DE69028325T2 - Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines Einzelprimers - Google Patents
Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines EinzelprimersInfo
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- Die Nukleinsäurehybridisierung ist zur Identitätsaufklärung und zum Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuren eingesetzt worden. Hybridisierung beruht auf komplementärer Basenpaarung. Wenn komplementäre einzelsträngige Nukleinsäuren zusammen inkubiert werden, paaren die komplementären Basensequenzen, um doppeistrangige Hybridmoleküle zu bilden. Das Vermögen von einzelstrangiger Desoxyribonukleinsäure (ssDNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) zur Bildung einer Wasserstoffgebundenen Struktur mit einer komplementären Nukleinsäuresequenz ist als analytisches Werkzeug in der molekularbiologischen Forschung eingesetzt worden. Die Verfügbarkeit von radioaktiven Nukleosidtriphosphaten hoher spezifischer Aktivität und die ³²P-Markierung von DNA mit T4-Kinase hat es möglich gemacht, verschiedene Nukleinsäuresequenzen von biologischem Interesse zu identifizieren, isolieren und charakterisieren. Die Nukleinsäurehybridisierung besitzt ein großes Potential bei der Diagnose von Krankheitszuständen, die mit einzigartigen Nukleinsäuresequenzen assoziiert sind. Diese einzigartigen Nukleinsäuresequenzen können resultieren aus genetischer oder umweltbedingter Veränderung in der DNA durch Insertionen, Deletionen, Punktmutationen oder durch den Erwerb fremder DNA oder RNA mittels Infektion durch Bakterien, Schleimpilze, Pilze und Viren. Die Nukleinsäurehybridisierung ist bisher hauptsächlich in molekularbiologischen Laboratorien der Hochschulen und Industrie eingesetzt worden. Die Anwendung der Nukleinsäurehybridisierung als diagnostisches Werkzeug in der klinischen Medizin ist beschränkt aufgrund der häufig sehr geringen Konzentrationen an krankheitsbezogener DNA oder RNA, die in der Körperflüssigkeit eines Patienten vorhanden sind, und der mangelnden Verfügbarkeit eines ausreichend empfindlichen Verfahrens zur Nukleinsäurehybridisierungs- Analyse.
- Gegenwärtige Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen beinhalten im allgemeinen die Immobilisierung der Target- Nukleinsäure auf einem festen Träger wie Nitrocellulosepapier, Cellulosepapier, diazotiertem Papier oder einer Nylonmembran. Nach der Fixierung der Target-Nukleinsäure auf dem Träger wird der Träger mit einer geeignet markierten Sonden-Nukleinsäure für etwa 2 bis 48 Stunden in Kontakt gebracht. Nach der obigen Zeitspanne wird der feste Träger mehrmals bei kontrollierter Temperatur gewaschen, um die unhybridisierte Sonde zu entfernen. Der Träger wird dann getrocknet und das hybridisierte Material durch Autoradiographie oder durch spektrometrische Methoden nachgewiesen.
- Wenn es erforderlich ist, sehr geringe Konzentrationen nachzuweisen, sind die gegenwärtigen Verfahren langsam und arbeitsaufwendig und nicht-isotopische Markierungen, die weniger leicht als radioaktive Markierungen nachgewiesen werden, sind häufig nicht verwendbar. Ein Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit, um die Verwendung einfacher, schneller, nicht-isotopischer, homogener oder heterogener Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen zu erlauben, ist deshalb wünschenswert.
- Kürzlich wurde ein Verfahren für die enzymatische Amplifizierung von spezifischen DNA-Segmenten beschrieben, welches als das Polymerase- Kettenreaktions (PCR)-Verfahren bekannt ist. Dieses in vitro Amplifizierungsverfahren basiert auf wiederholten Zyklen von Denaturierung, Oligonukleotid-Primerverschmelzung und Primerverlängerung durch thermophile Polymerase, wodurch sich eine exponentielle Zunahme an Kopien der von den Primern flankierten Region ergibt. Die PCR-Primer, die mit entgegengesetzten Strängen der DNA verschmelzen, sind so lokalisiert, daß das Polymerasekatalysierte Verlängerungsprodukt eines Primers als Matrizenstrang für den anderen dienen kann, was zur Anhäufung eines diskreten Fragments führt, dessen Länge durch die Entfernung zwischen den 5'- Enden der Oligonukleotid-Primer definiert ist.
- Ein Verfahren zum Amplifizieren, Nachweisen und/oder Klonieren von Nukleinsäuresequenzen ist in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 offenbart. Die Sequenzpolymerisation durch Polymerase- Kettenreaktion ist von Saiki et al., (1986) Science, 230: 1350- 1354, beschrieben worden. Ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotids ist in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0194545 A2 beschrieben. Die belgische Patentanmeldung Nr. BE 904402 offenbart einen Schleimpilz zur Herstellung von Sonden zum DNA-Nachweis. Die Gen-Amplifizierung in eukaryotischen Zellen ist im US-Patent Nr. 4, 656, 134 offenbart.
- Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1981) 78: 6633-6637, offenbaren die enzymatische Synthese von Biotin-markierten Polynukleotiden und den Einsatz dieser Materialien als neue Nukleinsäure- Affinitätssonden. Der Nachweis von viralen Genomen in kultivierten Zellen und in Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten unter Verwendung von Biotin-markierten Hybridisierungssonden wird von Brigati et al., Virology (1983) 126 32-50, erörtert. Das US-Patent Nr. 4,486,539 offenbart den Nachweis von mikrobiellen Nukleinsäuren durch einen einstuf igen Sandwich-Hybridisierungstest. Empfindliche Tests für maligne Krankheitszustände, die auf DNA-Nachweis beruhen, werden im US-Patent Nr. 4,490,472 beschrieben. Das US-Patent Nr. 4,480,040 offenbart die empfindliche und schnelle Diagnose von Pflanzenviroid- Krankheiten und Viren unter Einsatz von radioaktiv markierter DNA, welche komplementär zu dem Viroid oder der Nukleinsäure des zu diagnostizierenden Virus ist.
- EP-A-97373 (Priorität der US-Patentanmeldung 391,440, eingereicht am 23. Juni 1982) lehrt modifizierte markierte Nukleotide und Polynukleotide und Verfahren zur Herstellung, Verwendung und zum Nachweis derselben. Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis und zur Bestimmung von zellulärer DNA sind im US-Patent Nr. 4,423,153 offenbart. Spezifische DNA-Sonden in der diagnostischen Mikrobiologie werden im US-Patent Nr. 4,358,535 erörtert. Ein Verfahren zum Nachweis von polymorphen Restriktionsstellen und Nukleinsäuresequenzen wird in der europäischen Patentanmeldung Nr.0164054 A1 erörtert. Das US-Patent 4,663,283 beschreibt ein Verfahren zur Veränderung doppelsträngiger DNA.
- Eine genomische Amplifizierung mit Transkript-Sequenzierung wird von Stoflet et al., Science (1988) 239:491, erörtert. Eine Primergesteuerte enzymatische Amplifizierung von DNA mit einer thermostabilen DNA-Polymerase wird von Saiki et al., Science (1988) 239:487, beschrieben. Das US-Patent Nr. 4,724,202 offenbart die Verwendung von nicht-hybridisierbaren Nukleinsäuren zum Nachweis von Nukleinsäurehybridisierung. Bugawan et al. beschreiben die Verwendung von nicht-radioaktiven Oligonukleotid-Sonden zur Analyse von enzymatisch amplifizierter DNA für die pränatale Diagnose und gerichtsmedizinische HLA-Typenbestimmung.
- Der Nachweis und die Isolierung von homologen, wiederholten und amplifizierten Nukleinsäuresequenzen wird im US-Patent Nr. 4,675,283 offenbart. Eine einzelsträngige selbsthybridisierende Nukleinsäure- Sonde, die imstande ist, wiederholt mit sich selbst oder anderen Nukleinsäuren unter Bildung einer amplifizierten Einheit zu hybridisieren, wird in der US-Patentanmeldung Nr. 888,058, eingereicht am 22.7.86 (US 6,888,058-A) beschrieben. Die US-Patente Nr.4,683,195 und 4,683,202 offenbaren einen homogenen Polynukleotid- Verdrängungsassay mit Verdauung des verdrängten einzelstrangigen RNA-Polynukleotids aus dem Reagenz-Komplex und Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen durch Behandlung separater komplementärer Stränge der Nukleinsäure mit zwei Oligonukleotid-Primern. Die europäische Patentanmeldung Nr.0200362 beschreibt ein Verfahren zum Amplifizieren, Nachweisen oder Klonieren von Nukleinsäuresequenzen, das zur Diagnose von Krankheiten und zur Herstellung von Transformationsvektoren geeignet ist. Ein Verfahren zur einfachen Analyse von relativen Nukleinsäureniveaus in mehrfachen kleinen Proben durch cytoplasmatische "Dot"-Hybridisierung wird im US- Patent Nr. 4,677,054 beschrieben. Ein Hybridisierungsverfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen mit einer Sonde, die ein Thionukleotid enthält, wird im US-Patent Nr.4,647,529 beschrieben.
- Ein einfaches und effizientes enzymatisches Verfahren zur kovalenten Verknüpfung von DNA mit Cellulose und dessen Anwendung für die Hybridisierungs-Restriktionsanalyse und für die in vitro-Synthese von DNA-Sonden wird in Nucleic Acids Research (1986) 14: 9171-9191 beschrieben. Die Spaltung von einzelsträngigen Oligonukleotiden durch die Restriktionsendonuklease EcoRI wird in Nucleic Acids Research (1987) 15: 709-716 beschrieben.
- Die exponentielle Amplifizierung von rekombinante-RNA-Hybridisierungs-Sonden wird von Lizardi et al., (1988) Bio/Technology 6:1197- 1202, beschrieben. Fahrlander et al. erörtern "Amplifying DNA Probe Signals: A Christmas Tree Approach" in Bio/Technology (1988) 6:1165- 1168.
- Ein Nukleinsäurehybridisierungs-Assay unter Einsatz von Sonden, die mit Target-Sequenzen vernetzbar sind, wird im US-Patent Nr.4,599,303 beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Herstellung eines spezifischen einzelsträngigen Ribonukleinsäure- oder Desoxyribonukleinsäuremoleküls, in das ein bifunktionelles vernetzendes Molekül kovalent inkorporiert wurde. Die Inkorporierung ist derart, daß das vernetzende Molekül die Kapazität behält, eine zweite Reaktion mit der Nukleinsäure des bakteriellen, viralen oder Säuger-Genoms einzugehen, welche das Target für die Sonde ist, um eine kovalente Vernetzung zu bilden. Nach der Vernetzung wird die nicht vernetzte Sonde von kovalent vernetztem Sonden-Target-Komplex unter Anwendung eines von mehreren Verfahren abgetrennt, die zwischen einzelsträngiger Sonde und doppelsträngigem, kovalent verknüpftem Sonden- Target-Komplex unterscheiden.
- Der Nachweis von Target-Sequenzen in Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit Hilfe diagnostischer und angrenzender Sonden zur Diagnose von Krankheiten genetischer Anomalität, insbesondere in einem automatisierten Verfahren, wird in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0185494 A2 beschrieben. In diesem Verfahren wird eine Probe mit einer Sonde, die komplementär zu einem diagnostischen Abschnitt der Target-Sequenz ist, (der diagnostischen Sonde) und mit einer Sonde, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz ist, die an den diagnostischen Abschnitt angrenzt, (der angrenzenden Sonde) unter Bedingungen hybridisiert, unter denen die diagnostische Sonde im wesentlichen nur an die Proben-Nukleinsäure gebunden bleibt, welche die Target-Sequenz enthält. Die diagnostische Sonde und angrenzende Sonde werden dann kovalent verknüpft, um eine Target-Sonde zu ergeben, welche komplementär zu der Target-Sequenz ist, und die nicht verknüpften Sonden werden entfernt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine der Sonden markiert, so daß die Anwesenheit oder Abwesenheit der Target-Sequenz durch Schmelzen des Proben-Nukleinsäure-Target-Sonden-Duplexes, Eluieren der dissozuerten Target- Sonde und Überprüfung hinsichtlich der Markierung getestet werden kann.
- Das obige Verfahren leidet mindestens unter dem einen Nachteil, daß aneinander angrenzende Sequenzen erforderlich sind. Zur Durchführung des Verfahrens müssen die diagnostische Sequenz und die angrenzende Sequenz identifiziert werden und diagnostische und angrenzende Sonden, die komplementär zu den obigen Sequenzen sind, erzeugt werden. Werden die diagnostischen und angrenzenden Sequenzen nicht präzise identifiziert, könnten die diagnostischen und angrenzenden Sonden nicht ausreichend hybridisieren und die Spezifität und Empfindlichkeit des Assays kann verlorengehen oder wesentlich verringert werden.
- Die hier offenbarte Erfindung umfaßt Verfahren und Reagenzien zur Herstellung mehrfacher Kopien eines einzelsträngigen Polynukleotids, wobei ein einzelner Polynukleotid-Primer eingesetzt wird. Als Ergebnis sind die Anzahl der Reagenzien und Assay-Schritte gegenüber bekannten Verfahren verringert.
- In einer Ausführungsform der Erfindung wird mindestens eine Kopie eines einzelsträngigen Polynukleotids durch ein Verfahren hergestellt, welches umfaßt: (a) die Bildung in Gegenwart von Nukleosid- Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase entlang des einzelstrangigen Polynukleotids einer Verlängerung eines Polynukleotid-Primers, bei dem mindestens dessen 3'-Ende eine Sequenz von mindestens 10 Basen aufweist, die mit einer zweiten flankierenden Sequenz am 3'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids hybridisierbar ist, wobei die zweite flankierende Sequenz teilweise oder vollständig komplementär zu einer ersten flankierenden Sequenz von mindestens 10 Basen am 5'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids ist, (b) die Dissoziation des verlängerten Polynukleotid-Primers und des einzelsträngigen Polynukleotids und (c) die Wiederholung von Schritt (a).
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Herstellung von mehrfachen Kopien einer Polynukleotidsequenz. Das Verfahren umfaßt die Bereitstellung in Kombination von (1) einem einzelsträngigen Polynukleotid, welches die Polynukleotidsequenz aufweist und an jedem Ende von teilweise oder vollständig komplementären ersten und zweiten flankierenden Sequenzen flankiert ist, (2) einem Polynukleotid-Primer, bei dem ein Abschnitt von mindestens 10 Basen an dessen 3'-Ende mit demjenigen Mitglied der ersten und zweiten Flankierungssequenzen hybridisierbar ist, das sich am 3'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids befindet, (3) Nukleosid-Triphosphaten, und (4) Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Poly merase. Die Kombination wird unter Bedingungen inkubiert, um entweder ganz oder teilweise sequentiell oder gleichzeitig (1) das einzelsträngige Polynukleotid von etwaiger komplementärer Sequenz, mit der es hybridisiert ist, zu dissoziieren, (2) den Polynukleotid- Primer mit der flankierenden Sequenz am 3'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids zu hybridisieren, (3) den Polynukleotid-Primer entlang des einzelstrangigen Polynukleotids zu verlängern, um einen ersten verlängerten Polynukleotid-Primer bereitzustellen, (4) den ersten verlängerten Polynukleotid-Primer und das einzelsträngige Polynukleotid zu dissoziieren, (5) den ersten verlängerten Polynukleotid- Primer mit dem Polynukleotid-Primer zu hybridisieren, (6) den Polynukleotid-Primer entlang des ersten verlängerten Polynukleotid- Primers zu verlängern, um einen zweiten verlängerten Polynukleotid- Primer bereitzustellen, (7) den zweiten verlängerten Polynukleotid- Primer von dem ersten verlängerten Polynukleotid-Primer zu dissoziieren, und (8) die Schritte (5)-(7) zu wiederholen.
- Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Herstellung mehrfacher Kopien einer Polynukleotidsequenz in einem Polynukleotid, worin die Sequenz an jedem Ende von einem anderen Mitglied eines Paars von flankierenden Sequenzen flankiert wird, die teilweise oder vollständig komplementär zueinander sind. Das Verfahren umfaßt (a) das Kombinieren des Polynukleotids mit einem einzelnen Polynukleotid-Primer, der mindestens eine terminale Sequenz an seinem 3'-Ende aufweist, die zu mindestens einem Abschnitt des Mitglieds des Paars von flankierenden Sequenzen am 3'-Ende der Polynukleotidsequenz mindestens teilweise komplementär und damit hybridisierbar ist, Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid- Polymerase. Die Kombination wird unter Bedingungen inkubiert, um entweder ganz oder teilweise sequentiell oder gleichzeitig (1) die Polynukleotidsequenz von etwaiger Sequenz, mit der sie hybridisiert ist, zu dissoziieren, um ein einzelsträngiges Polynukleotid bereitzustellen, (2) den Polynukleotid-Primer mit der flankierenden Sequenz am 3'Ende des einzelsträngigen Polynukleotids zu hybridisieren, (3) den Polynukleotid-Primer entlang des einzelsträngigen Polynukleotids zu verlängern, um einen verlängerten Polynukleotid-Primer bereitzustellen, (4) den ersten verlängerten Polynukleotid-Primer und das einzelstrangige Polynukleotid zu dissoziieren, (5) den ersten verlängerten Polynukleotid-Primer mit dem Polynukleotid-Primer zu hybridisieren, (6) den Polynukleotid- Primer entlang des ersten verlängerten Polynukleotid-Primers zu verlängern, um einen zweiten verlängerten Polynukleotid-Primer bereitzustellen, (7) den zweiten verlängerten Primer von dem ersten verlängerten Polynukleotid-Primer zu dissoziieren, und (8) die obigen Schritte (5)-(7) zu wiederholen.
- Die obigen Verfahren finden Anwendung, um die Bestimmung der Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe zu erleichtern, von der angenommen wird, daß sie einen solchen Polynukleotid-Analyten enthält. Die Target-Polynukleotidsequenz kann DNA oder RNA sein.
