TWI638047B - 藉由核酸三磷酸酯轉運子將非天然或經修飾的核苷三磷酸酯輸入至細胞中 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種經重組表現之核苷酸三磷酸酯轉運子，其有效地將非天然核苷酸之三磷酸酯輸入至細胞中，且內源性細胞機制將彼等核苷酸併入至細胞核酸中。UBP可因此形成於該細胞之核酸內。此外，該非天然三磷酸酯之存在或該UBP之複製均不成為顯著生長負擔。該UBP未被核酸修復路徑有效地切除，且因此只要可在生長介質中獲得該非天然三磷酸酯，即可保留該UBP。因此，所得細胞為穩定地繁殖擴展遺傳密碼符號之第一有機體。

Description

藉由核酸三磷酸酯轉運子將非天然或經修飾的核苷三磷酸酯輸入至細胞中 交叉參考
本申請案主張2014年4月9日申請之美國臨時申請案第61/977,439號及2014年4月9日申請之美國臨時申請案第61/977,430號之權益，該等美國臨時申請案均以全文引用之方式併入。
關於聯邦贊助之研究之聲明
本發明係在政府支持下在由美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予的GM060005下進行。政府享有本發明中之某些權利。
大量對於活有機體之活力必需之遺傳資訊以包含核酸核鹼基之序列的形式記錄。不同於由20種類型之胺基酸構成的蛋白質，核酸之化學及物理多樣性受天然核酸中之僅4種鹼基(2種鹼基對)限制。該等核酸允許使用自身作為模板自我複製及自DNA至DNA、自DNA至RNA及/或自RNA至蛋白質之遺傳資訊傳遞。天然核苷酸經由兩個或三個氫鍵(A：T/U、G：C)配對，且此配對使得能夠複製及傳遞遺傳資訊。活體外，天然雙字母遺傳密碼符號已經形成非天然鹼基對(UBP)之化學合成非天然核苷酸擴展。
為產生具有擴展遺傳密碼符號之有機體，非天然核苷三磷酸酯必須首先在細胞內部可獲得。已提出，此可能藉由游離核苷被動擴散至細胞質中接著其藉由核苷補救路徑轉化成對應的三磷酸酯來實現。一些非天然核酸係藉由來自黑腹果蠅(D.melanogaster)之核苷激酶經磷酸化，且單磷酸激酶似乎較具有特異性。然而，大腸桿菌(E.coli)的內源性二磷酸核苷激酶之過度表現導致不良的細胞生長。
Benner等人已基於來自天然鹼基對之不同氫鍵結組合設計新穎鹼基對(例如isoG：isoC及κ：X鹼基對)(Piccirilli等人，1990；Piccirilli等人，1991；Switzer等人，1993)。然而，isoG與T經由在1位置與2位置之間的酮-烯醇互變異構形成鹼基對；isoC及K不為聚合酶之受質，其係歸因於在2位置處之胺基取代；且isoC之核苷衍生物化學不穩定。
亦已研發出具有不同於天然鹼基配對之氫鍵結模式的氫鍵結模式且能夠藉由位阻消除與天然鹼基之鹼基配對的鹼基對。舉例而言，Ohtsuki等人(2001)及Hirao等人(2002)設計了2-胺基-6-二甲基胺嘌呤(X)、2-胺基-6-噻吩基嘌呤(S)及吡啶-2-酮(Y)。然而，Y相對X之合併顯示較低選擇性。
Kool等人合成不具有氫鍵結之A及T衍生物(分別為4-甲基苯并咪唑(Z)及9-甲基-1-H-咪唑并[(4,5)-b]吡啶(Q))。此等鹼基對經發現以補充方式藉由大腸桿菌衍生DNA聚合酶I之克列諾(Klenow)片段併入DNA中。包括A：F、Q：T及Z：T之其他鹼基對亦顯示經併入[Morales及Kool,1999]。其他實例包括7-(2-噻吩基)-咪唑并[4,5-b]吡啶(Ds)及吡咯-2-甲醛(Pa)。
為了研發正交第三鹼基對，超過100個疏水性鹼基已以三磷酸酯及胺基磷酸酯之形式經設計、合成，且在Floyd Romesberg之實驗室中經表徵。亦已產生大量疏水性鹼基對，包括吡咯并吡啶(PP)及C3-羰基苯乙烯基(MICS)(Wu等人，2000)。然而，此等鹼基獨立於形狀 擬合彼此配對，從而產生至DNA中之PP：PP及MICS：MICS併入；且在該等鹼基組合之合併在無任何形狀擬合之情況下形成之後伸長不實質上繼續進行。發現H-鍵結或較大芳族表面積均不為一些UBP(例如3-氟苯(3FB)自我配對)之雙螺旋DNA或聚合酶介導的複製中之鹼基配對穩定性所需要。
第三、非天然DNA鹼基對及擴展遺傳密碼符號之開發為合成及化學生物學之中心目標，且其將增加核酸之功能多樣性、為其位點特異性標記提供工具、增加DNA之資訊潛能且為半合成有機體奠定基礎。 本文中描述一種新開發類別之UBP，其形成於帶有疏水性核鹼基之核苷酸之間(藉由形成於d5SICS與dNaM之間的對(d5SICS-dNaM)例示)，其經有效地PCR擴增及轉錄，且其獨特的複製機制已經由動力學(Lavergne等人，Chem.Eur.J.(2012)18：1231-1239；Seo等人，J.Am.Chem.Soc.(2009)131：3246-3252)及結構研究(Betz等人，J.Am.Chem.Soc.(2013)135：18637-18643；Malyshevet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2012)109：12005-12010)澈底表徵。直至目前，並不存在能夠併入及繁殖非天然資訊之活有機體。
與天然蛋白質中之20種不同胺基酸相比，在標準核酸中僅具有四種不同鹼基組分(核苷酸)之限制限制了其功能及潛能。本文所描述之UBP及穩定地併入UBP之細胞提供大量優勢且可應用於大範圍的生物技術。具有在天然鹼基對之範圍內複製的第三鹼基對可顯著增加在相同長度之DNA中的資訊密度，且使得DNA成為用於資訊儲存之較有吸引力的替代方案。更重要地，第三UBP可擴展DNA之編碼以用於非天然胺基酸，從而提供獲取蛋白質(包括蛋白質治療劑)(其具有使用20種天然胺基酸不可獲得之獨特特性)之途徑。
本文中提供一種包含第一非天然核酸之細胞，其中第一非天然核 酸為輸入之非天然核酸。
在一些實施例中，細胞進一步包含非天然鹼基對(UBP)，其中UBP在細胞內形成。
在一些實施例中，UBP包含第一非天然核酸。
在一些實施例中，細胞包含擴展遺傳密碼符號。
在一些實施例中，擴展遺傳密碼符號包含UBP。
在一些實施例中，UBP經併入細胞之核酸中。
在一些實施例中，UBP經穩定地併入細胞之核酸中。
在一些實施例中，UBP不被細胞之DNA修復路徑有效地認可。
在一些實施例中，UBP包含第一非天然核酸。
在一些實施例中，細胞進一步包含異源核酸。
在一些實施例中，異源核酸編碼核苷酸三磷酸酯轉運子(NTT)、聚合酶或其組合。
在一些實施例中，異源核酸編碼NTT。
在一些實施例中，細胞進一步包含至少一個模板UBP，該模板UBP包含第一非天然模板核酸。
在一些實施例中，第一非天然模板核酸能夠與第一非天然核酸鹼基配對。
在一些實施例中，鹼基配對包含疏水性鹼基配對。
在一些實施例中，鹼基配對不包含氫鍵結。
在一些實施例中，細胞輸入第一非天然核酸。
在一些實施例中，異源NTT將第一非天然核酸轉運至細胞中。
在一些實施例中，細胞包含與各別野生型細胞相比增強的非天然核苷酸之輸入、增強的非天然核苷酸至細胞之核酸中之併入，或減少的非天然核酸降解。
在一些實施例中，細胞包含與不具有異源NTT之細胞相比增強的 第一非天然核酸輸入。
在一些實施例中，異源NTT鍵結至第一非天然核酸。
在一些實施例中，細胞進一步包含第二非天然核酸。
在一些實施例中，細胞輸入第二非天然核酸。
在一些實施例中，異源NTT將第二非天然核酸轉運至細胞中。
在一些實施例中，至少一個模板UBP進一步包含第二非天然模板核酸。
在一些實施例中，第二非天然模板核酸能夠與第二非天然核酸鹼基配對。
在一些實施例中，第一非天然模板核酸能夠與第二非天然模板核酸鹼基配對。
