut werden kann. Bevorzugte Sonden sind daher Oligodesoxyribonukleotide. Die Länge einer Sonde beträgt, bezogen auf die Bindesequenz D, bevorzugt zwischen 9 und 30 Basen. Die Sonde weist bevorzugt an unterschiedlichen Nukleotiden eine Reportergruppe, die Licht einer Wellenlänge absorbieren kann, und einen Quencher, der die eingestrahlte und von der Reportergruppe absorbierte Energie ganz oder teilweise übernehmen kann, sodaß eine Emission von Licht durch die Reportergruppe unterdrückt wird, auf. Details für die Herstellung einer solchen Sonde sowie die generellen Bedingungen für die Durchführung eines Nachweisverfahrens aufgrund dieses Prinzips sind in WO 92/02638, US-A- 5,210,015 sowie EP-A-0 699 768 beschrieben. Auf die Offenbarung dieser Patentanmeldungen sowie ihrer Äquivalente wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Unter einer Bindesequenz wird bevorzugt die Sequenz von Basen verstanden, die zwischen den äußersten, mit einer bestimmten Nukleinsaure, einem Primer oder einer Sonde über Basen-Basen- Wechselwirkung bindenden Basen einer bestimmten Nukleinsaure, einem Primer oder einer Sonde liegt, einschließlich dieser äußersten Basen.
Die als Sonde eingesetzten Agentien können eine oder mehrere Bindesequenzen D für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren oder deren Komplement, insbesondere jedoch für einen Strang des Amplifikats enthalten und können Sequenz- Modifikationen, endständige und/oder interne Sequenzergänzungen und/oder sonstige Modifikationen wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon, nicht funktioneile Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen- Analoga oder Äquivalente davon enthalten oder methyliert, gecappt oder polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein, solange die Bindung an einen Strang des Amplifikats möglich ist, und ein Abbau durch eine 5'-Nuklease möglich ist. Die Reportergruppe liegt bevorzugt in 5 '-Richtung von der Quenchergruppe in einer Entfernimg, die ein effektives Quenchen noch erlaubt.
In der vorliegenden Erfindung wird das Teilstück der Nukleinsaure, von welchem eine Vielzahl von Amplifikaten hergestellt werden soll, so ausgewählt, daß es drei Bereiche A, B und C enthält. Die Bereiche A und C sind Bereiche, die so gewählt werden, daß der eine Primer die Sequenz A als Bindesequenz benutzen kann und das Komplement des Bereiches C als Bindesequenz für den anderen Primer dienen kann. Unter einem Komplement wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine zu einer bestimmten anderen Nukleinsaure, z. B. einem Sequenzbereich z. B. eines Amplifikats oder der nachzuweisenden Nukleinsaure im wesentlichen komplementäre Nukleinsaure oder Nukleinsäuresequenz verstanden.
Im wesentlichen komplementär bedeutet, daß die Basenpaarungen so gewählt sind, daß (für den Fall, daß eine Hybridisierung mit einer anderen Nukleinsaure, z. B. einer Sonde oder einem Primer) eine Hybridisierung unter den Testbedingungen noch erfolgen kann bzw. (für den Fall eines Verlängerungsprodukts eines Primers im Verhältnis zu dem eingesetzten Templat) die Nukleinsaure aufgrund einer Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung der entsprechenden Nukleinsaure gebildet werden konnte. Im wesentlichen komplementär bedeutet daher oft, daß unter stringenten Bedingungen mehr als 90 % der Basen der betrachteten Nukleinsaure bzw. Sequenz mit der bestimm- ten Nukleinsaure bzw. Sequenz Basenpaarungen ausbilden.
Die Bereiche A und C sind erfindungsgemäß bevorzugt so lang, daß Bedingungen gefunden werden können, bei denen Primer einer entsprechenden Länge mit den Basen in diesen Bereichen hybridisieren können. Daher sind die Bereiche bevorzugt länger als 8, besonders bevorzugt länger als 12 Nukleotide. Auch bezüglich der Obergrenze der Länge der Bereiche A und C ergeben sich im Sinne der Erfindung bevorzugte Bereiche. Die Bereiche A und C sind jeweils bevorzugt kleiner als 30, besonders bevorzugt kleiner als 20 Nukleotide. Die Länge der Bereiche wird in einem besonderen Aspekt der Erfindung dadurch nach oben begrenzt, daß die Primer in für die nachzuweisende Nukleinsaure unspezifischer Weise daran hybridisieren können sollen. Daher ist die besonders bevorzugte Länge der Bindesequenzen A und C 12 bis 20 Nukleotide. Die Bereiche A und C auf der nachzuweisenden Nukleinsaure überlappen nicht miteinander.
Im Sinne der Erfindung enthalten das Teilstück der nachzuweisenden Nukleinsaure (welches dem Amplikon entspricht) und somit die hieraus gebildeten Amplifikate eine zwischen den Bereichen A und C gelegene Sequenz B (Fig. 1 bis 3). Diese Sequenz hat eine Länge von ein oder mehr Nukleotiden, bevorzugt mehr als 4, besonders bevorzugt mehr als 8 Nukleotide. Nach oben hin ist die Länge der Sequenz B durch die geforderte Gesamtlänge des Amplifikats begrenzt. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Sequenz B keine Nukleotide, die nicht der Bindesequenz der Sonde zugehören. Bevorzugt ist die Sequenz B daher kleiner als 30, besonders bevorzugt kleiner als 15 Nukleotide. Die Sequenz B hat bevorzugt eine Länge von zwischen 4 und 30 Nukleotiden. Besonders bevorzugt ist die Länge der Sequenz B zwischen 8 und 15 Nukleotiden. Diese Sequenz oder das Komplement davon dienen im Sinne der Erfindung mit zur Bindung der Sonde. Die Länge der Sonde wird so gewählt, daß eine Hybridisierung mit dem Amplifikat möglich ist. Die Sequenz der Sonde wird so gewählt, daß sie eine Bindesequenz D enthält, welche durch die mit dem Amplikon Basen-Basen- Wechselwirkung ausbildenden Nukleotide der Sonde, insbesondere den zwischen den äußersten mit korrespondierenden Basen des Amplikons Basenwechselwirkung ausbildenden Nukleotide der Sonde definiert ist. Bevorzugt ist die Sonde im wesentlichen komplementär zu den Nukleotiden der Bindesequenz E des Amplifikats. Die Bindesequenz D bzw. D' kann zu dem Amplifikat zu 100 % komplementär sein, aber auch Mismatche zwischen den äußeren Enden der Bindesequenz aufweisen. Die Sonde kann neben der Bindesequenz weitere Gruppen oder Reste oder auch Nukleinsäure-bindende Bereiche enthalten (Fig. 3, V, VI).