- In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfaßt das Verfahren die Schritte:
- (a) (i) Bildung in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase entlang eines ersten einzelsträngigen Polynukleotids einer Verlängerung des Analyten oder eines Fragments davon (verlängerter Polynukleotid-Analyt), bei dem mindestens dessen 3'-Ende eine Basensequenz aufweist, welche mit einer zweiten flankierenden Sequenz hybridisierbar ist, die mit dem 3'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids verknüpft ist, wobei die zweite flankierenden Sequenz mindestens teilweise komplementär zu einer ersten flankierenden Basensequenz ist, die mit dem 5'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids verknüpft ist, um doppelsträngiges Polynukleotid zu bilden;
- (a) (ii) Dissoziation des einzelsträngigen verlängerten Poly nukleotid-Analyten von dem Polynukleotid;
- (b) Bildung mehrfachen Kopien des einzelsträngigen Polynukleotids und der flankierenden Sequenzen nach dem Verfahren von Anspruch 1, und
- (c) Nachweis des einzelsträngigen Polynukleotids.
- Es kann jedes Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren oder Polynukleotide eingesetzt werden. Mehrfache Kopien des einzelsträngigen Polynukleotids können beispielsweise nach irgendeinem der vorgenannten Verfahren hergestellt werden.
- Der obige Schritt (a) kann die Schritte umfassen:
- (i) Bildung in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase entlang eines ersten einzelsträngigen Polynukleotids einer Verlängerung des Analyten oder eines Fragments davon (verlängerter Polynukleotid-Analyt), um doppelsträngiges Polynukleotid 1 zu bilden,
- (ii) Dissoziation des einzelsträngigen verlängerten Polynukleotid-Analyten von dem Polynukleotid 1,
- (iii) Bildung in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleosid-Polymerase entlang des einzelsträngigen verlängerten Polynukleotid-Analyten einer Verlängerung eines ersten Polynukleotid-Primers, bei dem mindestens dessen 3'- Ende eine Sequenz von mindestens 10 Basen aufweist, die mit mindestens einem Abschnitt des einzelsträngigen verlängerten Polynukleotid-Analyten hybridisierbar ist, um doppelsträngiges Polynukleotid 2 zu bilden,
- (iv) Dissoziation des einzelsträngigen verlängerten ersten Polynukleotid-Primers von dem Polynukleotid 2,
- (v) Bildung in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase entlang eines zweiten Polynukleotid-Primers einer Verlängerung des einzelsträngigen verlängerten ersten Polynukleotid-Primers, wobei mindestens das 3'- Ende des zweiten Polynukleotid-Primers eine Sequenz von mindestens 10 Basen aufweist, die mit mindestens einem Abschnitt des einzelsträngigen verlängerten ersten Polynukleotid-Primers hybridisierbar ist, um doppelsträngiges Polynukleotid 3 zu bilden, wobei das 3'- Ende und das 5'-Ende des einzelsträngigen, zweimal verlängerten ersten Polynukleotid-Primers jeweils Sequenzen von 10 Basen aufweisen, welche Sequenzen mindestens teilweise komplementär sind, und
- (vi) Dissoziation des einzelsträngigen, zweimal verlängerten ersten Polynukleotid-Primers von dem Polynukleotid 3;
- während Schritt (b) die Schritte umfassen kann:
- (i) Bildung in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase entlang des einzelsträngigen, zweimal verlängerten ersten Polynukleotid-Primers einer Verlängerung des ersten Polynukleotid-Primers, um doppelsträngiges Polynukleotid 4 zu bilden,
- (ii) Dissoziation des einzelsträngigen verlängerten ersten Polynukleotid-Primers von dem Polynukleotid 4, und
- (iii) Wiederholung von Schritt (i).
- Siehe Beispiel 2 für Einzelheiten.
- In einem speziellen Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, wird ein einzelsträngiges Polynukleotid, das von mindestens zu 80% komplementären ersten und zweiten flankierenden Sequenzen flankiert ist, wobei jede mindestens 15 Basen umfaßt, als Ergebnis der Anwesenheit des Analyten gebildet. In Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase wird eine Verlängerung eines Polynukleotid- Primers gebildet, bei dem mindestens dessen 3'-Ende mit der zweiten Sequenz am 3'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids hybridisieren kann. Es wird dann verlängerter Polynukleotid-Primer, der eine Sequenz enthält, die mit dem einzelsträngigen Polynukleotid identisch und/oder dazu komplementär ist, nachgewiesen, dessen Anwesenheit die Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten anzeigt.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein analytisches Verfahren, welches umfaßt das Kontaktieren einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, mit ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden. Die erste Sonde umfaßt eine Sequenz an ihrem 3'-Ende, die komplementär zu einem ersten Abschnitt eines Stranges des Analyten ist, und eine erste flankierende Sequenz. Die zweite Sonde umfaßt eine Sequenz an ihrem 5'-Ende, die komplementär zu einem zweiten Abschnitt desselben Stranges des Analyten ist, und eine zweite flankierende Sequenz. Die ersten und zweiten flankierenden Sequenzen sind teilweise oder vollständig komplementär. Der Kontakt wird unter Bedingungen durchgeführt, um die ersten und zweiten Sonden an den Analyten zu binden. Es werden Bedingungen bereitgestellt, um die ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden nur miteinander zu ligieren, wenn sie an den Analyten gebunden sind. Eine Verlängerung eines Polynukleotid-Primers, bei dem mindestens dessen 3'-Ende mit der flankierenden Sequenz hybridisieren kann, wird in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase gebildet. Es wird verlängerter Polynukleotid-Primer, der eine zur ersten Sonde komplementäre Sequenz enthält, nachgewiesen, und dessen Anwesenheit zeigt die Anwesenheit des Analyten an.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält. Das Verfahren umfaßt die Schritte der (a) Ligierung dritter und vierter Sequenzen einer Polynukleotid-Sonde, wobei die dritte Sequenz ein freies 3'-Ende aufweist und die vierte Sequenz ein freies 5'-Ende aufweist und jede mit separaten Abschnitten des Analyten hybridisierbar ist und nur in Gegenwart des Analyten ligierbar ist oder imstande ist, ligierbar gemacht zu werden, wobei die Polynukleotid-Sonde weiter erste und zweite flankierende Sequenzen umfaßt, wobei die erste Sequenz 5' von der dritten Sequenz liegt, die zweite Sequenz 5' von der ersten Sequenz liegt und die vierte Sequenz 5' von der zweiten Sequenz liegt,
- (b) Bildung in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizenabhängiger Polynukleotid-Polymerase einer Verlängerung eines Polynukleotid-Primers, bei dem mindestens dessen 3'-Ende mit der zweiten flankierenden Sequenz der Polynukleotid-Sonde hybridisieren kann, und des Nachweises von verlängertem Polynukleotid-Primer, der eine Sequenz enthält, die identisch mit und/oder komplementär zu mindestens demjenigen Abschnitt der ligierten dritten oder vierten Sequenzen ist, der komplementär zu den separaten Abschnitten des Analyten ist.
- Ein weiteres analytisches Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Kontaktieren einer Probe, von der angenommen wird, daß sie einen Analyten enthält, mit ersten und zweiten Polynukleotid- Sonden. Die erste Sonde umfaßt (1) eine erste flankierende Sequenz, die teilweise oder vollständig komplementär zu einer zweiten flankierenden Sequenz in der zweiten Sonde ist, und (2) eine Sequenz, die komplementär ist zu einem anderen Abschnitt des Analyten als ein Abschnitt, der teilweise oder vollständig komplementär zu der zweiten Sonde ist. Die ersten und zweiten Sonden sind nur miteinander ligierbar, oder imstande, ligierbar gemacht zu werden, wenn sie an den Analyten gebunden sind. Das Verfahren umfaßt ferner die Bildung in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase einer Verlängerung eines Polynukleotid- Primers, bei dem mindestens ein Abschnitt mit der flankierenden Sequenz derjenigen Sonde hybridisiert werden kann, welche mit dem 3'-Ende der anderen Sonde ligiert ist. Anschließend werden verlängerter Polynukleotid-Primer und/oder ligierte erste und zweite Polynukleot id-Sonden nachgewiesen.
- Das vorliegende Verfahren erlaubt die Herstellung mindestens einer Kopie und vorzugsweise mehrfacher Kopien eines einzelstrangigen Polynukleotids. Das einzelsträngige Polynukleotid kann in einem Medium anwesend sein oder kann durch die Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, gebildet werden. Bei der Herstellung mehrfacher Kopien des einzelsträngigen Polynukleotids werden die folgenden Komponenten bereitgestellt: (i) das einzelsträngige Polynukleotid, (ii) ein Polynukleotid-Primer, bei dem mindestens dessen 3'-Ende eine Sequenz von mindestens zehn Basen, vorzugsweise mindestens 15 Basen, aufweist, die mit einer zweiten flankierenden Sequenz hybridisierbar ist, welche mit dem 3'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids verknüpft ist, (ii) Nukleosid-Triphosphate, und (iv) Matrizenabhängige Polynukleotid-Polymerase. Die zweite flankierende Sequenz, die mit der einzelsträngigen Polynukleotidsequenz verknüpft ist, ist gewöhnlich mindestens zu 65% komplementär zu einer ersten flankierenden Sequenz von mindestens zehn Basen, vorzugsweise 15 Basen, die mit dem 5'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids verknüpft ist. Nach der Verlängerung des Primers entlang des einzelsträngigen Polynukleotids und der ersten flankierenden Sequenz, wird die verlängerte Polynukleotidsequenz von dem einzelsträngigen Polynukleotid dissoziiert. Verlängerung und Dissoziation werden wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von Kopien erhalten wurde.
- Ein Aspekt der Erfindung umfaßt eine Bestimmung eines Polynukleotid- Analyten durch Veranlassung der Bildung eines einzelsträngigen Polynukleotids und Initiierung des oben beschriebenen Verfahrens zur Herstellung mehrfacher Kopien. Bei diesem Verfahren ist das einzelsträngige Polynukleotid von ersten und zweiten Polynukleotidflankierenden Sequenzen flankiert, welche sich von der Sequenz des Analyten oder einer Sequenz, die komplementär zu dem Analyten ist, unterscheiden. Die Anwesenheit des Analyten wird bestimmt durch den Nachweis einer Sequenz, die am oder jenseits des 3'-Ende(s) der ersten flankierenden Sequenz lokalisiert ist, die mit einer Sequenz verknüpft ist, welche am oder jenseits des 5'-Ende(s) der zweiten flankierenden Sequenz lokalisiert ist.
- Bevor mit einer Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, soll eine Anzahl von Begriffen definiert werden.
- Polynukleotid-Analyt -- Eine zu bestimmendende Verbindung oder Zusammensetzung, welche ein polymeres Nukleotid mit etwa 20 bis 500.000 oder mehr Nukleotiden, üblicherweise etwa 100 bis 200.000 Nukleotiden, häufiger 500 bis 15.000 Nukleotiden, darstellt. Die Polynukleotid-Analyten umfassen Nukleinsäuren jeglichen Ursprungs in gereinigter oder ungereinigter Form, einschließlich DNA (dsDNA und ssDNA) und RNA, einschließlich t-RNA, m-RNA, r-RNA, mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten-DNA und -RNA, DNA-RNA-Hybride oder Mischungen davon, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von biologischem Material wie Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schleimpilzen, Pilzen, Pflanzen, Tieren, Menschen, und Fragmente davon und dgl. Der Polynukleotid-Analyt kann lediglich eine kleinere Fraktion einer komplexen Mischung wie einer biologischen Probe sein. Der Analyt kann aus verschiedenembiologischem Material durch im Stande der Technik wohlbekannte Verfahren erhalten werden. Einige erläuternde und nicht beschränkende Beispiele solchen biologischen Materials sind in der folgenden Tabelle I offenbart. TABELLE I Interessierende Mikroorganismen schließen ein:
- Der Polynukleotid-Analyt kann, wenn dies angebracht ist, einer Behandlung zur Spaltung des Analyten unterworfen werden, um ein Fragment zu erhalten, welches eine Target-Polynukleotidsequenz enthält, z.B. durch Scherung oder Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease oder einem anderen stellenspezifischen chemischen Spaltungsverfahren.
- Für die Zwecke dieser Erfindung wird der Polynukleotid-Analyt oder das aus dem Polynukleotid-Analyten erhaltene gespaltene Fragment gewöhnlich mindestens teilweise denaturiert oder einzelsträngig sein oder behandelt werden, um ihn bzw. es denaturiert oder einzelsträngig zu machen. Solche Behandlungen sind im Stand der Technik wohlbekannt und schließen beispielsweise Wärme- oder Alkalibehandlung ein. Beispielsweise kann doppelsträngige DNA für eine Zeitspanne von etwa 1 bis 10 Minuten auf 90-100ºC erwärmt werden, um denaturiertes Material zu erzeugen.
- Target-Polynukleotidsequenz -- Eine Sequenz von zu identifizierenden Nukleotiden, deren Identität bis zu einem ausreichenden Grad bekannt ist, um die Herstellung von Polynukleotid-Sonden zu erlauben, welche zu mindestens einem Abschnitt einer solchen Target-Sequenz komplementär sind und damit hybridisieren werden. Die Target-Polynukleotidsequenz wird gewöhnlich etwa 12 bis 1000 oder mehr Nukleotide, vorzugsweise 20 bis 100 Nukleotide, enthalten. Die Target-Polynukleotidsequenz ist häufig ein Teil des Polynukleotid-Analyten. Die Target- Polynukleotidsequenz wird im allgemeinen ein Bruchteil eines größeren Moleküls sein oder sie kann im wesentlichen das gesamte Molekül sein. Die minimale Anzahl der Nukleotide in der Target- Polynukleotidsequenz wird so gewählt werden, daß sichergestellt ist, daß die Anwesenheit der Target-Polynukleotidsequenz in einer Probe ein spezifischer Indikator der Gegenwart des Polynukleotid-Analyten in der Probe sein wird. Ganz grob wird die Sequenzlänge gewöhnlich größer als etwa 1,6 log L Nukleotide sein, wobei L die Anzahl der Basenpaare im Genom des biologischen Ursprungs der Probe ist. Die maximale Anzahl der Nukleotide in der Target-Sequenz wird normalerweise bestimmt durch die Länge des Polynukleotid-Analyten und dessen Tendenz durch Scherung, durch endogene Nukleasen oder Reagenzien, die zur Spaltung der Target-Sequenz verwendet werden, aufgebrochen zu werden.
- Einzelsträngiges Polynukleotid -- Eine natürliche oder synthetische Sequenz von Nukleotiden, welche in der Natur vorkommt oder vorgebildet wird oder aus einer Sonde als Ergebnis der Anwesenheit eines Analyten gebildet wird. Es wird normalerweise mindestens eine Sequenz umfassen, die mit mindestens einem Abschnitt der Target- Polynukleotidsequenz identisch ist oder dazu komplementär, und kann auch eine oder mehrere Sequenzen enthalten, welche, wenn sie an ihre komplementären Sequenzen gebunden sind, spezifische Bindungsstellen für Rezeptoren wie Repressoren, Restriktionsenzyme und dgl. darstellen. Das einzelsträngige Polynukleotid ist von einer ersten flankierenden Sequenz und einer zweiten flankierenden Sequenz flankiert, die mindestens zu 50% komplementäre Basensequenzen, gewöhnlich mindestens zu 65% komplementäre Basensequenzen, oft mindestens zu 80% komplementäre Basensequenzen, aufweisen. Die ersten und zweiten flankierenden Sequenzen sind mit dem 3'-Ende bzw. 5'-Ende des einzelstrangigen Polynukleotids verknüpft und umfassen jeweils mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, Nukleotide, Desoxynukleotide und/oder Derivate davon.
- Das einzelstrangige Polynukleotid zusammen mit den flankierenden Sequenzen und damit verknüpften Polynukleotiden wird gewöhnlich 30 bis 3000 Nukleotide, vorzugsweise 50 bis 500 Nukleotide, enthalten. Das einzelsträngige Polynukleotid kann RNA oder DNA und auch ein synthetisches Oligonukleotid sein. Wird das einzelsträngige Polynukleotid, das von den ersten und zweiten Sequenzen flankiert ist, mit einem komplementären Strang hybridisiert, wird es häufig "inverted repeats" bilden.
- Polynukleotid-Primer -- Ein Polynukleotid, das an seinem 3'-Ende eine Sequenz enthält, die mit der zweiten flankierenden Sequenz am 3'- Ende des einzelsträngigen Polynukleotids hybridisierbar ist. Die Anzahl der Nukleotide in dem Polynukleotid-Primer, welche mit der zweiten flankierenden Sequenz hybridisierbar sind, sollte derart sein, daß die Stringenzbedingungen, welche zur Hybridisierung des Polynukleotid-Primers eingesetzt werden, eine übermäßige statistische nicht-spezifische Hybridisierung verhindern. Gewöhnlich wird die Anzahl der Nukleotide in dem Polynukleotid-Primer mindestens so groß wie in der zweiten flankierenden Sequenz sein, nämlich mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide, und im allgemeinen etwa 10 bis 2000, vorzugsweise 20 bis 100 Nukleotide.
- Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ("sbp-Mitglied") -- Eines von zwei verschiedenen Molekülen mit einem Gebiet auf der Oberfläche oder in einer Cavität, welches spezifisch an eine besondere räumliche oder polare Organisation des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Dies können Mitglieder eines immunologischen Paares wie Antigen-Antikörper sein, oder Operator-Repressor, Nuklease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nukleinsäure-Doppel stränge, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA-RNA und dgl.
- Ligand -- Jede Verbindung, für die ein Rezeptor natürlicherweise existiert oder hergestellt werden kann.
- Rezeptor ("Antiligand") -- Jede Verbindung oder Zusammensetzung, die imstande ist, eine besondere räumliche oder polare Organisation eines Moleküls zu erkennen, z.B. ein Epitop oder eine Determinante. Beispielhafte Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, z.B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lektine, Nukleinsäuren, Repressoren, Schutz-Enzyme, Protein A, Komplementkomponente Clq, DNA-bindende Proteine oder Liganden und dgl. ein.
- Kleines organisches Molekül -- Eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500, vorzugsweise 100 bis 1000, noch bevorzugter 300 bis 600, z.B. Biotin, Fluorescein, Rhodamin und andere Farbstoffe, Tetracyclin und andere Protein-bindende Moleküle und Haptene etc. Das kleine organische Molekül kann ein Mittel zur Verknüpfung einer Nukleotidsequenz mit einer Markierung oder einem Träger bereitstellen.