在一些實施例中，第一非天然核酸能夠與第二非天然核酸鹼基配對。
在一些實施例中，第一非天然核酸不同於第二非天然核酸。
在一些實施例中，第一非天然核酸與第二非天然核酸相同。
在一些實施例中，至少一個模板UBP包含至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個模板UBP。
在一些實施例中，至少一個模板UBP存在於至少一種異源核酸中。
在一些實施例中，至少一種異源核酸包含至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000種異源核酸。
在一些實施例中，至少一個模板UBP係藉由轉染、脂質體轉染、注射、病毒載體或電穿孔經引入至細胞中。
在一些實施例中，UBP包含第一非天然模板核酸。
在一些實施例中，UBP包含第二非天然核酸。
在一些實施例中，包含第二非天然核酸之UBP包含第二非天然模板核酸。
在一些實施例中，UBP包含至少2個UBP。
在一些實施例中，至少2個UBP包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個UBP。
在一些實施例中，至少2個UBP包含第一UBP及第二UBP，其中第一UBP包含：第一非天然核酸及第一非天然模板核酸或第一非天然核酸及第二非天然模板核酸；且其中第二UBP包含：第二非天然核酸及第二非天然模板核酸，或第二非天然核酸及第一非天然模板核酸；或其任何組合。
在一些實施例中，至少一個模板UBP形成於細胞外部。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸為去氧核苷。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸為核苷。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸為核苷三磷酸酯。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸包含經修飾糖基團在一些實施例中，第一或第二非天然核酸係選自由在附錄A中所列之非天然核酸中之任一者及其任何組合組成之群。
在一些實施例中，細胞包含至少一個遺傳修飾。
在一些實施例中，至少一個遺傳修飾包含異源聚合酶、突變聚合酶、細胞之核苷酸酶之破壞、細胞之磷酸酶之破壞或其組合。
在一些實施例中，細胞與磷酸酶抑制劑或核苷酸酶抑制劑接觸。
在一些實施例中，細胞為原核細胞。
在一些實施例中，細胞係來自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)或阿莫氏原披 衣菌(Protochlamydia amoebophila)。
在一些實施例中，細胞為真核細胞。
在一些實施例中，細胞為大腸桿菌。
在一些實施例中，異源NTT係來自三角褐指藻(Pt)NTT2、假微型海鏈藻(Tp)NTT2、阿莫氏原披衣菌(Pam)NTT2、阿莫氏原披衣菌(Pam)NTT5或其組合。
在一些實施例中，異源NTT為核苷酸轉運子1(NTT1)、核苷酸轉運子2(NTT2)、核苷酸轉運子3(NTT3)、核苷酸轉運子4(NTT4)、核苷酸轉運子5(NTT5)、核苷酸轉運子6(NTT6)、核苷酸轉運子7(NTT7)、核苷酸轉運子8(NTT8)或其組合。
在一些實施例中，UBP不藉由細胞有效地移除。
在一些實施例中，移除包含3'-5'核酸酶活性。
在一些實施例中，移除包含藉由細胞之核苷酸切除。
在一些實施例中，UBP在生長約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或50或超過50個複製之後不從細胞有效地移除。
在一些實施例中，UBP在生長約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月；或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、50年之生長之後不從細胞有效地 移除。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸包含非天然鹼基。
在一些實施例中，非天然鹼基係選自由以下各者組成之群：2-胺基腺嘌昤-9-基；2-胺基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-硫尿嘧啶；2-硫基-胸腺嘧啶；2-硫胞嘧啶；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及烷基衍生物；2-胺基-腺嘌呤；2-胺基-丙基-腺嘌呤；2-胺基吡啶；2-吡啶酮；2'-去氧尿苷；2-胺基-2'-去氧腺苷3-去氮鳥嘌昤；3-去氮腺嘌呤；4-硫基-尿嘧啶；4-硫基-胸腺嘧啶；尿嘧啶-5-基；次黃嘌呤-9-基(I)；5-甲基-胞嘧啶；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；5-溴及5-三氟甲基尿嘧啶及胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶；5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基-尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-尿嘧啶；5-取代、5-鹵基、5-取代嘧啶；5-羥基胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-氯胞嘧啶；氯化胞嘧啶；環胞嘧啶；胞嘧啶阿拉伯糖苷；5-氟胞嘧啶；氟嘧啶；氟尿嘧啶；5,6-二氫胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；羥基脲；碘尿嘧啶；5-硝基胞嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-氟尿嘧啶及5-碘尿嘧啶；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-烷基衍生物；6-氮雜嘧啶；6-偶氮-尿嘧啶；6-偶氮胞嘧啶；氮雜胞嘧啶；6-偶氮-胸腺嘧啶；6-硫基-鳥嘌呤；7-甲基鳥嘌呤；7-甲基腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤；7-去氮鳥苷；7-去氮-腺嘌呤；7-去氮-8-氮雜鳥嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤；8-氮雜腺嘌呤；8-鹵基、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基及8-羥基取代腺嘌呤及鳥嘌呤；N4-乙基胞嘧啶；N-2取代嘌呤；N-6取代嘌呤；O-6取代嘌呤；增加雙螺旋體形成之穩定性之彼等者；通用核酸；疏水性核酸；混雜核酸；尺寸擴展核酸；氟化核酸；三環嘧啶；啡噁嗪胞嘧啶核苷([5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)；啡噻嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G-鉗結構物；啡噁嗪胞嘧啶核苷(9-(2-胺基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)；咔唑胞嘧啶核苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞嘧 啶核苷(H-吡啶并[3',2'：4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；次黃嘌呤；黃嘌呤；4-乙醯胞嘧啶；5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶；5-羧甲基胺基甲基-2-硫尿苷；5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶；二氫尿嘧啶；β-D-半乳糖基Q核苷；肌苷；N6-異戊烯基腺嘌昤；1-甲基鳥嘌呤；1-甲基肌苷；2,2-二甲基鳥嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鳥嘌呤；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N6-腺嘌呤；7-甲基鳥嘌呤；5-甲基胺基甲基尿嘧啶；5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶；β-D-甘露糖基Q核苷；5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶；5-甲氧基尿嘧啶；2-甲基硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5氧基乙酸；懷丁氧苷(wybutoxosine)；假尿嘧啶；Q核苷(queosine)；2-硫胞嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯；尿嘧啶-5-氧基乙酸；5-甲基-2-硫尿嘧啶；3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶；(acp3)w及2,6-二胺基嘌昤及嘌呤或嘧啶鹼基經雜環替代之彼等者。
在一些實施例中，非天然鹼基係選自由以下各者組成之群：
其中R為官能基。
在一些實施例中，該官能基係選自由以下各者組成之群：親和力標籤，諸如生物素、螢光團；烷基；烯基；炔基；苯基；苄基；鹵基；羥基；羰基；醛；鹵甲醯基；碳酸酯；羧酸酯；羧基；酯；甲氧基；氫過氧基；過氧基；醚；半縮醛；半縮酮；縮醛；縮酮；原酸 酯；亞甲基二氧基；原碳酸酯；甲醯胺；一級胺；二級胺；三級胺；一級氯胺酮；二級氯胺酮；一級醛亞胺；二級醛亞胺；醯亞胺；疊氮化物；偶氮；氰酸酯；異氰酸酯；硝酸酯；腈；異腈；亞硝基氧基；硝基；亞硝基；吡啶基；硫氫基；硫化物；二硫化物；亞磺醯基；亞磺酸基；磺酸基；硫氰酸酯；異硫氰酸酯；碳硫醯基；膦基；膦醯基；磷酸酯；二羥硼基；酸酯、二取代硼酸(borino)、二取代硼酸酯(borinate)及其組合。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸包含非天然糖部分。
在一些實施例中，非天然糖部分係選自由以下各者組成之群：在2'位置處之修飾：OH；經取代低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2F；O-烷基、S-烷基、N-烷基；O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基；O-烷基-O-烷基、2'-F、2'-OCH3、2'-O(CH2)2OCH3，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、-O[(CH2)n O]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)n NH2、-O(CH2)n CH3、-O(CH2)n-ONH2及-O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2，其中n及m為1至約10；及/或在5'位置處之修飾：5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)；在4'位置處之修飾：4'-S、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷胺基、聚烷基胺基、經取代矽烷基、RNA分裂基團、報導子基團、嵌入劑、用於改良寡核苷酸之藥物動力學特性之基團或用於改良寡核苷酸之藥效學特性之基團，及其任何組合。
在一些實施例中，非天然核酸包含非天然主鏈。
在一些實施例中，非天然主鏈係選自由以下各者組成之群：硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、C1-C10膦酸酯、3'-膦酸伸烷酯、對掌性膦酸酯、亞膦酸酯、 胺基磷酸酯、3'-胺基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及硼烷磷酸酯。
在一些實施例中，細胞與天然核酸接觸。
在一些實施例中，天然核酸係選自由以下各者組成之群：ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP、dGMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP、dGMP及其任何組合。
在一些實施例中，天然核酸係選自由以下各者組成之群：ATP、UTP、CTP、GTP及其任何組合。
在一些實施例中，NTT來自細菌。
在一些實施例中，細菌為三角褐指藻、假微型海鏈藻或阿莫氏原披衣菌。
在一些實施例中，NTT包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24中之任一者至少約60%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，NTT係藉由編碼與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24中之任一者至少約60%一致的胺基酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，NTT係藉由與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、 SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：28中之任一者至少約60%一致的核酸序列編碼。
在一些實施例中，細胞包含含有異源核酸之載體。
在一些實施例中，異源核酸經併入細胞之基因組中。
在一些實施例中，異源核酸編碼聚合酶。
在一些實施例中，聚合酶為嗜溫性聚合酶或嗜熱性聚合酶。
在一些實施例中，聚合酶經改變。
在一些實施例中，聚合酶缺乏3'-5'外切核酸酶。
在一些實施例中，聚合酶係選自由DNA聚合酶、RNA聚合酶及逆轉錄酶組成之群。
在一些實施例中，聚合酶係選自由以下各者組成之群：Φ29、B103、GA-1、PZA、Φ15、BS32、M2Y、Nf、G1、Cp-1、PRD1、PZE、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17、ThermoSequenase®、9°NmTM、TherminatorTM、Tne、Tma、TfI、Tth、TIi、Stoffel片段、VentTM及Deep VentTM DNA聚合酶、KODDNA聚合酶、Tgo、JDF-3、Pfu、Taq、T7 DNA聚合酶、PGB-D、UlTma DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I、古細菌DP1I/DP2 DNA聚合酶II、9°N DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Phusion® DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶及RB69 DNA聚合酶。