Abhängig von der Länge des Bereiches B und der Länge der Bindesequenz D bzw. D' lassen sich unterschiedliche Fallgestaltungen treffen. In einem ersten Fall ist die Bindesequenz D oder D' länger als der Bereich B bzw. B' des Amplikons. In diesem Fall reicht die Bindesequenz D bzw. D' in einen oder beide Bereiche A bzw. A' und C bzw. C des Amplikons hinein. Diese Fälle sind in Fig. 3, II bis IV gezeigt. In diesen Fällen enthält das Amplifikat zwischen den voneinander wegweisenden Enden der Bereiche A und C keine Nukleotide, die nicht der Bindesequenz E oder den Bindesequenzen der Primer zugehören. Die Bindesequenz D der Sonde überlappt in Fig. 3, II und III mit einer der beiden Bindesequenzen der Primer. In einem weiteren Fall entspricht die Länge des Bereiches B der Länge des Bereiches D, so daß die Bindesequenz der Sonde nicht mit den Bindesequenzen der Primer überlappt (Fig. 3, 1). Bevorzugt im Sinne der Erfindung überlappt der Bereich D bzw D' nicht mit dem in 5'-Richtung gelegenen Bereich A, A', C oder C.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet in einer bevorzugten Ausführungsform die Bildung von dreiteiligen Mini-Amplikons (Tripartite-Mini-Amplikon), die neben den Primer und Sonde bindenden Sequenzen keine zusätzlichen Sequenzen aufweisen und somit die Nachteile bei Bildung von längeren Nukleinsaure- Vermehrungsprodukten vermeiden, wobei andererseits die Spezifität des gesamten Amplfikationsformats durch Bindung der Primer, durch Bindung der Sonde und durch Ablauf der targetabhängigen enzymatischen Elongationsreaktion mit allen 4 Nukleotid- bzw. Basenspezifitäten oder natürlicher oder artifizieller Analoga, Isomere oder Äquivalente davon aber sichergestellt wird. Das erfindungsgemäße Vermehrungsverfahren wird daher auch als Mini-Chain-Reaction (MCR) bezeichnet.
Die Vermehrung der nachzuweisenden Nuklemsäuresequenzen oder deren Komplement erfolgt, wenn im folgenden nichts anderes ausgesagt ist, unter Befolgung der dem Fachmann bekannten Reaktionsschritte und Reaktionsbedingungen. Ein Unterschied zu den herkömmlichen Verfahren ist der Einsatz der speziell ausgewählten Primer und Sondensequenzen, welche die Bildung und Vermehrung des Mini-Tripartite-Amplikons erlauben. Wesentlich im Sinne der Erfindung ist die Zugabe von einem oder mehrerer Primer, die an die Primer-Bindesequenzen der nachzuweisenden Nukleinsaure, des Tripartite-Mini-Amplikons beziehungsweise deren Komplemente binden.
Allgemein üblich ist die Zugabe zur Vermehrung befähigender Vermehrungsreagentien. Bevorzugt können als Vermehrungsreagentien enzymatisch aktive Komponenten (z. B. Enzyme) in Kombination mit Elongationssubstraten und geeignete
Hilfsreagentien (wie Puffer) verwendet werden. Bevorzugte Elongationssubstrate sind Nukleinsäurebausteine oder natürliche oder artifizielle Analoga oder Isomere oder Äquivalente davon. Als Elongationssubstrate werden Agentien eingesetzt, die zum Aufbau eines Gegenstrangs der nachzuweisenden Nukleinsaure geeignet sind. Bevorzugt werden als Elongationssubstrate Nukleotide eingesetzt. Bevorzugte Nukleotide sind dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP, dITP, iso-dGTP, iso-dCTP, deaza-dGTP und ATP, GTP, CTP, UTP und/oder ITP, deazaGTP, iso-GTP, iso-CTP.
Besonders bevorzugt werden im Fall der PCR als Nukleinsäure-Vermehrungsreagentien Mischungen aus meta- oder thermostabilen enzymatischen DNA-Polymerase-
Aktivitäten und Mischungen von Desoxyribo- und oder Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagenzien verwendet, z. B. T.aq.-DNA Polymerase in Kombination mit dATP, dGTP, dCTP, dTTP und oder dUTP und Hilfsreagentien wie z. B. Salze und ggf. Detergentien. Besonders bevorzugt werden im Fall der RT-PCR als Vermeh- rungsreagentien Mischungen, Komplexe oder Domänen aus thermostabilen enzymatischen Reverse Transkriptase- und DNA-Polymerase- Aktivitäten und Mischungen von Desoxyribo- und Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagentien verwendet, z. B. Mischungen aus AMV oder Mo-MLV-Reverse Transkriptase.