- Träger oder Oberfläche -- Ein poröses oder nicht-poröses wasserunlösliches Material. Der Träger kann hydrophil sein oder imstande, hydrophil gemacht zu werden, und umfaßt anorganische Pulver wie Siliciumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere Materialien, insbesondere Cellulose-Materialien und Materialien, die von Cellulose abgeleitet sind, z.B. faserhaltige Papiere, beispielsweise Filterpapier, Chromatographiepapier etc.; synthetische oder modifizierte, natürlich vorkommende Polymere, z.B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat), etc.; entweder als solche oder in Verbindung mit anderen Materialien eingesetzt; Glas, erhältlich als Bioglas, Keramiken, Metalle und dgl. Natürliche oder synthetische Vereinigungen wie Liposome, Phospholipid-Vesikel und Zellen können ebenfalls eingesetzt werden.
- Die Bindung von sbp-Mitgliedern an den Träger oder die Oberfläche kann durch wohlbekannte Techniken, die allgemein in der Literatur zugänglich sind, erreicht werden. Siehe beispielsweise "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970). Die Oberfläche kann jede beliebige Gestalt, z.B. Streifen, Stab, Teilchen, einschließlich Perle, und dgl., aufweisen.
- Die Oberfläche wird gewöhnlich polyfunktionell sein oder imstande, polyfunktionalisiert zu werden, oder imstande sein, an ein Oligonukleotid oder ein sbp-Mitglied durch spezifische oder nichtspezifische kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen zu binden. Eine große Vielfalt funktioneller Gruppen steht zur Verfügung oder kann inkorporiert werden. Funktionelle Gruppen umfassen Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dgl. Die Art und Weise der Verknüpfung einer großen Vielfalt von Verbindungen mit Teilchen ist wohlbekannt und in der Literatur reichlich erläutert. Siehe beispielsweise Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970). Die Länge einer Verknüpfungsgruppe zu dem Oligonukleotid oder sbp- Mitglied kann in großem Umfang variieren, in Abhängigkeit von der Art der Verbindung, die verknüpft wird, der Wirkung der Entfernung zwischen der Verbindung, die verknüpft wird, und dem Teilchen auf die Hybridisierung der Sequenzen und dgl. Das Oligonukleotid oder sbp-Mitglied wird im wesentlichen an die äußere Oberfläche des Teilchens gebunden werden.
- Als Oberfläche eingesetzte Teilchen können fluoreszieren, entweder direkt oder mit Hilfe fluoreszierender Verbindungen oder "Fluorescer", die an das Teilchen auf übliche Weise gebunden sind. Die "Fluorescer" werden gewöhnlich in dem Teilchen gelöst oder kovalent oder nicht kovalent an das Teilchen gebunden sein und werden häufig im wesentlich gleichmäßig über das ganze Teilchen hinweg gebunden sein. Fluoresceinierte Latexteilchen werden im US-Patent Nr. 3,853,987 gelehrt.
- Markierung oder Reporter-Gruppe -- Ein Mitglied des signalerzeugenden Systems, das mit einer Sonde konjugiert ist oder daran gebunden wird, und imstande ist, direkt nachgewiesen zu werden, oder mit Hilfe einer spezifischen Bindungsreaktion ein nachweisbares Signal erzeugen kann. Markierungen umfassen einen Polynukleotid-Primer oder eine spezifische Polynukleotidsequenz, die eine Matrize zur Amplifizierung oder Ligierung bieten kann oder als Ligand, z.B. für ein Repressorprotein, dienen kann. Vorzugsweise wird eine der Polynukleotid-Sonden eine Markierung aufweisen oder imstande sein, eine solche aufzuweisen. Im allgemeinen kann jede nachweisbare Markierung eingesetzt werden. Die Markierung kann isotopisch oder nicht-isotopisch, gewöhnlich nicht-isotopisch, sein und kann ein Katalysator, ein Farbstoff, fluoreszierendes Molekül, chemolumineszierender Stoff, Coenzym, Enzym, Substrat&sub1; eine radioaktive Gruppe, ein Teilchen wie ein Latex- oder Kohlenstoffteilchen, ein Metall-Sol, Kristallit, Liposom, eine Zelle etc. sein, welche (s,r) darüber hinaus mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen nachweisbaren Gruppe und dgl. markiert sein kann oder auch nicht. Die Markierung ist ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems und kann entweder allein oder zusammen mit anderen Mitgliedern des signalerzeugenden Systems ein nachweisbares Signal erzeugen. Die Markierung kann direkt an eine Nukleotidsequenz gebunden sein oder kann daran gebunden werden durch die Bindung an ein sbp-Mitglied, welches komplementär zu einem sbp-Mitglied ist, das an eine Nukleotidsequenz gebunden ist.
- Signalerzeugendes System -- Das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei mindestens eine Komponente die Markierung oder Reporter-Gruppe ist. Das signalerzeugende System erzeugt ein Signal, das in Beziehung steht zur Anwesenheit oder Menge des Polynukleotid-Analyten in einer Probe. Das signalerzeugende System umfaßt alle Reagenzien, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals erforderlich sind. Wenn die Markierung nicht mit einer Nukleotidsequenz konjugiert ist, so ist die Markierung normalerweise an ein sbp-Mitglied gebunden, welches komplementär zu einem sbp- Mitglied ist, das an eine Nukleotidsequenz gebunden oder Teil davon ist. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können in einer Entwicklerlösung eingeschlossen sein und können Substrate, Verstärker, Aktivatoren, chemolumineszierende Verbindungen, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfangreagenzien, Metallionen, spezifisch bindende Substanzen, die zur Bindung von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, und dgl. umfassen. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können Coenzyme, Substanzen, welche mit enzymatischen Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dgl. sein. Das signalerzeugende System liefert ein Signal, das durch externe Mittel mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung, wünschenswerterweise durch visuelle Überprüfung, nachweisbar ist.
- Das signalerzeugende System kann mindestens einen Katalysator, gewöhnlich ein Enzym, und mindestens ein Substrat einschließen, und kann zwei oder mehr Katalysatoren und eine Vielzahl von Substraten einschließen, und kann eine Kombination von Enzymen einschließen, wobei das Substrat des einen Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist. Die Wirkungsweise des signalerzeugenden Systems ist die Herstellung eines Produkts, welches ein nachweisbares Signal liefert, das zur Menge des Polynukleotid-Analyten in der Probe in Beziehung steht.
- Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen, die für ein signalerzeugendes System geeignet sind, sind im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 19 bis 23, und US-Patent Nr. 4,318,980, Spalten 10 bis 14, angegeben. Eine Anzahl von Enzymkombinationen ist im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 23 bis 28, angegeben, welche Kombinationen in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können.
- Von besonderem Interesse sind Enzyme, welche die Erzeugung von Wasserstoffperoxid und die Verwendung des Wasserstoffperoxids zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers zu einem Farbstoff beinhalten. Besondere Kombinationen umfassen Saccharidoxidasen, z.B. Glucose- und Galactoseoxidase, oder heterocyclische Oxidasen, z.B. Uricase und Xanthinoxidase, gekoppelt mit einem Enzym, welches das Wasserstoffperoxid zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers verwendet, d.h. eine Peroxidase wie Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase. Weitere Enzymkombinationen können in dem durch die Bezugnahme eingeschlossenen Material gefunden werden. Wird ein einzelnes Enzym als Markierung verwendet, können andere Enzyme wie Hydrolasen, Transferasen und Oxidoreduktasen, vorzugsweise Hydrolasen wie alkalische Phosphatase und β-Galactosidase, Verwendung finden. Als Alternative können Luciferasen wie Glühwürmchenluciferase und bakterielle Luciferase verwendet werden.
- Beispielhafte Coenzyme, die Verwendung finden, umfassen NAD[H]; NADP[H]; Pyridoxalphosphat; FAD[H]; FMN[H], etc., gewöhnlich Coenzyme, die zyklische Reaktionen beinhalten, siehe insbesondere US-Patent Nr. 4,318,980.
- Das Produkt der Enzymreaktion wird gewöhnlich ein Farbstoff oder ein Fluorescer sein. Eine große Zahl von beispielhaften Fluorescern ist im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 30 und 31, angegeben.
- Das signalerzeugende System kann ein oder mehrere Teilchen umfassen, welche unlösliche Teilchen von mindestens etwa 50 nm und nicht mehr als etwa 50 µm, gewöhnlich mindestens etwa 100 nm und weniger als etwa 25 µm, vorzugsweise etwa 0,2 bis 5 µm, Durchmesser sind. Das Teilchen kann sein organisch oder anorganisch, porös oder nichtporös, vorzugsweise von einer ähnlichen Dichte wie Wasser, gewohnlich von etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml, und aus Material aufgebaut, das transparent, teilweise transparent oder opak sein kann.
- Die organischen Teilchen werden normalerweise aus Polymeren, entweder Additions- oder Kondensationspolymere, bestehen, die ohne weiteres im Assay-Medium dispergierbar sind. Die Teilchenoberfläche wird adsorptionsfähig sein oder funktionalisierbar, um entweder direkt oder indirekt ein Oligonukleotid oder ein sbp-Mitglied zu binden. Die Art der Teilchen ist oben beschrieben.
- Fluoreszierende Stoffe (Fluorescer) von Interesse werden im allgemeinen Licht bei einer wellenlänge oberhalb von 350 nm, gewöhnlich oberhalb von 400 nm und vorzugsweise oberhalb von 450 nm emittieren. Wünschenswerterweise haben die Fluorescer eine hohe Quanteneffizienz, eine große Stokes-Verschiebung und sind unter den Bedingungen ihrer Konjugation und Verwendung chemisch stabil. Der Ausdruck "Fluorescer" soll Substanzen einschließen, welche Licht nach Aktivierung durch elektromagnetische Strahlung oder chemische Aktivierung emittieren, und schließt fluoreszierende und phosphoreszierende Substanzen, Scintillatoren und chemolumineszierende Substanzen ein.
- Fluorescer von Interesse fallen in eine Vielzahl von Kategorien mit bestimmten primären Funktionalitäten. Diese primären Funktionalitäten umfassen 1- und 2-Aminonaphthalen, p,p-Diaminostilbene, Pyrene, quaternäre Phenanthridin-Salze, 9-Aminoacridine, p-p'-Diaminostilben- Imine, Anthracene, Oxacarboxyanin, Merocyanin, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bisbenzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinal, Bis-3-aminopyridiniumsalze, Hellebrigenin, Tetracylin, Sterophenol, Benzimidazolylphenylamin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumarin, 4, 5-Benzimidazole, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane, Flavin und Seltene- Erden-Chelate,-Oxide und -Salze. Beispielhafte Fluorescer sind im US-Patent Nr. 4,318,707, Spalten 7 und 8, aufgezählt.
- Ferner können energieabsorbierende oder "quenchende" Teilchen eingesetzt werden, welche feste unlösliche Teilchen von mindestens etwa 50 nm Durchmesser sind, die imstande sind, die Fluoreszenz des fluoreszierenden Teilchens zu löschen ("quenchen), wenn sie sich innerhalb der Distanz befinden, die aus der Hybridisierung einer Sonde mit dem Polynukleotid-Analyten oder aus spezifischer Bindung zwischen Mitgliedern von spezifischen Bindungspaaren resultiert. Das quenchende Teilchen kann gleich oder verschieden, gewöhnlich verschieden, von dem fluoreszierenden Teilchen sein. Normalerweise wird das quenchende Teilchen eine substantielle Löschung in einer Entfernung von mehr als etwa 50 Å, vorzugsweise mehr als etwa 500 Å, noch bevorzugter mehr als etwa 2000 Å, ergeben, wobei die Distanz von den Oberflächen der Teilchen gemessen wird.
- Zur Modulierung der Lichtemission können viele verschiedene Arten von Teilchen eingesetzt werden. Von besonderem Interesse sind Kohlenstoffteilchen, z.B. Holzkohle, Rußschwarz, Graphit, kolloidaler Kohlenstoff und dgl. Außer Kohlenstoffteilchen können auch Metall- Sole, insbesondere der Edelmetalle Gold, Silber und Platin, Verwendung finden. Andere von Metall abgeleitete Teilchen können Metallsulfide umfassen, z.B. Blei-, Silber- oder Kupfersulfide, oder Metalloxide, wie Eisen- oder Kupferoxid.
- Eine alternative Lichtquelle als nachweisbares Signal ist eine chemolumineszierende Quelle. Die chemolumineszierende Quelle beinhaltet eine Verbindung, die durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt wird und dann Licht emittieren kann, welches als das nachweisbare Signal dient oder Energie an einen Fluoreszenz- Akzeptor abgibt.
- Von einer mannigfaltigen Zahl von Verbindungsfamilien wurde festgestellt, daß sie Chemolumineszenz unter einer Vielfalt von Bedingungen ergeben. Eine Verbindungsfamilie ist 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion. Die bekannteste Verbindung ist Luminol, welche das 5-Amino-Analogon der obigen Verbindung ist. Andere Mitglieder der Familie umfassen das 5-Amino-6,7,8-trimethoxy- und das Dimethylamin- [ca]benz-Analogon. Diese Verbindungen können mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder Calciumhypochlorit und Base zur Lumineszenz gebracht werden. Eine weitere Verbindungsfamilie sind die 2,4,5- Triphenylimidazole mit Lophin als üblicher Name für das Stammprodukt. Chemolumineszierende Analoga umfassen para-Dimethylamino- und para- Methoxy-Substituenten. Chemolumineszenz kann auch durch Oxilate, gewöhnlich Oxalyl, aktive Ester, z.B. p-Nitrophenyl, und ein Peroxid, z.B. Wasserstoffperoxid, unter basischen Bedingungen erhalten werden. Alternativ können Luciferine in Verbindung mit Luciferase oder Lucigeninen eingesetzt werden.
- Hilfsmaterialien -- In dem erfindungsgemäßen Assay werden häufig verschiedene Hilfsmaterialien verwendet werden. Beispielsweise werden gewöhnlich im Assay-Medium Puffer anwesend sein, ebenso wie Stabilisatoren für das Assay-Medium und die Assay-Komponenten. Häufig können neben diesen Zusätzen Proteine, z.B. Albumine, organische Lösungsmittel wie Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykationen wie Dextransulfat, Tenside, insbesondere nicht-ionische Tenside, Bindungsverstärker, z.B. Polyalkylenglykole, oder dgl. eingeschlossen sein.
- Nukleosid-Triphosphate -- Ein Nukleosid mit einem 5'-Triphosphat- Substituenten, vorzugsweise ein Desoxynukleosid-Triphosphat. Die Nukleoside sind Pentose-Zucker-Derivate von stickstoffhaltigen Basen, die sich entweder von Purin oder Pyrimidin ableiten und kovalent an den 1'-Kohlenstoff des Pentose-Zuckers gebunden sind. Die Purinbasen umfassen Adenin (A), Guanin (G), Inosin und Derivate und Analoga davon. Die Pyrimidinbasen umfassen Cytosin (C), Thymin (T), Uracil (U) und Derivate und Analoga davon.
- Die Derivate und Analoga sind beispielsweise diejenigen, welche auf ähnliche Weise wie die underivatisierten Nukleosid-Triphosphate erkannt und polymerisiert werden. Beispiele solcher Derivate oder Analoga, als Erläuterung und nicht als Beschränkung, sind diejenigen, die mit einer Reporter-Gruppe modifiziert sind, biotinylierte, Aminmodifizierte, radioaktiv markierte, alkylierte und dgl., und schließen auch Thiophosphat, Phosphit, Ringatom-modifizierte Derivate und dgl. ein. Die Reporter-Gruppe kann eine fluoreszierende Gruppe wie Fluorescein, eine chemolumineszierende Gruppe wie Luminol, ein Terbium-Chelator wie N-(Hydroxyethyl)ethylendiamintriessigsäure, der durch verzögerte Fluoreszenz nachgewiesen werden kann, und dgl. sein.
- Polynukleotid-Polymerase -- Ein Katalysator, gewöhnlich ein Enzym, zur Bildung einer Verlängerung des Polynukleotid-Primers entlang einer DNA- oder RNA-Matrize, welche das einstrangige Polynukleotid einschließt, zu dem die Verlängerung komplementär ist. Die Polynukleotid-Polymerase ist eine Matrizen-abhängige Polynukleotid- Polymerase und verwendet die Nukleosid-Triphosphate als Bausteine zur Verlängerung des 3'-Endes des Polynukleotid-Primers, um eine Sequenz zu liefern, die komplementär zu dem einzelsträngigen Polynukleotid ist. Gewöhnlich sind die Katalysatoren Enzyme, z.B. RNA-Polymerasen, vorzugsweise DNA-Polymerasen wie beispielsweise prokaryotische DNA-Polymerase (I, II oder III), T4-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, reverse Transkriptase, RNA- Replikasen und dgl., die aus beliebiger Quelle wie Zellen, Bakterien, z.B. E. coli, Pflanzen, Tieren, Viren, thermophilen Bakterien etc. stammen.
- Ganz oder teilweise sequentiell -- Wenn die Probe und die verschiedenen Agentien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, auf andere Weise als alle gemeinsam (gleichzeitig) kombiniert werden, können eines oder mehrere mit einem oder mehreren der verbleibenden Agentien kombiniert werden, um eine Unterkombination zu bilden. Jede Unterkombination kann dann einem oder mehreren Schritt (en) des vorliegenden Verfahrens unterworfen werden. Auf diese Weise kann jede der Unterkombinationen unter Bedingungen, um eines oder mehrere der gewünschten Ergebnisse zu erreichen, inkubiert werden.
- Hybridisierung (Hybridisieren) und Bindung -- Im Zusammenhang mit Nukleotidsequenzen werden diese Begriffe hier austauschbar verwendet. Die Fähigkeit von zwei Nukleotidsequenzen, miteinander zu hybridisieren, beruht auf dem Grad der Komplementärität der beiden Nukleotidsequenzen, welcher wiederum auf dem Anteil der überstimmenden komplementären Nukleotidpaare beruht. Je mehr Nukleotide in einer gegebenen Sequenz komplementär zu einer anderen Sequenz sind, desto größer ist der Grad der Hybridisierung miteinander. Der Hybridisierungsgrad hängt auch von den Viskositätsbedingungen oder der Stringenz ab, welche Temperatur, Lösungsmittelverhältnisse, Salzkonzentrationen und dgl. einschließen.