在一些實施例中，聚合酶為來自反轉錄病毒之逆轉錄酶。
在一些實施例中，反轉錄病毒來自HIV、HTLV-I、HTLV-II、FeLV、FIV、SIV、AMV、MMTV或MoMuLV。
在一些實施例中，變化包含由定向進化產生之變化。
在一些實施例中，細胞進一步包含同源核酸之變化。
在一些實施例中，同源核酸編碼核苷酸酶、核苷酸磷酸酶或其組 合。
在一些實施例中，同源核酸包含編碼核苷酸磷酸酶之基因，且其中核苷酸磷酸酶係選自由以下各者組成之群：聚核苷酸磷酸酶、作用於游離核苷酸之核苷酸磷酸酶活性、核苷酸三磷酸酶三磷酸腺苷雙磷酸酶、ATP-二磷酸酶、腺苷二磷酸酶、ADP酶、ATP二磷酸水解酶核苷二磷酸酯磷酸酶、核苷-二磷酸酶、硫胺焦磷酸酶、UDP酶、肌苷二磷酸酶、腺苷二磷酸酶、IDP酶、ADP酶、鳥苷二磷酸酶、鳥苷二磷酸酶、鳥苷5'-二磷酸酶、肌苷5'-二磷酸酶、尿苷二磷酸酶、尿苷5'-二磷酸酶、B型核苷二磷酸酶、GDP酶、CDP酶、核苷5'-二磷酸酶、L型核苷二磷酸酶、NDP酶、核苷二磷酸酯磷酸水解酶及其任何組合。
在一些實施例中，同源核酸編碼核苷酸磷酸酶，且其中該核苷酸磷酸酶係選自由表4或表5中所列之核苷酸磷酸酶中之任一者組成之群。
在一些實施例中，同源核酸編碼核苷酸酶，且其中該核苷酸酶係選自由5'-核苷酸酶、3'-核苷酸酶或其組合組成之群。
在一些實施例中，同源核酸編碼核苷酸酶，且其中該核苷酸酶係選自由表2或表3中所列之核苷酸酶中之任一者組成之群。
在一些實施例中，變化包含由同源核酸編碼的基因之功能損失或降低。
在一些實施例中，變化包含由定向進化產生之變化。
在一些實施例中，細胞與磷酸酶或核苷酸酶抑制劑接觸。
在一些實施例中，磷酸酶或核苷酸酶抑制劑係選自由以下各者組成之群：氟化鈉、原釩酸鈉、β-甘油磷酸酯、焦磷酸酯及其鹽、磷酸鉀(KPi)、磷酸酯(Pi)、寡黴素、焦磷酸酯(PPi)陰離子、銨離子肌醇六磷酸酯及其組合。
在一些實施例中，磷酸酶或核苷酸酶抑制劑係以0.1μM至500mM、0.1mM至500mM、0.2mM至250mM、0.25mM至200mM、1.0mM至150mM、2.5mM至125mM、5mM至100mM、25mM至75mM或40mM至60mM之濃度存在。
在一些態樣中，本文中提供一種用於產生遺傳修飾細胞之方法，該方法包含：提供展現第一非天然核苷酸之野生型輸入量的細胞；及將異源NTT引入至細胞中，從而與第一非天然核苷酸輸入至細胞(其展現第一非天然核苷酸之野生型輸入量)中之量相比增強第一非天然核苷酸之輸入量。
在一些實施例中，展現第一非天然核苷酸之野生型輸入量的細胞不包含異源NTT。
在一些實施例中，該方法進一步包含使包含異源NTT之細胞與第一非天然核苷酸接觸。
在一些態樣中，本文中提供一種將非天然核酸併入至細胞中之方法，其包含使包含異源NTT之細胞與第一非天然核酸接觸；及培養細胞一定時間段；其中異源NTT將第一非天然核酸轉運至細胞中。
在一些態樣中，本文中提供一種用於將細胞遺傳工程化之方法，其包含：使包含異源NTT之細胞與液體接觸，該液體包含一定濃度之非天然核酸及一定濃度之天然核酸；培養該細胞一定時間段；增加非天然核酸濃度與天然核酸濃度之比率；及重複(b)及(c)一或多次。
在一些實施例中，在一或多次重複(b)及(c)之後，與各別野生型細胞相比，該細胞包含增強的非天然核苷酸之輸入、增強的非天然核苷酸至細胞之核酸中之併入或減少的非天然核酸之降解。
在一些實施例中，包含異源NTT之細胞進一步包含至少一個包含第一非天然模板核酸之模板UBP。
在一些實施例中，第一非天然模板核酸能夠與第一非天然核酸鹼 基配對。
在一些態樣中，本文中提供一種製造具有擴展遺傳密碼符號之細胞的方法，其包含：使第一非天然核酸與細胞、包含異源NTT之細胞及至少一個包含非天然模板核酸之模板UBP接觸；及培養細胞一定的時間段，其中非天然模板核酸鹼基能夠與第一非天然核酸鹼基配對。
在一些實施例中，包含異源NTT之細胞與不具有異源NTT之細胞相比包含第一非天然核酸之增強的輸入。
在一些實施例中，UBP係形成於包含異源NTT之細胞內。
在一些實施例中，在細胞內形成之UBP包含輸入之第一非天然核酸。
在一些實施例中，該方法進一步包含判定包含輸入之第一非天然核酸之UBP之存在。
在一些實施例中，該方法進一步包含使包含第一非天然核酸之UBP與細胞分離。
在一些實施例中，該方法進一步包含判定存在於細胞內的第一非天然核酸之量。
在一些實施例中，該方法進一步包含將存在於細胞內的第一非天然核酸之量與存在於對應野生型細胞內的第一非天然核酸之量進行比較。
在一些實施例中，接觸包含使含有第一非天然核酸之液體與細胞接觸，且其中該方法進一步包含在該時間段之後測定存在於液體中之第一非天然核酸之量(與各別野生型相比較)。
在一些實施例中，該時間段為1小時或1小時以上。
在一些實施例中，細胞包含至少一個遺傳修飾。
在一些實施例中，至少一個遺傳修飾包含異源聚合酶、突變聚合酶、細胞之核苷酸酶之破壞、細胞之磷酸酶之破壞或其組合。
在一些實施例中，該方法進一步包含添加磷酸酶或核苷酸酶抑制劑。
在一些實施例中，細胞為原核細胞。
在一些實施例中，細胞係來自三角褐指藻、假微型海鏈藻或阿莫氏原披衣菌。
在一些實施例中，細胞為真核細胞。
在一些實施例中，細胞為大腸桿菌。
在一些實施例中，異源NTT係來自三角褐指藻(Pt)NTT2、假微型海鏈藻(Tp)NTT2、阿莫氏原披衣菌(Pam)NTT2、阿莫氏原披衣菌(Pam)NTT5或其組合。
在一些實施例中，異源NTT為核苷酸轉運子1(NTT1)、核苷酸轉運子2(NTT2)、核苷酸轉運子3(NTT3)、核苷酸轉運子4(NTT4)、核苷酸轉運子5(NTT5)、核苷酸轉運子6(NTT6)、核苷酸轉運子7(NTT7)、核苷酸轉運子8(NTT8)或其組合。
在一些實施例中，該方法進一步包含使細胞與第二非天然核酸接觸。
在一些實施例中，異源NTT將第二非天然核酸轉運至細胞中。
在一些實施例中，至少一個模板UBP進一步包含第二非天然模板核酸。
在一些實施例中，第一非天然模板核酸能夠與第二非天然模板核酸鹼基配對。
在一些實施例中，第二非天然模板核酸能夠與第二非天然核酸鹼基配對。
在一些實施例中，第一非天然核酸能夠與第二非天然核酸鹼基配對。
在一些實施例中，第一非天然核酸不同於第二非天然核酸。
在一些實施例中，第一非天然核酸與第二非天然核酸相同。
在一些實施例中，至少一個模板UBP包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個模板UBP。
在一些實施例中，至少一個模板UBP在與第一或第二非天然核酸接觸之前即存在於細胞中。
在一些實施例中，至少一個模板UBP存在於至少一種異源核酸中。
在一些實施例中，至少一種異源核酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000種異源核酸。
在一些實施例中，至少一個模板UBP係藉由轉染、脂質體轉染、注射、病毒載體或電穿孔經引入至細胞中。
在一些實施例中，細胞形成包含輸入之第一非天然核酸之UBP。
在一些實施例中，包含輸入之第二非天然核酸之UBP進一步包含第一非天然模板核酸。
在一些實施例中，細胞形成包含輸入之第二非天然核酸之UBP。
