EP1029083A2 - Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren - Google Patents

Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren

Info

Publication number
EP1029083A2
EP1029083A2 EP98965652A EP98965652A EP1029083A2 EP 1029083 A2 EP1029083 A2 EP 1029083A2 EP 98965652 A EP98965652 A EP 98965652A EP 98965652 A EP98965652 A EP 98965652A EP 1029083 A2 EP1029083 A2 EP 1029083A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
probe
sequence
detected
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP98965652A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Kessler
Gerd Haberhausen
Knut Bartl
Henrik Orum
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19748690A external-priority patent/DE19748690A1/de
Priority claimed from DE19814001A external-priority patent/DE19814001A1/de
Priority claimed from DE19814828A external-priority patent/DE19814828A1/de
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP1029083A2 publication Critical patent/EP1029083A2/de
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the detection of nucleic acid hybridization has the advantage that, for. B. the infectious agent can be detected directly after infection and very sensitive.
  • nucleic acid detection methods When detecting the presence or absence of the body's own nucleic acid within certain genomic loci and or their changes, such as. B. inherited, spontaneous or a mixture of inherited and spontaneous mutations, deletions, inversions, translocations, rearrangements or triplet expansions in the form of specific and / or polymorphic changes, the availability of specific and sensitive nucleic acid detection methods is also advantageous.
  • Quantitative sensitive and specific determinations of the nucleic acids to be detected have so far been possible in the context of heterogeneous or homogeneous target-specific exponential nucleic acid amplification reaction formats in which the Nucleic acid amplification product is intercepted either by built-in labels or by hybridization with a probe which is specific for the nucleic acid to be detected or its complement in part of the sequence section formed by elongation.
  • Exponential nucleic acid amplification reaction formats in which nucleic acid-binding dyes are intercalated are also sensitive, but are not sequence-specific.
  • Shorter amplicon lengths have so far only been used to detect special sequences such as e.g. B. in triplet expansions, for in-situ studies or the detection of highly fragmented nucleic acids in the context of antiquity research.
  • these short amplicon lengths were detected in more time-consuming gel formats or in-situ formats, which are characterized by a lack of sensitivity and / or a lack of quantification.
  • Other special short sequences such as short tandem repeats, short interspersed repetitive elements microsatellite sequences or HLA-specific sequences have so far only been used as primer or probe binding sequences.
  • a further object of the invention was to make the selection of the primer and probe sequences so flexible while maintaining the overall specificity that a determination of several different nucleic acids to be detected is possible in a unified reaction format using partially identical primer or probe sequences.
  • the amplificates can have one or more further regions Y which lie outside the region which contains the sequence information derived from the nucleic acid to be detected.
  • Such solid supports are e.g. B. solid supports with glass-containing surfaces (e.g. magnetic particles, glass fleece with glass-containing surfaces, particles, microtiter plates, reaction vessels, dip sticks or miniaturized reaction chambers, which in turn can also be part of integrated reaction chips).
  • This solid support is preferably used for non-sequence-specific purification, i.e. no substantial isolation of the nucleic acids to be detected from other nucleic acids, but only a sample material (nucleic acid) concentration and possibly inactivation and or elimination of inhibitors for the subsequent nucleic acid amplification and detection reactions.
  • These solid supports also make it possible to provide several nucleic acids to be detected, e.g. B. in the context of multiplexing, in a form accessible for nucleic acid amplification and detection reactions possible.
  • Such propagation methods are used which permit an amplification of the nucleic acid sequence to be detected or its complement, which result in the formation of tripartite mini-nucleic acid amplification products.
  • All nucleic acid amplification methods known in the prior art are available for this.
  • Target-specific nucleic acid amplification reactions are preferably used.
  • exponential target-specific nucleic acid amplification reactions are particularly preferably used, in which an antiparallel replication of the nucleic acid to be detected or its complement takes place, such as, for. B. elongation-based reactions such.
  • B. the polymerase chain reaction PCR for deoxyribonucleic acids, RT-PCR for
  • Ribonucleic acids or transcription-based reactions
  • B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) or Transcription Mediated Amplification (TMA).
  • Thermocyclic exponential elongation-based nucleic acid amplification reactions such as, for. B. uses the polymerase chain reaction. The evidence to be used for propagation
  • a primer in the sense of the present invention is understood to mean a molecule which can bind to a nucleic acid via base pairings and which can be extended, preferably enzymatically.
  • Ohgonucleotides are preferred which can be extended at their 3 'end using the nucleic acid to be detected or a complement thereof as template nucleic acid.
  • Monovalent or multivalent or monofunctional or multifunctional agents which permit nucleic acid-dependent elongation can be used as primers.
  • Oligomers or polymers with a binding length of between 9 and 30 nt can preferably be used as primers, which bind antiparallel to the nucleic acid to be detected and which act as one of several reaction partners for an enzymatic replication of the nucleic acid to be detected or its complement.
  • oligomers which, after addition of a multiplication reagent by addition of at least part of the primer to the nucleic acid to be detected or its complement, are directed replication of one or both strands of the nucleic acid to be detected or their complement initiate.
  • An example of a particularly preferred primer is an oligonucleotide with a free 3 'hydroxyl end.
  • nucleic acid sequence additions and / or other modifications such as.
  • Preferred nucleotide equivalents are PNA monomers or PNA oligomers (WO92 / 20702) with or without positive and / or negative charges in the backbone and / or in the spacer.
  • PNA oligomer probes with or without positive or negative charges in the backbone and / or spacers have the additional advantages that they are stable against the degradation of nucleases or proteases because of the different structure of the backbone and the H or NH 2 ends , have a higher melting point in binding complexes between nucleic acids and PNA than between two nucleic acid molecules and the hybrid complex is therefore more stable, can be used at low salt concentrations, has a higher difference in melting points in the case of mismatches, and thus better mismatch discrimination is possible, Sequences with secondary structures at low salt concentrations are more accessible, the competition between amplicon counter strand and probe is lower at low salt concentrations and thereby a higher signal yield is achieved and the potential for eliminating the amplicon denaturation step at low salt concentrations consists.
  • a binding sequence is preferably understood to mean the sequence of bases that are between the outermost ones with a certain nucleic acid.
  • a primer or a probe is based on base-base interaction binding bases of a particular nucleic acid, a primer or a probe, including these outermost bases.
  • Regions A and C are, according to the invention, preferably so long that conditions can be found under which primers of a corresponding length can hybridize with the bases in these regions.
  • the regions are therefore preferably longer than 8, particularly preferably longer than 12 nucleotides.
  • preferred ranges also result with regard to the upper limit of the length of the regions A and C.
  • the regions A and C are each preferably less than 30, particularly preferably less than 20 nucleotides.
  • the length of the regions is limited by the fact that the primers should be able to hybridize to them in a manner that is unspecific for the nucleic acid to be detected. Therefore, the particularly preferred length of the binding sequences A and C is 12 to 20 nucleotides.
  • the areas A and C on the nucleic acid to be detected do not overlap.
  • Preferred nucleotides are dATP, dGTP, dCTP, dTTP and or dUTP, dITP, iso-dGTP, iso-dCTP, deaza-dGTP and ATP, GTP, CTP, UTP and / or ITP, deazaGTP, iso-GTP, iso-CTP.
  • Equivalents are PNA monomers or PNA oligomers with or without positive and / or negative charge in the backbone and / or in the spacer.
  • the elongation substrates can carry modifications as stated above.
  • thermocyclic multiplication reactions e.g. PCR, RT-PCR
  • 2- or 3-phase cycles are carried out, preferably 2-phase cycles.
  • the strand separation of the nucleic acid amplification products is carried out at high temperature, preferably 85 ° C.-95 ° C., the common primer annealing and primer elongation at temperatures close to the melting point between primer and elongation counter strand, preferably between 55 ° C and 75 ° C.
  • the strand separation is carried out by supplying energy and / or enzymatically, preferably by means of elevated temperature, microwaves or applying a voltage via a microelectrode, particularly preferably by means of elevated temperature.
  • Up to 60 thermal cycles are carried out, preferably 32-42.
  • Enzyme activity uracil deglycosylase preferably with a thermolabile embodiment of the enzyme activity in which the renaturation takes place more slowly after thermal denaturation of the enzyme activity, the fragmentation of the amplification product and thus its property as a nucleic acid amplification unit.
  • the UMP-containing amplification product can be incubated following the nucleic acid amplification and detection reaction (sterilization) and / or before a renewed nucleic acid amplification reaction (carry over prevention).
  • Direct spectroscopic or physical methods are e.g. B. melting temperature determinations, attachment of intercalating or nucleic acid-binding dyes or metal atoms or particles, mass spectroscopy, surface plasmon resonance or fluorescence-coupled surface plasmon resonance, or E-wave measurements.
  • the probe When using the probe as a capture probe, the probe can either be covalently attached to the solid support or via a binding pair and the formation of the
  • the increased tripartite mini amplicons are bound by nucleic acid capture probes or PNA capture probes, which are covalently immobilized on micro titer plates or magnetic particles.
  • detection takes place after formation of the binding complex and washing via a biotin modification of one or both primers in the amplificate by addition of avidin-horseradish peroxidase and a mixture of TMB / TMF color substrates.
  • one or more amplificates are detected after binding by one or more different covalently (for example anthraquinone: UV light coupling or gold surface: SH coupling) or coordinatively (for example Biotin: streptavidin) -bound capture probes, by washing and by detection of a fluorescence or chemiluminescence signal, which was excited either directly by primary light or via surface plasmon resonance or E-wave, with the aid of CCD cameras or confocal fluorescence scanners.
  • covalently for example anthraquinone: UV light coupling or gold surface: SH coupling
  • coordinatively for example Biotin: streptavidin
  • ruthenium chelate-containing detection probes are bound to the amplificates which contain biotin modifications via one or both primers.
  • the detection probes are either ruthenium-labeled oligonucleotides or ruthenium-labeled PNA oligomers.
  • the complex is bound by a capture probe which is covalently immobilized on a microtiter plate or on magnetic particles.
  • detection takes place after formation of the binding complex and washing via a biotin modification of one or both primers in the tripartite mini amplicon by addition of avidin-horseradish peroxidase and a mixture of TMB / TMF color substrates.
  • detection probes When using homogeneous reaction formats, detection probes are used that contain either quenched fluorescent labels, internal base substitutions with double-strand complex-activatable fluorescent dyes or terminal energy donors or acceptors (in combination with corresponding energy donors or acceptors on adjacent primer ends: energy transfer Complexes). In these cases, the detection probe is added during the nucleic acid amplification. In the case of the quenched Fluorescence labels are activated by dequenching after binding the detection probe to the resulting tripartite mini-amplicon and exonucleolytic degradation and release of the fluorescent dye-modified nucleotide. In the case of internal base substitutions, the fluorescence signal is generated by forming the binding complex between the detection probe and the tripartite mini-amplicon that forms. In the case of the energy transfer complexes, a fluorescence signal is formed by adjacent attachment of the labeled primer and the labeled probe. The measurement of the resulting fluorescence signals is preferably carried out by real-time measurements.
  • fluorescein and rhodamine or derivatives thereof are used as fluorescence and quencher components in the quenched detector probes.
  • ruthenium or rhenium chelates and quinones or derivatives thereof are used as electrochemiluminescent and quencher components in the quenched detector probes.
  • anthraquinone or derivatives thereof are used as internal base substituents of the detector probe.
  • Cy-5 and fluorescein or derivatives thereof are used as energy transfer components.
  • cyanine dyes such. B. SYBR Green or acridine dyes used.
  • the invention also relates to a method for the specific detection of a nucleic acid comprising the steps of producing a multiplicity of amplificates of a section of this nucleic acid with the aid of at least two primers, bringing the amplificates into contact with a probe which can bind to the amplificate and detection of the formation of a hybrid from the strand of the amplificate and the probe, characterized in that at least one of the primers is not specific for the nucleic acid to be detected.
  • region B can contain nucleotides which do not belong to the binding sequence E.
  • the binding sequences of the primers and the probe can overlap.
  • the primers at their 5 'end contain further sequences which connect to the primer sequences in the human genome. These sequences are between 1 and 100, particularly preferably between 5 and 80 nucleotides long. It is possible to modify one or both of the primers accordingly. The additional sequences are not so long that they hybridize the primers with the binding sequences on the nucleic acid to be detected, e.g. B. prevent the HCV genome.
  • the primers bind to the binding sequences A or C, as described above, and the probe to a region B between the ends of the binding sequences A and C or the complement thereof.
  • the overall specificity of the detection method is retained. If one of the primer sequences is not specific for the nucleic acid to be detected, it also binds to others Nucleic acids, no specific nucleic acid amplification product can be formed on the other nucleic acid because the second primer binding sequence on this other nucleic acid is missing. Unspecific nucleic acid amplification products on the other nucleic acid are not detected if the specific binding sequence for the probe is missing.
  • Nucleic acid amplification products of the other nucleic acid that may be formed contain other sequences in the probe binding region and are therefore not detected. All three binding sequences for the two primers and the probe are not specific for the nucleic acid to be detected. no nucleic acid amplification product is formed if at least one of the two primer sequences is not in a nucleic acid amplification unit of the other nucleic acid. If the probe sequence is not in the nucleic acid multiplication unit of the two primer sequences for the other nucleic acid, a specific nucleic acid multiplication product of the other nucleic acid can be formed, but it cannot be detected.
  • partial components (primers or probes) of the different primer-probe combinations can be identical for the different nucleic acids to be detected.
  • the determination of several nucleic acid targets eg. B. possible for different viruses such as HBV, HTV and HCV with a single amplification reaction (multiplex).
  • a technical advantage of the method according to the invention is that a high degree of agreement of the measured values is achieved with multiple determinations of a sample.
  • HCV RNA from the 5 'untranslated region of the HC V genome in a copy number of 10 copies per test with a dynamic range of 105 due to an improved signal-to-noise ratio.
  • primers and probes can be used in the test which have a primer / probe design which is not preferred for the person skilled in the art, namely e.g. B. sequence sections that tend to form primers-dimers, or base mismatches near the 3 ' end.
  • the short probe has a melting point close to the test temperature, so that the person skilled in the art would not have expected stable binding of the probe to the nucleic acid amplification product.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine Bindesequenz A der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine Bindesequenz C', die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'-Richtung von A gelegenen Sequenz C komplementär ist, binden kann, Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an eine zwischen den Sequenzen A und C gelegene Sequenz B oder das Komplement davon binden kann, und Nachweis der Bildung eines Hybrides aus dem Amplifikat und der Sonde, wobeidie zwischen den Bindesequenzen A und C gelegene Sequenz keine Nukleotide enthält, die nicht der Bindesequenz D der Sonde oder ihrem Komplement D' zugehören.