- Erste Polynukleot id-Sonde -- Eine Verbindung mit einer Polynukleotidsequenz an ihrem 3'-Ende (3'-Target-bindende Sequenz), wobei mindestens ein Abschnitt einer derartigen Sequenz, vorzugsweise die gesamte Sequenz, imstande ist, mit einem Abschnitt des Target- Polynukleotid-Analyten aufgrund der teilweisen oder vollständigen, gewöhnlich vollständigen, Komplementärität zu einem Bereich des Target-Polynukleotid-Analyten zu hybridisieren, so daß die erste Polynukleotid-Sonde an einen derartigen Bereich der Target- Polynukleotid-Analyten gebunden wird. Die erste Polynukleotid- Sonde umfaßt auch eine erste flankierende Sequenz, die zu mindestens 50%, gewöhnlich mindestens zu 65%, zu einer zweiten flankierenden Sequenz einer zweiten Polynukleotid-Sonde komplementär ist. Die erste Polynukleotid-Sonde kann zusätzliche Sequenzen enthalten, die zwischen der Target-Polynukleotid-bindenden Sequenz un& der ersten flankierenden Sequenz lokalisiert sind und mit der ersten flankierenden Sequenz distal zu der Target-Polynukleotid-bindenden Sequenz verknüpft sind.
- Die Hauptkriterien für die Auswahl der ersten Polynukleotid-Sonde sind: (1) Die Target-bindende Sequenz des 3'-Endes sollte verläßlich sein, d.h. sie sollte annähernd oder genau komplementär zu mindestens einem Abschnitt der Target-Nukleotidsequenz sein und eine ausreichende Länge aufweisen, um eine stabile und spezifische Bindung zu ergeben. (2) Das 3'-Ende muß eine freie 3'-Hydroxylgruppe bilden oder imstande sein, diese zu bilden. Die minimale erste flankierende Sequenz wird gewöhnlich mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, Nukleotide lang sein. Weitere Sequenzen, gewöhnlich zwischen der Target-bindenden Sequenz des 3'-Endes und der ersten flankierenden Sequenz lokalisiert, sind so gewählt, daß die Entfernung zwischen den beiden Gruppen erhöht und so eine größere DNA-Synthese während der Amplifizierung ermöglicht wird und für Rezeptor-Bindungsstellen gesorgt wird, um einen Nachweis des amplifizierten Produkts zu erlauben. Im allgemeinen wird die erste Polynukleotid-Sonde etwa 30 bis 5000 Nukleotide, häufiger 40 bis 1000 Nukleotide, an Länge aufweisen. Die vereinigte Länge des hybridisierenden Abschnitts der ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden ist eine Länge von mindestens etwa 20 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 40 bis 2000 Nukleotiden. Bei biologisch synthetisierten Polynukleotiden können statistische Fragmente unbekannter Sequenzen eingesetzt werden, jedoch mit der Maßgabe, daß die Nukleinsäuren einzelsträngig und komplementär zu den Target-Nukleotidsequenzen oder dem Polynukleotid-Analyten sind.
- Zweite Polynukleotid-Sonde -- Die zweite Polynukleotid-Sonde weist eine Sequenz an ihrem 5'-Ende auf, bei der mindestens ein Abschnitt und vorzugsweise die gesamte Sequenz imstande ist, den Target- Polynukleotid-Analyten in einem anderen Bereich zu binden als demjenigen, mit welchem die erste Polynukleotid-Sonde hybridisiert (5'-Target-bindende Sequenz). Die zweite Polynukleotid-Sonde weist eine Sequenz auf, die mindestens zu 50%, gewöhnlich mindestens zu 65%, komplementär zu der ersten flankierenden Sequenz der ersten Polynukleotid-Sonde ist und als zweite flankierende Sequenz bezeichnet wird. So besitzen die ersten und zweiten Polynukleotid- Sonden jeweils eine Polynukleotidsequenz, die mindestens teilweise komplementär zu einer Sequenz der anderen ist. Die zweite Polynukleotid-Sonde kann zusätzliche Rezeptor-bindende oder "Spacer"- Sequenzen enthalten, die zwischen der Target-Polynukleotid-bindenden Sequenz und der zweiten flankierenden Sequenz lokalisiert sind und mit der zweiten flankierenden Sequenz distal zu der Target-Polynukleotid-bindenden Sequenz verknüpft sind.
- Die beiden Bereiche des Target-Polynukleotid-Analyten, die komplementär zu den ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden sind, werden sich normalerweise in annehmbarer Nähe zueinander befinden, um sicherzustellen, daß ein wesentlicher Anteil des Analyten die beiden Bereiche verknüpft aufweisen wird. Die beiden Bereiche können innerhalb von 0 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 0 bis 1 Nukleotid, vorliegen. Sind die Bereiche durch mehr als ein Nukleotid voneinander getrennt, wird es häufig wünschenswert sein, die erste Sonde, wenn sie an das Target gebunden ist, mit Hilfe einer Nukleotid-Polymerase und Nukleosid-Triphosphaten zu verlängern und dadurch die Entfernung zwischen den Sonden zu verringern.
- Nicht-aneinander angrenzend -- Die Sonden werden mit nichtaneinander angrenzenden Abschnitten der Target-Nukleotidsequenz hybridisiert, wobei mindestens ein Nukleotid in der Target- Polynukleotidsequenz zwischen dem hybridisierten 5'-Ende der ersten Polynukleotid-Sonde und dem 3'-Ende der zweiten Polynukleotid- Sonde vorhanden ist.
- Aneinander angrenzend -- Die Sonden werden als aneinander angrenzend betrachtet, wenn keine Nukleotide zwischen dem 5'-Ende der ersten Sonden-Sequenz und dem 3'-Ende der zweiten Sonden-Sequenz liegen, wenn diese Nukleotidsequenzen mit dem Target-Polynukleotid-Analyten hybridisiert sind.
- Kopie -- Bedeutet eine Sequenz, die eine direkte Kopie eines einzelsträngigen Polynukleotids ist, im Unterschied zu einer Sequenz, die komplementär zu der Sequenz eines derartigen einzelsträngigen Polynukleotids ist. Bei der vorliegenden Erfindung wird zunächst eine komplementäre Sequenz eines einzelstrangigen Polynukleotids als Ergebnis der Verlängerung des Polynukleotid-Primers erzeugt und eine Sequenz, die eine direkte Kopie des einzelstrangigen Polynukleotids ist, wird anschließend aus der vorgenannten komplementären Sequenz erhalten.
- Kovalente Verknüpfung -- Bildung einer chemischen Bindung zwischen der ersten Polynukleotid-Sonde und der zweiten Polynukleotid-Sonde.
- Die chemische Bindung kann gebildet werden, ob die Sonden aneinander angrenzen oder nicht, wenn die Sonden an den Target-Polynukleotid- Analyten gebunden sind, gewöhnlich wenn sie durch 0 oder 1 Nukleotid getrennt sind. Eine kovalente Verknüpfung kann enzymatisch, z.B. mit Hilfe einer Ligase, erreicht werden. Vor der Ligierung der Sonden kann die Sonde, welche ein 3'-Ende aufweist, das in Richtung der anderen, mit dem Target-Polynukleotid-Analyten hybridisierten Sonde verlängerbar ist, behandelt werden, um sie an die andere Sonde angrenzend oder praktisch angrenzend zu machen. Die Sonden sind praktisch aneinander angrenzend, wenn z.B. eine enzymatische Ligierung oder eine chemische Kopplung stattfinden kann. Gewöhnlich sind die Sonden praktisch aneinander angrenzend, wenn sie von 1 bis 3 Nukleotiden getrennt werden. Eine Kettenverlängerung kann beispielsweise erreicht werden durch Zugabe einer Polynukleotid- Polymerase und von Nukleosid-Triphosphaten oder durch Ligierung einer der Sonden mit einer Nukleotidsequenz, die zu dem Lücken-Bereich des Target-Polynukleotid-Analyten zwischen den hybridisierten Sonden komplementär ist. Die kovalente Verknüpfung kann chemisch erreicht werden durch Bildung chemischer Bindungen zwischen den Phosphat- Gruppierungen der Sonden.
- Mittel zur Verlängerung einer Sonde -- Zur Ligierung der Sonden, wenn die Sonden an die Target-Polynukleotidsequenz gebunden sind, ist es oft wünschenswert, die Proben aneinander angrenzend zu machen. Wie oben erläutert, kann die Sonde, welche einen in Richtung der anderen Sonde verlängerbaren 3'-Terminus enthält, verlängert werden durch Kombinieren der Sonde, die mit dem Target-Polynukleotid- Analyten hybridisiert ist, mit einer Polynukleotid-Polymerase und Nukleosid-Triphosphaten unter Bedingungen zur Verlängerung der Sonde. Alternativ kann eine Nukleotidsequenz, die zu dem Lücken-Abschnitt des Target-Polynukleotid-Analyten zwischen den Sonden komplementär ist, mit einer der Sonden ligiert werden.
- Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung mindestens einer Kopie eines einzelsträngigen Polynukleotids oder einer dazu komplementären Sequenz. Das Verfahren umfaßt die Bildung in Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase einer Verlängerung eines Polynukleotid-Primers, der eine mit einer ersten flankierenden Sequenz am 3'-Ende des einzelsträngigen Polynukleotids hybridisierbare Sequenz aufweist, wobei die erste flankierende Sequenz mindestens teilweise komplementär zu einer zweiten flankierenden Sequenz des einzelsträngigen Polynukleotids ist, und Dissoziation des verlängerten Polynukleotid-Primers und des einzelsträngigen Polynukleotids. Die obigen Schritte werden wiederholt, um die angemessene Kopie zu ergeben.
- Gewöhnlich wird eine Kombination in einem flüssigen Medium bereitgestellt, welche umfaßt (1) ein einzelsträngiges Polynukleotid mit einer Polynukleotidsequenz, die an jedem Ende von intern hybridisierbaren ersten und zweiten flankierenden Sequenzen flankiert wird, (2) einen Polynukleotid-Primer, bei dem mindestens ein Abschnitt von 10 Basen an seinem 3'-Ende komplementär zu demjenigen Mitglied der ersten und zweiten flankierenden Sequenzen ist, das sich am 3'- Ende des einzelsträngigen Polynukleotids befindet, (3) Nukleosid- Triphosphate, und (4) Matrizen-abhängige Polynukleotid-Polymerase. Die Kombination wird unter Bedingungen inkubiert, um (1) jegliche intern hybridisierten ersten und zweiten flankierenden Sequenzen zu dissoziieren, (2) den Polynukleotid-Primer mit seiner komplementären Sequenz, die das einzelsträngige Polynukleotid flankiert, zu hybridisieren, (3) den Polynukleotid-Primer entlang des einzelsträngigen Polynukleotids zu verlängern, um einen ersten verlängerten Polynukleotid-Primer bereitzustellen, (4) den ersten verlängerten Polynukleotid-Primer und das einzelsträngige Polynukleotid zu dissoziieren, (5) den ersten verlängerten Polynukleotid-Primer mit dem Polynukleotid-Primer zu hybridisieren, (6) den Polynukleotid-Primer entlang des ersten verlängerten Polynukleotid-Primers zu verlängern, um einen zweiten verlängerten Polynukleotid-Primer bereitzustellen, (7) den zweiten verlängerten Polynukleotid-Primer von dem ersten verlängerten Polynukleotid-Primer zu dissoziieren und (8) die obigen Schritte (5) - (7) zu wiederholen.
- Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist im Schema 1 (Figur 4) als Beispiel und nicht als Beschränkung dargestellt.
- Das Molekül I kann beispielsweise doppelsträngige DNA sein, die einen "inverted repeat" mit komplementären Sequenzen 1a und 1b aufweist. Die DNA kann einzelsträngig gemacht werden, um Molekül II zu ergeben, oder das Molekül II kann RNA mit den Sequenzen 1a und 1b sein. Eine Hybridisierung des Polynukleotid-Primers 1c mit dem Molekül II ergibt das Molekül III. Der Primer 1c weist im wesentlichen dieselbe oder eine ähnliche Polynukleotidsequenz wie Sequenz 1a auf. In Gegenwart von DNA-Polymerase und Nukleosid-Triphosphaten wird Primer 1c entlang Molekül II verlängert, um Molekül IV zu ergeben. Die Dissoziation des Moleküls IV ergibt einzelsträngiges VIa und VIb. Das Molekül IVA ist das unveränderte Molekül II und weist komplementäre Sequenzen 1a und 1b auf und das Molekül IVb weist komplementäre Sequenzen 1c und 1d auf. Wie ersichtlich, korrespondiert 1c mit 1a und 1d korrespondiert mit 1b. Der Polynukleotid-Primer 1c kann mit dem Bereich 1b von IVA und mit dem Bereich 1d von IVb hybridisiert werden, um die Moleküle Va (III) bzw. Vb zu ergeben. Eine Verlängerung des Primers 1c entlang Va und Vb unter den oben beschriebenen Bedingungen ergibt die Moleküle VIa (IV) bzw. VIb. Die Moleküle VIa und VIb können zu einzelsträngigen Polynukleotiden dissoziiert werden, welche dann mit dem Primer 1c hybridisieren können, und die Kettenverlängerung kann wiederholt werden. Auf diese Weise können mehrfache Kopien des ursprünglichen einzelsträngigen Polynukleotids, welches die Sequenz zwischen den Sequenzen 1a und 1b des Moleküls II umfaßt, und einer dazu komplementären Sequenz erhalten werden.
- Bei der Durchführung des Verfahrens wird ein wäßriges Medium eingesetzt werden. Es können auch andere polare Cosolventien eingesetzt werden, gewöhnlich sauerstoffhaltige organische Lösungsmittel mit 1-6, üblicher 1-4, Kohlenstoffatomen, einschließlich Alkohole, Ether und dgl. Gewöhnlich werden diese Cosolventien in weniger als etwa 70 Gew.-%, gewöhnlicher in weniger als etwa 30 Gew.-%, vorhanden sein.
- Der pH-Wert des Mediums wird gewöhnlich im Bereich von etwa 4,5 bis 9,5, gewöhnlicher im Bereich von etwa 5,5 - 8,5, und vorzugsweise im Bereich von etwa 6-8 liegen. pH und Temperatur werden je nach Fall gewählt und variiert, um entweder eine gleichzeitige oder sequentielle Dissoziierung etwaiger intern hybridisierter Sequenzen in der einzelsträngigen Polynukleotidsequenz, Hybridisierung des Polynukleotid-Primers mit dem einzelsträngigen Polynukleotid, Verlängerung des Primers, Dissoziierung des verlängerten Primers, Hybridisierung des verlängerten Primers mit Primer, Verlängerung des so hybridisierten Primers und Dissoziierung des verlängerten Primers zu ermöglichen. In einigen Fällen wird ein Kompromiß zwischen diesen Gesichtspunkten gemacht werden, je nach dem ob die obigen Schritte sequentiell oder gleichzeitig durchgeführt werden. Zur Erzielung des gewünschten pH-Werts und Aufrechterhaltung des pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer eingesetzt werden. Beispielhafte Puffer umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dgl. Der speziell eingesetzte Puffer ist nicht kritisch in dieser Erfindung, es kann jedoch in einzelnen Verfahren ein Puffer gegenüber anderen bevorzugt sein.
- Normalerweise werden zur Durchführung des Verfahrens mäßige Temperaturen eingesetzt. Wünschenswerterweise werden während der Zeitspanne zur Durchführung des Verfahrens konstante Temperaturen eingesetzt werden, häufig wird jedoch das Medium zyklisch zwischen zwei oder drei Temperaturen geführt werden. Im Falle konstanter Temperatur wird sich die Temperatur in der Nähe der Schmelztemperatur des Komplexes des einzelsträngigen Polynukleotids und des verlängerten Polynukleotid-Primers befinden. Die Temperaturen für das Verfahren werden gewöhnlich im Bereich von etwa 10 bis 100ºC, gewöhnlicher von etwa 20 bis 95ºC, vorzugsweise 35 bis 70ºC, liegen. Jedoch kann die Temperatur variiert werden, in Abhängigkeit davon, ob die obigen Schritte sequentiell oder gleichzeitig durchgeführt werden. Beispielsweise können relativ niedrige Temperaturen von etwa 20 bis 40ºC für die Verlängerungsschritte eingesetzt werden, während Denaturierung und Hybridisierung bei einer Temperatur von etwa 50 bis 95ºC durchgeführt werden können.
- Die Zeitspanne zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird gewöhnlich lange genug sein, um die gewünschte Anzahl von Kopien des einzelsträngigen Polynukleotids oder einer dazu komplementären Sequenz zu erhalten. Dies hängt wiederum von dem Zweck ab, zu dem die Amplifizierung durchgeführt wird, wie z.B. ein Assay für einen Polynukleotid-Analyten. Im allgemeinen wird die Zeitspanne zur Durchführung des Verfahrens etwa 1 bis 10 Minuten pro Zyklus betragen und es kann jede Anzahl von Zyklen von 1 bis 200 oder mehr, gewöhnlich 1 bis 80, häufig 20 bis 80, verwendet werden. Aus Gründen der Bequemlichkeit wird es gewöhnlich wünschenswert sein, die Zeitspanne und die Anzahl der Zyklen zu minimieren. Im allgemeinen kann die Zeitspanne für einen gegebenen Amplifizierungsgrad verkürzt werden, beispielsweise durch die Wahl von Konzentrationen an Nukleosid-Triphosphaten, welche ausreichen, die Polynukleotid- Polymerase zu sättigen, und durch Erhöhung der Konzentrationen an Polynukleotid-Polymerase und Polynukleotid-Primer.