在一些實施例中，包含輸入之第二非天然核酸之UBP進一步包含第二非天然模板核酸。
在一些實施例中，細胞形成包含輸入之第一非天然核酸及輸入之第二非天然核酸的UBP。
在一些實施例中，UBP在細胞內形成。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸為去氧核苷。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸為核苷。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸為核苷三磷酸酯。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸包含經修飾糖基團。
在一些實施例中，非天然糖部分係選自由以下各者組成之群：在2'位置處之修飾：OH；經取代低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2F；O-烷基、S-烷基、N-烷基；O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基；O-烷基-O-烷基、2'-F、2'-OCH3、2'-O(CH2)2OCH3，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、-O[(CH2)n O]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)n NH2、-O(CH2)n CH3、-O(CH2)n-ONH2及-O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2，其中n及m為1至約10；及/或在5'位置處之修飾：5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)；在4'位置處之修飾：4'-S、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷胺基、聚烷基胺基、經取代矽烷基、RNA分裂基團、報導子基團、嵌入劑、用於改良寡核苷酸之藥物動力學特性之基團或用於改良寡核苷酸之藥效學特性之基團，及其任何組合。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸包含經修飾鹼基。
在一些實施例中，經修飾鹼基基團係選自由以下各者組成之群：
其中R為官能基。
在一些實施例中，該官能基係選自由以下各者組成之群：親和力標籤，諸如生物素、螢光團；烷基；烯基；炔基；苯基；苄基；鹵基；羥基；羰基；醛；鹵甲醯基；碳酸酯；羧酸酯；羧基；酯；甲氧 基；氫過氧基；過氧基；醚；半縮醛；半縮酮；縮醛；縮酮；原酸酯；亞甲基二氧基；原碳酸酯；甲醯胺；一級胺；二級胺；三級胺；一級氯胺酮；二級氯胺酮；一級醛亞胺；二級醛亞胺；醯亞胺；疊氮化物；偶氮；氰酸酯；異氰酸酯；硝酸酯；腈；異腈；亞硝基氧基；硝基；亞硝基；吡啶基；硫氫基；硫化物；二硫化物；亞磺醯基；亞磺酸基；磺酸基；硫氰酸酯；異硫氰酸酯；碳硫醯基；膦基；膦醯基；磷酸酯；二羥硼基；酸酯、二取代硼酸、二取代硼酸酯及其組合。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸包含非天然主鏈。
在一些實施例中，非天然主鏈係選自由以下各者組成之群：硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、C1-C10膦酸酯、3'-膦酸伸烷酯、對掌性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯、3'-胺基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及硼烷磷酸酯。
在一些實施例中，該方法進一步包含使細胞與一或多種天然核苷酸三磷酸酯接觸。
在一些實施例中，一或多種天然核苷酸三磷酸酯包含dATP、dTTP、ATP、TTP、UTP或其任何混合物。
在一些實施例中，第一或第二非天然核酸係選自由在附錄A中所列之非天然核酸中之任一者及其任何組合組成之群。
在一些態樣中，本文中提供一種包含UBP之經分離核酸，其中UBP在細胞內形成。
在一些實施例中，UBP係選自由在附錄A中所列之UBP中之任一者及其任何組合組成之群。
在一些態樣中，本文中提供一種經分離異源NTT蛋白質，其包含與其結合之非天然核酸。
在一些實施例中，與其結合之非天然核酸係選自由在附錄A中所列之非天然核酸中之任一者組成之群。
一或多個本發明實施例之細節在本文中之隨附圖式、申請專利範圍及描述中闡述。本文中所揭示及涵蓋之本發明實施例之其他特徵、目標及優勢將自描述及附圖及自申請專利範圍而顯而易見。
以引用之方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如各個別公開案、專利或專利申請經特定及單獨地經指示以引用的方式併入一般。
圖1顯示d5SICS-dNaM與經顯示以用於比較之天然(dC-dG)鹼基對之結構。
圖2描繪與核苷三磷酸酯穩定性及輸入相關之資料；及對培養基及表現PtNTT2之細胞之細胞質溶離份中的d5SICS及dNaM核苷酸之組成分析。3P、2P、1P及0P分別對應於三磷酸酯、二磷酸酯、單磷酸酯及核苷。[3P]=三磷酸酯之總細胞內濃度。
圖3A描繪例示性pINF構築體及活體內複製實驗之流程。同源性之區域係藉由陰影描繪。(Y=5SICS及X=NaM)。B=生物素。
圖3B描繪含有已添加d5SICSTP及dNaMTP之pINF的細胞之生長曲線。EP=電穿孔。
圖3C描繪在pINF及pUC19中之整體核苷含量之LC-MS/MS總離子層析圖，其係以動態多反應監測(DMRM)模式記錄。pINF及pUC19(對照物)係在存在或不存在非天然三磷酸酯及具有或不具有PtNTT2誘發之情況下在大腸桿菌中繁殖。插圖顯示質量計數軸在d5SICS區域中之100×擴展。
圖3D描繪PCR片段之凝膠移位分析，該等PCR片段在UBP、非天 然三磷酸酯及轉運子誘發存在下展現生物素化。B=生物素。SA=抗生蛋白鏈菌素。在左側顯示50bp DNA階梯。
圖3E描繪展現UBP保持力之桑格(Sanger)定序分析，其係如藉由在UBP併入之位置處之定序反應突然終止(以箭頭指示)來證明。
圖4描繪與UBP之細胞內穩定性相關之資料。大腸桿菌C41(DE3)-pACS用pINF轉化且使其在培養基中經提供單一劑量之d5SICSTP及dNaMTP之後生長。隨時間變化測定UBP保持力(方形)、OD600(菱形)及d5SICSTP及dNaMTP在培養基中之相對量(分別為開環及閉環；100%=0.25mM)。
圖5描繪PtNTT2與其他核苷酸轉運子相比在[α-32P]-dATP之吸收中顯著較為活性。顯示原始(左)及經處理(右)資料。相對放射活性對應於由各樣品產生的計數之總數。
圖6A描繪來自生長細菌培養物(在存在或不存在磷酸鉀(KPi)之情況下)之dNaM及d5SICS之非天然三磷酸酯(3P)之HPLC。
圖6B描繪來自生長細菌培養物(在存在或不存在磷酸鉀(KPi)之情況下)之dNaM及d5SICS之非天然三磷酸酯之組成量變曲線。
圖7A描繪原始(左)及經處理(右)資料，其在經指示KPi濃度存在下抑制[α-32P]-dATP吸收至細胞中之吸收。來自普氏立克次體(RpNTT2)之NTT用作陰性對照物：其背景信號自PtNTT2(黑色條柱)及TpNTT2(白色條柱)之信號減去。相對放射活性對應於由各樣品產生的計數之總數。