Bei den thermozyklischen Vermehrungsreaktionen (z. B. PCR, RT-PCR) werden 2- oder 3-phasige Zyklen durchgeführt, bevorzugt 2-phasige Zyklen. Bei den 2-phasigen Zyklen wird die Strangtrennung der Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte bei hoher Temperatur, bevorzugt 85 °C - 95 °C, durchgeführt, das gemeinsame Primer- und Sonden- Annealing und Primer-Elongation bei Temperaturen nahe dem Schmelzpunkt zwischen Primer und Elongationsgegenstrang bzw. Primer und Sonde und Elongations- gegenstrang, bevorzugt zwischen 48 °C und 72 °C. Die Strangtrennung erfolgt durch Energiezufuhr und/oder enzymatisch, bevorzugt durch erhöhte Temperatur, Mikrowellen oder das Anlegen einer Spannung über eine Mikroelektrode, besonders bevorzugt durch erhöhte Temperatur. Es werden bis zu 80 Thermozyklen durchgeführt, bevorzugt bis zu 60 Zyklen. Es wird bis zu 4 Stunden inkubiert, bevorzugt 30 - 120 Minuten. Die Vermehrungsreaktion kann in Reaktionsgefäßen, Kapillaren oder miniaturisierten Reaktionskammern erfolgen, die auch Teil eines integrierten Reaktionschips sein können. Die Fluoreszenzmessung erfolgt während der Amplifikationsreaktion kontinuierlich oder innerhalb kurzer Zeitintervalle, bevorzugt mehrfach während eines Temperaturcyclus, besonders bevorzugt 3 fach oder öfters während eines Temperaturcyclus. Die Vermehrungsreaktion kann eine interne Kontrolle und/oder Kalibrator enthalten. Die Kontrolle kann auch extern durch eine zusätzliche Vermehrungsreaktion erfolgen.
Bei Verwendung von dUTP anstelle von oder in Ergänzung zu dTTP wird durch die DNA-Polymerase-Aktivität dUMP anstelle von dTMP in die vermehrte
Nukleinsäuresequenz oder deren Komplement eingebaut. Dies erlaubt durch Inkubation mit der Enzymaktivität Uracil-Deglycosylase, bevorzugt mit einer thermolabilen Ausführungsform der Enzymaktivität, bei der die Renaturierung nach thermischer Denaturierung der Enzymaktivität langsamer erfolgt, die Fragmentierung des Vermeh- rungsprodukts und somit seiner Eigenschaft als Nukleinsaure- Vermehrungseinheit. Die Inkubation des UMP -haltigen Vermehrungsprodukts kann im Anschluß an die Nukleinsäure-Vermehrungs- und Nachweisreaktion (Sterilisierung) und/oder vor einer erneuten Nukleinsäure-Vermehrungsreaktion (Carry over-Prävention) erfolgen.
Alternativ können auch Psoralen und/oder Isopsoralen und Derivate davon und Bestrahlung mit UV-Licht zur fiinktionellen Inaktivierung des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts verwendet werden.
Der Nachweis der Bildung der Amplifikate erfolgt mit der Sonde, die an die Bindesequenz B des Amplikons zu einem Hybrid bindet. Die wirkt als Substrat zur Freisetzung einer Reportergruppe aus ihr. Die Enden der Bindesequenz der Sonde liegen zwischen den äußeren Enden der Primer-Bindesequenzen. Die Sonde ist somit hybridisierbar mit einem Strang des Amplifikats.
Die Bindung der Sonde kann unter Benutzung bekannter Bedingungen geschehen. Denn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D. Harnes und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug genommen. Zu den bekannten Methoden gehört auch die chemische Synthese von modifizierten und unmodifizierten Oligonukleotiden und die Auswahl von Hybridisierungsbedingungen, durch welche eine Spezifität erreicht werden kann, die unter anderem vom Ausmaß der Homologie zwischen den zu hybridisierenden Nukleinsäuren, deren GC-Gehalt und deren Länge abhängt.
Die Sonde wird im erfindungsgemäßen Verfahren entweder vor oder während der Amplifikationsreaktion zugegeben, bevorzugt in Form einer Lösung, gewünschtenfalls zusammen mit den Primern. Dabei werden Reagenzbedingungen eingestellt, die eine Hybridisierung der Sonde mit einem Amplifikat erlauben.
Die Bindung zwischen der vermehrten Nukleinsäuresequenz des Amplikons und/oder dessen Komplement und der Sonde erfolgt während der Amplifikation, sodaß das Enzym bei der Verlängerung eines Primers die Sonde von ihrem 5 '-Ende her abbauen kann, hierdurch wird die Reportergruppe freigesetzt, bevorzugt in Form von Mononukleosidbausteinen. Dadurch wird der Quenchprozess unterbunden und die Reportergruppe kann Licht emittieren, welches als Signal gemessen wird und als Zeichen für die Anwesenheit der Nukleinsaure verwendet wird.
Bei Verwendung mehrerer Sonden oder multifunktionaler Sonden oder Sonden, die mehrere Bindesequenzen für Amplifikate verschiedener nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplemente aufweisen, können mehrere unterschiedliche Amplifikate oder deren Komplemente gebunden werden. Dabei erlaubt die Bildung von Tripartite-Mini- Amplikons bevorzugt ähnlicher Länge, besonders bevorzugt solcher Tripartite-Mini-Amplikons gleicher Länge, bei der Nukleinsäurevermehrung die Einstellung vereinheitlichter Inkubationsbedingungen für die Bildung der unterschiedlichen Bindekomplexe. Dies erlaubt den parallelen und/oder sequentiellen Nachweis mehrerer Nukleinsäuresequenzen im Rahmen von Multiplex-Verfahren. Unter einem Multiplex- Amplifikationsverfahren wird meist ein Verfahren verstanden, bei dem entweder unterschiedliche Sequenzen auf einer Nukleinsaure (z. B. unterschiedliche Regionen eines Gens) oder aber unterschiedliche Sequenzen auf unterschiedlichen Nukleinsäuren, z. B. aus unterschiedlichen Organismen, z. B. unterschiedlichen Viren, gleichzeitig in einer Amplifikationsmischung vermehrt werden. Solche Verfahren stellen hohe Anforderungen an die Reaktionsbedingungen, da für eine zuverlässige Auswertung die Amplifikationen für die unterschiedlichen Sequenzen eine ähnliche Amplifikations-Effizienz haben müssen. Einen der Einflußfaktoren für unterschiedliche Effizienz auszuräumen, ist Gegenstand der vorligenden Erfindung. Dazu unterscheiden sich die Ampliconlängen bevorzugt um nicht mehr als 20 %, besonders bevorzugt um nicht mehr als 5 Nukleotide.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Multiplexverfahrens werden Amplicons der verschiedenen Sequenzen hergestellt und anschließend die Summe der gebildeten Amplicons bestimmt. Dabei wird bevorzugt ein Nachweisverfahren eingesetzt, bei dem eine Markierung für alle Nachweise verwendet werden kann; so können beispielsweise alle Sonden für die einzelnen Amplifikate gleich markiert sein, z. B. mit dem gleichen Ruthenium-Komplex. Dieses Vorgehen ist insbesondere für Tests in Proben aus Blutbanken vorteilhaft, da es bei der weiteren Verwendbarkeit der Proben für Blutspenden nicht auf die Art einer Infektion ankommt, sondern die Probe schon dann nicht mehr als Blutspendematerial in Frage kommt, wenn irgendeine getestete Infektion (z. B. HIV oder HBV) vorliegt.