- Die Menge des zu kopierenden einzelsträngigen Polynukleotids kann nur 1 bis 2 Moleküle in einer Probe betragen, wird jedoch gewöhnlich von etwa 10² bis 10¹&sup0;, noch üblicher von etwa 10³ bis 10&sup8;, Molekülen in einer Probe variieren. Die Menge des Polynukleotid-Primers wird mindestens so groß wie die Anzahl der gewünschten Kopien sein und gewöhnlich 10&supmin;¹&sup5; bis 10&supmin;&sup9; Mol pro Probe betragen, wobei die Probe 10-1000 µl aufweist. Gewöhnlich wird der Primer mit mindestens 10&supmin;¹²M, vorzugsweise 10&supmin;¹&sup0; M, und noch bevorzugter mit mindestens 10&supmin;&sup8;M anwesend sein. Vorzugsweise ist die Konzentration des Polynukleotid-Primers wesentlich größer, vorzugsweise mindestens Mal größer, als die Konzentration des einzelsträngigen Polynukleotids.
- Die Endkonzentration jedes der Reagenzien wird normalerweise empirisch bestimmt werden, um die Anzahl der Kopien der Target- Sequenz zu optimieren.
- Die Konzentration der Desoxynukleosid-Triphosphate in dem Medium kann in großem Umfang variieren; vorzugsweise sind diese Reagenzien im Überschuß vorhanden. Die Desoxynukleosid-Triphosphate werden gewöhnlich mit 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;²M, vorzugsweise 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;³M, vorhanden sein.
- Die Konzentration der Matrizen-abhängigen Polynukleotid-Polymerase wird gewöhnlich empirisch bestimmt werden. Vorzugsweise wird eine Konzentration eingesetzt, die ausreicht, daß eine weitere Erhöhung der Konzentration die Zeit für die Amplifizierung nicht um mehr als das 5-Fache, vorzugsweise 2-Fache, verringert. Den in erster Linie limitierenden Faktor stellen gewöhnlich die Kosten des Reagenzes dar.
- Die Reihenfolge beim Kombinieren der verschiedenen Reagenzien zur Bildung der Kombination kann variieren. Gewöhnlich ist ein einzelsträngiges Polynukleotid mit ersten und zweiten flankierenden Sequenzen die Target-Polynukleotidsequenz in der Probe selbst oder wird als Funktion der Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in der Probe gebildet. Dieses kann mit einer vorbereiteten Kombination von Polynukleotid-Primer, Nukleosid-Triphosphaten und Matrizenabhängiger Polynukleotid-Polymerase kombiniert werden. Jedoch können eine gleichzeitige Zugabe aller obigen sowie andere stufenweisen oder sequentiellen Reihenfolgen der Zugabe angewandt werden.
- Die Konzentration und Zugabereihenfolge der Reagenzien und die Bedingungen für das Verfahren werden allgemein durch den Wunsch bestimmt, die Kopienzahl der einzelsträngigen Polynukleotidsequenz und die Geschwindigkeit, mit der solche Kopien gebildet werden, zu maximieren. Im allgemeinen ist es wünschenswert, die Kopienzahl der einzelsträngigen Polynukleotidsequenz mindestens um einen Faktor von 10², vorzugsweise einen Faktor von 10&sup4;, noch bevorzugter 10&sup6; oder mehr, zu erhöhen.
- Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung für die Bestimmung oder den Nachweis eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe. Im allgemeinen umfaßt das Verfahren als Ergebnis der Anwesenheit eines Analyten die Bildung eines einzelsträngigen Polynukleotids, das von ersten und zweiten Polynukleotidflankierenden Sequenzen flankiert ist, gemäß Schritt (a) wie in Anspruch 8 angegeben. Es werden dann mehrfache Kopien des einzelsträngigen Polynukleotids hergestellt. Direkter oder indirekter Nachweis des so gebildeten einzelsträngigen Polynukleotids zeigt die Anwesenheit des Analyten an.
- Das einzelstrangige Polynukleotid kann durch Kontaktieren der Probe mit ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden gebildet werden. Die erste Sonde umfaßt eine Sequenz an ihrem 3'-Ende, die komplementär zu einem ersten Abschnitt eines Stranges des Analyten ist, und eine erste flankierende Sequenz. Die zweite Sonde umfaßt eine Sequenz an ihrem 5'-Ende, die komplementär zu einem zweiten Abschnitt desselben Stranges des Analyten ist, und eine zweite flankierende Sequenz. Die ersten und zweiten flankierenden Sequenzen sind zu mindestens 50 - 65% zueinander komplementär und werden häufig zu 80-100% komplementär sein. Der Kontakt wird unter Bedingungen durchgeführt, um die ersten und zweiten Sonden an den Analyten zu binden. Dann werden Bedingungen bereitgestellt, um die ersten und zweiten Polynukleotid- Sonden nur miteinander zu ligieren, wenn sie an den Analyten gebunden sind.
- Die Kombinationsreihenfolge der verschiedenen Reagenzien zur Bildung der Kombination kann variieren und kann gemeinsam oder gleichzeitig oder ganz oder teilweise sequentiell sein. Im allgemeinen wird eine Probe erhalten, die eine Analyten-Sequenz enthält. Diese kann mit einer vorbereiteten Kombination von ersten und zweiten Polynukleotid- Sonden, Nukleosid-Triphosphaten und Polynukleotid-Polymerase kombiniert werden, gefolgt von der Zugabe einer Ligase. Es können jedoch auch eine gleichzeitige Zugabe der obigen, sowie andere stufenweisen oder sequentiellen Reihenfolgen der Zugabe angewandt werden. Die Konzentration und die Zugabereihenfolge der Reagenzien und die Bedingungen für das Verfahren sind allgemein durch den Wunsch bestimmt, die Hybridisierung aller Target-Polynukleotidsequenzen mit den ersten und zweiten Folynukleotid-Sonden und die kovalente Verknüpfung der so hybridisierten ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden zu optimieren.
- Ein Mittel zur kovalenten Verknüpfung der ersten und zweiten Sonden, wenn diese Sonden mit der Target-Polynukleotidsequenz hybridisiert sind, beinhaltet die Kettenverlängerung der ersten Sonde, um die ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden aneinander angrenzend zu machen. Ein Mittel zur Verlängerung der ersten Sonde umfaßt die Zugabe einer Polynukleotid-Polymerase und von Desoxynukleotid- Triphosphaten zu dem flüssigen Medium und Inkubation des Mediums unter Bedingungen zur Bildung einer Kettenverlängerung am 3'-Ende der ersten Sonde, um sie an die zweite Polynukleotid-Sonde angrenzend zu machen, wenn diese Sonden mit dem Analyten hybridisiert sind.
- Sind die ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden aneinander angrenzend gemacht worden, wenn sie mit der Analyten-Sequenz hybridisiert sind, werden die ersten und zweiten Sonden anschließend kovalent verknüpft. Ein Verfahren zur Erzielung einer kovalenten Verknüpfung der ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden ist der Einsatz enzymatischer Mittel. Vorzugsweise kann das Medium, welches die ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden mit der Analyten- Sequenz hybridisiert enthält, mit einer Ligase behandelt werden, welche die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem 5'- Ende einer Sonde und dem 3'-Ende der anderen katalysiert.
- Es kann jedes Enzym eingesetzt werden, welches imstande ist, die Reaktion der 3'-Hydroxylgruppe des Polynukleotids zu katalysieren. Erläuternde, jedoch nicht beschränkende, Beispiele solcher Enzyme sind Polynukleotid-Ligasen beliebigen Ursprungs, wie z.B. bakterielle E. coli-Ligase, T4-Phagen-DNA-Ligase, Säuger-DNA-Ligase und dgl. pH, Temperatur, Lösungsmittel und zeitliche Erwägungen werden ähnlich sein wie oben für das Verfahren der Erfindung beschrieben.
- Ein weiteres Mittel zur Erreichung der kovalenten Verknüpfung der ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden, wenn die Sonden mit nicht aneinander angrenzenden Abschnitten der Analyten-Sequenz hybridisiert sind, beinhaltet die Verwendung einer Nukleotidsequenz, welche ausreichend komplementär zu dem Lücken-Abschnitt der Analyten- Sequenz ist, der zwischen den ersten und zweiten Nukleotid-Sonden liegt. Für die Zwecke dieser Beschreibung wird eine derartige Nukleotidsequenz als intervenierende Linker-Sequenz bezeichnet werden. Die Linker-Sequenz kann nach bekannten Verfahren hergestellt werden, wie sie oben für die Herstellung von beispielsweise der ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden beschrieben wurden. Die Linker-Sequenz kann mit der Analyten-Sequenz zwischen den ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden hybridisiert werden. Die Linker- Sequenz kann dann sowohl mit der ersten als auch der zweiten Polynukleotid-Sonde mit Hilfe enzymatischer Mittel wie oben beschrieben ligiert werden. Es ist auch möglich, Kombinationen von Linker-Sequenzen und Polymerase einzusetzen, um eine zusammenhängende Beziehung zwischen den ersten und zweiten Polynukleotidsequenzen zu erreichen, wenn diese Sequenzen an den Analyten gebunden sind.
- Nach der Ligierung der ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden, wenn diese Sonden mit dem Polynukleotid-Analyten hybridisiert sind, werden die hybridisierten Polynukleotide dissoziiert. Da jede der Sonden eine flankierende Sequenz enthält, die potentiell mit einer flankierenden Sequenz der anderen hybridisierbar ist, enthält das einzelsträngige Polynukleotid ebenfalls diese Sequenzen. Mehrfache Kopien des einzelstrangigen Polynukleotids, das aus den ligierten Proben resultiert, werden dann nach den oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines einzelnen Polynukleotid-Primers hergestellt.
- Der Nachweis der ersten flankierenden Sequenz, die mit der zweiten flankierenden Sequenz verknüpft ist, oder der Nachweis des einzelsträngigen Polynukleotids oder dessen komplementärer Sequenz zeigt die Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten in der Probe an.
- Ein Beispiel der Bestimmung eines Polynukleotid-Analyten ist nur beispielhaft und nicht als Beschränkung im Schema 2 (Figur 5) dargestellt.
- Der Polynukleotid-Analyt wird durch VII dargestellt, worin zwei Polynukleotid-Sonden mit einem Abschnitt des Target-Analyten hybridisiert sind. Die Sonden enthalten die Sequenzen 2a bzw. 2b, welche mindestens teilweise zueinander komplementär sind. Das Molekül VII wird behandelt, um die Sonden ligierbar zu machen und die Sonden zu ligieren. Dies kann erreicht werden wie oben beschrieben und ist als Molekül VIII im Schema 2 (Figur 5) dargestellt. Eine Dissoziation von VIII ergibt das Molekül IX, welches ein einzelsträngiges Polynukleotid mit zwei mindestens teilweise komplementären Sequenzen 2a und 2b ist. Wie ersichtlich, ist Molekül IX dem Molekül II im Schema 1 (Figur 4) ähnlich und kann mit einem Polynukleotid-Primer 2c kombiniert werden, welcher mit der Sequenz 2b des Moleküls IX hybridisiert, um das Molekül X zu ergeben. Eine Kettenverlängerung des Primers 2c wie oben beschrieben ergibt das Molekül XI. Dissoziation von XI, gefolgt von Hybridisierung mit Primer 2c und Kettenverlängerung ergibt mehrfache Kopien des Moleküls IX oder einer dazu komplementären Sequenz. Das einzelsträngige Polynukleotid wird entweder als Einzelstrang nachgewiesen oder mit seinem komplementären Strang hybridisiert. Die Anwesenheit ligierter Sonden zeigt die Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten in der Probe an.
- Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Anwendung für den Nachweis eines Polynukleotid-Analyten wird ein wäßriges Medium eingesetzt, welches ferner andere polare Lösungsmittel wie oben beschrieben enthalten kann. pH, Temperatur, Zeit und Konzentration von Reagenzien werden im allgemeinen diejenigen sein, die oben zur Bildung mehrfacher Kopien eines einzelstrangigen Polynukleotids beschrieben wurden.
- Der pH des Mediums wird gewöhnlich im Bereich von etwa 4,5 bis 9,5, gewöhnlich im Bereich von etwa 5,5 - 8,5, und vorzugsweise im Bereich von etwa 6 - 8 liegen&sub6;
- Die Temperaturen für das Verfahren werden gewöhnlich im Bereich von etwa 20 bis 90ºC, gewöhnlicher von etwa 30 bis 70ºC, vorzugsweise 37 bis 50ºC, liegen.
- Im allgemeinen wird die Zeitspanne zur Durchführung des Verfahrens etwa 5 bis 200 Minuten betragen. Aus Gründen der Bequemlichkeit wird es gewöhnlich wünschenswert sein, die Zeitspanne zu minimieren.
- Die Konzentration des Target-Polynukleotid-Analyten kann so niedrig wie möglicherweise nur 1 Molekül, vorzugsweise mindestens 10&supmin;²¹M, in einer Probe sein, wird jedoch gewöhnlich von etwa 10&supmin;¹&sup4;M bis 10&supmin;¹&sup9;M, gewöhnlicher von etwa 10&supmin;¹&sup6; bis 10&supmin;¹&sup9;M, variieren. Die Konzentration der ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden und der Desoxynukleosid-Triphosphate in dem Medium können in großem Umfang variieren. Vorzugsweise werden diese Reagenzien in großem molarem Überschuß über die erwartete Menge des Target-Analyten vorliegen. Die Desoxynukleosid-Triphosphate werden gewöhnlich mit 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;²M, vorzugsweise 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;³M, vorhanden sein. Die zweite Polynukleotid-Sonde sowie die erste Polynukleotid-Sonde werden gewöhnlich mit mindestens 10&supmin;¹²M, vorzugsweise 10&supmin;¹&sup0;M, noch bevorzugter mindestens etwa 10&supmin;&sup8;M, vorhanden sein.
- Die Konzentration der Polymerase und etwaiger Cofaktoren in dem Medium kann ebenfalls wesentlich variieren. Diese Reagenzien können mit nur 10&supmin;¹²M vorhanden sein, können jedoch in einer Konzentration vorhanden sein, die mindestens genauso hoch oder höher als die Konzentration der ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden ist.
- Während die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich des Polynukleotid-Analyten bestimmt werden, wird die Endkonzentration jedes der Reagenzien normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays über den interessierenden Bereich zu optimieren. Die Konzentration der anderen Reagenzien in einem Assay wird gewöhnlich nach demselben Prinzipien bestimmt wie oben für das Amplifizierungsverfahren dargelegt. Die Hauptüberlegung ist, daß eine ausreichende Kopienzahl eines einzelstrangigen Polynukleotids im Verhältnis zur Polynukleotid-Analyten-Sequenz erzeugt wird, so daß solche Kopien leicht nachgewiesen werden können und eine genaue Bestimmung des Polynukleotid-Analyten ermöglichen.
- Nachdem das Medium entweder gleichzeitig oder sequentiell unter den obigen Bedingungen inkubiert ist, werden etwa vorhandene(s) einzelsträngiges Polynukleotid oder ligierte Target-bindende Sequenzen der ersten und zweiten Sonden nachgewiesen. Die Anwesenheit der ligierten Sequenzen zeigt die Anwesenheit des Polynukleotid- Analyten in der Probe an. Die ligierten Sequenzen können auf vielfache Weise nachgewiesen werden.
- Bei dem vorliegenden Verfahren können einige Moleküle des Polynukleotid-Primers mit einem Liganden (B) wie z.B. Biotin markiert sein und andere Moleküle des Polynukleotid-Primers können mit einer nachweisbaren (F) Markierung wie Fluorescein markiert sein.
- Der Ligand kann ein kleines organisches Molekül, eine Polynukleotidsequenz, ein Protein oder dgl. sein. Nach der Amplifizierung wird eine Mischung von Doppelsträngen erhalten (siehe Schema 3 (Figur 6)), wobei einige Liganden an beiden Enden, einige nachweisbare Markierung an beiden Enden, und einige (einen) Liganden an einem Ende und eine nachweisbare Markierung am anderen Ende aufweisen. Die Verhältnisse der Produkte können modifiziert werden durch Variation des Verhältnisses der beiden unterschiedlich markierten Primer. Die Doppelstränge können nachgewiesen werden, indem das Molekül veranlaßt wird, an eine Oberfläche zu binden, an die ein Rezeptor für den Liganden gebunden ist. Doppelstränge, enthaltend die beiden Primer- Markierungen, die kürzer sind als das einzelstrangige Polynukleotid mit seinen ersten und zweiten flankierenden Sequenzen, können an der Bindung gehindert werden, indem Bedingungen eingesetzt werden, welche stringent genug sind, um nur diese kürzeren Doppelstränge zu dissoziieren. Nach der Entfernung von ungebundenem Material wird der Träger auf die Anwesenheit einer nachweisbaren Markierung überprüft. Deren Anwesenheit zeigt die Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten in der Probe an.
- Bei einer weiteren Vorgehensweise können die intern hybridisierbaren Sequenzen selektioniert werden, da ein synthetischer oder natürlicher Rezeptor existiert, welcher an die hybridisierten Sequenzen binden kann. Die Sequenzen werden gewöhnlich eingeführt, indem sie zwischen der Target-Polynukleotid-bindenden Sequenz und einer flankierenden Sequenz einer Polynukleotid-Sonde oder des einzelsträngigen Polynukleotids eingeschlossen werden. Alternativ können sie als Markierungen am 5'-Ende eines Abschnitts der Polynukleotid-Primer- Moleküle eingeführt werden. Der Tetracyclin-Repressor ist ein derartiger Rezeptor. Dieses Protein bindet an den Tetracyclin- Operator und die hybridisierten Sequenzen können ausgewählt werden, um einen Teil dieses Operators oder den ganzen Operator zu umfassen. Der Repressor wird an einen festen Träger gebunden und zur Absorption und Konzentration des Amplifizierungsprodukts aus der Amplifizierungsreaktionslösung eingesetzt. Das gebundene Produkt kann dann nachgewiesen werden durch Anfärbung mit einem Farbstoff wie Acridin-Orange, durch Veränderungen einer physikalischen Eigenschaft des Adsorptionsmittels wie elektrische Eigenschaften, optische Eigenschaften, akustische Wellenmodulation und dgl., oder durch den Nachweis der Anwesenheit einer Markierung, die an einen anderen Abschnitt der Polynukleotid-Primer-Moleküle gebunden ist.