圖7B描繪曲線圖，其示出來自表現經指示NTT之細胞的[α-32P]-dATP之組成%(在培養基中存在或不存在50mM KPi之情況下)。
圖8A描繪在經指示時間點處放射性受質之總吸收(左)及總細胞內三磷酸酯含量(右)隨IPTG濃度變化之曲線圖。相對放射活性對應於由各樣品產生的計數之總數。
圖8B描繪隨IPTG濃度變化之生長曲線及用pCDF-1b-PtNTT2(pACS)質體轉化之細菌細胞之[α-32P]-dATP吸收。
圖9A描繪培養基中之[α-32P]-dATP隨時間變化之TLC影像(下)及其定量(上)。M係指用作TLC標準物之所有三種化合物[3P、2P及1P]之混合物。標記為「起始」之位置對應於在TLC盤上之樣品點樣之位置。
圖9B描繪細胞溶解物中之[α-P]-dATP隨時間變化之TLC影像(下)及其定量(上)。M係指用作TLC標準物之所有三種化合物[3P、2P及1P]之混合物。標記為「起始」之位置對應於在TLC盤上之樣品點樣之位置。
圖10顯示質體pINF(藉由用dNaM替代dT505由pUC19建構)及編碼PtNTT2之pCDF-1b質體(pACS)之示意圖圖示。dX及dY對應於dNaM及d5SICS類似物。cloDF=pCDF-1b質體之複製起點；Sm=鏈黴素耐受性基因；AmpR=安比西林耐受性基因；ori=ColE1複製起點；MCS=多選殖位點；lacZα=β-半乳糖苷酶片段基因。
圖11A說明抗生蛋白鏈菌素移位(SAS)隨含有UBP之模板之分率變化的校準曲線圖。
圖11B說明且表示來自SAS樣品(重複三次操作)之原始數據。SA=抗生蛋白鏈菌素。
圖12A描繪經指示在組成中之非天然核苷三磷酸酯3P(黑色)、2P(暗灰色)、1P(亮灰色)及0P(白色)磷酸化狀態之%之曲線。在1h回收結束時的組成在各曲線圖之右側顯示。
圖12B描繪自大腸桿菌純化的pINF及pACS質體之限制分析，該等質體用NdeI限制核酸內切酶線性化且在1%瓊脂糖凝膠上經分離。對於各時間點，重複三份資料在三條色帶中顯示，未轉化對照物在第四條最右側之色帶中顯示。pINF/pACS質體之莫耳比在各色帶之頂部 顯示。
圖12C描繪曲線圖，其顯示隨時間變化之pINF倍增數目。在約50h時起始的降低係歸因於pINF質體之損失，該損失亦導致誤差增加。
圖13A至圖13H描繪PCR片段之原始定序跡線，其係由在大腸桿菌中繁殖的pINF質體在不同時間點處產生。顯示重複三份資料。非天然核苷酸之位置以箭頭指示。
如本文中所說明，d5SICSTP及dNaMTP可藉由來自三角褐指藻之轉運子2(PtNTT2)有效地輸入至大腸桿菌中，且大腸桿菌複製機制可有效地將此等非天然三磷酸酯併入至細胞環境內之DNA中以形成非天然DNA鹼基對。
本發明部分地基於以下發現：特定非天然鹼基對(UBP)(包括(但不限於)(d)5SICS-(d)NaM及(d)TPT3-(d)NaM)可以如天然鹼基對之效率及保真度擴增(Malyshev等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2012)109：12005-12010；Li等人，J.Am.Chem.Soc.(2014)136：826-829)。因此，本文中提供用於增加細胞或有機體之遺傳密碼符號的方法、組合物及套組。此外，本文中提供包含擴展遺傳密碼符號之組合物(例如細胞)，例如穩定地繁殖擴展遺傳密碼符號之細胞。此外，本文中提供包含擴展遺傳密碼符號之組合物(例如細胞)，其中非天然三磷酸酯之存在或UBP之複製均不表示對細胞之顯著生長負擔。
另外，本發明係關於遺傳構築體、經修飾細胞及將天然及非天然核苷酸輸入及併入至活細胞之核酸中的方法。本發明之態樣促進活細胞之標記及修飾。藉由本文所描述之經修飾細胞及方法輸入至細胞中之非天然核苷酸可活體內形成UBP，且此等UBP可經由細胞之一或多個複製循環複製。首次描述了將除A、G、T及C以外之核苷酸(例如(d)5SICS及(d)NaM)穩定地併入其細胞核酸內的細胞。本文中亦提供 將非天然核苷酸併入至核酸中之方法，其係藉由使用含有第一非天然核苷酸之核酸作為模板以使得第二非天然核酸在與第一非天然核苷酸互補的位點處併入來達成。舉例而言，該等將非天然核苷酸併入至核酸中之方法可包含實現非天然核苷酸至非天然胺基酸中之轉錄、複製、反轉錄或轉譯。
此外，本文中提供保留UBP之組合物(例如細胞)，例如在非天然三磷酸酯在細胞之生長介質中可獲得時提供。該等方法、組合物及套組可例如通過核酸之增強的細胞輸入來利用核酸之增強的細胞吸收。 經歷增強的細胞吸收之核酸可為一或多種非天然核苷酸。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸可為一或多種非天然核苷酸且不為天然核酸。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸可為一或多種非天然核苷酸及一或多種天然核苷酸。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸可為一或多種非天然核苷酸及一或多種第一天然核苷酸，但不為一或多種第二天然核苷酸。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸可為一或多種第一非天然核苷酸及一或多種天然核苷酸，但不為一或多種第二非天然核苷酸。
該等方法、組合物及套組可利用一或多種內源性或外源性酶以穩定地整合非天然核酸，例如非天然核苷三磷酸酯。該等方法、組合物及套組可利用一或多種內源性或外源性酶以複製同源核酸來形成包含非天然核酸之核酸。舉例而言，內源性或外源性酶(例如內源性或外源性聚合酶)可經利用以複製基因組DNA來形成在細胞內含有UBP。 該等方法、組合物及套組可利用一或多種內源性或外源性酶以複製包含UBP之細胞核酸來形成包含非天然核酸之核酸複製物。舉例而言，內源性或外源性聚合酶可經利用以複製含有在細胞內之UBP的基因組DNA。該等方法、組合物及套組亦可利用不經DNA修復路徑有效切除之UBP。
核酸
核酸(例如，在本文中亦稱為靶核酸、靶核苷酸序列、所關注之核酸序列或所關注之核酸區域)可例如來自任何源或組合物，諸如DNA、cDNA、gDNA(基因組DNA)、RNA、siRNA(短抑制性RNA)、RNAi、tRNA或mRNA，且可呈任何形式(例如，線性、環狀、超螺旋、單股、雙股及其類似者)。核酸可包含核苷酸、核苷或聚核苷酸。核酸可包含天然及非天然核酸。核酸亦可包含非天然核酸，諸如DNA或RNA類似物(例如，含有鹼基類似物、糖類似物及/或非原生主鏈及其類似者)。應理解，術語「核酸」並不指或推斷聚核苷酸鏈之特定長度，因此聚核苷酸及寡核苷酸亦包括於該定義中。例示性天然核苷酸包括(但不限於)ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP及dGMP。例示性天然去氧核糖核苷酸包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP及dGMP。例示性天然核糖核苷酸包括ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP及GMP。對於RNA，尿嘧啶鹼基為尿苷。核酸有時為載體、質體、噬菌體、自主複製序列(ARS)、著絲點、人工染色體、酵母人工染色體(例如YAC)或其他能夠在宿主細胞中複製或經複製的核酸。非天然核酸可為核酸類似物。非天然核酸可來自細胞外源。非天然核酸可供用於本文所提供之有機體(例如遺傳修飾有機體)之細胞內空間。
非天然核酸