Description

Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, bei dem eine Amplifikation eines Teilstückes dieser Nukleinsäuren vorgenommen wird und wobei dieses Teilstück im Hinblick auf seine Basensequenz bestimmte Bedingungen erfüllen muß, sowie ein Reagenzkit enthaltend zwei Primer und eine Sonde, die dieses Teilstück definieren.
Eine der meist angewandten molekularbiologischen Techniken zum Nachweis von Nukleinsäuren ist Hybridisierung mit sequenzspezifischen Sonden zum Nachweis homologer Nukleinsäure-Sequenzen. Der Nachweis von Nukleinsäure-Sequenzen ist von Bedeutung im Grundlagenbereich, jedoch von besonderer Bedeutung in verschiedenen Anwendungsfeldern, z. B. in den Bereichen medizinische Diagnostik, forensische Diagnostik, Lebensmitteldiagnostik, Umweltdiagnostik, Pflanzenschutz und Tiermedizin.
Als Sonde werden dabei entweder Oligonukleotide (kurze DNA oder RNA) oder Polynukleotide (längere DNA oder RNA) verwendet. Dabei haben die kürzeren Sonden gegenüber den längeren Sonden den Vorteil größerer Sequenzselektivität, wegen des kürzeren Hybridisierungsbereichs aber den Nachteil geringerer Sensitivität. Eine verbesserte Sensitivität und Sequenzselektivität wird mit PNA-Sonden (Peptidnuklein- säuren, z. B. WO 92/20702) erreicht, da diese Sonden eine höhere Bindungsaffinität zu Nukleinsäuren haben (höherer Tm) und durch eine höhere Basendiskriminierung gekennzeichnet sind (ΔTm). Zusätzlich können Sonden zum Nukleinsäure-Nachweis Markierungsgruppen tragen, die entweder zum Fangen und/oder zur Detektion von Hybridkomplexen aus Sonde und nachzuweisender Nukleinsäure geeignet sind. Zum Nukleinsäure-Nachweis durch Hybridisierung werden eine oder mehrere Sonden entweder zur Hybridisierung in Lösung oder auf festen Trägern verwendet. Bei Nuklein- säure-Nachweisen in Lösung spricht man von homogenen Nachweisformaten, bei Nachweis auf festen Trägern und/oder vermittelt durch feste Trägern von heterogenen Nachweisformaten. Bei den heterogenen Nachweisverfahren (z. B. dot blot) kann die nachzuweisende Nukleinsäure auf dem festen Träger vorgebunden sein. Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen mit einer Lösung, die die Sonde enthält. Umgekehrt kann die Sonde auf dem festen Träger vorgebunden sein (z. B. reverse dot blot). Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen der gebundenen Sonde mit einer Lösung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure enthält. Bei homogenen Testformaten werden z. B. Sondenpaare verwendet, die endständig energieübertragende Gruppen tragen und die über Co-Hybridisierung an die nachzuweisende Nukleinsäure in unmittelbaren Kontakt gebracht werden und dadurch ein Signal erzeugen.
Der Nachweis von Nukleinsäuren durch alleinige Sonden-Hybridisierung hat nur begrenzte Sensitivität. So ist selbst mit empfindlichen Detektions-Markierungsgruppen wie 32P, Digoxigenin, Biotin, Fluorescein, Ruthenium-Chelate, Fluorescein, R odamin oder AMCA allein nur eine Sensitivität in pg- bis fg-Bereich möglich. Zum empfindlichen Nukleinsäure-Nachweis gerade im medizinisch-diagnostischen Bereich sind jedoch Sensitivitäten im ag-Bereich und eine hohe Nachweisspezifität notwendig. Dies gilt sowohl für den Nachweis von körperfremden Nukleinsäuren, z. B. in Form von Infektionserregern, als auch für den Nachweis der An- oder Abwesenheit oder Veränderung körpereigener Nukleinsäuren. Hohe Nachweissensitivität und Nachweisspezifität ist aber auch in den anderen genannten Anwendungsbereichen von hoher Wichtigkeit.
So müssen manche Infektionserreger, wie z. B. HCV, HIV und HBV schon in wenigen Kopien nachgewiesen werden, um rechtzeitig erfolgreiche medizinische Interventionsmaßnahmen, z. B. durch frühzeitige Arzneimittelbehandlung, ansetzen zu können. Für solch frühzeitige Nachweise von Infektionserregen ist der Nachweis von Nukleinsäure- Sequenzen der Infektionserreger von Vorteil, da wegen der Verfügbarkeit von Nukleinsäure- Vervielfältigungstechniken (Nukleinsäure-Vermehrungsverfahren) ein empfϊndli- eher Nachweis schon in einer frühen Infektionsphase (Latenzphase) möglich ist. Die Möglichkeit der gezielten Vermehrung des nachzuweisenden Agens gibt es nur im Fall von Nukleinsäuren, nicht aber im Fall von immunologischen Nachweisverfahren. Bei diesen Verfahren ist eine Steigerung der nachzuweisenden Infektionserreger- spezifischen Partikel nur über die humorale Immunantwort über Bildung von entsprechenden Infektionserreger-spezifischen Antikörpern möglich; diese Immunantwort erfolgt jedoch erst nach Ablauf der Latenzzeit und ist eine Sekundärreaktion nach Infektion durch den Errger. Daher hat der Nachweis über Nukleinsäure-Hybridisierung den Vorteil, daß z. B. der Infektionserreger direkt nach Infektion und sehr empfindlich nachgewiesen werden kann.
Der Erfolg von medizinischen Interventionsmaßnahmen ist jedoch auch davon abhängig, daß der Infektionserreger nicht nur frühzeitig mit hoher Sensitivität, sondern auch sehr spezifisch nachgewiesen werden kann. Zur gezielten Behandlung ist daher eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Infektionserregern sowie die Unterscheidung einzelner Subtypen oder Varianten wie, z. B. HIV-1 und HIN-2 oder z. B. HBV, HCV und HGV, von Bedeutung. Dabei ist aber auch entscheidend, daß quantitative Aussagen gemacht werden können und keine falsch-positiven oder falschnegativen Ergebnisse erhalten werden, da solche falschen Ergebnisse u.U. gravierende therapeutische Konsequenzen nach sich ziehen können. Dies setzt Richtigkeit und hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse voraus. Daher muß der Nukleinsäure-Nachweis nicht nur sehr sensitiv, sondern auch sehr spezifisch und reproduzierbar sein. Der spezifische und sensitive Nukleinsäure-Nachweis muß auch rasch erfolgen, damit eine gezielte Therapie umgehend erfolgen kann.
Oftmals ist auch von Bedeutung, mehrere Infektionserreger wie z. B. HCV, HTV und HBV nebeneinander nachzuweisen, z. B. im Rahmen von Blutbanken-Screeningtests. Dies erfolgt bei derzeit gängigen Nukleinsäure-Nachweistests durch hintereinander- geschaltete Einzelbestimmungen der nachzuweisenden Infektionserreger. Dies hat den Nachteil, daß mehrere Bestimmungen hintereinander durchgeführt werden müssen, was gerade beim Screening von großen Specimen-Stückzahlen nachteilig ist. Im Rahmen dieser Nukleinsäure-Bestimmungen ist wünschenswert, sensitive und spezifische Testmöglichkeiten verfügbar zu haben, die z. B. eine rasche parallele Bestimmimg mehrerer Infektionserreger nebeneinander in einer einzigen Probe ermöglichen (Multiplex- Bestimmung).
Beim Nachweis der An- oder Abwesenheit von körpereigener Nukleinsäure innerhalb bestimmter genomischer Loci und oder deren Veränderungen, wie z. B. ererbte, spontane oder eine Mischung aus ererbten und spontanen Mutationen, Deletionen, Inversionen, Translokationen, Rearrangements oder Triplett-Expansionen in Form von spezifischen und/oder polymorphen Veränderungen, ist ebenfalls die Verfügbarkeit spezifischer und sensitiver Nukleinsäure-Nachweisverfahren von Vorteil. Die
Verfügbarkeit spezifischer und sensitiver Nukleinsäure-Nachweisverfahren ist jedoch auch in den anderen genannten Anwendungsbereichen von hoher Wichtigkeit.
Die bisherigen Testverfahren zum sensitiven und spezifischen Nachweis der An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuren basieren auf der kombinierten Durchführung von Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen (Nukleinsäure- Vermehrung) und Nukleinsäure- Nachweisreaktionen (Detektion).
Die nachzuweisende Nukleinsäure wird dabei in einer für die Vermehrungsreaktionen zugänglichen Form eingesetzt, z. B. in Form von unbehandeltem oder behandeltem Probenmaterial und/oder Probenmaterial-Konzentrierung, z. B. durch Adsorption des unbehandelten oder behandelten Probenmaterials an die Oberfläche eines festen Trägers und anschließende Resorption von diesem festen Träger. Solche festen Träger sind z. B. feste Träger mit glashaltigen Oberflächen. Durch diese festen Träger erfolgt keine substantielle Reinigung und/oder Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren, sondern lediglich eine Probenmaterial-Konzentrierung und ggf. Inaktivierung und/oder Eliminierung von Inhibitoren für die darauffolgenden Nukleinsäure- Vermehrungs- und Nachweisreaktionen. Durch diese festen Träger ist auch die Bereitstellung mehrer nachzuweisender Nukleinsäuren, z. B. im Rahmen von Multiplex-Verfahren, in für die Nukleinsäure- Vermehrungs- und -Nachweis-Reaktionen zugänglichen Form möglich. Andere Probenvorbereitungs- Verfahren enthalten gezielte Verfahrensschritte zur Nukleinsäure-spezifischen und/oder sequenzspezifischen Bindung der nachzuweisenden Nukleinsäure, z. B. die Verwendung von festen Trägern mit Nukleinsäure-spezifischen Bindungsgruppen und oder Nukleinsäure-Fangsonden zur selektiven Bindung und Freisetzung der nachzuweisenden Nukleinsäure durch Nukleinsäure-spezifische Bindung und anschließende Dissoziation zwischen Bindungsgruppe und/oder trägergebundener Fangsonde und nachzuweisender Nukleinsäure. Bei dieser Art von festen Trägern sind Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppen und/oder Nukleinsäure- Fangsonden an der Oberfläche der festen Träger norwendig. Daher sind zur Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäuren, z. B. im Rahmen von
Multiplex- Verfahren, entweder mehrere feste Träger notwendig, was aufwendiger ist, oder feste Träger mit einer oder mehreren Bindungsgruppen und/oder mit multiplen oder mehreren Fangsonden. Multiple Fangsonden enthalten mehrere Bindungssequenzen für mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Diese Träger mit mehreren Bindungsgruppen und/oder mehreren und/oder multiplen Fangsonden sind jedoch aufwendiger herzustellen. Ebenfalls sind die Reaktionsbedingungen zur gezielten Bindung mehrer nachzuweisender Nukleinsäuren an Träger mit mehreren Bindungsgruppen und/oder Fangsonden schwieriger einzustellen bzw. die Bindung mehrer nachzuweisender Nukleinsäurearten an eine Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppe oder an eine Fangsonde mit mehreren komplementären Hybridisierungssequenzen schwieriger einzustellen.
Die Vermehrung und der Nachweis der bereitgestellten nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt in heterogenen oder homogenen Nukleinsäure- Vermehrungs-Nachweisformaten. Die Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen und Detektionreaktionen können entweder hintereinander (heterogene Testverfahren) oder gleichzeitig (homogene Testverfahren) erfolgen. Als Vermehrungsreaktionen werden entweder targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen, targetabhängige Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen oder Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen verwendet. Die Verwendung von Detektionssystemen zum Nachweis der vermehrten Nukleinsäuren erfolgt entweder über den Einbau von Nukleotiden und/der die Verwendung von markierten Primern oder markierten Sonden. Die verwendeten Detektionssysteme enthalten entweder direkte oder indirekte Detektionsmarkierungen bzw. gekoppelte sekundäre und tertiäre Nachweiskomponenten. Die Detektion der vermehrten nachzuweisenden Nukleinsäuren kann jedoch auch durch spektroskopische oder pyhsikalische Methoden erfolgen.
Die bisherigen Nukleinsäure-Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierten Signal- Nukleinsäure- Vermehrungereaktionen haben den Nachteil geringer Sensitivität wegen der nicht-exponentiellen Signalvermehrung, erhöhten Störanfälligkeit durch stärkere Tendenz zur Hintergrundsignalbildung durch die Vielzahl der Sondenkomponenten und der Bildung unspezifischer Detektionssignale, da nicht die nachzuweisende Nukleinsäure selbst, sondern lediglich ein daran gekoppeltes Detektionssignal targetunabhängig vermehrt wird. Beispiele sind gekoppelte Signalkaskaden (z. B. SELF- Zyklus) oder signalgebende Sonden-Baum- oder -Bürstenstrukturen (z. B. branched DNA).
Die bisherigen Nukleinsäure- Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierten target- abhängigen Signal-Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen sind wegen der exponentiellen Signalvermehrung zwar sensitiver als die reinen Signal-Nukleinsäure- Vermehrungsverfahren, haben aber wiederum den Nachteil der Bildung unspezifischer Detektionssignale, da nicht die nachzuweisende Nukleinsäure selbst, sondern lediglich ein davon in einer einleitenden targetabhängigen Primärrektion abgeleitetes Detektionssignal in Form eines Nukleinsäure-Reportermoleküls Targetsequenz- unabhängig enzymatisch vermehrt wird. Beispiele sind die Qß-Replikationsreaktion, bei der ein Qß-Reportermolekül enzymatisch vermehrt wird, oder die Ligase- Kettenreaktion, bei der Teilstücke der Nukleinsäure-Reportermoleküle sequenzunabhängig enzymatisch verknüpft werden.
Als Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte der bisher sensitivsten und spezifischsten exponentiellen targetspezifischen Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen wie z. B. PCR (US-A-4,683,202 bzw EP-B-0 202 362), RT-PCR, NASBA (EP-A-0 329 822) oder TAM, wurden bisher jeweils einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure-Vermehrungs- produkte durch targetsequenzabhängige thermozyklische oder isotherme enzymatische Elongation gegenläufige Primer, die sequenzpezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind und an die Enden der Nukleinsäure- Vermehrungseinheit (Amplikon) der nachzuweisenden Desoxyribo- oder Ribo-Nukleinsäuren oder deren Komplemente binden und somit die Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte begrenzen, erzeugt. Bei diesen Elongationsreaktionen werden alle 4 Basenspezifitäten eingebaut.
Die genannten Nukleinsäure- Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierter targetspezifischer Nukleinsäure- Vermehrungsreaktion sind wegen Targetsequenz-abhängiger enzymatischer Nukleinsäure- Vermehrungszyklen am spezifischsten. Während lineare targetspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen, wie z. B. die Cycling-Probe- Reaktion, nur zu begrenzter Sensitivität fuhren, ergeben exponentielle targetspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsrektionen wie Elongations-basierte Reaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, RT-PCR) oder Transkriptions-basierte Reaktionen wie z. B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) oder Transcription Mediated Amplification (TMA) bisher die sensitivsten und spezifischsten Signale.
Mischformen zwischen targetabhängiger Signal-Nukleinsäure-Vermehrung und targetspezifischer Nukleinsäure- Vermehrung, wie z. B. die Gap-filling Ligase-Kettenreaktion (gap-filling LCR, WO 90/01069), haben zwar gegenüber der nicht-modifizierten LCR einen targetabhängigen Reaktionsschritt, dieser ist aber begrenzt auf limitierte Sequenz- abschnitte bestehend aus lediglich 1 oder 2 Basenspezifitäten und damit limitierterer Target-Spezifität.
Für den Nachweis der entstandenen Nukleinsäure stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Der Nachweis der gebildeten Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte über Fragment- oder Sequenz-Gelanalyse ist zeitaufwendig und nicht quantitativ. Der Nachweis über trägergebundene Dot-, Slot- oder Reverse-Dot-Blot- Verfahren ist ebenfalls zeitaufwendig und nicht quantitativ.