- Es können andere Operator-Repressor-Paare eingesetzt werden, einschließlich z.B. der lac-Repressor und Operator, welche als Ligand und Rezeptor zum Einfangen von DNA-Doppelsträngen verwendet wurden, und der Tryptophan-Repressor und Operator.
- Bei einer weiteren Verfahrensweise kann Bromdesoxynridin in einen Abschnitt der Polynukleotid-Primer-Moleküle inkorporiert werden und Antikörper gegen Bromdesoxynridin eingesetzt werden. Der Nachweis der gebundenen Sequenz kann nach irgendeinem der obigen Verfahren durchgeführt werden.
- Bei einem bevorzugten Weg zum Nachweis des einzelsträngigen Polynukleotids werden die Polynukleotide gleichzeitig oder sequentiell denaturiert durch Erwärmung oder Verwendung von denaturierenden Lösungsmitteln und gelöster Stoffe und dazu veranlaßt, an einen Träger durch z.B. eines der obigen Verfahren zu binden. Der Träger wird dann mit einer Sonde in Kontakt gebracht, die eine Nukleinsäuresequenz und eine Markierung oder Rezeptor- Bindungsstelle umfaßt. Die Nukleinsäuresequenz ist mindestens komplementär zu demjenigen Abschnitt des einzelsträngigen Polynukleotids, der ligiert wurde, oder dessen komplementärer Sequenz. Die Anwesenheit des einzelsträngigen Polynukleotids wird dann durch die Anwesenheit der Markierung oder der Rezeptor- Bindungsstelle auf dem Träger angezeigt.
- In einem weiteren Assay-Format (wie dargestellt in Schema 4 (Figur 7)), kann das einzelsträngige Polynukleotid, welches die intern hybridisierbaren Sequenzen 3a und 3b enthält, als Markierung eingesetzt werden. Bei diesem Verfahren kann jedes Mittel, wie z.B. die Bildung eines DNA-Sandwiches, verwendet werden, um einen markierten Nukleinsäurestrang zur Bindung an eine Oberfläche zu veranlassen. Bei dem Sandwich-Verfahren werden zwei Sonden eingesetzt, die an einen Target-Analyten binden können. Eine dieser Sonden ist an eine feste Oberfläche gebunden oder kann zur Bindung veranlaßt werden, beispielsweise durch den Einsatz von Liganden- Rezeptor-Bindung, wie z.B. Biotin-Avidin. Die andere Sonde trägt das einzelsträngige Polynukleotid als Markierung. Nach (1) Hybridisierung der Sonden mit der Target-Polynukleotidsequenz, (2) Bindung des Komplexes an die Oberfläche, wenn eine der Sonden nicht bereits gebunden ist, und (3) Waschen der Oberfläche, wird das einzelsträngige Polynukleotid veranlaßt, den vorliegenden Amplifizierungsprozeß zu initiieren, und die Produkte werden durch irgendein günstiges Verfahren zum Nachweis spezifischer Polynukleotidsequenzen, einschließlich der oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis des einzelsträngigen Polynukleotids, nachgewiesen.
- Es kann jedes Standardverfahren zum spezifischen Nachweis von doppelsträngigen Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden.
- Ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren besteht in der Verwendung von Nukleinsäure-Sonden. Dieses Verfahren beinhaltet im allgemeinen die Immobilisierung der Target-Nukleinsäure auf einem festen Träger wie Nitrocellulosepapier, Cellulosepapier, diazotiertem Papier oder einer Nylonmembran. Nachdem die Target-Nukleinsäure auf dem Träger fixiert ist, wird der Träger mit einer geeignet markierten Sonden-Nukleinsäure etwa 10 Minuten bis 48 Stunden lang in Kontakt gebracht. Nach der obigen Zeitspanne wird der feste Träger mehrmals gewaschen, um die ungebundene Sonde zu entfernen, und das hybridisierte Material durch Autoradiographie oder spektroskopische Verfahren nachgewiesen.
- Ein Verfahren unter Einsatz von Sonden ist in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 773,386, eingereicht am 6. September 1985 (siehe auch die äquivalente EP-A-224 995) beschrieben. Das Verfahren umfaßt das Kombinieren der Probe und ersten und zweiten Polynukleotid-Reagenzien, die zu dem Nukleinsäurefragment komplementär sind, in einem Assay-Medium. Jedes der ersten und zweiten Reagenzien hybridisiert mit einem anderen Bereich des Nukleinsäurefragments. Das erste Reagenz enthält Mittel, um das erste Reagenz auf nicht-kovalente Weise polymerisierbar zu machen. Das zweite Reagenz enthält Mittel, um das zweite Reagenz nachweisbar zu machen. Die Probe und die ersten und zweiten Reagenzien werden im Assay-Medium unter Bedingungen zur Polymerisation des ersten Reagenzes kombiniert, wobei das zweite Reagenz an das polymerisierte erste Reagenz nur gebunden wird, wenn das DNA-Fragment in der Probe vorhanden ist. Dann wird eine Bestimmung durchgeführt, ob das zweite Reagenz an das polymerisierte erste Reagenz gebunden worden ist.
- Zur Trennung des einzelsträngigen Polynukleotids von anderen Komponenten in einer Assay-Mischung, die eine Probe enthält, kann es wünschenswert sein, und in manchen Fällen in der Tat vorzuziehen, daß die erste oder zweite Polynukleotid-Sonde oder das einzelsträngige Polynukleotid Mittel zur Immobilisierung der Sequenz aufweist oder imstande ist, diese aufzuweisen. Im allgemeinen beinhaltet dieses Mittel zur Immobilisierung einen Träger. Die fragliche Sequenz kann behandelt werden, um die Sequenz vor der Verwendung dieser Sequenz im erfindungsgemäßen Verfahren an einen Träger zu binden. Zur Bindung von Nukleotidsequenzen an feste Träger sind zahlreiche Verfahren bekannt. Siehe beispielsweise T. Goldkorn et al., Nucleic Acids Research (1986) 14:9171-9191 und die darin enthaltenen Referenzen. Im allgemeinen beinhalten die Verfahren zur Verknüpfung der Nukleotidsequenz mit Trägern chemische Modifizierungen einiger Nukleotide in der Sequenz, wodurch die Sequenz dann mit dem Träger verknüpft werden kann. Vorzugsweise wird die Bindung zwischen dem Träger und der Nukleotidsequenz kovalent sein, noch bevorzugter eine Verknüpfungsgruppe zwischen der Nukleotidsequenz und dem Träger beinhalten. Beispielsweise kann der Träger behandelt werden, um Maleimidgruppen einzuführen, und die Nukleotidsequenz kann behandelt werden, um eine Thiolgruppe einzuführen. Die Thiolgruppe kann mit dem aktivierten Olefin der Maleimidgruppe reagieren und auf solche Weise kann die Nukleotidsequenz kovalent an den Träger gebunden werden. Beispiele anderer derartiger Verknüpfungsgruppen sind Cellulose, derivatisiert mit Diazobenzyloxymethylgruppen, wie von Noyes, B.E. und Start, G.R., Cell 5, 301 (1975) und Alwine, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5350 (1977) beschrieben, und mit o-Aminophenylthioether derivatisierte Cellulose, wie von Seed, B., Nucleic Acids Res., 10, 1799 (1982) beschrieben.
- Ist die Nukleotidsequenz ursprünglich nicht an einen Träger gebunden, kann es wünschenswert sein, daß eine der beiden Sequenzen zu irgendeinem Zeitpunkt während des Verfahrens der Erfindung, vorzugsweise vor der Feststellung, ob die ersten und zweiten Target- Polynukleotid-bindenden Sequenzen als Ergebnis der Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten kovalent verknüpft wurden, an einen Träger gebunden wird. Dementsprechend müssen der Träger und eine der Nukleotidsequenzen reaktive Gruppen enthalten, welche eine Verknüpfung zwischen dem Träger und der Nukleotidsequenz ergeben können. Die Natur der reaktiven Gruppen wird derart sein, daß sie mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kompatibel ist.
- Ein solches System ist das oben beschriebene, worin der Träger Maleimidgruppen und die Nukleotidsequenz eine Thiolgruppe enthalten würde. In einer weiteren Ausführungsform können die Nukleotidsequenz und der Träger komplementäre Mitglieder eines spezifischen Bindungspaares wie Biotin-Avidin und dgl. enthalten. So kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Lösung durchgeführt werden und zur geeigneten Zeit der Träger eingeführt werden, an den die komplementären sbp-Mitglieder binden werden. Nachdem der Träger zur Entfernung von ungebundenem Material gewaschen wurde, können weitere Reaktionen oder Bestimmungen durchgeführt werden.
- Andere Beispiele solcher Systeme sind Repressor-Operator-Wechselwirkungen, wobei eine der Nukleotidsequenzen durch deren sequenzspezifische Wechselwirkung mit einem spezifischen Repressor oder Modulatorprotein, der oder das auf der festen Oberfläche immobilisiert ist, auf der festen Oberfläche eingefangen wird. Ein Vorteil dieser Ausführungsform der Einfangphase besteht darin, daß in einigen Fällen die Freisetzung der Operator-DNA von dem Repressor durch Behandlung des Komplexes mit einem Inducer-Molekül erreicht werden kann. Beispielsweise kann der Tetracyclin-Repressor auf einer festen Oberfläche immobilisiert sein, so daß eine Operator-Sequenz, die auf der einen oder anderen Nukleotidsequenz vorhanden ist, spezifisch eingefangen und zurückgehalten wird, wenn die Lösung mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird. Die Oberfläche kann dann gewaschen werden, um etwaige nicht-spezifische Bindung zu eliminieren, und schließlich kann das den Operator enthaltende Nukleotid von der Oberfläche freigesetzt werden, indem der an die Oberfläche gebundene Repressor-Operator-Komplex mit einem "Inducer" - Molekül (Tetracyclin oder eines seiner aktiven Analoga in diesem Fall) in Kontakt gebracht wird.
- Das "Inducer"-Molekül kann der "natürliche Inducer" in dem Sinne sein, daß es strukturell identisch ist mit dem Molekül in der Natur, welches die Dissoziation des biologischen/regulatorischen Repressor- Operator-Komplexes verursacht, oder es kann ein synthetisches Analogon des natürlichen Inducers mit ähnlicher oder erhöhter Bindungs- und Komplex-Dissoziierungs-Aktivität sein. Beispiele des obigen umfassen die Tetracyclin-Repressor-Operator-Wechselwirkung und deren Dissoziation durch Tetracyclin wie von Hillen, W. et al., J. Mol. Biol., 169, 707-721 (1983) und Klock, G. et al., J. Bact., 161, 326-332 (1985) beschrieben.
- Falls die Nukleotidsequenz kovalent mit dem Träger verknüpft ist, kann es wünschenswert sein, die verknüpfte Sequenz von dem Träger zu entfernen, beispielsweise um die Sequenz zu amplifizieren oder zu klonieren. In dieser Situation ist es wünschenswert, eine spaltbare Gruppe zwischen der Nukleotidsequenz und dem Träger einzuführen. Beispiele solcher spaltbaren Gruppen sind Pyrophosphatverknüpfungen, Disulfidverknüpfungen und Restriktionsenzym- Spaltstellen.
- Nachdem Vorsorge getroffen wurde, um die ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden kovalent zu verknüpfen, wenn diese Sequenzen mit dem Polynukleotid-Analyten hybridisiert sind, um ein einzelsträngiges Polynukleotid zu erzeugen, und nach der Amplifizierung des einzelstrangigen Polynukleotids, falls vorhanden, wird die Anwesenheit der kovalent verknüpften ersten und zweiten Target-Polynukleotid-bindenden Sequenzen bestimmt. Die Anwesenheit der kovalenten Verknüpfung zeigt die Anwesenheit des Polynukleotid- Analyten in der Probe an. Wie oben erwähnt, kann diese Bestimmung eine Nukleotidsequenz beinhalten, die an einen Träger gebunden ist oder imstande ist, gebunden zu werden. Der Träger wird aus dem Medium entfernt, von ungebundenem Material freigewaschen und dann auf die gekoppelten ersten und zweiten Target-Polynukleotid-bindenden Sequenzen überprüft, beispielsweise durch den Nachweis der Anwesenheit einer Markierung oder einer Reportergruppe. Im allgemeinen beinhaltet diese Prüfung das Kontaktieren des Trägers mit den verbleibenden Mitgliedern eines signalerzeugenden Systems, um ein Signal in Beziehung zur Anwesenheit der Target-Nukleotidsequenz in der Probe zu erzeugen.
- Der Einsatz des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, einen Träger unter Bedingungen zu waschen, die normalerweise härter sein werden als diejenigen, wenn die Hybridisierung ohne kovalente Verknüpfung durchgeführt wird. Häufig werden die Waschbedingungen an den Träger gebundene Komplexe vollständig dissoziieren. Diese Bedingungen umfassen Lösungen, welche chaotrope Agentien wie Harnstoff, entweder allein oder in Kombination mit anderen denaturierenden Agentien wie Formamid, umfassen, die entweder bei Umgebungstemperatur oder erhöhter Temperatur eingesetzt werden. Die kovalente Verknüpfung zwischen den ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden und die Bindung von einer der Sonden an eine Oberfläche wird jedoch nicht beeinflußt werden. Der Nachweis des resultierenden markierten Materials, das an den Träger gebunden ist, wird die Anwesenheit der Target-Nukleotidsequenz in der Probe anzeigen.
- Der Nachweis des Signals wird von der Natur des verwendeten signalerzeugenden Systems abhängen. Ist die Markierung oder Reportergruppe ein Enzym, würden zusätzliche Mitglieder des signalerzeugenden Systems Enzym-Substrate etc. einschließen. Das Produkt der Enzymreaktion ist vorzugsweise ein lumineszierendes Produkt oder ein fluoreszierender oder nicht-fluoreszierender Farbstoff, das oder der jeweils spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann, oder ein Produkt, das durch andere spektrometrische oder elektrometrische Mittel nachgewiesen werden kann. Ist die Markierung ein fluoreszierendes Molekül, kann das Medium bestrahlt und die Fluoreszenz bestimmt werden. Ist die Markierung eine radioaktive Gruppe, kann das Medium gezählt werden, um die radioaktiven Impulse zu bestimmen.
- Ein weiterer Aspekt eines Verfahrens zum Nachweis der Anwesenheit eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, beinhaltet die Ligierung von dritten und vierten Sequenzen einer Polynukleotid-Sonde, wobei die dritten und vierten Sequenzen mit separaten Abschnitten des Analyten hybridisierbar sind und nur in Gegenwart des Analyten ligierbar sind oder imstande sind, ligierbar gemacht zu werden. Wenn die dritten und vierten Sequenzen ligiert sind, kann das so gebildete einzelsträngige Polynukleotid in einen zirkulären Polynukleotid- Strang inkorporiert werden. Die Polynukleotid-Sonde umfaßt ferner mindestens teilweise komplementäre erste und zweite Sequenzen.
- Eine Verlängerung eines Polynukleotid-Primers wird in der Gegenwart von Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotidpolymerase gebildet. Mindestens das 3'-Ende des Polynukleotid- Primers kann mit den ersten oder zweiten Sequenzen der Polynukleotid- Sonde hybridisieren. Anschließend wird verlängerter Polynukleotid- Primer und/oder eine Sequenz nachgewiesen, die identisch mit und/oder komplementär zu mindestens demjenigen Abschnitt der ligierten dritten oder vierten Sequenzen ist, welcher komplementär zu den separaten Abschnitten des Analyten ist. Die Anwesenheit eines der obigen zeigt die Anwesenheit des Polynukleotid-Analyten in der Probe an.
- Zur Herstellung eines Polynukleotid-Primers, von ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden oder einer einzelstrangigen Polynukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene Techniken eingesetzt werden. Sie können durch biologische Synthese oder durch chemische Synthese erhalten werden. Für kurze Sequenzen (bis zu etwa 100 Nukleotide) wird eine chemische Synthese im Vergleich zur biologischen Synthese häufig wirtschaftlicher sein. Über die Wirtschaftlichkeit hinaus bietet die chemische Synthese ein bequemes Mittel zur Inkorporierung von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht und/ oder modifizierten Basen während des Syntheseschritts. Ferner ist die chemische Synthese sehr flexibel hinsichtlich der Wahl der Länge und des Bereichs der Target- Polynukleotid-bindenden Sequenz. Der Polynukleotid-Primer kann nach Standardverfahren synthetisiert werden, wie z.B. diejenigen, welche bei kommerziellen automatisierten Nukleinsäure-Synthesizern verwendet werden. Die chemische Synthese von DNA auf einem geeignet modifizierten Glas oder Harz kann in DNA resultieren, die kovalent mit der Oberfläche verknüpft ist. Dies kann Vorteile beim Waschen und der Probenhandhabung bieten. Für längere Sequenzen können in der Molekularbiologie eingesetzte Standard-Replikat ionsverfahren verwendet werden, wie z.B. diejenigen, welche in handelsüblichen Kits zur Herstellung von RNA (z.B. von Promega) eingesetzt werden, und die Verwendung von M13 für einzelsträngige DNA, wie von J. Messing (1983) Methods Enzymol, 101, 20-78, beschrieben.
- Andere Verfahren der Oligonukleotid-Synthese umfassen Phosphotriester- und Phosphodiester-Verfahren (Narang, et al. (1979) Meth. Enzymol 68: 90) und Synthese auf einem Träger (Beaucage, et al. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1862) sowie die Phosphoramidat- Technik, Caruthers, M.H., et al., "Methods in Enzymology,", Bd. 154, S. 287-314 (1988) und andere, die in "Synthesis and Applications of DNA and RNA", S.A. Narang, Herausgeber, Academic Press, New York, 1987 und den darin enthaltenen Referenzen beschrieben werden.