核苷酸類似物或非天然核苷酸包含核苷酸，該核苷酸含有對鹼基、糖或磷酸酯部分之某些類型的修飾。修飾可包含化學修飾。修飾可為例如3'OH或5'OH基團、主鏈、糖組分或核苷酸鹼基之修飾。修 飾可包括添加非天然存在之連接子分子及/或股間或股內交聯。在一個態樣中，經修飾核酸包含3'OH或5'OH基團、主鏈、糖組分或核苷酸鹼基中之一或多者之修飾，及/或非天然存在之連接子分子之添加。在一個態樣中，經修飾主鏈包含除磷酸二酯主鏈以外的主鏈。在一個態樣中，經修飾糖包含除去氧核糖(在經修飾DNA中)以外或除核糖(經修飾RNA)以外的糖。在一個態樣中，修飾鹼基包含除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶(在經修飾DNA中)以外的鹼基或除腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶(在經修飾RNA中)以外的鹼基。
核酸可包含至少一個經修飾鹼基。對鹼基部分之修飾將包括A、C、G及T/U以及不同嘌吟或嘧啶鹼基之天然及合成修飾。在一些實施例中，修飾為對於腺嘌呤、鳥嘌呤胞嘧啶或胸腺嘧啶(在經修飾DNA中)之修飾形式或腺嘌呤、鳥嘌呤胞嘧啶或尿嘧啶(經修飾RNA)之修飾形式。
非天然核酸之經修飾鹼基包括(但不限於)尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)、2-胺基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌昤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代腺嘌昤及鳥嘌呤、5-鹵(尤其為5-溴、5-三氟甲基)及其他5-取代尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌昤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌昤、7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。某些非天然核酸，諸如5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2取代嘌呤、N-6取代嘌呤、O-6取代嘌呤、2-胺基丙基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、增加雙螺旋體形成 穩定性之彼等者、通用核酸、疏水性核酸、混雜核酸、尺寸擴展核酸、氟化核酸、5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及0-6取代嘌呤，包括2-胺基丙基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、6-甲基、腺嘌呤及鳥嘌呤之其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CI¼)尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、嘧啶核酸之其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(尤其為5-溴、5-三氟甲基)、其他5-取代尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-胺基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤、3-去氮雜腺嘌呤、三環嘧啶、啡噁嗪胞嘧啶核苷([5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、啡噻嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-鉗結構物、啡噁嗪胞嘧啶核苷(例如9-(2-胺基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞嘧啶核苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞嘧啶核苷(H-吡啶并[3',2'：4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)、嘌呤或嘧啶鹼基經其他雜環替代之彼等者、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-胺基吡啶、2-吡啶酮、氮雜胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、環胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5,6-二氫胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羥基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶及5-碘尿嘧啶、2-胺基-腺嘌呤、6-硫基-鳥嘌昤、2-硫基-胸腺嘧啶、4-硫基-胸腺嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、4-硫基-尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮-8-氮雜鳥嘌 呤、5-羥基胞嘧啶、2'-去氧尿苷、2-胺基-2'-去氧腺苷，及在美國專利第3,687,808號；第4,845,205號；第4,910,300號；第4,948,882號；第5,093,232號；第5,130,302號；第5,134,066號；第5,175,273號；第5,367,066號；第5,432,272號；第5,457,187號；第5,459,255號；第5,484,908號；第5,502,177號；第5,525,711號；第5,552,540號；第5,587,469號；第5,594,121號；第5,596,091號；第5,614,617號；第5,645,985號；第5,681,941號；第5,750,692號；第5,763,588號；第5,830,653號及第6,005,096號；第WO 99/62923號；Kandimalla等人，(2001)Bioorg.Med.Chem.9：807-813；The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,Kroschwitz,J.I.編，John Wiley & Sons,1990,858-859；Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；及Sanghvi，第15章，Antisense Research and Applications,Crooke及Lebleu編，CRC Press,1993,273-288中所描述之非天然核酸。額外鹼基修飾可例如在美國專利第3,687,808號；Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；及Sanghvi，第15章，Antisense Research and Applications，第289至302頁，Crooke及Lebleu編，CRC Press,1993中發現。