Quantitative sensitive und spezifische Bestimmungen der nachzuweisenden Nukleinsäuren wurden bisher im Rahmen von heterogenen oder homogenen targetspezifischen exponentiellen Nukleinsäure-Vermehrungs-Reaktionsformaten möglich, bei denen das Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt entweder durch eingebaute Label oder durch Hybridisierung mit einer für die nachzuweisende Nukleinsäure oder deren Komplement spezifischen Sonde in einem Teil des durch Elongation entstandenen Sequenzabschnitts abgefangen wird. Exponentielle Nukleinsäure- Vermehrungs-Reaktionsformate, bei denen eine Interkalation von Nukleinsäure-bindenden Farbstoffen erfolgt, sind zwar auch sensitiv, aber nicht sequenzspezifisch.
Bei den heterogenen Reaktionsformaten wird das Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt z. B. entweder über eine Primer-Fangmodifikation oder durch eine immobilisierte Fangsonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts ist, auf einen festen Träger gebunden und über Einbau eines detektionsmarkierten Nukleotids, durch Hybridisierung mit einer detektionsmarkierten Sonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts ist, oder über eine Primer-Detektionsmodifikation nachgewiesen. In homogenen Reaktionsformaten erfolgte bisher der Nachweis z. B. über die Hybridisierung einer Sonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts ist und die einen gequenchten Fluoreszenz-Label trägt, wobei die Targetsequenz-abhängige enzymatische Aufhebung der Quenchung durch die Primer-Elongationsbedingte Freisetzung des gequenchten Fluoreszenzmarkierten Nukleotids erfolgt (WO92/02638).
Bei allen bisherigen quantitativen sensitiven und spezifischen heterogenen und homogenen targetspezifischen exponentiellen Nukleinsäure- Vermehrungs-Reaktionsformaten wurden bisher Nukleinsäure- Vermehrungseinheiten (Amplikons) verwendet, die neben den spezifischen Primer- und Sonden-Bindungssequenzen zusätzliche Sequenzen variabler Länge zwischen den flankierenden Primer-Bindungssequenzen und der internen Sonden-Bindungssequenz enthielten. Diese fünfgeteilte Amplikonsstruktur resultierte in Amplikonlängen größer als die Summe der Sequenzlängen der beiden flankierenden Primer und der internen Sonde zwischen vorzugsweise 100 und 1000 Basen(paaren). Optimierungen der Nukleinsäure- Vermehrungsreaktion durch verbesserte Enzymmischungen gingen bisher vielmehr hauptsächlich in Richtung längere Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte.
Kürzere Amplikonlängen wurden bisher lediglich zum Nachweis spezieller Sequenzen wie z. B. bei Triplett-Expansionen, für In-situ-Untersuchungen oder den Nachweis stark fragmentierter Nukleinsäuren im Rahmen der Altertumsforschung erzeugt. Diese kurzen Amplikon-Längen wurden jedoch in zeitaufwendigeren Gelformaten oder In-situ- Formaten detektiert, die durch mangelnde Sensitivität und/oder fehlende Quantifizierung gekennzeichnet sind. Andere spezielle kurze Sequenzen wie Short Tandem Repeats, Short Interspersed Repetitive Elements Microsatellite Sequences oder HLA-spezifische Sequenzen wurden bisher lediglich als Primer- oder Sonden- Bindungssequenzen verwendet.
Die fünfgeteilten Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte haben den Nachteil, daß sie neben den spezifisch Primer und Sonde bindenden Sequenzen noch zusätzliche Sequenzen beinhalten, die das Amplikon verlängern und die Gesamtspezifität im Hinblick auf die Spezifitäts-generierenden Primer- und Sonden-Bindungsreaktionen reduzieren.
Die bisher verwendeten längeren fünfteiligen Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte haben ferner den Nachteil längerer Primer-Elongationszeiten und damit längere Gesamt- Testzeiten. Die Sensitivität ist auch begrenzt durch Plateaueffekte der beteiligten Enzyme und Substrate, die bei längeren Amplikons früher erreicht werden. Ein weiterer Nachteil längerer Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte ist eine Kompetition zwischen Amplikon-Gegenstrang und Detektor- oder Fangsonde und somit reduzierter Sensitivität. Ein weiterer Nachteil ist die erhöhte Möglichkeit der unspezifischen Bindung bedingt durch die zusätzlichen Sequenzen mit der Folge eines erhöhten Hintergrunds und dadurch geringerer Sensitivität (geringeres Signal-Rausch- Verhältnis). Ein weiterer Nachteil bei der Bindung des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts an trägergebundene Fangsonden ist die sterische und kinetische Hinderung längerer Nukleinsäure-Moleküle; daher werden Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte bisheriger Länge vor der Bindung durch die Fangsonde vorzugsweise fragmentiert. Ein weiterer Nachteil ist die erhöhte Anfälligkeit gegenüber Fragmentierung innerhalb der Amplikonsequenz und dadurch Zerstörung der Nukleinsäure- Vermehrungseinheit; dies fuhrt zu geringerer Reproduzierbarkeit. Ein weiterer Nachteil ist, daß längere Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte bei niedrigen Testtemperaturen von z. B. 37 °C, die bei gängigen Nukleinsäure- Analysegeräten vorgegeben sind, weniger spezifisch hybridisieren, da eine größere Differenz zur Schmelztemperatur besteht. Ein weiterer Nachteil von fünfteiligen Nukleinsäure- Vermehrungsprodukten ist beim Nachweis mehrerer verschiedener Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte, daß unterschiedliche Nukleinsäure-Vermehrungslängen gebildet werden, die einen Multiplex-Nachweis erschweren.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein alternatives Nachweisverfahren für Nukleinsäuren bereitzustellen, welches Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Verfahren hat.
Eine spezielle Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein targetabhängiges exponentielles Nukleinsäure-Vermehrungsverfahren zum hochsensitiven, hochspezifischen, reproduzierbaren und quantifizierbaren Nachweis einer oder mehrerer einzelsträngiger oder doppelsträngiger Nukleinsäuren bereitzustellen, welches insbesondere einen oder mehrere der genannten Nachteile vermeidet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war, unter Erhalt der Gesamtspezifität die Auswahl der Primer- und Sondensequenzen so flexibel zu gestalten, daß eine Bestimmung mehrerer verschiedener nachzuweisender Nukleinsäuren in einem vereinheitlichten Reaktionsformat unter Verwendung von teilweise gleichen Primer- oder Sonden- Sequenzen möglich ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Amplifi- katen eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine erste Bindesequenz (A) eines Strangs der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine zweite Bindesequenz (C), die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'-Richtung von A gelegenen Sequenz C dieses Stranges im wesentlichen komplementär ist, binden kann, Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an die zwischen den Sequenzen A und C gelegene dritte Sequenz (B) oder das Komplement (B') davon binden kann, und Nachweis der Bildung eines Hybrides aus einem Amplifikat und der Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß die zwischen den Bindesequenzen A und C gelegene dritte Sequenz (B) oder das Komplement (B') davon keine Nukleotide enthält, die nicht dem aus der Bindesequenz D der Sonde und der hieran gebundenen Sequenz des Amplifikats gebildeten Sequenzbereich E zugehören. Bevorzugt ist die Länge der Sonde gleich groß oder größer als die Sequenz B oder das Komplement B'.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens.
In Fig. 1 ist schematisch die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnungsweise für die Bereiche auf der nachzuweisenden Nukleinsäure gezeigt.
In Fig. 2 ist die entsprechende Bezeichnungsweise für die intermediär gebildeten Verlängerungsprodukte der Primer sowie die Amplifikate (Amplikons) gezeigt. Ebenfalls ist gezeigt, daß die Amplifikate ein oder mehrere weitere Bereiche Y aufweisen können, die außerhalb des Bereiches liegen, der die von der nachzuweisenden Nukleinsäure stammende Sequenzinformation enthält.
In Fig. 3 ist schematisch gezeigt, wie im Falle der vorliegenden Erfindung die Binde- Sequenzen der Primer und Sonde angeordnet sind. Es ergeben sich verschiedene
Alternativen I bis VI, je nachdem, ob und wie die Bindesequenzen überlappen. Es ist jeweils nur ein Strang des Amplifikats gezeigt. Dieselbe Anordnung (nur komplementär) kann für einen zweiten Strang des Amplifikats erstellt werden. Für die intermediär gebildeten Verlängerungsprodukte ergibt sich ein ähnliches Bild. Als Fall V und VI ist der Fall gezeigt, daß die Sonde neben der Bindesequenz D noch weitere, nicht mit dem Amplifikat Basenpaarungen ausbildende Bereiche X enthält, die gleich oder verschieden sein können. Zum Vergleich ist der Fall des Standes der Technik als VII gezeigt. In Fig. 4 sind Sequenzen der benutzten Bereiche eingezeichnet, nämlich A', B und C.
In Fig. 5 sind weitere bevorzugte Primer und Sonden gezeigt. Dabei ist insbesondere die Kombination mit der Sonde aus Zeile 3 bevorzugt.
In Fig. 6 und 7 sind auch noch Primer und Sonden gezeigt, die entweder unspezifisch sind oder bei denen keine Nukleotide zwischen Primer und Sonde übrig sind.
In Fig. 8 ist ein besonders kurzes Stück HCV-Genom gezeigt, mit dessen Hilfe kurze Amplicons hergestellt werden können.
Nukleinsäuren, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können, können beliebigen Ursprungs sein, beispielsweise Nukleinsäuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Proben (specimen), in denen die nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen oder deren Komplement enthalten sind, sind z. B. humane, tierische, bakterielle oder pflanzliche Flüssigkeiten, Exkremente, Abstriche, Zellsuspensionen, Kulturen oder Gewebs-, Zeil- oder Flüssigkeits-Punktionen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren in Lösung vor. Damit das erfmdungsgemäße Verfahren seine Vorteile voll entfalten kann, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure eine Größe von mindestens 40 bp aufweist. Die Nukleinsäure kann auch eine durch Klonierung und in-vivo-Vermehrung hergestellte Nukleinsäure sein.
Die nachzuweisende Nukleinsäure kann einzelsträngig (insbesondere bei RNA) oder ganz oder teilweise doppelsträngig (insbesondere bei DNA) sein. Für den Fall doppelsträngiger Nukleinsäuren können beide Stränge vermehrt werden oder aber auch nur einer. Aus beiden Sorten von Nukleinsäuren können einzel- oder doppelsträngige Amplifikate gebildet werden, wovon einer oder beide zum weiteren Nachweis verwendet werden können. Entsprechend wird die Sequenz der Sonde oder der Sonden ausgewählt. Sie ist bevorzugt komplementär zu dem Strang des Amplifikats, der zum weiteren Nachweis verwendet wird. Der Probe oder einer Kontrollprobe können positive oder negative Kontrollnukleinsäuren oder Quantifizierungsstandards zugesetzt sein, die ähnlich oder gleich behandelt werden wie die nachzuweisenden Nukleinsäuren (interner bzw. externer Standard, interne bzw. externe Kontrolle). Als Standards können beispielsweise interne oder externe heterologe DNA- oder RNA-Standards, enthaltend zu den Sequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäuren homologe Primer-Bindesequenzen und zu Sequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäure heterologen Sonden-Bindesequenzen, verwendet werden. Umgekehrt ist aber auch die Verwendung von besonders im 3 '-Priming- Bereich heterologen Primer-Bindesequenzen und homologen Sonden-Bindesequenzen möglich. Als Negativ-Kontrollen werden bevorzugt analoge Specimen eingesetzt, welche die nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplement nicht enthalten.
Vor der Vermehrung wird die Probe bevorzugt einem oder mehreren Vorbehandlungsschritten unterzogen, um die nachzuweisenden Nukleinsäuren in eine vermehrungsfähige Form zu bringen. In einem ersten optionalen Schritt findet eine Vorbehandlung der Probe (Specimen) statt, durch welche die Probe in eine Form gebracht wird, aus der die nachzuweisende Nukleinsäure in eine für die Überführung der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrung geeignete Form gebracht wird (z. B. eine Abtrennung störender Bestandteile aus der Probe).
Die Art der Vorbehandlung der Probe hängt von der Art der Probe und der Komplexität des biologischen Materials in der Probe ab. Bei humanen Körperflüssigkeiten, wie z. B. Human-Blut, erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform zunächst eine Abtrennung von Blutzellen zur Erzeugung von Plasma, Serum oder Blutzellkonzentraten. Durch diesen Trennschritt wird durch die Probenvorbehandlung die Komplexität des biologischen Probenmaterials in den resultierenden Fraktionen deutlich reduziert, ohne daß eine substantielle Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäure erfolgt. Im Fall von Sputum oder Abstrichen erfolgt eine Proben Vorbehandlung z. B. durch Suspendieren des Sputums bzw. des Abstrichs in einer Flüssigkeit, im Fall von Urin z. B. durch Zentrifugation und Weiterverarbeitung der erhaltenen Fraktionen. Im Fall von Gewebspunktionen erfolgt eine Probenvorbehandlung z. B. durch Suspendierung und Behandlung mit einem Zellverbands-auflösenden Agens. Bei Cerebrosidal-Flüssigkeit erfolgt die Probenvorbehandlung z. B. durch Zentrifugation und Weiterverarbeitung der erhaltenen Fraktionen. Auch in diesen Fällen erfolgt durch die Probenvorbehandlung eine Reduktion der Komplexität des biologischen Probenmaterials.
Danach kann sich ein Schritt anschließen, in dem die nachzuweisende Nukleinsäure aus der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrung zugängliche Form überführt wird. Dabei werden bevorzugt bekannte Methoden angewandt. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt in einem ersten Reaktionsschritt eine Lysebehandlung der vorbehandelten Probe zur Freisetzung der nachzuweisenden Nukleinsäure, z. B. durch Proteinase K-Behandlung bei erhöhten Temperaturen oder bei Desoxyribonukleinsäuren durch Alkali. In einem zweiten Schritt wird die durch Lyse vorbehandelte Probe nach Zugabe von chaotropen Agentien, wie z. B. Guanidinium-Hydrochlorid oder Harnstoff, in Anoder Abwesenheit von löslichen Alkoholen, wie z. B. Isopropanol, an die Oberfläche eines festen Trägers und anschließende Resorption von diesem festen Träger konzen- triert. Solche festen Träger sind z. B. feste Träger mit glashaltigen Oberflächen (z. B. Magnetpartikel, Glasvließe mit glashaltigen Oberflächen, Partikel, Mikrotit erplatten, Reaktionsgefäße, Dip-sticks oder miniaturisierte Reaktionskammern, die wiederum auch Teil von integrierten Reaktionschips sein können). Durch diesen festen Träger erfolgt bevorzugt eine nicht-sequenzspezifische Reinigung, d.h. keine substantielle Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren von anderen Nukleinsäuren, sondern lediglich eine Probenmaterial-(Nukleinsäuren-)Konzentrierung und ggf. Inaktivierung und oder Eliminierung von Inhibitoren für die darauffolgenden Nukleinsäure- Vermehrungs- und Nachweisreaktionen. Durch diese festen Träger ist auch die Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäure, z. B. im Rahmen von Multiplex- Verfahren, in für die Nukleinsäure-Vermehrungs- und -Nachweis-Reaktionen zugängliche Form möglich.