- Das einzelsträngige Polynukleotid oder die ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden können durch enzymatische Ligierung hergestellt werden. Zwei geeignete komplementäre Oligonukleotide können durch automatisierte Standardverfahren hergestellt werden. Sie werden dann enzymatisch mit einer weiteren Polynukleotidsequenz ligiert, beispielsweise durch T4-Ligase, um das einzelsträngige Polynukleotid zu erzeugen, oder sie werden jeweils einzeln mit verschiedenen Polynukleotidsequenzen ligiert, wobei die letzteren jeweils mit einem Abschnitt eines Polynukleotid-Analyten hybridisierbar sind. Die gewünschten Produkte können dann beispielsweise durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese oder Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) isoliert werden.
- In einigen Fällen wird das 3'-Ende des einzelstrangigen Polynukleotids oder der zweiten Polynukleotid-Sonde modifiziert werden, um die Reaktion mit Matrizen-abhängiger DNA-Polymerase zu verhindern oder um eine bindende Sequenz anzuhängen. Das 3'-Ende kann beispielsweise modifiziert werden durch Ligierung eines Didesoxynukleotids oder eines Ribonukleotids, gefolgt von Oxidation der Ribose mit Periodat, gefolgt von reduktiver Aminierung des resultierenden Dialdehyds mit Borhydrid und einem sperrigen Amin wie Aminodextran.
- Der Polynukleotid-Primer kann nach automatisierten Standardverfahren hergestellt werden.
- Aus Gründen der Bequemlichkeit können die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Reagenzien in einem Kit in abgepackter Kombination mit vorherbestimmten Mengen an Reagenzien zur Verwendung im vorliegenden Verfahren bereitgestellt werden. Bei dem Nachweis eines Polynukleotid-Analyten in einer Probe kann ein für das vorliegende Verfahren geeigneter Kit in abgepackter Kombination mit anderen Reagenzien umfassen einen Polynukleotid-Primer und erste und zweite Polynukleotid-Sonden, welche markiert sein können oder von denen eine an einen Träger gebunden sein kann oder mit Gruppen versehen werden kann, um die Sequenz markiert oder an einen Träger gebunden zu machen. Zur Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung mehrfacher Kopien eines einzelsträngigen Polynukleotids wird der Kit einen Polynukleotid-Primer enthalten. Jeder der obigen Kits kann ferner in der abgepackten Kombination Nukleosid-Triphosphate wie Desoxynukleosid-Triphosphate, z.B. Desoxyadenosin-Triphosphat (dATP), Desoxyguanosin-Triphosphat (dGTP), Desoxycytidin-Triphosphat (dCTP) und Desoxythymidin-Triphosphat (dTTP) umfassen. Der Kit kann ferner eine Polynukleotid-Polymerase und auch Mittel zur kovalenten Verknüpfung der ersten und zweiten Sequenzen, z.B. eine Ligase, und Mitglieder eines signalerzeugenden Systems umfassen.
- Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien in den Kits können in großem Umfang variiert werden, um Konzentrationen der Reagenzien bereitzustellen, welche die Reaktionen, die während des vorliegenden Verfahrens ablaufen müssen, im wesentlichen zu optimieren und um ferner die Empfindlichkeit des Assays im wesentlichen zu optimieren. Unter geeigneten Bedingungen können eines oder mehrere der Reagenzien im Kit als Trockenpulver, üblicherweise lyophilisiert, einschließlich Trägerstoffe, bereitgestellt werden, welches nach Auflösung eine Reagenzlösung mit den geeigneten Konzentrationen zur Durchführung eines Verfahrens oder Assays gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt. Jedes Reagenz kann in separaten Behältern abgepackt sein oder einige Reagenzien können in einem Behälter kombiniert sein, wenn es Reaktivität und Lagerungsfähigkeit erlauben.
- Die Erfindung wird durch die folgenden illustrativen Beispiele weiter erläutert.
- Oligodesoxyribonukleotid-Sequenzen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 & 9:
- Einzelsträngiges Polynukleotid mit ersten und zweiten flankierenden Sequenzen:
- Oligomer 1
- 5' CAA TTA CAC AAG CTT AAT ACA TTC CTT CGA GCT CGG TAC CCG GGG ATC CTC TAG AGT CGA CCT GCA GGC ATG CAA GGA ATG TAT TAA GCT TGT GTA ATT G 3'
- Erste Polynukleotid-Sonde A;
- Oligomer 2
- 5' CAA TTA CAC AAG CTT AAT ACA TTC CTT CGA GCT CGG TAC CCG GGG ATC CT 3'
- Erste Polynukleotid-Sonde B;
- Oligomer 3
- 5' CAA TTA CAC AAG CTT AAT ACA TTC CTT CGA GCT CGG TAC CCG GGG ATC C 3'
- Zweite Polynukleot id-Sonde;
- Oligomer 4
- 5' CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGG AAT GTA TTA AGC TTG TGT AAT TG 3'
- Polynukleotid- Primer;
- Oligomer 5
- 5' CAA TTA CAC AAG CTT AAT ACA TTC C 3'
- Oligomer 6
- 5' CCG GGG ATC CTC TAG AGT CGA CC 3'
- Oligomer 7
- 5' CCG GGG ATC CCT AGA GTC GAC C 3'
- Oligomer 8
- 5' TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA TGC A 3'
- Oligomer 9
- 5' TGC ATG CCT GCA GGT CGA CTC TAG A 3'
- wurden nach dem Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert und auf denaturierenden Polyacrylamidgelen gereinigt. Die 27 5'-terminalen Basen und 27 3'-terminalen Basen des loomer-Oligomers 1 sind selbstkomplementär und dieses Molekül wird daher eine "Haarnadel" oder "Stamm-Schleife"-Struktur bilden.
- Die Oligomere 2 und 4 repräsentieren die 50 5'-Basen bzw. 50 3'- Basen des Oligomers 1. Das Oligomer 5 ist komplementär zu den 25 3o terminalen Basen der Oligomere 1 und 4. Die Oligomere 6 (7) werden mit den zentralen 23 (22)-Basen des Oligomers 1 hybridisieren, das Oligomer 7 weist jedoch eine einzelne Basendeletion (einen Thymio dinrest) auf. Die Oligomere 8 und 9 sind komplementär; Oligomer 8 ist identisch mit Oligomer 1 von den Basen 50 bis 74, inklusive, des Oligomers 1.
- Ein Protokoll zur DNA-Amplifizierung des Oligomers 1 unter Verwendung von Oligomer 5 als Polynukleotid-Primer wird beschrieben; Variationen dieses Versuchsprotokolls werden in späteren Beispielen beschrieben. Ein Picomol (pMol) Oligomer 1 und 60 pmol Oligomer 5 werden in einem Puffer von 50 mM Tris-HCl (pH 8,4 @ 25ºC), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mg/ml Gelatine mit 10 Nanomol (nmol) eines jeden dNTP kombiniert. Fünf Einheiten des Enzyms Taq-Polymerase werden für ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zugegeben. Eine zyklische Temperaturführung von 94ºC (1 Minute), 37ºC (2 Minuten) und 72ºC (3 Minuten) wird unter Einsatz eines programmierbaren Thermozyklisierers (Ericomp, Inc.) für eine Anzahl von Zyklen durch die 3 Temperaturen vorgenommen. Aliquots dieser Reaktionen werden in verschiedenen Stadien entnommen und auf Genescreen Plus Nylonmembranen (Du Pont) nach den vom Hersteller empfohlenen Versuchsprotokollen "Dot Blots" durchgeführt.
- Die getrockneten Membranen werden 3 Stunden lang bei 65ºC in einer Lösung von 0,75 M NaCl, 0,15 M Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, SX Denhardt's Lösung (1 g Ficoll , 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g BSA in einem Gesamtvolumen von 1000 ml H&sub2;O), 20 mM Natriumphosphat, 250 mg/ml gescherter denaturierter Kalbsthymus-DNA und 0,5% SDS vorhybridisiert. Zum Nachweis der Bildung von amplifiziertem Oligomer 1 wird mit ³²p 5'-endmarkierte Oligodesoxynukleotid-Sonde ( 10&sup7; DPM, 100-1000 Ci/mMol) mit frischer Vorhybridisierungslösung zugegeben und über Nacht unter sanftem Schütteln bei 60ºC hybridisiert. Die hybridisierten Membranen werden typischerweise in einem Puffer von 0,3 M NaCl, 0,06 M Tris-HCl (pH 8,0), 4 mM EDTA und 0,5% SDS bei 60ºC 30 Minuten lang mit einem Wechsel des Waschpuffers gewaschen. Mit den gewaschenen Membranen wird ein Kodak-X-Omat AR-Film verschiedene Zeiten belichtet, gelegentlich mit einer einzelnen Verstärkerfohe (Du Pont Cronex Lightning-Plus).
- Figur 1 zeigt die Ergebnisse der Amplifizierung von 1 pMol Oligomer 1 in Gegenwart von 60 pMol Polynukleotid-Primer, Oligomer 5. Die Sonde ist in diesem Fall Oligomer 5 und die Standards (Spur A, 1- 10) sind variierende Mengen an Oligomer 1. Es findet keine nachweisbare Hybridisierung statt, wenn Oligomer 5 aus der Amplifizierungsreaktion weggelassen wird. Eine kleines Maß an Amplifizierung von Oligomer 5 wird nachgewiesen, wenn Oligomer 1 nicht zugegeben wird.
- Dieser Blot wurde von der radioaktiven Sonde befreit, indem 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 0,4 N NaOH gewaschen und in 1 M Tris-HCL (pH 7,5), 0,3 M NaCl, 4 mM EDTA neutralisiert wurde. Die Membran wurde dann mit ³²P 5'-markiertem Oligomer 9 (siehe Figur 2) hybridisiert. In diesem Fall wird eine Amplifizierung in der Reaktion nachgewiesen, die sowohl die Oligomere 1 und 5 enthält, und nicht in denjenigen, die entweder 1 oder 5 separat enthalten.
- Standards von 1,8, 0,9, 0,454, 0,18, 0,09, 0,045, 0,018, 0,009, 0,0045, 0,0018 nmol Oligomer #1.
- Negative Kontrolle von 1 µg gescherter, denaturierter Kalbsthymus-DNA.
- Fünf µl-Aliquots aus dem 10., 20., 30.1 40. und 50. Temperaturzyklus der Amplifizierungsreaktion, welche 60 pMol Oligomer 5 ohne Oligomer 1 enthalten. Man beachte etwas Hybridisierung von Produkten aus Zyklus 50 mit der Oligomer 5-Sonde.
- 5 µl-Aliquots aus dem 10., 20., 30., 40. und 50. Zyklus, enthaltend nur Oligomer 1 (1 pMol). Man beachte die Abwesenheit von nachweisbarem Amplifizierungsprodukt.
- 5 µl-Aliquots aus dem 10., 20., 30., 40. und 50. Zyklus, enthaltend beide Oligomere 1 und 5. Die Amplifizierung übersteigt das 2000-Fache (1 pMol bis zu > 1,8 nMol).
- Der Blot in Figur 1 wurde von hybridisiertem ³²P-Oligomer 5 befreit und mit ³²P-Oligomer 9-Sonde hybridisiert. Die Ergebnisse sind im wesentlichen dieselben wie in Figur 1, mit Ausnahme, daß eine Hybridisierung in Zeile B, Spuren 7-11, mit dieser Sonde nicht nachgewiesen werden kann.
- Oligodesoxyribonukleotid-Sequenzen 1, 2, 3, 4, 5:
- Einzelsträngiges Polynukleotid-Target;
- Oligomer 1
- 5' ACT TGG GCT ATC ACT TCC CTG AAC CGC GTG CTT TTA CTA ATA GAG AAC GAG CAA GGC TTC AAA GTT TTC CTG ATG ATT TTG AGT TTG TCG GAT CAA CAA CTG AAG T 3'
- Erstes Polynukleotid-Substrat;
- Oligomer 2
- 5' ACG GTT CCA TCA AAA GGG GGG AAT TCA CTT TTC TCT ATC ACT GAT AGG GAG TGG TAA AAT AAC TCT ATC AAT GAT AGA GAC TTC AGT TGT TGA TCC GAC TTC GAA GAG C
- Zweites Polynukleotid-Substrat;
- Oligomer 3
- 5' ACG GTT CCA TCA AAA GGG GGG AAT TCT GTG TGG AAT TGT GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AAC TTG GGC TAT CAC TTC CCT GGA TCC CCA T 3'
- Polynukleotid- Primer;
- Oligomer 4
- 5' ACG GTT CCA TCA AAA GGG GG
- Polynukleotid- Sonde;
- Oligomer 5
- 5' TAA TAG AGA ACG AGC AAG GCT TCA A 3'
- Das Oligomer 1 ist ein Strang eines doppelsträngigen Rsa I- Restriktionsfragments eines genomischen N. gonorrhoeae (N. g.)- Klons. Das gesamte klonierte DNA-Insert repräsentiert ein 7 Kilobasen (Kb) Sau 3AI-Restriktionsfragment aus dem Stamm N.g. 125 (erhalten vom C.D.C. (Center for Disease Control), Atlanta, USA) . Dieses 7kb- Fragment wurde in mit Bam HI-linearisierten Vektor pGEM 3Zf (+) von Promega Biotech inseriert.
- Die zwanzig 3'-terminalen Basen von Oligomer 1 hybridisieren mit den Basen-Nr. 80-99, inklusive, des Oligomers 2 (siehe Schema 5, A (Figur 8,A)). Dies bildet ein "geprimtes" Substrat für DNA-Polymerisation auf der Oligomer 2-Matrize vom 3'-Terminus des Oligomers 1, katalysiert durch Taq-Polymerase. Das 185 Basen lange Produkt dieser Polymerisation basenpaart, wenn es durch thermische Denaturierung einzelsträngig gemacht wurde, mit seinen 20 3'-terminalen Basen mit dem Oligomer 4 (Schema 5,B (Figur 8,B)). Dies ist ein Substrat für Taq-Polymerase, welche auf der "geprimten" 185-Basen-Matrize polymerisiert, um ein komplementäres Strangprodukt von 185 Basen zu bilden.
- Das denaturierte Produkt der vorhergehenden Polymerisation weist 20 Basen an seinem 3'-Terminus auf, welche mit Oligomer 3 an den Nukleotiden 62-81, inklusive, hybridisieren, und ist deshalb ein Substrat für Taq-Polymerase, um 61 Basen auf der Oligomer 3-Matrize (Schema 5,C (Figur 8)) zu verlängern. Das Produkt ergab bei thermischer Denaturierung das 246 Basen lange Polynukleotid 6 des Schemas 5 (Figur 8).
- Polynukleotid 6 bildet eine "Stamm-Schleife"-Struktur mit einem Stamm von 20 Basenpaaren komplementärer Sequenz an den 5'- und 3'- Termini. Es folgt, daß das Komplement von 6 ebenfalls eine Stamm- Schleife-Struktur bildet. Sowohl 6 als auch sein Komplement hybridisieren mit Primer-Oligomer 4 an ihrem jeweiligen 3'-Terminus, was ein Substrat für Taq-Polymerase ergibt und dadurch eine Einzelprimer-Polynukleotid-Amplifizierung des in Beispiel 1 beschriebenen Typs erlaubt. Zusammenfassend, die Anwesenheit von Oligomer 1 ermöglichte durch alternierende Verlängerung von "geprimten" Matrizen durch Polymerase und thermische Denaturierung die "Verknüpfung" von Sequenzen, die komplementär zu den Oligomeren 2 und 3 sind, unter Bildung des Polynukleotids 6.
- Das folgende Experiment ist ein Beispiel dieser Technik. Es wurden 5 Assays durchgeführt, welche die folgenden Komponenten enthielten:
- Zehnfach (10 X)-Puffer ist 0,1 M Tris-HCl, pH 8,4 (bei 25ºC), 0,5 M KCl, 60 mM MgCl&sub2;, 2 mg/ml Gelatine. Das Endvolumen des Assays betrug 100 µl. Alle Komponenten, mit Ausnahme von Taq-Polymerase, wurden in Eppendorf-Röhrchen gegeben, mit 50 µl Mineralöl überschichtet und 3 Minuten lang auf 95ºC erwärmt. Die Röhrchen wurden dann langsam im Verlauf von 30 Minuten auf weniger als 50ºC abkühlen gelassen. Dann wurden 5 Einheiten Taq-Polymerase zugegeben und eine thermische Zyklisierung in einem ERICOMP-Thermoblock begonnen: 94ºC für 30 Sekunden, 50ºC für 30 Sekunden, 72ºC für 2 Minuten, dann Wiederholung dieser Drei-Temperatur-Regelung (1 Zyklus). Zehn Mikroliter-Aliquots dieser fünf Assays wurden nach 20, 40 und 60 Zyklen entnommen und eingefroren.
- Fünf Mikroliter der gefrorenen Aliquots wurden aufgetaut und durch "Dot-Blots" auf Genescreen Plus -Nylonmembranen (DuPont) unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Versuchsprotokolle analysiert. Die Blots wurden weiterbehandelt wie in Beispiel 1 beschrieben. Das ³²P-kinasierte Sonden-Oligomer 5 (100 - 1000 Ci/ mmol, 10&sup7; dpM) wurde zur Hybridisierung des "Dot-Blots" verwendet. Das Oligomer 5 ist mit den Basen 38 - 62, einschließlich, des Target- Oligomers 1 identisch.
- Der Blot in Figur 3 demonstriert, daß nach 60 Temperaturzyklen alle Assays, welche Target-DNA enthielten, mehr als 25 fMol/5 µl DNA aufwiesen, die mit der Sonde hybridisierbar war. Bei Dot-Blot SE bedeutet dies eine Amplifizierung von 5x10&supmin;¹&sup8; Mol hybridisierbarer Sequenz auf > 25 x 10&supmin;¹&sup5; Mol hybridisierbarer Sequenz oder eine 5 x 10³-fache Amplifizierung.
- Standards von 25, 2,5, 0,25 und 0,025 fMol eines genomischen N. gonorrhoeae-Klons.
- Fünf Mikroliter-Aliquots des 20. Temperaturzyklus der jeweiligen Assays 1-5.
- Fünf Mikroliter-Aliquots des 40. Temperaturzyklus der jeweiligen Assays 1-5.
- Fünf Mikroliter-Aliquots des 60. Temperaturzyklus der jeweiligen Assays 1-5.