Bei den Multiplex-Amplifikationsverfahren unterscheidet man zwischen echten und unechten Multiplex- Verfahren. Bei unechten Verfahren werden die Primer aus stark konservierten Regionen der Analytnukleinsäuren ausgewählt, derart, daß mit dem einen Set von (2) Primern alle nachzuweisenden Nuklemsäuresequenzen amplifiziert werden. Bei echten Multiplex- Verfahren wird ein Gemisch von mehr als 2 Primern eingesetzt, von denen mindestens 2 eine unterschiedliche Selektivität haben. Einer oder mehrere der Primer können für alle oder ein Unterset von nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifisch sein. Dieses Verfahren ist insbesondere dann vorzuziehen, wenn wenig verwandte Sequenzen nebeneinander amplifiziert werden sollen. Mit Multiplex-Verfahren können verschiedenste Kombinationen von nachzuweisenden Nuklemsäuresequenzen nebeneinander amplifiziert werden, z. B. verschiedene Subtypen eines Virus oder Bakterien verschiedener Genera oder Spezies.
Der Nachweis der freigesetzten Reportergruppe kann in für den Fachmann bekannten Verfahren, insbesondere in verschiedenen Ausführungsformen erfolgen, bevorzugt basierend auf Fluoreszenzmessungen.
Im Fall der gequenchten Fluoreszenzmarkierungen erfolgt eine Fluoreszenzaktivierung durch Dequenching nach Bindung der Detektions-Sonde an das entstehende Tripartite- Mini- Amplikon und 5'-nukleolytischer Abbau und Freisetzung des Fluo- reszenzfarbstoff-modifizierten Nukleotids. Die Messung der resultierenden
Fluoreszenzsignale erfolgt jeweils bevorzugt durch Real time-Messungen. In einer besonderen Ausführungsform werden bei den gequenchten Detektorsonden Fluorescein und Rhodamin oder Derivate davon als Fluoreszenz- und Quencher-Komponenten verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden bei den gequenchten Detektor- sonden Ruthenium- oder Rhenium-Chelate und Quinone oder Derivate davon als Elektrochemilumineszenz- und Quencher-Komponenten verwendet.
Besonders bevorzugt im Sinne dieses ersten Aspekts der Erfindung sind solche Ausführungsformen, bei denen mindestens eine der Bindesequenzen der Primer und der Sonde nicht für die nachzuweisende Nukleinsaure spezifisch ist. Spezifisch im Sinne der Erfindung ist eine Sequenz dann, wenn sie aufgrund einer fortlaufenden Sequenz von Nukleobasen prinzipiell in der Lage wäre, unter stringenten Bedingungen nur mit einer Sequenz auf der nachzuweisenden Nukleinsaure, nicht jedoch mit Nukleinsäuren anderer, nicht nachzuweisender Organismen oder Spezies oder Gruppen von Organismen zu binden. Bevorzugt ist eine Sequenz dann nicht für eine Sequenz spezifisch, wenn sie unter den Bedingungen, welche für die Durchführung des Nachweises eingestellt werden, mit anderen Nukleinsäuren hybridisiert.
Homologien zu anderen Genomen (Sequenzen) lassen sich mit Hilfe einer definierten Ausgangssequenz identifizieren. Verwendet wird eine z. B. über das Internet für jeden zugängliche Suchmaschine mit Namen "BLAST" (Basis Local Alignment Search Tool) (Homepage-Addresse: >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/<).
Diese ermöglicht den Zugriff auf diverse andere Sequenz- und Proteindatenbanken, von denen als am wesentlichsten zu benennen sind:
GenBank, EMBL, DDJB, PDB, PIR und Swiss-Prot.
Es werden auch BLASTN- Verfahren gemäß Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 im Rahmen von UWGCG Suchverfahren verwendet.
Die Suchverfahren werden auch auf Sequenzdatenbanken wie z.B. die EMBL- Sequenzdatenbanken, bevorzugt auch virale Sequenzdatenbanken wie z.B. em-vrl angewandt.
Das Blast-Programm bietet dem Anwender zahlreiche Anpassungsmöglichkeiten, ume ine individuelle Suche ausführen zu können, d. h. solche Sequenzen zu identifizieren, die für einen oder mehrere Analyten spezifisch sind, oder die eben nicht spezifisch sind, d. h. auch in anderen Organismen vorkommen oder nicht. Hierzu wird auch verwiesen auf Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, David J. Lipman (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 403-410. Erstaunlicherweise ergibt sich nämlich die Selektivität des Nachweisverfahrens nicht allein aus der Selektivität der einzelnen Primer für ein spezifisches Target, sondern aus der kumulierten Selektivität des Gesamtsystems. So können sogar zwei Primer oder zwei Primer und eine Sonde, einzeln völlig unselektiv sein, d. h. einzeln mit einer
Vielzahl von Targets hybridisieren; dadurch, daß sich die Selektivitäten der einzelnen Primer und Sonde (nur) in der nachzuweisenden Nukleinsaure überlagern, ist eine Gesamtspezifität gegeben. Dadurch, daß man auf die Selektivität der Primer aber bei der Auswahl der zu amplifizierenden und nachzuweisenden Nukleinsaure nicht so sehr fest- gelegt ist, ist es viel besser möglich, für unterschiedliche Targets kurze Amplicons zu lokalisieren, die in ihrer Länge vollständig oder weitgehend (d. h. über 95 %) übereinstimmen. Dies macht Simultan- Amplifikationen und -Hybridisierungen (wie im Falle von Nukleinsäuresondenarrays) besser realisierbar und reproduzierbar. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens. Dieses enthält die Primer und bevorzugt auch eine Nachweissonde. Es kann jedoch auch weitere Reagenzien, wie Puffer und Enzyme, z. B. eine Polymerase, enthalten.