In einer anderen Ausführung kann die Überführung der nachzuweisenden Nukleinsäure aus der vorbehandelten Probe nach Nukleinsäure-Freisetzung in einem ersten Schritt durch z. B. Proteinase K-Behandlung bei erhöhten Temperaturen oder bei Desoxyribo- nukleinsäuren durch Alkali erfolgen. In einem zweiten Schritt wird die lysierte vorbehandelte Probe zur Bindung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit festen Trägern in Kontakt gebracht, die mit Nukleinsäure-spezifischen Bindungsgruppen und/oder Fangsonden spezifisch zur selektiven Bindung der nachzuweisenden Nukleinsäure modifiziert sind, und anschließend die gebundene nachzuweisende
Nukleinsäure durch Dissoziation zwischen Bindungsgruppe und/oder trägergebundener Fangsonde und nachzuweisender Nukleinsäure wieder eluiert. Beispiele für Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppen sind PNA-Homopyrimidin-Oligomere wie z. B. (T)7-PNA oder Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Substanzen wie z. B. Nukleinsäure-Interkalatoren, Major groove-Binder oder Minor groove-Binder. Beispiele für Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind Nukleinsäure- Oligomere oder Nukleinsäure-Polymere mit Bindungssequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Weitere Beispiele für Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind PNA-Oligomere mit Bindungssequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Die Bindung der Nukleinsäure- spezifischen Bindungsgruppen oder der Fangsonden an den festen Träger kann mit oder ohne Zwischenschaltung von Abstandshaltern (Spacern) entweder kovalent oder über Bindungspaare, wie z. B. BiotimStreptavidin oder Ni:Chelat. erfolgen.
Die zur Vermehrung eingesetzten Nukleinsäurensequenzen können linear oder zirkulär sein und können Sequenz-Modifikationen und/oder sonstige Modifikationen, wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen- Analoga oder Äquivalente davon, enthalten oder methyliert, gecappt, polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein. Die zur Vermehrung eingesetzten Nukleinsäuren oder deren Komplement können natürlichen Ursprungs sein, fragmentiert, modifiziert oder enzymatisch, z. B. mit dem Enzym Uracil-Deglykosylase (UNG), oder physikalisch vorbehandelt, vorvermehrt, oder chemisch, photochemisch oder enzymatisch erzeugt sein, z. B. durch chemische Oligonukleotidsynthese oder in- vitro-Replikation, in-vitro-Reverse Transkription oder in-vitro-Transkription. In dem ersten essentiellen Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Teilstück der nachzuweisenden Nukleinsäure amplifiziert. Im folgenden wird dieses Teilstück auch Amplikon genannt. Dieses enthält zwingend den Sequenzbereich zwischen den äußeren Enden der Bindesequenzen A und C bzw. des Komplements davon der Primer, und enthält den Bindebereich E der Sonde bzw. das Komplement davon. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Amplikon (bevorzugt die Gesamtlänge der Sequenzen der Bereiche A, B und C) bevorzugt kürzer als 100 Nukleotide, besonders bevorzugt kürzer als 60 Nukleotide, jedoch bevorzugt länger als 40 Nukleotide. Dies bedeutet jedoch nicht, daß die Gesamtlänge der Amplifikate nicht doch größer sein kann, z. B. wenn die Primer zusätzlich Nukleotide aufweisen. Es werden solche Vermehrungsmethoden eingesetzt, die eine Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz oder deren Komplement erlauben, die in der Bildung von Tripartite-Mini-Nukleinsäure- Vermehrungsprodukten münden. Hierfür stehen prinzipiell alle Nukleinsäureamplifikationsverfahren zur Verfügung, die im Stand der Technik bekannt sind. Bevorzugt werden targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen verwendet. Besonders bevorzugt werden theoretisch exponentielle targetspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen verwendet, bei denen eine antiparallele Replikation der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement erfolgt, wie z. B. Elongations-basierte Reaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR für Desoxyribonukleinsäuren, RT-PCR für
Ribonukleinsäuren) oder Transkriptions-basierte Reaktionen wie z. B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) oder Transcription Mediated Amplification (TMA). In besonderer Weise bevorzugt werden thermozyklische exponentielle Elongations-basierte Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen wie z. B. die Polymerase- Kettenreaktion verwendet. Die zur Vermehrung eingesetzten nachzuweisenden
Nukleinsäuren oder deren Komplement können in Form von einzelsträngigen oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäuren oder Ribonukleinsäuren vorliegen. Ziel der Vermehrungsreaktion (Amplifikation) ist die Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks der nachzuweisenden Nukleinsäure. Unter einem Amplifikat wird daher jede unter Verwendung von Sequenzinformation der Nukleinsäure hergestellte Molekülspezies verstanden. Insbesondere handelt es sich um Nukleinsäuren. Der Begriff "Amplifikat" beinhaltet sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäuren. Ein Amplifikat kann neben den die Sequenzinformationen der zugrunde liegenden Nukleinsäure enthaltenden Bereichen (Amplikon) außerhalb der voneinander wegweisenden Enden der Primerbindungsstellen noch weitere Bereiche enthalten, welche nicht in direkter Relation mit Sequenzen der zu amplifizierenden Nukleinsäure stehen. Bevorzugt kommen gerade solche Sequenzen einer Länge von mehr als 15 Nukleotiden nicht auf der nachzuweisenden Nukleinsäure oder ihrem Komplement vor und können mit dieser nicht durch direkte Basenpaarung hybridisieren. Amplifikate können somit entweder mit der nachzuweisenden
Nukleinsäure selbst oder mit deren Komplement hybridisieren. Amplifikate sind beispielsweise auch die Produkte einer asymmetrischen Amplifikation, d. h. einer Amplifikation, bei der die beiden Stränge in unterschiedlicher Menge gebildet werden (z. B. durch Einsatz unterschiedlicher Mengen an Primern) oder einer der beiden Stränge wieder zerstört wird (z. B. durch RNase).
Unter einem Primer im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül verstanden, welches über Basenpaarungen an eine Nukleinsäure binden kann und welches, bevorzugt enzymatisch, verlängert werden kann. Bevorzugt sind Ohgonukleotide, die an ihrem 3 '-Ende unter Verwendung der nachzuweisenden Nukleinsäure oder einem Komplement hiervon als Templatnukleinsäure verlängert werden können. Als Primer können monovalente oder multivalente oder monofunktionelle oder multifunktionelle Agentien eingesetzt werden, die eine Nukleinsäure-abhängige Elongation zulassen. Bevorzugt können als Primer Oligomere oder Polymere einer Bindelänge von zwischen 9 und 30 nt verwendet werden, die an die nachzuweisende Nukleinsäure antiparallel binden und die als einer von mehreren Reaktionspartnern für eine enzymatische Replikation der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement wirken. Besonders bevorzugt werden als Primer Oligomere verwendet, die nach Zugabe eines Vermehrungsreagenzes durch Anlagerung zumindest eines Teils des Primers an die nachzuweisende Nukleinsäure oder deren Komplement eine gerichtete Replikation einer oder beider Stränge der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement initiieren. Ein Beispiel für einen besonders bevorzugten Primer ist ein Oligonukleotid mit einem freien 3 '-Hydroxyl-Ende.
Die als Primer eingesetzten Agentien können eine oder mehrere Bindesequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren oder deren Komplement enthalten und können Sequenz-Modifikationen, endständige und/oder interne
Sequenzergänzungen und/oder sonstige Modifikationen wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon, nicht funktioneile Nu- kleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen- Analoga oder Äquivalente davon enthalten oder methyliert, gecappt oder polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein. Erforderlich ist, daß sie die geforderten Bindeeigenschaften zur nachzuweisenden Nukleinsäure bzw. ihrem Komplement haben und verlängerbar sind. Bevorzugte Nukleotid-Äquivalente sind PNA-Monomere bzw. PNA-Oligomere (WO92/20702) mit oder ohne positive und/oder negative Ladungen im Rückgrat und/oder im Abstandshalter. Die als Primer eingesetzten Agentien können Modifikationen tragen, die entweder direkt oder indirekt über ein weiteres Bindungspaar zur Detektion und/oder Bindung an einen festen Träger geeignet sind. Bevorzugte Primer-Modifikationen sind die Fluoreszenzfarbstoffe wie z. B. Fluorescein, Rhodamin, AMCA oder Derivate davon, einen der Partner in einem der Bindungspaare Biotin:(Strept-)Avidin, Digoxigenin:Anti-Digoxigenin, Digoxigenin:Anti-Digoxigenin gekoppelt mit Äquorin, Fluorescein: Anti-Fluorescein oder Ruthenium- oder Rhenium- Chelat oder Äquorin. Eine besonders bevorzugte Primer-Modifikation ist Biotin als Fang- oder Detektions-Modifikation. Die Primer können weitere Sequenzbereiche Y enthalten, insbesondere an ihrem 5'-Ende (Fig. 2). Hier sind sowohl 5 '-3 '-Verknüpfungen als auch 5 '-5 '-Verknüpfungen und/oder 5 '-2 '-Verknüpfungen möglich. Außerdem können sie zusätzliche Strukturkomponenten, wie z. B. Abstandshalter, immobilisierbare Gruppen oder Löslichkeits-vermittelnde Molekülteile oder im Hinblick auf Primingaktivität aktivierbare Bereiche haben, wie z. B. AP-Stellen.
Unter einer Sonde wird ein Molekül verstanden, welches aufgrund von Basen-Basen- Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren hybridisieren kann. Bevorzugte Sonden sind daher Oligonukleotide sowie basenhaltige Nukleinsäuremimetica, wie Peptidnukleinsäuren (PNA). Die Länge einer Sonde beträgt, bezogen auf die Bindesequenz D, bevorzugt zwischen 9 und 30 Basen.
PNA-Oligomer-Sonden mit oder ohne positive oder negative Ladungen im Rückgrat und/ oder Abstandshalter haben die zusätzlichen Vorteile, daß sie stabil sind gegenüber dem Abbau von Nukleasen oder Proteasen wegen der verschiedenen Struktur des Rückgrats und der H- bzw. NH2-Enden, einen höheren Schmelzpunkt in Bindungskomplexen zwischen Nukleinsäuren und PNA als zwischen zwei Nukleinsäure-Molekülen aufwiesen und der Hybridkomplex dadurch stabiler ist, bei niedrigen Salz- konzentrationen anwendbar sind, eine höhere Differenz der Schmelzpunkte bei Fehlpaarungen aufwiesen und somit eine bessere Fehlpaarungs-Diskriminierung möglich ist, Sequenzen mit Sekundärstrukturen bei niedrigen Salzkonzentrationen zugänglicher sind, die Kompetition zwischen Amplikon-Gegenstrang und Sonde geringer ist bei niedrigen Salzkonzentrationen und dadurch eine höhere Signalausbeute erreicht wird und das Potential zur Eliminierung des Amplikon-Denaturierungsschritts bei niedrigen Salzkonzentrationen besteht.
Als Sonden können monovalente oder multivalente Agentien eingesetzt werden, die eine Bindung vermehrungsabhängiger Elongationsprodukte und/oder vermehrter Nukleinsäuresequenzen zulassen. Bevorzugt können als Sonden Oligomere oder Polymere verwendet werden, die an die nachzuweisende Nukleinsäure antiparallel binden. Besonders bevorzugt werden als Sonden Oligomere verwendet, die durch Anlagerung zumindest eines Teils der Sonde an die nachzuweisende Nukleinsäure oder deren Komplement eine im Rahmen der Folgereaktionen stabile Bindung an einen oder beide Stränge der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement herbeiführen. Die Oligomere können sowohl 5 '-3 '-Verknüpfungen als auch 5 '-5 '-Verknüpfungen und/oder 5 '-2 '-Verknüpfungen sowie zusätzliche Strukturkomponenten, wie z. B. Abstandshalter oder Löslichkeits-vermittelnde Molekülteile, enthalten. Unter einer Bindesequenz wird bevorzugt die Sequenz von Basen verstanden, die zwischen den äußersten, mit einer bestimmten Nukleinsäure. einem Primer oder einer Sonde über Basen-Basen- Wechselwirkung bindenden Basen einer bestimmten Nukleinsäure, einem Primer oder einer Sonde liegt, einschließlich dieser äußersten Basen.
Die als Sonde eingesetzten Agentien können eine oder mehrere Bindesequenzen D für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren oder deren Komplement, insbesondere jedoch für einen Strang des Amplifikats enthalten und können Sequenz- Modifikationen, endständige und/oder interne Sequenzergänzungen und/oder sonstige Modifikationen wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon, nicht funktioneile Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen- Analoga oder Äquivalente davon enthalten oder methyliert, gecappt oder polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein, solange die Bindung an einen Strang des Amplifikats möglich ist. Bevorzugte Nukleotid-Äquivalente sind PNA-Monomere bzw. PNA-Oligomere mit oder ohne positive und/oder negative Ladungen im Rückgrat und/oder Abstandshalter. Die als Sonden eingesetzten Agentien können Modifikationen tragen, die entweder direkt oder indirekt über ein weiteres Bindungspaar zur Detektion und/oder Bindung an einen festen Träger geeignet sind. Bevorzugte Sonden- Modifikationen (nachweisbare Gruppen L, immobilisierbare Gruppen I) sind die Fluo- reszenzfarbstoffe wie z. B. Fluorescein, Rhodamin, AMCA oder Derivate davon, Bindungspaare Biotin:(Strept-)Avidin, Digoxigenin:Anti-Digoxigenin,
DigoxigenimAnti-Digoxigenin gekoppelt mit Äquorin, Fluorescein:Anti-Fluorescein oder Ruthenium-Chelat oder Äquorin. Besonders bevorzugte Sonden-Modifikation sind Biotin als Fang- oder Detektions-Modifikation, Digoxigenin. Ruthenium- oder Rhenium-Chelat oder Äquorin als Detektions-Modifikationen.
In der vorliegenden Erfindung wird das Teilstück der Nukleinsäure, von welchem eine Vielzahl von Amplifikaten hergestellt werden soll, so ausgewählt, daß es drei Bereiche A, B und C enthält. Die Bereiche A und C sind Bereiche, die so gewählt werden, daß einer der Primer die Sequenz A als Bindesequenz benutzen kann und das Komplement des Bereiches C als Bindesequenz für den anderen Primer dienen kann. Unter einem Komplement wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine zu einer bestimmten anderen Nukleinsäure, z. B. einem Sequenzbereich z. B. eines Amplifikats oder der nachzuweisenden Nukleinsäure im wesentlichen komplementäre Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz verstanden.
Im wesentlichen komplementär bedeutet, daß die Basenpaarungen so gewählt sind, daß (für den Fall, daß eine Hybridisierung mit einer anderen Nukleinsäure, z. B. einer Sonde oder einem Primer) eine Hybridisierung unter den Testbedingungen noch erfolgen kann bzw. (für den Fall eines Verlängerungsprodukts eines Primers im Verhältnis zu dem eingesetzten Templat) die Nukleinsäure aufgrund einer Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung der entsprechenden Nukleinsäure gebildet werden konnte. Im wesentlichen komplementär bedeutet daher oft, daß unter stringenten Bedingungen mehr als 90 % der Basen der betrachteten Nukleinsäure bzw. Sequenz mit der bestimmten Nukleinsäure bzw. Sequenz Basenpaarungen ausbilden.