Claims (22)
1. Verfahren zur Herstellung mindestens einer Kopie eines
einzelsträngigen Polynukleotids, welches umfaßt:
(a) die Bildung in Gegenwart von
Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger
Polynukleotid-Polymerase entlang eines einzelsträngigen Polynukleotids
einer Verlängerung eines Polynukleotid-Primers, bei dem
mindestens dessen 3'-Ende eine Sequenz von mindestens 10
Basen aufweist, die mit einer zweiten flankierenden
Sequenz hybridisierbar ist, welche mit dem 3'-Ende des
einzelstrangigen Polynukleotids verknüpft ist, wobei die
zweite flankierende Sequenz mindestens teilweise
komplementär zu einer ersten flankierenden Sequenz von
mindestens 10 Basen ist, die mit dem 5'-Ende des
einzelsträngigen Polynukleotids verknüpft ist;
(b) die Dissoziation des verlängerten
Polynukleotid-Primers und des einzelsträngigen Polynukleotids; und
(c) die Wiederholung von Schritt (a).
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die letzten 10
Nukleotide des 3'-Endes des Polynukleotid-Primers in derselben
Sequenz sind wie die zweite flankierende Sequenz.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das nach der
Wiederholung von Schritt (a) gebildete Produkt ein "inverted
repeat" enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die
hybridisierbare Sequenz des Polynukleotid-Primers 15 bis 100
Nukleotide lang ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, worin die
Matrizen-abhängige Polynukleotid-Polymerase eine
DNA-Polymerase
ist, und die Nukleosid-Triphosphate dATP, dGTP, dCTP
und dTTP sind.
6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-5 zur
Herstellung mehrfacher Kopien einer Polynukleotid-Sequenz,
welches umfaßt:
(a) die Bereitstellung in Kombination von (1)
einem einzelsträngigen Polynukleotid, welches die genannte
Polynukleotid-Sequenz aufweist und an jedem Ende von
mindestens teilweise komplementären ersten und zweiten
flankierenden Sequenzen flankiert ist, (2) einem
Polynukleotid-Primer, bei dem ein Abschnitt von mindestens 10
Basen an dessen 3'-Ende mit demjenigen Mitglied der ersten
und zweiten Flankierungssequenzen hybridisierbar ist, das
sich am 3'-Ende des einzelstrangigen Polynukleotids
befindet, (3) Nukleosid-Triphosphaten, (4)
Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase und
(b) die Inkubation der Kombination unter
Bedingungen, um ganz oder teilweise sequentiell oder
gleichzeitig (1) das einzelsträngige Polynukleotid von etwaigen
komplementären Sequenzen zu dissoziieren, (2) den
Polynukleotid-Primer mit der flankierenden Sequenz am 3'-Ende
des einzelsträngigen Polynukleotids zu hybridisieren,
(3) den Polynukleotid-Primer entlang des einzelsträngigen
Polynukleotids zu verlängern, um einen ersten
verlängerten Polynukleotid-Primer bereitzustellen, (4) den ersten
verlängerten Polynukleotid-Primer und das
einzelstrangigen Polynukleotid zu dissoziieren, (5) den ersten
verlängerten Polynukleotid-Primer mit dem
Polynukleotid-Primer zu hybridisieren, (6) den Polynukleotid-Primer
entlang des ersten verlängerten Polynukleotid-Primers zu
verlängern, um einen zweiten verlängerten Polynukleotid-
Primer bereitzustellen, (7) den zweiten verlängerten
Polynukleotid-Primer von dem ersten verlängerten
Polynukleotid-Primer zu dissoziieren, und (8) die obigen
Schritte (5) - (7) zu wiederholen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die ersten und zweiten
Sequenzen komplementär sind.
8. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines
Polynukleotid-Analyten in einer Probe, von der angenommen wird,
daß sie den Analyten enthält, umfassend die Schritte:
(a) (i) Bildung in Gegenwart von
Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger
Polynukleotid-Polymerase entlang eines ersten einzelsträngigen
Polynukleotids einer verlängerung des Analyten oder eines Fragments
davon (verlängerter Polynukleotid-Analyt), bei dem
mindestens dessen 3'-Ende eine Basensequenz aufweist, welche
mit einer zweiten flankierenden Sequenz hybridisierbar
ist, die mit dem 3'-Ende des einzelsträngigen
Polynukleotids verknüpft ist, wobei die zweite flankierende Sequenz
mindestens teilweise komplementär zu einer ersten
flankierenden Basensequenz ist, die mit dem 5'-Ende des
einzelsträngigen Polynukleotids verknüpft ist, um
doppelstrangiges Polynukleotid zu bilden;
(a) (ii) Dissoziation des einzelsträngigen,
verlängerten Polynukleotid-Analyten von dem Polynukleotid;
(b) Bildung mehrfacher Kopien des einzelsträngigen
Polynukleotids und der flankierenden Sequenzen nach dem
Verfahren von Anspruch 1, und
(c) Nachweis des einzelsträngigen Polynukleotids.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die ersten und zweiten
flankierenden Sequenzen komplementäre Sequenzen von
mindestens 10 Basen umfassen.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin das
einzelsträngige Polynukleotid von Schritt (a) (i) von Anspruch 8 von
mindestens zu 80% komplementären ersten und zweiten
flankierenden Sequenzen flankiert ist, wobei jede mindestens
15 Basen umfaßt, und worin
(a) der Schritt der Bildung des einzelsträngigen
Polynukleotids und der Schritt der Bildung der
Verlängerung
von Schritt (a) (i) von Anspruch 8 ganz oder
teilweise sequentiell oder gleichzeitig durchgeführt werden
können und
(b) verlängerter Polynukleotid-Primer nachgewiesen
wird, der eine Sequenz enthält, die mit der
Polynukleotid-Sequenz identisch und/oder dazu komplementär ist.
11. Verfahren nach Anspruch 101 worin ein Abschnitt des
Polynukleotid-Primers mit einer "Reporter"-Gruppe markiert
ist und ein Abschnitt mit einer zweiten "Reporter"-Gruppe
markiert ist.
12. Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, welches
zusätzlich umfaßt:
(a) Kontaktieren der Probe mit ersten und zweiten
Polynukleotid-Sonden, wobei die erste Sonde eine Target-
Polynukleotid-bindende Sequenz an ihrem 3'-Ende, die
komplementär zu einem ersten Abschnitt eines Stranges
des Analyten ist, und eine erste flankierende Sequenz
umfaßt, und die zweite Sonde eine
Target-Polynukleotidbindende Sequenz an ihrem 5'-Ende, die komplementär zu
einem zweiten Abschnitt desselben Stranges des Analyten
ist, und eine zweite flankierende Sequenz umfaßt, wobei
die ersten und zweiten flankierenden Sequenzen mindestens
zu 65% komplementär sind, unter Bedingungen zur Bindung
der ersten und zweiten Sonden an den Analyten,
(b) Bereitstellung von Bedingungen, um die ersten
und zweiten Polynukleotid-Sonden nur aneinander zu
ligieren wenn sie an den Analyten gebunden sind,
(c) Bildung in Gegenwart von
Nuleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase
einer Verlängerung eines Polynukleotid-Primers, bei dem
mindestens dessen 3'-Ende mit der zweiten flankierenden
Sequenz hybridisieren kann, und
(d) Nachweis des verlängerten
Polynukleotid-Primers, der eine zur ersten Sonde komplementäre Sequenz
enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin der
Polynukleotid-Primer mit einer "Reporter"-Gruppe markiert ist, die aus der
Gruppe aus fluoreszierenden Stoffen,
chemolumineszierenden Stoffen, Katalysatoren, Coenzymen, radioaktiven
Substanzen, amplifizierbaren Polynukleotid-Sequenzen und
kleinen organischen Molekülen ausgewählt ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, worin die ersten und
zweiten Polynukleotid-Sonden, wenn sie mit dem Analyten
hybridisiert sind, mindestens ein Nukleotid
auseinanderliegen, und die Bedingungen zur Ligierung der ersten und
zweiten Polynukleotid-Sonden nach Schritt (b) von
Anspruch 12 umfassen
(a) die Zugabe von Nukleosid-Triphosphaten und
einer Polynukleotid-Polymerase, um die hybridisierten
Abschnitte zusammenhängend zu machen und
(b) die Zugabe von Ligase, um die hybridisierten
Abschnitte zu ligieren.
15. Verfahren nach Anspruch 8, welches zusätzlich umfaßt:
(a) die Ligierung dritter und vierter Sequenzen
einer Polynukleotid-Sonde, wobei die dritte Sequenz ein
freies 3'-Ende aufweist und die vierte Sequenz ein
freies 5'-Ende aufweist, und jede mit separaten Abschnitten
des Analyten hybridisierbar ist und nur in Gegenwart des
Analyten ligierbar ist, oder imstande ist, ligierbar
gemacht zu werden, wobei die Polynukleotid-Sonde weiter
mindestens teilweise komplementäre erste und zweite
flankierende Sequenzen umfaßt, wobei die erste Sequenz 5' von
der dritten Sequenz liegt, die zweite Sequenz 5' von der
ersten Sequenz liegt und die vierte Sequenz 5' von der
zweiten Sequenz liegt,
(b) Bildung in Gegenwart von
Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase
einer Verlängerung eines Polynukleotid-Primers, bei dem
mindestens dessen 3'-Ende mit der ersten flankierenden
Sequenz der Polynukleotid-Sonde hybridisieren kann,
worin die Schritte (a) und (b) ganz oder teilweise
sequentiell oder gleichzeitig durchgeführt werden, und
(c) Nachweis des verlängerten
Polynukleotid-Primers und/oder einer Sequenz, die identisch ist und/oder
komplementar mit bzw. zu mindestens demjenigen Abschnitt
der ligierten dritten oder vierten Sequenzen, der
komplementär zu den separaten Abschnitten des Analyten ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Sonde eine
Operator-Sequenz enthält.
17. Verfahren nach Anspruch 8, welches zusätzlich umfaßt:
(a) Kombination der Probe in einem Assay-Medium
mit ersten und zweiten Polynukleotid-Sonden, wobei die
erste Sonde eine erste flankierende Sequenz umfaßt, die
mindestens teilweise komplementär zu einer zweiten
flankierenden Sequenz in der zweiten Sonde ist und an ihrem
3'-Ende mit einer Sequenz verknüpft ist, die mit einem
ersten Abschnitt eines Stranges des Analyten hybridisier
bar ist, und wobei die zweite flankierende Sequenz an
ihrem 5'-Ende mit einer Sequenz verknüpft ist, die mit
einem zweiten Abschnitt des genannten Stranges des
Analyten hybridisierbar ist,
(b) Inkubation des Assay-Mediums unter Bedingungen
zur Bindung der ersten und zweiten Sonden an den
Analyten, wobei die ersten und zweiten Sonden nur aneinander
ligierbar sind, oder imstande ist, ligierbar gemacht zu
werden, wenn sie an den Analyten gebunden sind,
(c) Ligierung der ersten und zweiten Sonden, mit
der Maßgabe, daß erforderlichenfalls die ersten und
zweiten Sonden ligierbar gemacht werden, wenn sie sonst nicht
ligierbar sind,
(d) Kombination des Assay-Mediums mit einem
Polynukleotid-Primer, der eine 3'-terminale Sequenz aufweist,
die zu der zweiten flankierenden Sequenz in der zweiten
Sonde komplementar ist,
(e) Inkubation des Assay-Mediums unter
Bedingungen, um entweder ganz oder teilweise sequentiell oder
gleichzeitig (1) intern hybridisierte, ligierte erste und
zweite Sonden zu dissoziieren, (2) den Polynukleotid
Primer mit den ligierten ersten und zweiten Sonden zu
hybridisieren, (3) den Polynukleotid-Primer entlang der
ligierten ersten und zweiten Sonden zu verlängern,
(4) den hybridisierten verlängerten Polynukleotid-Primer
und die ligierten ersten und zweiten Sonden zu dissoziie
10 ren, (5) den verlängerten Polynukleotid-Primer mit dem
Polynukleotid-Primer zu hybridisieren, (6) den
Polynukleotid-Primer entlang des verlängerten Polynukleotid-
Primer zu verlängern, (7) den hybridisierten verlängerten
Primer zu dissoziieren, und (8) die obigen Schritte
(5) - (7) zu wiederholen,
worin die Schritte (a) - (d) ganz oder teilweise
sequentiell oder gleichzeitig durchgeführt werden,
gefolgt von dem Schritt (e), und
(f) Nachweis des verlängerten Primers.
18. Verfahren nach Anspruch 17, worin separate Moleküle des
Polynukleotid-Primers mit einer Gruppe markiert sind,
die imstande ist, an eine Oberfläche gebunden zu werden.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin die
Verlängerung des Polynukleotid-Primers entlang der ligierten
ersten und zweiten Sonden mindestens einen Teil eines
Operators bildet und der Nachweis weiter umfaßt:
(a) die Zugabe eines Repressors, der an einen
festen Träger gebunden ist, und
(b) den Nachweis einer Sequenz, die an den festen
Träger gebunden ist, welche mit einer Sequenz in der
ersten Polynukleotid-Sonde identisch oder dazu
komplementär ist.
20. Verfahren nach Anspruch 8, welches zusätzlich umfaßt:
(a) Kontaktieren der Probe mit ersten und zweiten
Polynukleotid-Sonden, wobei die erste Sonde umfaßt (1)
eine erste flankierende Sequenz, die komplementär zu
einer zweiten flankierenden Sequenz in der zweiten Sonde
ist, und (2) eine Sequenz, die zu einem anderen Abschnitt
des Analyten komplementär ist als ein Abschnitt, der zu
der zweiten Sonde komplementär ist, unter Bedingungen zur
Bindung der ersten und zweiten Sonden an den Analyten,
wobei die ersten und zweiten Sonden nur aneinander
ligierbar sind oder imstande sind, ligierbar gemacht zu
werden, wenn sie an den Analyten gebunden sind,
(b) Bildung in Gegenwart von
Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase
einer Verlängerung eines Polynukleotid-Primers, bei dem
mindestens ein Abschnitt mit der ersten oder zweiten
Sonde hybridisiert ist,
worin die Schritte (a) und (b) ganz oder teilweise
sequentiell oder gleichzeitig durchgeführt werden, und
Nachweis des verlängerten Polynukleotid-Primers
und/oder der ligierten ersten und zweiten Polynukleotid-
Sonden.
21. Kit zur Verwendung bei der Bestimmung eines
Polynukleotid-Analyten nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 20 und
22, welcher in abgepackter Kombination umfaßt:
eine erste Polynukleotid-Sonde mit einer ersten
Nukleotidsequenz, welche imstande ist, mit einem ersten
Abschnitt des Polynukleotid-Analyten zu hybridisieren,
eine zweite Polynukleotid-Sonde mit einer zweiten
Nukleotidsequenz, welche imstande ist, mit einem zweiten
Abschnitt desselben Strangs des Polynukleotid-Analyten
zu hybridisieren, einem anderen Abschnitt als derjenige
Abschnitt, welcher von der ersten Nukleotidsequenz der
ersten Polynukleotid-Sonde erkannt wird,
Mittel zur kovalenten Verknüpfung der ersten und
zweiten Polynukleotid-Sequenzen, wenn die ersten und
zweiten Polynukleotid-Sonden mit dem
Polynukleotid-Analyten hybridisiert sind, und
ein Polynukleotid-Primer, der imstande ist, mit der
zweiten Polynukleotid-Sonde zu hybridisieren und entlang
der kovalent verknüpften Sonden in Richtung der ersten
Polynukleotid-Sonde verlängert zu werden.
22. Verfahren nach Anspruch 8, welches als Schritt (a) von
Anspruch 8 die Schritte umfaßt:
(i) Bildung in Gegenwart von
Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase
entlang eines ersten einzelsträngigen Polynukleotids
einer Verlängerung des Analyten oder eines Fragments
davon (verlängerter Polynukleotid-Analyt), um
doppelsträngiges Polynukleotid 1 zu bilden,
(ii) Dissoziation des einzelstrangigen,
verlängerten Polynukleotid-Analyten von dem Polynukleotid 1,
(iii) Bildung in Gegenwart von
Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase
entlang des einzel strängigen, verlängerten Polynukleotid-
Analyten einer Verlängerung eines ersten Polynukleotid-
Primers, bei dem mindestens das 3'-Ende eine Sequenz von
mindestens 10 Basen aufweist, die mit mindestens einem
Abschnitt des einzelstrangigen, verlängerten
Polynukleotid-Analyten hybridisierbar ist, um doppelsträngiges
Polynukleotid 2 zu bilden,
(iv) Dissoziation des einzelsträngigen, verlängerten
ersten Polynukleotid-Primers von dem Polynukleotid 2,
(v) Bildung in Gegenwart von
Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase
entlang eines zweiten Polynukleotid-Primers einer
Verlängerung des einzelsträngigen, verlängerten ersten
Polynukleotid-Primers, wobei mindestens das 3'-Ende des
zweiten Polynukleotid-Primers eine Sequenz von mindestens 10
Basen aufweist, die mit mindestens einem Abschnitt des
einzelstrangigen, verlängerten ersten
Polynukleotid-Primers hybridisierbar ist, um doppelsträngiges
Polynukleotid
3 zu bilden, wobei das 3'-Ende und das 5'-Ende des
einzelsträngigen, zweimal verlängerten ersten
Polynukleotid-Primers jeweils Sequenzen von 10 Basen
aufweisen, welche Sequenzen mindestens teilweise komplementär
sind, und
(vi) Dissoziation des einzelstrangigen, zweimal
verlängerten ersten Polynukleotid-Primers von dem
Polynukleotid 3;
und als Schritt (b) von Anspruch 8, die Schritte:
(i) Bildung in Gegenwart von
Nukleosid-Triphosphaten und Matrizen-abhängiger Polynukleotid-Polymerase
entlang des einzelsträngigen, zweimal verlängerten ersten
Polynukleotid-Primers einer Verlängerung des ersten
Polynukleotid-Primers, um doppelsträngiges Polynukleotid 4
zu bilden,
(ii) Dissoziation des einzelsträngigen,
verlängerten ersten Polynukleotid-Primers von dem Polynukleotid
4 und
(iii) Wiederholung von Schritt (i).
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