Bevorzugt binden die Primer an die Bindesequenzen A bzw C, wie oben beschrieben, und die Sonde an einen zwischen den Enden der Bindesequenzen A und C gelegenen Bereich B oder das Komplement davon.
Auch bei der Verwendung von mindestens einer Sequenz aus den 3 Sequenzbereichen der beiden Primer und der Sonde, die nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure ist, bleibt die Gesamtspezifität des Nachweisverfahrens erhalten. Ist eine der Primersequenzen nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure, sondern bindet auch an andere Nukleinsäuren, kann kein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt auf der anderen Nukleinsaure gebildet werden, da die zweite Primerbindungssequenz fehlt. Unspezifische Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte auf der anderen Nukleinsaure werden nicht detektiert, da die spezifische Bindungssequenz für die Sonde fehlt. Ist auch die zweite Primersequenz nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure, kann nur dann ein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt auf der anderen Nukleinsaure gebildet werden, wenn beide Primerbindungssequenzen in der gleichen Nukleinsaure- Vermehrungseinheit sind. Dieses Nukleinsaure- Vermehrungsprodukt wird ebenfalls nicht detektiert, da die spezifische Bindungssequenz für die Sonde fehlt. Ist die Sondensequenz nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure, jedoch die beiden Primer spezifisch, werden keine Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte der anderen Nukleinsaure gebildet. Ist zusätzlich zur Sondensequenz auch eine der beiden Primersequenzen nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure, kann wiederum kein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsaure gebildet werden. Unspezifische Nukleinsaure- Vermehrungsprodukte der anderen Nukleinsaure, die möglicherweise gebildet werden, enthalten andere Sequenzen im Sondenbindungsbereich und werden daher nicht detektiert. Sind alle drei Bindungssequenzen für die beiden Primer und die Sonde nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsaure, wird kein Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt gebildet, wenn mindestens eine der beiden Primersequenzen nicht in einer Nukleinsaure- Vermehrungseinheit der anderen Nukleinsaure liegt. Liegt die Sondensequenz nicht in der Nukleinsäure-Vermehrungseinheit der beiden Primersequenzen für die andere Nukleinsaure, kann zwar ein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsaure gebildet, aber nicht detektiert werden. Der einzige Fall, daß ein spezifisches Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsaure gebildet und detektiert werden kann, ist, wenn alle drei Sequenzen innerhalb eines Nukleinsaure- Vermehrungsbereichs liegen. Dies kann jedoch durch ent- sprechende Sequenzauswahl der Nukleinsaure- Vermehrungseinheit vermieden werden, z. B. indem die Primerhybridisierungsstellen nicht gleichzeitig aus demselben Locus desselben nicht nachzuweisenden Organismus gewählt werden.
Eine weitere Möglichkeit, Primer und Sonden gezielt unselektiv zu machen, besteht in der Verwendung degenerierter Basen innerhalb der Sequenz. Dabei wird zweckmäßigerweise die Region, in der die Hybridisierung der Targetnukleinsäure mit dem Primer oder der Sonde stattfinden soll, so gewählt, daß relativ wenig Unterschiede zwischen der Targetsequenz und einer anderen, jedoch nicht nachzuweisenden Sequenz (z. B. eines anderen Mikroorganismus) bestehen. Die noch bestehenden Unterschiede können durch den Einsatz degenerierter Basen an den differierenden Basenpositionen weitgehend ausgeglichen werden. So lassen sich Unterschiede von Primern (A bzw. G) durch den Einbau der Base P (6H, 8H-3,4-dihydro-pyrimido[9,5-C][l,2]oxazin-7-on, z. B. Nucleic Acids Research, Vol. 17, 24, 1989, p. 10373-10383) ausgleichen. Dasselbe gilt für Pyrimidine mit der Base K (Nucleorides & Nucleotides, 16 (7-9), 1507-1511 (1997)). Eine noch stärkere Degenierung ist durch den Einsatz von Inosin möglich (US- A-5,585,477; US- A-5, 691,134; US-A-5,578,467; J.Biol.Chem. 260, 5, 2605-2608,
1985; Nucl.Acids Res. 1995, 23, 13, 2499-2505), da Inosin Basenpaarung mit allen vier Basen erlaubt.
Eine weitere Möglichkeit, nichtkomplementäre Basen einzusetzen, ist der Ersatz von A durch D (Diaminopurine oder/und der Ersatz von C durch M (Methylcytosin). In einer weiteren Ausführungsform findet die Herstellung der Amplifikate unter Einsatz von Nukleotiden, besonders bevorzugt Mononukleotiden, welche jeweils zu A, G, C und/oder T komplementär sind, statt. Bevorzugt enthält der Bereich B bzw. B' der nachzuweisenden Nukleinsaure alle 4 natürlichen Nukleobasen.
Ein technischer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß bei Mehrfachbestimmungen einer Probe ein hoher Grad an Übereinstimmung der Meßwerte erreicht wird.
Im folgenden sollen die beiden Aspekte der vorliegenden Erfindung anhand eines Nachweises für HCV beschrieben werden. Die Nukleinsäuresequenz von HCV ist beispielsweise in EP-B-0 318 216 beschrieben. In FIG. 4 ist ein Ausschnitt aus einem HCV-Genom gezeigt, welches Grundlage des beispielhaft gezeigten Verfahrens ist. Die Sequenz aus HGBV-B, die der HCV-Sequenz entspricht und aus der die Sequenzen für die Primer und Probes entnommen sind, sind ebenfalls in FIG 4 gezeigt.