Die Bereiche A und C sind erfmdungsgemäß bevorzugt so lang, daß Bedingungen gefunden werden können, bei denen Primer einer entsprechenden Länge mit den Basen in diesen Bereichen hybridisieren können. Daher sind die Bereiche bevorzugt länger als 8, besonders bevorzugt länger als 12 Nukleotide. Auch bezüglich der Obergrenze der Länge der Bereiche A und C ergeben sich im Sinne der Erfindung bevorzugte Bereiche. Die Bereiche A und C sind jeweils bevorzugt kleiner als 30, besonders bevorzugt kleiner als 20 Nukleotide. Die Länge der Bereiche wird in einem besonderen Aspekt der Erfindung dadurch nach oben begrenzt, daß die Primer in für die nachzuweisende Nukleinsäure unspezifischer Weise daran hybridisieren können sollen. Daher ist die besonders bevorzugte Länge der Bindesequenzen A und C 12 bis 20 Nukleotide. Die Bereiche A und C auf der nachzuweisenden Nukleinsäure überlappen nicht miteinander.
Im Sinne der Erfindung enthalten das Teilstück der nachzuweisenden Nukleinsäure
(welches dem Amplikon entspricht) und somit die hieraus gebildeten Amplifikate eine zwischen den Bereichen A und C gelegene Sequenz B (Fig. 1 bis 3). Diese Sequenz hat eine Länge von ein oder mehr Nukleotiden, bevorzugt mehr als 4, besonders bevorzugt mehr als 8 Nukleotide. Nach oben hin ist die Länge der Sequenz B durch die geforderte Nichtanwesenheit von Nukleotiden, die nicht der Bindesequenz der Sonde zugehören, und in einem besonderen Aspekt der Erfindung durch die gewünschte Unspezifität der Sonde begrenzt. Besonders bevorzugt ist die Sequenz B daher kleiner als 30, besonders bevorzugt kleiner als 15 Nukleotide. Die Sequenz B hat bevorzugt eine Länge von zwischen 4 und 15 Nukleotiden. Diese Sequenz oder das Komplement davon dienen im Sinne der Erfindung mit zur Bindung der Sonde. Die Länge der Sonde wird so gewählt, daß eine Hybridisierung mit dem Amplifikat möglich ist. Die Sequenz der Sonde wird so gewählt, daß sie eine Bindesequenz D enthält, welche durch die mit dem Amplikon Basen-Basen- Wechselwirkung ausbildenden Nukleotide der Sonde, insbesondere den zwischen den äußersten mit korrespondierenden Basen des Amplikons Basenwechselwirkung ausbildenden Nukleotide der Sonde definiert ist. Bevorzugt ist die Sonde im wesentlichen komplementär zu den Nukleotiden der Bindesequenz E des Amplifikats. Die Bindesequenz D bzw. deren Komplement D' kann zu dem Amplifikat zu 100 % komplementär sein, aber auch Mismatche (Fehlpaarungen) zwischen den äußeren Enden der Bindesequenz aufweisen. Die Sonde kann neben der Bindesequenz weitere Gruppen oder Reste oder auch Nukleinsäure-bindende Bereiche enthalten (Fig. 3, V, VI).
Abhängig von der Länge des Bereiches B und der Länge der Bindesequenz D bzw. D' lassen sich unterschiedliche Fallgestaltungen treffen. In einem ersten Fall ist die Bindesequenz D oder D' länger als der Bereich B bzw. B' des Amplikons. In diesem Fall reicht die Bindesequenz D bzw. D' in einen oder beide Bereiche A bzw. A' und C bzw. C des Amplikons hinein. Diese Fälle sind in Fig. 3, II bis IV gezeigt. In diesen Fällen enthält das Amplifikat zwischen den voneinander wegweisenden Enden der Bereiche A und C keine Nukleotide, die nicht der Bindesequenz E oder den Bindesequenzen der Primer zugehören. Die Bindesequenz D der Sonde überlappt in Fig. 3, II und III mit einer der beiden Bindesequenzen der Primer.
In einem weiteren Fall entspricht die Länge des Bereiches B der Länge des Bereiches D, so daß die Bindesequenz der Sonde nicht mit den Bindesequenzen der Primer überlappt (Fig. 3, 1). Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet in einer bevorzugten Ausführungsform die Bildung von dreiteiligen Mini- Amplikons (Tripartite-Mini- Amplikon), die neben den Primer und Sonde bindenden Sequenzen keine zusätzlichen Sequenzen aufweisen und somit die Nachteile bei Bildung von längeren Nukleinsäure- Vermehrungsprodukten vermeiden, wobei andererseits die Spezifität des gesamten Amphfikationsformats durch Bindung der Primer, durch Bindung der Sonde und durch Ablauf der targetabhängigen enzymatischen Elongationsreaktion mit allen 4 Nukleotid- bzw. Basenspezifitäten oder natürlicher oder artifizieller Analoga, Isomere oder Äquivalente davon aber sichergestellt wird. Das erfindungsgemäße Vermehrungsverfahren wird daher auch als Mini-Chain-Reaction (MCR) bezeichnet.
Die Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen oder deren Komplement erfolgt, wenn im folgenden nichts anderes ausgesagt ist, unter Befolgung der dem Fachmann bekannten Reaktionsschritte und Reaktionsbedingungen. Ein Unterschied zu den herkömmlichen Verfahren ist der Einsatz der speziell ausgewählten Primer und Sondensequenzen, welche die Bildung und Vermehrung des Mini-Tripartite- Amplikons erlauben. Wesentlich im Sinne der Erfindung ist die Zugabe eines oder mehrerer Primer, die an die Primer-Bindesequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäure, des Tripartite- Mini-Amplikons beziehungsweise deren Komplemente binden.
Allgemein üblich ist die Zugabe zur Vermehrung befähigender Vermehrungsreagentien. Bevorzugt können als Vermehrungsreagentien enzymatisch aktive Komponenten (z. B. Enzyme) in Kombination mit Elongationssubstraten und geeignete Hilfsreagentien (wie Puffer) verwendet werden. Bevorzugte Elongationssubstrate sind Nukleinsäurebausteine oder natürliche oder artifizielle Analoga oder Isomere oder Äquivalente davon. Als Elongationssubstrate werden Agentien eingesetzt, die zum Aufbau eines Gegenstrangs der nachzuweisenden Nukleinsäure in gegenläufiger Form geeignet sind. Bevorzugt werden als Elongationssubstrate Nukleotide eingesetzt. Bevorzugte Nukleotide sind dATP, dGTP, dCTP, dTTP und oder dUTP, dITP, iso- dGTP, iso-dCTP, deaza-dGTP und ATP, GTP, CTP, UTP und/oder ITP, deazaGTP, iso- GTP, iso-CTP. Äquivalente sind PNA-Monomere bzw. PNA-Oligomere mit oder ohne positive und/oder negative Ladung im Rückgrat und/ oder im Abstandshalter. Die Elongationssubstrate können, wie oben ausgeführt, Modifikationen tragen.
Besonders bevorzugt werden im Fall der PCR als Nukleinsäure- Vermehrungsreagentien Mischungen aus meta- oder thermostabilen enzymatischen DNA-Po lymerasen und Mischungen von Desoxyribo- und/oder Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagenzien verwendet, z. B. Taq-DNA Polymerase in Kombination mit dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP und Hilfsreagentien wie z. B. Salze und ggf. Detergentien. Besonders bevorzugt werden im Fall der RT-PCR als Vermehrungsreagentien Mischungen aus thermostabilen enzymatischen Reverse Transkriptase- und DNA-Polymerase- Aktivitäten und Mischungen von Desoxyribo- und Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagentien verwendet, z. B. Mischungen aus AMV oder Mo-MLV-Reverse Transkriptase oder Tth-DNA Polymerase in Kombination mit dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP und ATP, GTP, CTP, UTP und Hilfsreagentien wie z. B. Salze und ggf. Detergentien.
Bei den thermozyklischen Vermehrungsreaktionen (z. B. PCR, RT-PCR) werden 2- oder 3-phasige Zyklen durchgeführt, bevorzugt 2-phasige Zyklen. Bei den 2-phasigen Zyklen wird die Strangtrennung der Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte bei hoher Temperatur, bevorzugt 85 °C - 95 °C, durchgeführt, das gemeinsame Primer-Annealing und Primer-Elongation bei Temperaturen nahe dem Schmelzpunkt zwischen Primer und Elongationsgegenstrang, bevorzugt zwischen 55 °C und 75 °C. Die Strangtrennung erfolgt durch Energiezufuhr und/oder enzymatisch, bevorzugt durch erhöhte Temperatur, Mikrowellen oder das Anlegen einer Spannung über eine Mikroelektrode, besonders bevorzugt durch erhöhte Temperatur. Es werden bis zu 60 Thermozyklen durchgeführt, bevorzugt 32 - 42. Bei den isothermen Vermehrungsreaktionen wird eine kontinuierliche Inkubation bei einer mittleren Temperatur zwischen 30 °C und 70 °C durchgefürt, bevorzugt bei 37 °C - 45 °C mit Enzymmischungen bzw. 60 °C - 65 °C mit mesothermen Enzymmischungen. Es wird bis zu 2 Stunden inkubiert, bevorzugt 30 - 60 Minuten. Die Vermehrungsreaktion kann in Reaktionsgefäßen, Kapillaren oder miniaturisierten Reaktionskammern erfolgen, die auch Teil eines integrierten Reaktionschips sein können.
Bei Verwendung von dUTP anstelle von oder in Ergänzung zu dTTP wird durch die DNA-Polymerase- Aktivität dUMP anstelle von dTMP in die vermehrte Nukleinsäure- sequenz oder deren Komplement eingebaut. Dies erlaubt durch Inkubation mit der
Enzymaktivität Uracil-Deglycosylase, bevorzugt mit einer thermolabilen Ausfuhrungs- form der Enzymaktivität, bei der die Renaturierung nach thermischer Denaturierung der Enzymaktivität langsamer erfolgt, die Fragmentierung des Vermehrungsprodukts und somit seiner Eigenschaft als Nukleinsäure- Vermehrungseinheit. Die Inkubation des UMP -haltigen Vermehrungsprodukts kann im Anschluß an die Nukleinsäure- Vermehrungs- und Nachweisreaktion (Sterilisierung) und/oder vor einer erneuten Nukleinsäure- Vermehrungsreaktion (Carry over-Prävention) erfolgen.
Alternativ können auch Psoralen und/oder Isopsoralen und Derivate davon und Bestrahlung mit UV-Licht zur funktioneilen Inaktivierung des Nukleinsäure-Vermehrungs- produkts verwendet werden.
Im Fall von NASBA und TMA können als Nukleinsäure-Vermehrungsreagentien bevorzugt Mischungen aus metastabilen enzymatischen Reverse Transkriptase-, DNA- Polymerase, RNase H und RNA-Polymerase und Mischungen von Desoxyribo- und Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagentien verwendet werden, z. B. eine Mischung aus AMV oder Mo-MLV-Reverse Transkriptase, ggf. E. coli DNA-Polymerase, ggf. E. coli RNase H und T7-, T3- oder SP6-codierte RNA-Polymerase oder Mo-MLV Reverse Transkriptase und T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase oder entsprechende mesostabile Enzyme, z. B. aus Bacillus stearothermophilus in Kombination mit dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP und ATP, GTP, CTP, UTP, und Hilfsreagentien wie z. B. Salze und ggf. Detergentien. Der Reaktionsverlauf der Vermehrungsreaktion bei NASBA, TMA ist isotherm.
Der Nachweis der Bildung der Amplifikate erfolgt mit der Sonde, die an die Bindesequenz B des Amplikons zu einem Hybrid bindet. Die Sonde kann als Fang- oder Detektionssonde fungieren. Die Enden der Bindesequenz der Sonde liegen zwischen den äußeren Enden der Primer-Bindesequenzen. Die Sonde ist somit hybridisierbar mit einem Strang des Amplifikats.
Die Bindung der Sonde kann unter Benutzung bekannter Bedingungen geschehen. Denn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D. Harnes und SJ. Higgins, ERL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al, J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug genommen. Zu den bekannten Methoden gehört auch die chemische Synthese von modifizierten und unmodifizierten Oligonukleotiden und die Auswahl von Hybridisierungsbedingungen, durch welche eine Spezifität erreicht werden kann, die vom Ausmaß der Homologie zwischen den zu hybridisierenden Nukleinsäuren, deren GC-Gehalt und deren Länge abhängt.
Hierzu wird, wenn die Fangsonde (in geschützter Form) nicht schon vorher zugegeben wurde, die Sonde zu der Reaktionsmischung nach der Vermehrungsreaktion, bevorzugt in Form einer Lösung, zugegeben. Dabei werden Reagenzbedingungen eingestellt, die eine Hybridisierung der Sonde mit einem Amplifikat erlauben.
Die Bindung zwischen der vermehrten Nukleinsäuresequenz des Amplikons und/oder dessen Komplement und der Sonde erfolgt bevorzugt bei einer konstanten Temperatur zwischen 20 °C und 75 °C, bevorzugt um 0 °C - 30 °C, besonders bevorzugt um 0 °C - 15 °C unterhalb der Schmelztemperatur des Bindekomplexes. Die Inkubationszeit beträgt bis zu 4 Stunden, bevorzugt 15 - 120 Minuten, besonders bevorzugt 30 - 60 Minuten. Die Bindung mit dem Amplifikat und/oder dessen Komplement erfolgt mit oder ohne vorausgehenden Denaturierungsschritt. Die Reaktionsführung ohne vorausgehenden Denaturierungsschritt erfolgt bevorzugt mit PNA-Oligomeren mit oder ohne negative und/oder positive Ladungen im Rückgrat und/oder im Abstandshalter bei niedrigen Salzkonzentrationen.
Bei Verwendung mehrerer Sonden oder multifunktionaler Sonden oder Sonden, die mehrere Bindesequenzen für Amplifikate verschiedener nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplemente aufweisen, können mehrere unterschiedliche Amplifikate oder deren Komplemente gebunden werden. Dabei erlaubt die Bildung von Tripartite-Mini-Amplikons bevorzugt ähnlicher Länge, besonders bevorzugt solcher Tripartite-Mini-Amplikons gleicher Länge, bei der Nukleinsäurevermehrung die Einstellung vereinheitlichter Inkubationsbedingungen für die Bildung der unterschiedlichen Bindekomplexe. Dies erlaubt den parallelen und/oder sequentiellen Nachweis mehrerer Nukleinsäuresequenzen im Rahmen von Multiplex- Verfahren.
Der Nachweis des gebildeten Bindekomplexes zwischen Amplifikat und Sonde kann in für den Fachmann bekannten Verfahren, insbesondere in verschiedenen Ausführungsformen erfolgen, nämlich direkten Nachweisverfahren, wie z. B. mit spektroskopischen oder physikalischen Methoden, durch Sequenzierung oder durch heterogene oder homogene Nachweisformate.
Direkte spektroskopische oder physikalische Verfahren sind z. B. Schmelztemperaturbestimmungen, Anlagerung von interkalierenden oder Nukleinsäure-bindenden Farbstoffen oder Metallatomen oder -partikeln, Massenspektroskopie, Oberflächen- Plasmonenresonanz oder Fluoreszenz-gekoppelte Oberflächen-Plasmonenresonanz, oder E-wave-Messungen.
Die Sequenzierung des gebundenen Tripartite-Mini-Amplikons kann über Bindung des Primers und anschließende enzymatische Sequenzierung nach Sanger erfolgen. Zur Detektion der Sequenzierungsprodukte ist bevorzugt entweder der Primer markiert oder die Kettenabbruchreagentien. Die Sequenzierungsprodukte können auch über Massenspektroskopie nachgewiesen werden. Bei Zugabe lediglich limitierter Nukleotidarten entsprechend den flankierenden Nukleotiden am Primerende ist eine Minisequenzierung möglich, was besonders für die Analyse von Polymorphismen von Vorteil ist. Bei den heterogenen Nachweisverfahren kann die Sonde abhängig von der angebrachten Modifikation entweder als Fangsonde oder als Detektorsonde verwendet werden. Bei Verwendung mehrerer Sonden sind Multiplexformate realisierbar.
Bei Verwendung der Sonde als Fangsonde kann die Sonde entweder an dem festen Trägerkovalent oder über ein Bindungspaar vorgebunden sein und die Bildung des
Bindekomplexes zwischen Amplifikat und der Sonde erfolgt auf dem festen Träger. Bei dieser Ausführungsform können neben festen Trägern, die eine Sondenart enthalten, auch feste Träger realisiert werden, die mehrere bzw. eine Vielzahl von Sondenarten enthalten, wie z. B. Sonden-Teststreifen, Sonden-Panels oder Sonden- Arrays auf festen Trägern oder miniaturisierten Chips, die wiederum auch Teil von integrierten
Reaktionschips sein können. Diese trägergebundenen Nachweissysteme sind besonders geeignet für Multiplexformate. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Komplex zwischen Amplifikat und Fangsonde in Lösung erst vorgebildet und anschließend auf den festen Träger aufgebracht. Hierzu enthält das Amplikon bevorzugt eine immobilisierbare Gruppe I, die an eine an einer Festphase befindlichen Gruppe R binden kann.
Die Art der Festphase richtet sich nach der zur Immobilisierung befähigenden Gruppe I. Bevorzugt weist sie eine immobilisierende Gruppe R auf, die eine bindende Wechselwirkung mit I eingehen kann. Ist die immobilisierbare Gruppe beispielsweise ein Hapten, dann kann eine Festphase verwendet werden, die an ihrer Oberfläche