Der Nachweis von HCV-RNA ist überraschenderweise trotz der kurzen vermehrten Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsaure auch spezifisch und reproduzierbar in positiven HCV-Plasmaproben möglich, in denen die HCV-RNA nicht sequenzspezifisch vorgereinigt wurde, sondern direkt aus lysierten und über Glasoberflächen aufkonzentrierten Plasmaproben eingesetzt wurde. HCV-negative Plasmaproben ergeben kein Signal. Dies ist insofern überraschend, da das HCV-RNA-Genom sehr labil ist gegenüber Fragmentierung in Plasma-Lysaten. Mit z. B. HTV-Plasmaproben,
HBV-Serumproben, Chlamydiaproben aus Urin oder Human-DNA-Proben aus Vollblut, die ebenfalls über Glasoberflächen aufkonzentriert wurden, wird mit den eingesetzten Primern und Sonden ebenfalls kein Signal erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um einen oder mehrere der für den Stand der Technik geschilderten Nachteile zu vermeiden oder um einen oder mehrere der folgenden Vorteile zu realisieren. Die PCR-Zyklen können sehr viel kürzer sein. Die Gesamtzeit der Nachweisverfahren kann dadurch verkürzt werden. Die Sensitivität des Nachweises kann erhöht werden, da weniger Kompetition/Verdrängung zwischen dem kurzen Gegenstrang des Amplikons und der Detektorsonde stattfinden kann. Die Spezifität des Nachweises wird erhöht, da der relative Anteil der internen Detektorregion gegenüber der gesamten Amplikonlänge erhöht wird. Die Differenzier- barkeit von Subtypen kann erhöht werden. Der Nachweishintergrund kann gesenkt werden, da kurze Amplika weniger Potential für unspezifische Hybridisierung mit sich bringen. Aus diesem Grund kann das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht werden. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse kann erhöht werden, da kleinere Targetregionen auf RNA-Genomen weniger sensitiv für RNA- Abbau sind. Die Möglichkeiten zur Ausbildung von Sekundärstrukturen werden reduziert.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Allgemeines
Alle verwendeten Oligonukleotide sind linear und einzelsträngig.
Beispiel 1
Nachweis von HCV aus menschlichem Blut
a) Probenvorbereitung:
Die RNA-Isolierung aus Plasma erfolgte anhand folgenden Probenvorbereitungsprotokolls:
I . Plasma (420 μl) mit 80 μl Proteinase K (25 mg/ml) mischen und einige Sekunden vortexen 2. Zugabe von 500 μl Lysepuffer (inkl. 1 μg Carrier-RNA (polyA)/ml): 5,4 M
Guanidinium-Thiocyanat; 10 mM Harnstoff; 10 mM Tris-HCl; 20 % Triton X 100; pH 4,4
3. vortexen und anschließend 10 min bei RT schütteln
4. Zugabe von 500 μl Isopropanol-MGP (6 mg magnetische Glaspartikel in Isopropanol)
5. vortexen und anschließend 20 min bei RT schütteln
6. Magnetseparation der MGPs
7. Überstand abnehmen und verwerfen
8. Zugabe von 750 μl Waschpuffer: 20 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 70 % Ethanol
9. MGPs auf Vortex resuspendieren und erneute Magnetseparation
10. Waschvorgang insgesamt 5mal wiederholen
I I . Zugabe von 100 μl DEMC-Wasser zur Elution 12. 15 min bei 80 °C schütteln 13. Magnetseparation
14. 10 μl des Eluats in die RT-PCR einsetzen
b) Klonierung und Präparation des RNA-Standards:
Der Wildtypstandard "pHCV-wt" wurde zunächst durch Amplifikation eines Abschnitts des HCV-Genoms mit den Primern KY80 (5 '-gcagaaagcgtctagccatggcgt-3 ',
SEQ.ID.NO.l) und KY78 (5'-ctcgcaagcaccctatcaggcagt-3', SEQ.ID.NO.2) gewonnen und das Amplikon anschließend über eine sog. "blunt-end"-Klonierung in den Vektor pBluescript SK+ kloniert. Nach Vermehrung der bakteriellen Zellen wurde das Plasmid isoliert, durch restriktionsenzymatischen Verdau linearisiert und über eine in-vitro- Transkription das entsprechende RNA-Fragment gewonnen und aufgereinigt.
Die Quantifizierung der RNA erfolgte über photometrische Messung der Absorption bei 260 nm.
Alle hier beschriebenen molekularbiologischen Verfahren können einschlägigen Methodik-Büchern entnommen werden (e.g. Maniatis et al.; Ausubel et al.).
c) RT-PCR assay:
Die Amplifikation erfolgte analog zu dem in EP-A-0 699 768 beschriebenen Verfahren. Weitere Details zur Konstruktion von Sonden für fluorogen markierte Sonden für das TaqMan™- Verfahren sind in der Produktbeschreibung für die Geräte TaqMan™ LS- 50B und ABI Prism 7700 von Perkin Eimer beschrieben. Die Versuche wurden vorgenommen mit folgenden Primer- und Sondensequenzen:
forward Primer: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 390 und 417, reverse Primer: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 421 und 448, Sonde: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 408 und 440, alle bezogen auf die HGBV-B Sequenz aus der Sequenz HG22304 erhältlich aus der EMBL- Datenbank em-vrl, oder aus Proc. Natl. Acad. Sei USA 1995, 92, 3401-3405 und oder aus J. Virlo. 69: 5621-5630. Die in Figur 4 gezeigte Sequenz entspricht den Positionen 390 bis 448 dieser Sequenz, so daß die Primer- und Sondenpositionen direkt umrechenbar sind.
Bevorzugte Primer-/Sonden-Kombinationen ergeben sich folgendermaßen: forward-Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 390-406, 390-408, 391-406, 391- 408, 392-406, und 392-408, reverse Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 427-448, 427-447, 427-446, 428-
448, 428-447, 428-446, 429-448 und 429-447, Sonde ausgewählt aus einer der Sequenzen: 408-436, 408-435, 408-434, 408-433, 408- 432, 408-431, 408-430, 408-429, 408-428, 409-436, 409-435, 409-434, 409-433, 409- 432, 409-431, 409-430, 409-429, 409-428, 410-436, 410-435, 410-434, 410-433, 410- 432, 410-431, 410-430, 410-429, und 410-428, oder, bevorzugt:
forward-Primer: Sequenz von 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, und 392-
408, reverse Primer: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 423-448, 423-447, 423-446, 423- 445, 423-444,
Sonde: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410- 432, , 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409-429, 409-428, 408-433, 408- 432, 408-431, 408-430, 408-429, und 408-428 oder, besonders bevorzugt:
forward Primer: Sequenz von 390-406, 391-406, und 392-406, reverse Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 423-448, 423-447, 423-446, 423- 445, 423-444, Sonde: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410- 432, , 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409-429, 409-428, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430, 408-429, und 408-428 . Beispiel 2:
Gemäß Beispiel 1 wurden auch die in Fig. 5 gezeigten Primer und Sonden eingesetzt. Dabei sind die letzten 3 Sequenzen als ihr Komplement angegeben (Sonden bzw. reverse Primer). Die erste Sequenz ist der forward primer, in der 2. bis 4. Zeile ist die Sequenz der Taq Man-Sonden angegeben. Die Zeilen 5-8 zeigen die Amplicons.
Beispiel 3:
Weitere mögliche Primer-Kombinationen sowie eine zu dem daraus gebildeten Amplicon korrespondierende HCV-Genomsequenz sind in Fig. 6 und 7 gezeigt. Hierbei sind die Kombinationen CK12-2/CK23-1/CK42 sowie CK11-1/CK21-1 und CK22- 1/CK39 bevorzugt. Die gezeigte HCV-Genomsequenz hat sich für die Konstruktion von Primern und Sonden als besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung erwiesen. In der letzten Zeile ist jeweils auch die zugehörige HGBV-B Sequenz gezeigt. Die Primer und Probes enthalten im gezeigten Falle Nukleotide mit gezielter Degenerierung. Dies bedeutet jedoch nicht, daß die Oligonukleotide ohne Degenerierung nicht auch zur Amplifikation von HCV geeignet sein können.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsaure umfassend die Schritte
- Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsaure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine erste Bindesequenz (A) eines Strangs der Nukleinsaure binden kann und von denen der andere an eine zweite Bindesequenz (C), die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'-Richtιmg von A gelegenen Sequenz C im wesentlichen komplementär ist, binden kann, in Anwesenheit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an die zwischen den Sequenzen A und C gelegene dritte Sequenz (B) oder das Komplement (B') davon binden kann, wobei diese
Sonde eine Reportergruppe und eine Quenchergruppe enthält, unter Verwendung einer Polymerase mit 5'-Nukleaseaktivität und
- Nachweis der Nukleinsaure durch Messung eines Signals, welches durch die Freisetzung der Reportergruppe bedingt ist,
dadurch gekennzeichnet, daß die mit Hilfe der Primer gebildeten Amplifikate eine
Länge von weniger als 100 Nukleotide aufweisen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindesequenz D der Sonde mit einer der Bindesequenzen der Primer nicht überlappt.
3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Bindesequenzen nicht für die nachzuweisende
Nukleinsaure spezifisch ist.
4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtlänge der Bindesequenzen von dem von der Bindesequenz der Sonde wegweisenden Teil der Bindesequenz des einen Primers bis zu dem ebenfalls von der Bindesequenz der Probe wegweisenden Teil des anderen
Primers kleiner ist als 60 Nukleotide.
5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde sowohl durch einen Fluoreszenzquencher als auch einen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.
6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsaure spezifisch ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zwei der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsaure spezifisch sind.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde nicht spezifisch ist für die nachzuweisende Nukleinsaure.
9. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amplifikation jeweils zu A, G, C und T komplementäre Nukleotide eingesetzt werden.
EP98965653A 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren Withdrawn EP1029084A2 (de)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19748690 1997-11-04
DE19748690A DE19748690A1 (de) 1997-11-04 1997-11-04 Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
DE19814001A DE19814001A1 (de) 1998-03-28 1998-03-28 Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
DE19814001 1998-03-28
DE19814828 1998-04-02
DE19814828A DE19814828A1 (de) 1998-04-02 1998-04-02 Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
PCT/EP1998/006961 WO1999023250A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1029084A2 true EP1029084A2 (de) 2000-08-23

Family

ID=27217887

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98965653A Withdrawn EP1029084A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren
EP98955529A Ceased EP1029077A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und empfindliches nukleinsäurenachweisverfahren
EP98965652A Ceased EP1029083A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98955529A Ceased EP1029077A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und empfindliches nukleinsäurenachweisverfahren
EP98965652A Ceased EP1029083A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren

Country Status (6)

Country Link
US (1) US7105318B2 (de)
EP (3) EP1029084A2 (de)
JP (3) JP2001521765A (de)
AU (3) AU741141B2 (de)
CA (3) CA2308762A1 (de)
WO (3) WO1999024606A2 (de)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1038029A2 (de) * 1997-12-12 2000-09-27 Digene Corporation Universelles sammelmedium
WO1999049293A2 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7807802B2 (en) 2002-11-12 2010-10-05 Abbott Lab Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
CA2673017C (en) 2006-12-21 2015-08-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
CA2679511A1 (en) * 2007-03-16 2008-09-25 454 Life Sciences Corporation System and method for detection of hiv drug resistant variants
GB0714389D0 (en) 2007-07-21 2007-09-05 Barry Callebaut Ag Process and product
CA2726396C (en) * 2008-04-17 2019-03-19 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions, methods, and kits using synthetic probes for determining the presence of a target nucleic acid
US8288520B2 (en) 2008-10-27 2012-10-16 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and system
JP6108661B2 (ja) * 2009-01-28 2017-04-05 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 配列特異的な大量試料調製方法およびアッセイ法
AU2010242867B2 (en) * 2009-05-01 2016-05-12 Qiagen Gaithersburg, Inc. A non-target amplification method for detection of RNA splice-forms in a sample
WO2011003020A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
WO2011032124A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
US9605303B2 (en) 2010-01-29 2017-03-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample
CA2787924A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
EP2572001A2 (de) 2010-05-19 2013-03-27 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Verfahren und zusammensetzungen für sequenzspezifische reinigung und multiplex-analyse von nukleinsäuren
WO2011149897A1 (en) 2010-05-25 2011-12-01 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes
CA2828224A1 (en) 2011-02-24 2012-08-30 Qiagen Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acids
JP2024097096A (ja) * 2021-04-28 2024-07-18 バイオニクス株式会社 光学測定装置

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
US5200313A (en) 1983-08-05 1993-04-06 Miles Inc. Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
ES286841Y (es) 1985-05-20 1988-10-01 Vileda Gmbh Dispositivo de acoplamiento de un mango a un util de limpieza
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5639871A (en) * 1988-09-09 1997-06-17 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction
ATE282716T1 (de) 1989-07-11 2004-12-15 Gen Probe Inc Verfahren zur amplifikation von nukleinsäuresequenzen
NL9000134A (nl) * 1990-01-19 1991-08-16 Stichting Res Fonds Pathologie Primers en werkwijze voor het detecteren van humaan papilloma virus genotypen m.b.v. pcr.