Antikörper gegen dieses Hapten aufweist. Ist die immobilisierbare Gruppe ein Vitamin, wie z. B. Biotin, dann kann die Festphase bindende Proteine wie Avidin oder Streptavidin immobilisiert enthalten. Besonders bevorzugte Reste I und R sind Biotin und Streptavidin. Die Immobilisierung über eine Gruppe an der modifizierten Nukleinsäure ist besonders vorteilhaft, da sie unter milderen Bedingungen stattfinden kann als beispielsweise Hybridisierungsreaktionen. Bevorzugt wird zur Immobilisierung der gebildeten Nukleinsäuren die Reaktionsmischung vor, während oder nach Bildung der Nukleinsäurehybride in ein Gefäß gefüllt, welches an seiner Oberfläche mit der immobilisierbaren Gruppe reagieren kann. Es ist möglich, eine Festphase in Form eines porösen Materials, wie einer Membran, eines Gewebes oder eines Vlieses, zu verwenden, aufweiche die Reaktionsmischung aufgegeben wird. Ebenso ist die Verwendung von Perlen, sogenannten beads - z. B. Magnetpartikeln oder Latex- Partikeln - möglich. Das Gefäß ist bevorzugt eine Küvette, ein Röhrchen oder eine Mikrotiterplatte. Die feste Phase sollte mindestens so viele Bindungsstellen für die immobilisierbare Gruppe der Sonde haben wie Nukleinsäurehybride und damit nachzuweisende Nukleinsäuren vorhanden sind. Die Herstellung einer bevorzugten festen Phase ist in der EP-A- 0 344 578 beschrieben, aufweiche vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Für die heterogenen Nachweisreaktionen wird nach der Inkubationszeit, während der die Immobilisierungsreaktion stattfindet, die flüssige Phase aus dem Gefäß, dem porösen Material oder den pelletierten beads entfernt. Die Festphase kann anschließend mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden, da die Bindung der Hybride an der Festphase sehr effizient ist. Die Detektion der gebundenen Bindekomplexe kann über die während der Nukleinsäuresequenz- Vermehrungsreaktion eingebaute
Detektionsmodifikation im Primer und/oder der Sonde und/oder einem Nukleotid mit Hilfe von bekannten direkten oder indirekten Nachweisarten für diese Modifikationen nach dem Stand der Technik erfolgen.
Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenzlabeln, kann die Menge an Markierung fluorometrisch bestimmt werden. Ist die nachweisbare Gruppe indirekt nachweisbar z. B. ein Hapten, so wird die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten umgesetzt, wie analog in der EP-A-0 324 474 beschrieben. Die Markierung am Antikörper kann beispielsweise eine Farboder Fluoreszenzmarkierung oder bevorzugt eine Enzymmarkierung, wie ß-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Im Falle der
Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische chemoluminometrische oder fluorometrische Verfolgung einer Reaktion des Enzyms mit einem chromogenen, chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen. Das Meßsignal ist ein Maß für die Menge ursprünglich vorhandener nachzuweisender Nukleinsäure und somit ggf. an nachzuweisenden Organismen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vermehrten Tripartite-Mini- Amplikons durch Nukleinsäure-Fangsonden oder PNA-Fangsonden gebunden, die kovalent auf Mikro titerplatten oder Magnetpartikeln immobilisiert sind. Die Detektion erfolgt in dieser bevorzugten Ausfuhrungsform nach Bildung des Bindekomplexes und Waschen über eine Biotin-Modifikation eines oder beider Primer im Amplifikat durch Anlagerung von Avidin-Meerettich-Peroxydase und einer Mischung aus TMB/TMF- Farbsubstraten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Einbau einer Digoxigenin- Detektionsmarkierung über eines der Nukleotide der Nukleinsäure-Vermehrungsreak- tion. Der Bindekomplex zwischen Amplifikat und einer Biotin-markierten Nukleinsäure-Fangsonde oder PNA-Fangsonde wird auf die Oberfläche eines Streptavidin-beschichteten Reaktionsgefäßes gebunden. Nach Waschen erfolgt Anlage- rang von Anti-Digoxigenin-Meerettich-Peroxidase-Antikörperkonjugaten und Farbnachweis mit dem Farbsubstrat ABTS.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform erfolgt der Nachweis einer oder mehrerer Amplifikate nach Bindung durch eine oder mehrere verschiedene kovalent (z. B. Anthrachinon: UV-Licht-Kopplung oder Gold-Oberfläche: SH-Kopplung) oder koordi- nativ (z. B. Biotin: Streptavidin) gebundene Fangsonden, durch Waschen und durch Detektion eines Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Signals, das entweder direkt durch Primärlicht oder über Oberflächenplasmonresonanz oder E-wave angeregt wurde, mit Hilfe von CCD-Kameras oder konfokalen Fluoreszenz-Scannern.
Bei Verwendung der Sonde als Detektionssonde kann die Sonde entweder gleichzeitig, vor oder nach Bindung des Amplifikats an die feste Phase binden. In diesem Fall erfolgt die Bindung des Amplifikats an die feste Phase über Modifikationen, die über einen oder beide Primer oder über die eingebauten Nukleotide eingebaut wurden. Anschließend wird gewaschen und detektiert. In einer weiteren Ausführungsform wird der Komplex zwischen Amplifikat und Detektionssonde in Lösung erst vorgebildet und anschließend auf den festen Träger aufgebracht und gewaschen. Die Detektion der Festphase-gebundenen Bindekomplexe zwischen Amplifikat und Detektionssonde erfolgt über die Detektionsmodifikation der Sonde mit Hilfe von bekannten direkten oder indirekten Nachweisarten für diese Modifikationen nach dem Stand der Technik.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden an die Amplifikate, die über einen oder beide Primer Biotin-Modifikationen enthalten, Ruthenium-Chelat-haltige Detektions- sonden gebunden. Die Detektionssonden sind entweder Ruthenium-markierte Oligo- nukleotide oder Ruthenium-markierte PNA-Oligomere. Nach Bildung des
Bindekomplexes zwischen Ruthenium-markierter Detektionssonde und Biotin- markiertem Amplifikat erfolgt Bindung des Komplexes an Streptavidin-beschichtete Magnetpartikel, Transfer in eine Meßzelle, Anlagerung an eine Elektrode innerhalb der Meßzelle und Erzeugung und Messung eines Elektochemilumineszenz-Signals.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Detektions-Sonde mit
Digoxigenin markiert. Nach Bildung des Bindekomplexes zwischen Digoxigenin- markierter Detektionssonde und Biotin-markiertem Amplifikat erfolgt die Bindung des Komplexes durch eine Fangsonde, die kovalent auf einer Mikrotiterplatte oder auf Magnetpartikeln immobilisiert ist. Die Detektion erfolgt in dieser bevorzugten Ausfuhrungsform nach Bildung des Bindekomplexes und Waschen über eine Biotin- Modifikation eines oder beider Primer im Tripartite-Mini- Amplikon durch Anlagerung von Avidin-Meerrettich-Peroxidase und einer Mischung aus TMB/TMF-Farbsubstraten.
Bei der Verwendung von homogenen Reaktionsformaten werden Detektionssonden verwendet, die entweder gequenchte Fluoreszenzmarkierungen, interne Basensubstitutionen mit Doppelstrang-Komplex-aktivierbaren Fluoreszenzfarbstoffen oder endständige Energie-Donatoren oder -Akzeptoren (in Kombination mit entsprechenden Energie-Donatoren oder -Akzeptoren an benachbarten Primerenden: Energy-Transfer-Komplexe) tragen. In diesen Fällen wird die Detektionssonde schon während der Nukleinsäure-Vermehrung zugegeben. Im Fall der gequenchten Fluoreszenzmarkierungen erfolgt eine Fluoreszenzaktivierung durch Dequenching nach Bindung der Detektions-Sonde an das entstehende Tripartite-Mini-Amplikon und exonukleolytischer Abbau und Freisetzung des Fluoreszenzfarbstoff-modifizierten Nukleotids. Im Fall der internen Basensubstitutionen erfolgt die Erzeugung des Fluoreszenzsignals durch Ausbildung des Bindekomplexes zwischen Detektionssonde und dem sich bildenden Tripartite-Mini-Amplikon. Im Fall der Energie-Transfer- Komplexe erfolgt die Bildung eines Fluoreszenzsignals durch benachbarte Anlagerung des markierten Primers und der markierten Sonde. Die Messung der resultierenden Fluoreszenzsignale erfolgt jeweils bevorzugt durch Real time-Messungen.
In einer besonderen Ausführungsform werden bei den gequenchten Detektorsonden Fluorescein und Rhodamin oder Derivate davon als Fluoreszenz- und Quencher- Komponenten verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden bei den gequenchten Detektorsonden Ruthenium- oder Rhenium-Chelate und Quinone oder Derivate davon als Elektrochemilumineszenz- und Quencher-Komponenten verwendet. In einer weiteren besonderen Ausführungsform werden als interne Basensubstituenten der Detektorsonde Anthrachinon oder Derivate davon verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden Cy-5 und Fluorescein oder Derivate davon als Energie- Transfer-Komponenten verwendet. In einer speziellen Ausführungsform werden Cyanin-Farbstoffe wie z. B. SYBR Green oder Acridin-Farbstoffe verwendet.
Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung sind solche Ausführungsformen, bei denen mindestens eine der Bindesequenzen der Primer und der Sonde nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist. Spezifisch im Sinne der Erfindung ist eine Sequenz dann, wenn sie aufgrund einer fortlaufenden Sequenz von Nukleobasen prinzipiell in der Lage wäre, unter stringenten Bedingungen nur mit einer Sequenz auf der nachzuweisenden Nukleinsäure, nicht jedoch mit Nukleinsäuren anderer, nicht nachzuweisender Organismen oder Spezies oder Gruppen von Organismen zu binden. Bevorzugt ist eine Sequenz dann nicht für eine Sequenz spezifisch, wenn sie unter den Bedingungen, welche für die Durchführung des Nachweises eingestellt werden, mit anderen Nukleinsäuren hybridisieren könnte. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Schritte Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe mindestens zweier Primer, Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde, welche an das Amplifikat binden kann, und Nachweis der Bildung eines Hybrides aus dem Strang des Amplifikates und der Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist. In diesem Fall kann der Bereich B Nukleotide enthalten, welche nicht der Bindesequenz E zugehören. Auch hier sind jedoch Überlappungen der Bindesequenzen der Primer und der Sonde möglich.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens.
In einer weiteren Ausführungsform enthalten die Primer an ihrem 5 '-Ende weitere Sequenzen, die sich im humanen Genom an die Primersequenzen anschließen. Diese Sequenzen sind zwischen 1 und 100, besonders bevorzugt zwischen 5 und 80 Nukleotide lang. Es ist möglich, einen oder beide der Primer entsprechend zu modifizieren. Die zusätzlichen Sequenzen sind nicht so lang, daß sie eine Hybridisierung der Primer mit den Bindesequenzen auf der nachzuweisenden Nukleinsäure, z. B. dem HCV-Genom, verhindern.
In einer weiteren Ausführungsform sind das 5 '-Ende des einen Primers und das 5 '-Ende des anderen Primers miteinander kovalent verknüpft. Zwischen den 5 '-Enden der Primer können sich beispielsweise die angrenzenden humanen Sequenzen befinden.
Bevorzugt binden die Primer an die Bindesequenzen A bzw C, wie oben beschrieben, und die Sonde an einen zwischen den Enden der Bindesequenzen A und C gelegenen Bereich B oder das Komplement davon.
Auch wenn mindestens eine Sequenz aus den 3 Bindesequenzen der beiden Primer und der Sonde nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure ist, bleibt die Ge- samtspezifität des Nachweisverfahrens erhalten. Ist eine der Primersequenzen nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, sondern bindet auch an andere Nukleinsäuren, kann kein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt auf der anderen Nukleinsäure gebildet werden, da die zweite Primerbindungssequenz auf dieser anderen Nukleinsäure fehlt. Unspezifische Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte auf der anderen Nukleinsäure werden nicht detektiert, wenn die spezifische Bindungssequenz für die Sonde fehlt. Ist auch die zweite Primersequenz nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, kann nur dann ein spezifisches Nukleinsäure- Veπnehrungsprodukt auf der anderen Nukleinsäure gebildet werden, wenn beide Primerbindungssequenzen in der gleichen Nukleinsäure- Vermehrungseinheit sind. Dieses Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt wird ebenfalls nicht detektiert, da die spezifische Bindungssequenz für die Sonde fehlt. Ist die Sondensequenz nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, jedoch die beiden Primer spezifisch, werden keine Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte der anderen Nukleinsäure gebildet. Ist zusätzlich zur Sondensequenz auch eine der beiden Primersequenzen nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, kann wiederum kein spezifisches Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet werden. Unspezifische
Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte der anderen Nukleinsäure, die möglicherweise gebildet werden, enthalten andere Sequenzen im Sondenbindungsbereich und werden daher nicht detektiert. Sind alle drei Bindungssequenzen für die beiden Primer und die Sonde nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure. wird kein Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt gebildet, wenn mindestens eine der beiden Primersequenzen nicht in einer Nukleinsäure- Vermehrungseinheit der anderen Nukleinsäure liegt. Liegt die Sondensequenz nicht in der Nukleinsäure- Vermehrungseinheit der beiden Primersequenzen für die andere Nukleinsäure, kann zwar ein spezifisches Nukleinsäure- Veπnehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet, aber nicht detektiert werden. Der einzige Fall, daß ein spezifisches Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet und detektiert werden kann, ist, wenn alle drei Sequenzen innerhalb eines Nukleinsäure- Vermehrungsbereichs liegen. Dies kann jedoch durch entsprechende Sequenzauswahl der Nukleinsäure- Vermehrungseinheit vermieden werden. Eine weitere Möglichkeit, Primer und Sonden gezielt unselektiv zu machen, besteht in der Verwendung degenerierter Basen innerhalb der Sequenz. Dabei wird zweckmäßigerweise die Region, in der die Hybridisierung der Targetnukleinsäure mit dem Primer oder der Sonde stattfinden soll, so gewählt, daß relativ wenig Unterschiede zwischen der Targetsequenz und einer anderen, jedoch nicht nachzuweisenden Sequenz (z. B. eines anderen Mikroorganismus) bestehen. Die noch bestehenden Unterschiede können durch den Einsatz degenerierter Basen an den differierenden Basenpositionen weitgehend ausgeglichen werden. So lassen sich Unterschiede von Primern (A bzw. G) durch den Einbau der Base P (6H, 8H-3,4-dihydro-pyrimido[9,5-C][l,2]oxazin-7-on, z. B. Nucleic Acids Research, Vol. 17, 24, 1989, p. 10373-10383) ausgleichen. Dasselbe gilt für Pyrimidine mit der Base K (Nucleorides & Nucleotides, 16 (7-9), 1507-1511 (1997)). Eine noch stärkere Degenierung ist durch den Einsatz von Inosin möglich (US- A-5,585,477; US-A-5,691,134; US-A-5,578,467; J.Biol.Chem. 260, 5, 2605-2608, 1985; Nucl.Acids Res. 1995, 23, 13, 2499-2505), da Inosin Basenpaarung mit allen vier Basen erlaubt.
Eine weitere Möglichkeit, nichtkomplementäre Basen einzusetzen, ist der Ersatz von A durch D (Diaminopurine oder/und der Ersatz von C durch M (Methylcytosin).
Eine weitere Möglichkeit der Erzeugung von unspezifischen Primern und Sonden ist durch das Mischen von 2 oder mehr Sequenzen gegeben, so kann beispielsweise eine Primersequenz einen für einen ersten Organismus, z. B. HCV, spezifischen Teil und einen für einen anderen Organismus, z. B. HGBV-B, spezifischen Teil enthalten. Diese (spezifischen) Teile können durch einen 1 bis 7 Nukleotide langen (gemeinsamen) Bereich getrennt sein. Die Organismen werden bevorzugt so gewählt, daß sie wahrscheinlich nicht in derselben Probe enthalten sind. Vorteile dieser Ausfuhrungsform sind, daß dieselben Primer für Nachweise von verschiedenen Organismen eingesetzt werden können und die Flexibilität der Auswahl größer ist.
In einer weiteren Ausführungsform findet die Herstellung der Amplifikate unter Einsatz von Nukleotiden, besonders bevorzugt Mononukleotiden, welche jeweils zu A, G, C und/oder T komplementär sind, statt. Bevorzugt enthält der Bereich B bzw. B' der nachzuweisenden Nukleinsäure alle 4 natürlichen Nukleobasen.
In einer weiteren Ausführungsform des neuartigen Verfahrens können Teilkomponenten (Primer oder Sonden) der verschiedenen Primer-Sonden-Kombinationen für die verschiedenen nachzuweisenden Nukleinsäuren identisch sein. Hierdurch wird die Bestimmung mehrerer Nukleinsäuretargets, z. B. für unterschiedliche Viren wie HBV, HTV und HCV mit einer einzigen Amplifikationsreaktion möglich (Multiplex). Ein technischer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß bei Mehrfachbestimmungen einer Probe ein hoher Grad an Übereinstimmung der Meßwerte erreicht wird.
Im folgenden sollen die beiden Aspekte der vorliegenden Erfindung anhand eines Nachweises für HCV beschrieben werden. Die Nukleinsäuresequenz von HCV ist beispielsweise in EP-B-0 318 216 beschrieben. Die Sequenzen der beteiligten Komponenten sind in Figur 4 gezeigt. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den hochspezifischen und hochsensitiven Nachweis von Virus-Nukleinsäuren wie z. B.
HCV-RNA aus der 5 '-nichttranslatierten Region des HC V-Genoms in einer Kopienzahl von 10 Kopien pro Test mit einem dynamischen Bereich von 105 bedingt durch ein verbessertes Signal-Rausch- Verhältnis. Dies ist insofern überraschend, da bei dem Test Primer und Sonden einsetzbar sind, die ein für den Fachmann nicht bevorzugtes Primer/Sonden-Design aufweisen, nämlich z. B. Sequenzabschnitte, die zur Primer- Dimer-Bildung neigen, oder Basenfehlpaarungen nahe dem 3 '-Ende. Die kurze Sonde hat einen Schmelzpunkt nahe der Testtemperatur, so daß der Fachmann keine stabile Bindung der Sonde an das Nukleinsäure- Vermehrungsprodukt erwartet hätte. Bei den bisherigen Tests mit den längeren, fünfteiligen Nukleinsäure-Vermehrungsprodukten wurde eine Spezifitäts- und Sensitivitätserhöhung bisher nicht über eine Verkürzung, sondern vielmehr eher über eine Verlängerung der Primer-Sonden-Sequenzen und/oder des Nukleinsäure- Vermehrungsprodukts mit den signalgebenden Komponenten versucht. Der Nachweis von HCV-RNA ist überraschenderweise trotz der kurzen vermehrten Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure auch spezifisch und reproduzierbar in positiven HCV-Plasmaproben möglich, in denen die HCV-RNA nicht sequenzspezifisch vorgereinigt wurde, sondern direkt aus lysierten und über Glasoberflächen aufkonzentrierten Plasmaproben eingesetzt wurde. HCV-negative Plasmaproben ergeben kein Signal. Dies ist insofern überraschend, als das HCV-RNA-Genom sehr labil ist gegenüber Fragmentierung in Plasma-Lysaten. Mit z. B. HlV-Plasmaproben, HBV-Serumproben, Chlamydiaproben aus Urin oder Human-DNA-Proben aus Vollblut, die ebenfalls über Glasoberflächen aufkonzentriert wurden, wird mit den eingesetzten Primern und Sonden ebenfalls kein Signal erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um einen oder mehrere der für den Stand der Technik geschilderten Nachteile zu vermeiden oder um einen oder mehrere der folgenden Vorteile zu realisieren. Die PCR-Zyklen können sehr viel kürzer sein. Die Gesamtzeit der Nachweisverfahren kann dadurch verkürzt werden. Die Sensitivität des Nachweises kann erhöht werden, da weniger Kompetition/Verdrängung zwischen dem kurzen Gegenstrang des Amplikons und der Detektorsonde stattfinden kann. Die Spezifität des Nachweises wird erhöht, da der relative Anteil der internen Detektorregion gegenüber der gesamten Amplikonlänge erhöht wird. Die Differenzier- barkeit von Subtypen kann erhöht werden. Der Nachweishintergrund kann gesenkt werden, da kurze Amplika weniger Potential für unspezifische Hybridisierung mit sich bringen. Aus diesem Grund kann das Signal-Rausch- Verhältnis erhöht werden. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse kann erhöht werden, da kleinere Targetregionen auf RNA-Genomen weniger sensitiv für RNA- Abbau sind. Die Möglichkeiten zur Ausbildung von Sekundärstrukturen werden reduziert.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert: AUgemeines
Alle verwendeten Oligonukleotide sind linear und einzelsträngig.
Beispiel 1
Nachweis von HCV aus menschlichem Blut
a) Probenvorbereitung:
Die RNA-Isolierung aus Plasma erfolgte anhand folgenden Probenvorbereitungsprotokolls:
I . Plasma (420 μl) mit 80 μl Proteinase K (25 mg/ml) mischen und einige Sekunden voitexen 2. Zugabe von 500 μl Lysepuffer (inkl. 1 μg Carrier-RNA (polyA)/ml): 5,4 M
Guanidinium-Thiocyanat; 10 mM Harnstoff; 10 mM Tris-HCl; 20 % Triton X I 00; pH 4,4
3. vortexen und anschließend 10 min bei RT schütteln
4. Zugabe von 500 μl Isopropanol-MGP (6 mg magnetische Glaspartikel in Isopropanol)
5. vortexen und anschließend 20 min bei RT schütteln
6. Magnetseparation der MGPs
7. Überstand abnehmen und verwerfen
8. Zugabe von 750 μl Waschpuffer: 20 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 70 % Ethanol
9. MGPs auf Vortex resuspendieren und erneute Magnetseparation
10. Waschvorgang insgesamt 5mal wiederholen
I I. Zugabe von 100 μl DEMC-Wasser zur Elution 12. 15 min bei 80 °C schütteln 13. Magnetseparation
14. 10 μl des Eluats in dei RT-PCR einsetzen
b) Klonierung und Präparation des RNA-Standards:
Der Wildtypstandard "pHCV-wt" wurde zunächst durch Amplifikation eines Abschnitts des HCV-Genoms mit den Primern KY80 (5 '- gcagaaagcgtctagccatggcgt-3 ', SEQ.ID.NO.l) und KY78 (5'- ctcgcaagcaccctatcaggcagt-3', SEQ.ID.NO.2) gewonnen und das Amplikon anschließend über eine sog. "blund-end"-Klonierung in den Vektor pBluescript SK+ kloniert. Nach Vermehrung der bakteriellen Zellen wurde das Plasmid isoliert, durch restriktionsenzymatischen Verdau linearisiert und über eine in-vitro-
Transkription das entsprechende RNA-Fragment gewonnen und aufgereinigt.
Die Quantifizierung der RNA erfolgte über photometrische Messung der Absorption bei 260 nm.
Alle hier beschriebenen molekularbiologischen Verfahren können einschlägigen Methodik-Büchern entnommen werden (e.g. Maniatis et al.; Ausubel et al.).
c) RT-PCR assay:
Die Amplifikation erfolgte mit den u.g. Reagentien und nach u.g. Cyclerprotokoll:
Reagentien Endkonzentration im Mastermix
5 x RT-PCR-Puffer l x
MnOAc 2,5 mM
Tth-Polym. 10 u dNTP-Mix 200 μM (dATP, dCTP, dGTP) / 600 μM (dUTP)
UNG 2u
Primer forw. HC2F 0.3 μM ( 5'-agtatgtgtgtcgtgcagcc-3', SEQ.ID.NO.3)
Primer rev. HClF-bio 0.3 μM ( 5'bio~tggctctcccgggagtgg-5', SEQ.ID.NO.4)
Die Amplifikation wurde nach folgendem Cyclerprotokoll durchgeführt: 10 min 37 °C Dekontamination durch UNG
30 min 60 °C reverse Transkription
1 min 95 °C Denaturierung
35 Zyklen:
15 sec 94 °C Denaturierung
20 sec 56 °C Primer- Annealing und Elongation
7 min 72 °C Elongation hold 50 °C
d) Detektion:
Die gesamte Detektionreaktion erfolgte vollautomatisiert an einem Elecsys® 1010-Analyse- Automaten (Boehringer Mannheim GmbH). Kurzbeschreibung:
1. Entnahme von 10 μl Amplifikat und 35 μl Denaturierungslösung (BM-Id-No. 1469053)
2. Inkubation in einem Reaktionsgefäß für 5 min bei 37 °C
3. Zugabe von 120 μl Hybridisierungslösung BM-Id-No. 146 9045 versetzt mit 25 ng/ml Ruthenium-markierter Sonde 4. Inkubation für 30 min bei 37 °C
5. Zugabe von 35 μl einer Elecsys® SA Magnetbeadlsg. (BM-Id-No. 171 9556)
6. Inkubation für 10 min bei 37 °C
7. Messung der Elekfrochemilumineszenz von 120 μl des Reaktionsgemisches in der Elecsys® 1010-Meßzelle
Zur Hybridisierung wurden zwei unterschiedliche Ruthenium-gelabelte Sonden verwendet:
PNA-Sonde: Ru-(Ser)2-TCCAGGACCC-Ser-Gly
DNA-Sonde: 5 '-Ru-CTCCAGGACCCC-3 ', SEQ.ID.NO.5
Beispiel 2
Ermittlung der analytischen Sensitivität anhand einer RNA-Standard- Verdünnungsreihe
Amplifiziert wurden in Doppelbestimmungen 10', 102, 103, 104 und 105 Kopien HCV- RNA-Standard. Als Kontrollen dienten ein HCV-negatives Plasma, ein HCV-positives Plasma (nach Probenvorbereitung) und Wasser. Nach Amplifikation wurden alle Proben gemessen (ECL-Detektion, Elecsys® 1010).
Ergebnis (Einheiten x 100):
• Die Verwendung der Primer HC2F/HC 1 F-bio führt zu einer sehr guten
Amplifikation in der RT-PCR, gemessen an dem Signalniveau: Hierbei wird der gesamte Detektionsbereich des Elecsys® ausgenutzt (ca. 5 log-Stufen).
• Es erfolgt eine sehr gute Signalabstufung innerhalb der Verdünnungsreihe
• Der Background, gemessen an HCV-negativem Plasma und Wasser, ist relativ gering
• Es ist sowohl die Verwendung von PNA als auch DNA als Sonde möglich Beispiel 3
Überprüfung der HCV-Assay-Spezifität
Hierzu wurden unterschiedliche Ausgangsnukleinsäuren (human-genomische DNA; HIV-RNA, HBV-DNA, Chlamydia-DNA) mit den o.g. Primern und Sonden getestet. Als Positiv-Kontrolle diente HCV-Plasma und als Negativ-Kontrolle HCV-Negativ- Plasma sowie Wasser.
Ergebnis (Einheiten x 100):
• Beide verwendeten Sonden (PNA, DNA) ergeben nur mit ihrem zugehörigen Analyten ein Signal in der ECL-Messung. Das bedeutet: Keine detektierbaren unspezifischen Amplifikationen mit den verwendeten Primern und Sonden. Beispiel 4
Überprüfung der Sonden-Spezifität
Für dieses Experiment wurden unterschiedliche Amplifikate anderer Analyten mit den jeweiligen spezifischen Primern hergestellt und dann gegen die o.g. PNA- und DNA- Sonden hybridisiert. Die Kontrolle der erfolgten Amplifikationen erfolgte mit der jeweiligen zugehörigen Analyt-Sonde.
Ergebnis (Einheiten x 100): (jeweils Mittelwert aus Doppelbestimmung)
• Die Kontrollreaktionen (HIV, HBV, Chlamydia) ergeben den deutlichen Nachweis von Amplifikat mit der entsprechenden Sonde.
• Die verwendeten PNA- sowie DNA-Sonden ergeben nur mit HCV ein spezifisches Signal.
• Es treten keine unspezifischen Hybridisierungen der PNA/DNA-Sonden mit anderen Amplifikaten auf. Beispiel 5
Nachweis von HCV mit alternativen Primern
In Fig. 8 ist eine weitere Kombination von Primern mit einer Fangsonde angegeben, die keine freien Nukleotide im überspannten Bereich enthält. Das Amplicon ist nur 51 Basen(paare) lang.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Schritte
- Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine Bindesequenz (A) eines Stranges der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine Bindesequenz C, die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'-Richtung von A gelegenen Sequenz C im wesentlichen komplementär ist, binden kann,
- Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an die zwischen den Sequenzen A und C gelegene Sequenz B oder das Komplement davon binden kann, und
- Nachweis der Bildung eines Hybrides aus einem Amplifikat und der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, daß die zwischen den Bindesequenzen A und C gelegene Sequenz keine Nukleotide enthält, die nicht dem aus der Bindesequenz D der Sonde und der hiervon gebundenen Sequenz des Amplifikats gebildeten Sequenzbereich E zugehören.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindesequenz D der Sonde mit einer oder beiden Bindesequenzen der Primer überlappt.
3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer an seinem nicht verlängerbaren Teil Nukleotide aufweist, die nicht direkt mit der nachzuweisenden Nukleinsäure oder ihrem
Komplement hybridisieren.
4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß mindestens eine der Bindesequenzen nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist.
5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtlänge der Bindesequenzen von dem von der Bindesequenz der Sonde wegweisenden Teil der Bindesequenz des einen Primers bis zu dem ebenfalls von der Bindesequenz der Probe wegweisenden Teil des anderen Primers kleiner ist als 100 Nukleotide.
6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer immobilisierbar und die Sonde nachweisbar markiert ist.
7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nachweisbar und die Sonde immobilisierbar markiert oder immobilisiert ist.
8. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde sowohl durch einen Fluoreszenzquencher als auch einen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.
9. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Primer durch eine erste Energietransferkomponente und die Sonde durch eine zweite, davon verschiedene Energietransferkomponente markiert ist.
10. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikat durch physikalische und/oder spektroskopische Methoden detektiert wird.
11. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß zwei der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch sind. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde nicht spezifisch ist für die nachzuweisende Nukleinsäure
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amplifikation jeweils zu A, G, C und T komplementäre Nukleotide eingesetzt werden
Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Schritte
- Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstucks dieser Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine Bindesequenz A der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine Bindesequenz C, die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3 '-Richtung von A gelegenen
Sequenz C komplementär ist, binden kann, und Nachweis der Amplifikate mittels Massenspektroskopie
Verfahren zum spezifischen Nachweis einer Nukleinsäure umfassend die Schritte
- Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstucks dieser Nukleinsäure mit Hilfe mindestens zweier Primer,
- Inkontaktbringen der Amplifikate mit einer Sonde, \\ eiche an das Amplifikat binden kann, und
- Nachweis der Bildung eines Hybrides aus dem Amplifikat und der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß zwei der Primer nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde nicht spezifisch ist für die nachzuweisende Nukleinsäure
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amplifikation jeweils zu A, G, C und T komplementäre Nukleotide eingesetzt werden.
EP98965652A 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren Ceased EP1029083A2 (de)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19748690 1997-11-04
DE19748690A DE19748690A1 (de) 1997-11-04 1997-11-04 Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
DE19814001A DE19814001A1 (de) 1998-03-28 1998-03-28 Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
DE19814001 1998-03-28
DE19814828 1998-04-02
DE19814828A DE19814828A1 (de) 1998-04-02 1998-04-02 Spezifisches und sensitives Nukleinsäurenachweisverfahren
PCT/EP1998/006951 WO1999024606A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1029083A2 true EP1029083A2 (de) 2000-08-23