US5453355A (en) * 1990-01-26 1995-09-26 Abbott Laboratories Oligonucleotides and methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
DE69233234T2 (de) * 1991-05-08 2004-08-05 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Genomische hcv-sequenzen für diagnostik und therapie
ES2198514T3 (es) 1991-08-27 2004-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Cebadores y sondas para la deteccion de la hepatitis c.
JPH05308999A (ja) * 1992-05-08 1993-11-22 Sumitomo Metal Ind Ltd Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ−Ｃ変異の判定法
WO1994003635A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Institute Of Molecular Biology & Biotechnology Rapid amplification and detection of nucleic acids
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
JPH09501829A (ja) * 1993-07-13 1997-02-25 アボツト・ラボラトリーズ 肝炎ｂ型ウイルスのヌクレオチド配列及びｄｎａの増幅及び検出のための方法
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
AT406019B (de) * 1995-05-08 2000-01-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines arzneimittels enthaltend ein oder mehrere plasmaderivate
US5882857A (en) 1995-06-07 1999-03-16 Behringwerke Ag Internal positive controls for nucleic acid amplification
CA2257109C (en) 1996-06-04 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
US5858671A (en) 1996-11-01 1999-01-12 The University Of Iowa Research Foundation Iterative and regenerative DNA sequencing method
EP1053348B1 (de) 1998-02-04 2010-06-02 Life Technologies Corporation Bestimmung des genotyps eines amplifikationsproduktes an mehreren allelen stellen
US5948648A (en) 1998-05-29 1999-09-07 Khan; Shaheer H. Nucleotide compounds including a rigid linker

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9923250A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999023249A3 (de) 1999-09-10
AU2152199A (en) 1999-05-24
US20030175765A1 (en) 2003-09-18
CA2308368A1 (en) 1999-05-14
JP2002505071A (ja) 2002-02-19
CA2312779A1 (en) 1999-05-20
JP2002509694A (ja) 2002-04-02
CA2308368C (en) 2009-01-20
CA2308762A1 (en) 1999-05-14
WO1999024606A3 (de) 1999-07-22
AU1232099A (en) 1999-05-24
WO1999023249A2 (de) 1999-05-14
AU741141B2 (en) 2001-11-22
JP2001521765A (ja) 2001-11-13
WO1999023250A2 (de) 1999-05-14
WO1999024606A2 (de) 1999-05-20
WO1999023250A3 (de) 1999-07-22
EP1029077A2 (de) 2000-08-23
US7105318B2 (en) 2006-09-12
EP1029083A2 (de) 2000-08-23
AU2152099A (en) 1999-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1029084A2 (de) Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren
DE3885027T2 (de) Amplifikationsverfahren zum Nachweis von Polynukleotide.
DE69523360T2 (de) Isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren durch Strangverdrängung
DE69213112T2 (de) Verbesserte Methoden zur Nukleinsäure-Amplifizierung
DE69327326T2 (de) Vervielfältigungs- und detektionsprozess
DE69133574T2 (de) Verfahren zur Unterscheidung von Sequenz Varianten
DE69736667T2 (de) Verfahren zum nachweis und amplifikation von nukleinsäuresequenzen unter verbrauch von modifizierten oligonukleotiden mit erhöhter zielschmelztemperatur (tm)
DE69028325T2 (de) Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines Einzelprimers
DE69223755T2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotids zum Gebrauch in &#34;single-primer&#34; Amplifizierung und Phosphorothioat-enthaltende Oligonukleotide als Primer in Nukleinsäureamplifizierung
DE68926484T2 (de) RNS-Template mit endverbundener Sonde und Verfahren zur Verwendung
DE69836012T2 (de) Zwei-schritt hybridisierung und einfang von einem polynukleotid
DE69627408T2 (de) Primers und Sonden zum Nachweis von HIV
DE69512003T2 (de) Oligonukleotid verwendbar als Primer in einem Amplifikationsverfahren auf der Basis einer Strangverdrängungsreplikation
DE69633941T2 (de) Nachweis von unterschieden in nukleinsäuren
EP0718408B1 (de) Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
DE60033825T2 (de) Detektion von unterschieden in nukleinsäuren durch inhibierung spontaner dna verzweigungsmigration
DE69737628T2 (de) Nukleinsäureprimer und -sonden zur detektion onkogener humaner papillomaviren
EP0705905A2 (de) Verfahren zum sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
DE69434688T2 (de) Diagnostischer nachweis von rna und reagentiensätze unter verwendung binärer rna proben und einer rna-abhängigen rna ligase
DE69836395T2 (de) Primern zum Nachweis von HIV-1
EP1595960B1 (de) DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
DE69814559T2 (de) Testverfahren für Chlamydia Trachomatis durch Amplifizierung und Erkennung von Chlamydia Trachomatis kryptischen Plasmid
EP0437774B1 (de) Verfahren zur Herstellung von modifizierten Nukleinsäuren
DE19832050C2 (de) Verfahren zum Nachweis von Hepatitis B- bzw. Hepatitis C-Virusgenomen in Plasmaproben und spezifische Primer
DE60024679T2 (de) Methoden und zusammensetzungen zur detektion von spezies des mycobacterium avium-komplexes

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20000605

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB IE IT LI LU NL SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 20050627

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: ORUM, HENRIK

Inventor name: BARTL, KNUT

Inventor name: HABERHAUSEN, GERD

Inventor name: KESSLER, CHRISTOPH

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20070530