Family

ID=27217887

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98965652A Ceased EP1029083A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren
EP98955529A Ceased EP1029077A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und empfindliches nukleinsäurenachweisverfahren
EP98965653A Withdrawn EP1029084A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98955529A Ceased EP1029077A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und empfindliches nukleinsäurenachweisverfahren
EP98965653A Withdrawn EP1029084A2 (de) 1997-11-04 1998-11-03 Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren

Country Status (6)

Country Link
US (1) US7105318B2 (de)
EP (3) EP1029083A2 (de)
JP (3) JP2002509694A (de)
AU (3) AU1232099A (de)
CA (3) CA2308368C (de)
WO (3) WO1999023249A2 (de)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7569342B2 (en) 1997-12-10 2009-08-04 Sierra Molecular Corp. Removal of molecular assay interferences
PT1038022E (pt) * 1997-12-12 2005-11-30 Digene Corp Avaliacao de doencas relacionadas com o virus papiloma humano
US6361942B1 (en) 1998-03-24 2002-03-26 Boston Probes, Inc. Method, kits and compositions pertaining to detection complexes
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7807802B2 (en) 2002-11-12 2010-10-05 Abbott Lab Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
US8198027B2 (en) 2006-12-21 2012-06-12 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
JP2010521156A (ja) * 2007-03-16 2010-06-24 ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法
GB0714389D0 (en) 2007-07-21 2007-09-05 Barry Callebaut Ag Process and product
EP2262911B1 (de) * 2008-04-17 2016-10-12 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Zusammensetzungen, verfahren und kits mit synthetischen sonden zum nachweis der anwesenheit einer target-nukleinsäure
JP2012506705A (ja) 2008-10-27 2012-03-22 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 迅速に結果を得るハイブリッドキャプチャー法による分析およびシステム
CA2750338C (en) * 2009-01-28 2019-06-25 Qiagen Gaithersburg, Inc. Sequence-specific large volume sample preparation method and assay
CN102414327B (zh) * 2009-05-01 2015-04-08 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 用于在样品中检测rna剪接形式的非靶向扩增方法
EP2449132B1 (de) 2009-07-01 2015-05-13 Gen-Probe Incorporated Verfahren und zusammensetzungen zur erweiterung von nukleinsäuren
WO2011032124A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
JP6103941B2 (ja) 2010-01-29 2017-03-29 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物
JP2013517803A (ja) 2010-01-29 2013-05-20 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド サンプル中のｈｐｖの存在を決定および確認する方法
CA2799200A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
US9376727B2 (en) 2010-05-25 2016-06-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes
WO2012116220A2 (en) 2011-02-24 2012-08-30 Qiagen Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acid
JP2024097096A (ja) * 2021-04-28 2024-07-18 バイオニクス株式会社 光学測定装置

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5453355A (en) * 1990-01-26 1995-09-26 Abbott Laboratories Oligonucleotides and methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
US5200313A (en) 1983-08-05 1993-04-06 Miles Inc. Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
ES286841Y (es) 1985-05-20 1988-10-01 Vileda Gmbh Dispositivo de acoplamiento de un mango a un util de limpieza
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5639871A (en) * 1988-09-09 1997-06-17 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction
EP0731175A3 (de) 1989-07-11 2004-05-26 Gen-Probe Incorporated Oligonukleotid-Sonden für Nukleinsäure von HIV
NL9000134A (nl) * 1990-01-19 1991-08-16 Stichting Res Fonds Pathologie Primers en werkwijze voor het detecteren van humaan papilloma virus genotypen m.b.v. pcr.
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
CA2108466C (en) * 1991-05-08 2007-07-10 Tai-An Cha Hcv genomic sequences for diagnostics and therapeutics
PT787807E (pt) 1991-08-27 2003-08-29 Hoffmann La Roche Iniciadores e sondas para a deteccao da hepatite c
JPH05308999A (ja) * 1992-05-08 1993-11-22 Sumitomo Metal Ind Ltd Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ−Ｃ変異の判定法
WO1994003635A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Institute Of Molecular Biology & Biotechnology Rapid amplification and detection of nucleic acids
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
EP0785996A1 (de) * 1993-07-13 1997-07-30 Abbott Laboratories Nukleotid sequenzen und verfahren zur vervielfältigung und bestimmung von hepatitus-b-virus
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
AT406019B (de) * 1995-05-08 2000-01-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines arzneimittels enthaltend ein oder mehrere plasmaderivate
US5882857A (en) 1995-06-07 1999-03-16 Behringwerke Ag Internal positive controls for nucleic acid amplification
US6174670B1 (en) 1996-06-04 2001-01-16 University Of Utah Research Foundation Monitoring amplification of DNA during PCR
US5858671A (en) 1996-11-01 1999-01-12 The University Of Iowa Research Foundation Iterative and regenerative DNA sequencing method
US6333179B1 (en) * 1997-06-20 2001-12-25 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for multiplex amplification of nucleic acids
DE69942444D1 (de) 1998-02-04 2010-07-15 Life Technologies Corp Bestimmung des genotyps eines amplifikationsproduktes an mehreren allelen stellen
US5948648A (en) 1998-05-29 1999-09-07 Khan; Shaheer H. Nucleotide compounds including a rigid linker

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5453355A (en) * 1990-01-26 1995-09-26 Abbott Laboratories Oligonucleotides and methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MORRIS T.; ROBERTSON B.; GALLAGHER M.: "RAPID REVERSE TRANSCRIPTION-PCR DETECTION OF HEPATITIS C VIRUS RNA IN SERUM BY USING THE TAQMAN FLUOROGENIC DETECTION SYSTEM", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 34, no. 12, 1996, pages 2933 - 2936, XP001052728 *
TYAGI; KRAMER: "Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridisation", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 14, 1996, pages 303 - 308, XP002926498 *
WHITBY; GARSON: "Optimisatin and evaluation of a quantitative chemiluminescent polymerase chain reaction assay for hepatitis C virus RNA", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 51, 1995, pages 75 - 88 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999024606A3 (de) 1999-07-22
JP2002505071A (ja) 2002-02-19
JP2002509694A (ja) 2002-04-02
WO1999024606A2 (de) 1999-05-20
EP1029084A2 (de) 2000-08-23
JP2001521765A (ja) 2001-11-13
EP1029077A2 (de) 2000-08-23
AU741141B2 (en) 2001-11-22
CA2312779A1 (en) 1999-05-20
US7105318B2 (en) 2006-09-12
AU1232099A (en) 1999-05-24
CA2308762A1 (en) 1999-05-14
AU2152199A (en) 1999-05-24
CA2308368A1 (en) 1999-05-14
WO1999023249A2 (de) 1999-05-14
CA2308368C (en) 2009-01-20
US20030175765A1 (en) 2003-09-18
AU2152099A (en) 1999-05-31
WO1999023250A3 (de) 1999-07-22
WO1999023250A2 (de) 1999-05-14
WO1999023249A3 (de) 1999-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1029083A2 (de) Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren
DE69736667T2 (de) Verfahren zum nachweis und amplifikation von nukleinsäuresequenzen unter verbrauch von modifizierten oligonukleotiden mit erhöhter zielschmelztemperatur (tm)
DE69133574T2 (de) Verfahren zur Unterscheidung von Sequenz Varianten
DE69512003T2 (de) Oligonukleotid verwendbar als Primer in einem Amplifikationsverfahren auf der Basis einer Strangverdrängungsreplikation
DE3885027T2 (de) Amplifikationsverfahren zum Nachweis von Polynukleotide.
DE69829328T2 (de) Strangverdrängungsamplifikation von RNA
DE69028325T2 (de) Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines Einzelprimers
DE69836012T2 (de) Zwei-schritt hybridisierung und einfang von einem polynukleotid
DE69836587T2 (de) Nukleinsäuresammlung
DE69627408T2 (de) Primers und Sonden zum Nachweis von HIV
DE69223755T2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotids zum Gebrauch in "single-primer" Amplifizierung und Phosphorothioat-enthaltende Oligonukleotide als Primer in Nukleinsäureamplifizierung
DE69213112T2 (de) Verbesserte Methoden zur Nukleinsäure-Amplifizierung
DE69531542T2 (de) Ligase/polymerase-vermittelte analyse genetischer elemente von einzelnukleotid-polymorphismen und ihre verwendung in der genetischen analyse
DE69620903T2 (de) Nachweiss von nukleinsäuren durch bildung von template abhängigen produkt
DE69633941T2 (de) Nachweis von unterschieden in nukleinsäuren
DE68926504T2 (de) Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
DE69523360T2 (de) Isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren durch Strangverdrängung
DE69528670T2 (de) Nachweis von nukleinsäuren durch nuklease-katalysierte produktbildung
DE69434688T2 (de) Diagnostischer nachweis von rna und reagentiensätze unter verwendung binärer rna proben und einer rna-abhängigen rna ligase
DE60033825T2 (de) Detektion von unterschieden in nukleinsäuren durch inhibierung spontaner dna verzweigungsmigration
EP0718408A2 (de) Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
DE69737628T2 (de) Nukleinsäureprimer und -sonden zur detektion onkogener humaner papillomaviren
DE69029740T2 (de) Neues verfahren zum nachweis einer spezifischen nukleinsäuresequenz in einer zellprobe
DE69836395T2 (de) Primern zum Nachweis von HIV-1
DE60309817T2 (de) Mehrzweck-Primer und -Sonden für verbesserte Hybridisierungsassays durch Zerstörung von Sekundärstrukturen

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20000605

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB IE IT LI LU NL SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 20021021

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN REFUSED

18R Application refused

Effective date: 20060508