包含各種雜環鹼基及各種糖部分(及糖類似物)之非天然核酸在此項技術中可獲得，且核酸可包括除天然存在的核酸之主要五個鹼基組分以外的一個或若干個雜環鹼基。舉例而言，雜環鹼基可包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥嘌呤-8-基、4-胺基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-側氧基吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-側氧基吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤係經由9位置、嘧啶經由1位置、吡咯并嘧啶經由7位置且吡唑并嘧啶經由1位置連接至核酸之糖部分。
核苷酸類似物亦可在磷酸酯部分處經修飾。經修飾磷酸酯部分包 括(但不限於)可經修飾以使得在兩種核苷酸之間的鍵含有以下各者的磷酸酯部分：硫代磷酸酯；對掌性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；胺基烷基磷酸三酯；甲基及其他烷基膦酸酯，包括3'-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯；亞膦酸酯；胺基磷酸酯，包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯；硫羰基胺基磷酸酯；硫羰基烷基膦酸酯；硫羰基烷基磷酸三酯及硼烷磷酸酯。應理解，在兩種核苷酸之間的此等磷酸酯或經修飾磷酸酯鍵聯可經由3'-5'鍵或2'-5'鍵，且該鍵聯可含有反轉極性，諸如3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。大量美國專利教示如何製造及使用含有經修飾磷酸酯之核苷酸，且其包括(但不限於)3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361及5,625,050，其中之每一者均以引用之方式併入本文中。
非天然核酸可包括2',3'-二去氧基-2',3'-二去氫-核苷(PCT/US2002/006460)、5'-取代DNA及RNA衍生物(PCT/US2011/033961；Saha等人，J.Org Chem.,1995,60,788-789；Wang等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1999,9,885-890；及Mikhailov等人，Nucleosides & Nucleotides,1991,10(1-3),339-343；Leonid等人，1995,14(3-5),901-905；及Eppacher等人，Helvetica Chimica Acta,2004,87,3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560)，或製成為具有經修飾鹼基之單磷酸酯之5'-取代單體(Wang等人，Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids,2004,23(1 & 2),317-337)。
非天然核酸可包括在糖環之5'位置及2'位置處之修飾(PCT/US94/02993)，諸如5'-CH2-取代2'-O-保護核苷(Wu等人，Helvetica Chimica Acta,2000,83,1127-1143及Wu等人，Bioconjugate Chem.1999,10,921-924)。非天然核酸可包括醯胺連接之核苷二聚體(已經製備用於併入寡核苷酸中)，其中在該二聚體(5'至3')中之3'連接核苷包含2'-OCH3及5'-(S)-CH3(Mesmaeker等人，Synlett,1997,1287-1290)。非天然核酸可包括2'-取代5'-CH2(或O)修飾核苷(PCT/US92/01020)。非天然核酸可包括5'-亞甲基膦酸酯DNA及RNA單體及二聚體(Bohringer等人，Tet.Lett.,1993,34,2723-2726；Collingwood等人，Synlett,1995,7,703-705；及Hutter等人，Helvetica Chimica Acta,2002,85,2777-2806)。非天然核酸可包括具有2'-取代之5'-膦酸酯單體(US2006/0074035)及其他經修飾5'-膦酸酯單體(WO1997/35869)。非天然核酸可包括5'-修飾亞甲基膦酸酯單體(EP614907及EP629633)。非天然核酸可包括在5'及/或6'位置處包含羥基之5'或6'-膦酸酯核糖核苷之類似物(Chen等人，Phosphorus,Sulfur and Silicon,2002,777,1783-1786；Jung等人，Bioorg.Med.Chem.,2000,8,2501-2509；Gallier等人，Eur.J.Org.Chem.,2007,925-933；及Hampton等人，J.Med.Chem.,1976,19(8),1029-1033)。非天然核酸可包括具有5'-磷酸酯基團之5'-膦酸酯去氧核苷單體及二聚體(Nawrot等人，Oligonucleotides,2006,16(1),68-82)。非天然核酸可包括核苷，其具有6'-膦酸酯基團，其中5'或/及6'位置未經取代或經硫基-第三丁基(SC(CH3)3)(及其類似物)取代；亞甲基胺基(CH2NH2)(及其類似物)或氰基(CN)(及其類似物)(Fairhurst等人，Synlett,2001,4,467-472；Kappler等人，J.Med.Chem.,1986,29,1030-1038；Kappler等人，J.Med.Chem.,1982,25,1179-1184；Vrudhula等人，J.Med.Chem., 1987,30,888-894；Hampton等人，J.Med.Chem.,1976,19,1371-1377；Geze等人，J.Am.Chem.Soc,1983,105(26),7638-7640；及Hampton等人，J.Am.Chem.Soc,1973,95(13),4404-4414)。
非天然核酸亦可包括糖部分之修飾。本發明之核酸可視情況含有一或多種其中的糖基團已經修飾的核苷。該等糖修飾核苷可經賦予增強的核酸酶穩定性、增加的結合親和力或某些其他有益生物特性。在某些實施例中，核酸包含化學修飾核呋喃糖環部分。化學修飾核呋喃糖環之實例包括(但不限於)添加取代基(包括5'及/或2'取代基)；橋接兩個環原子以形成雙環核酸(BNA)；用S、N(R)或C(Ri)(R2)(R=H、C1-C12烷基或一保護基)替代核糖基環氧原子；及其組合。化學修飾糖之實例可在WO2008/101157、US2005/0130923及WO2007/134181中發現。
經修飾核酸可包含經修飾糖或糖類似物。因此，除核糖及去氧核糖之外，糖部分可為戊醣、去氧戊醣、己醣、去氧己醣、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖或糖「類似物」環戊基。糖可呈哌喃糖基或呋喃糖基形式。糖部分可為核糖、去氧核糖、阿拉伯糖或2'-O-烷基核糖之呋喃糖苷，且該糖可以[α]或[β]變旋異構組態經連接至各別雜環鹼基。糖修飾包括(但不限於)2'-烷氧基-RNA類似物、2'-胺基-RNA類似物、2'-氟-DNA及2'-烷氧基-或胺基-RNA/DNA嵌合體。舉例而言，糖修飾可包括2'-O-甲基-尿苷或2'-O-甲基-胞嘧啶核苷。糖修飾包括2'-O-烷基-取代去氧核糖核苷及2'-O-乙二醇類核糖核苷。已知此等糖或糖類似物及各別「核苷」(其中該等糖或類似物連接至雜環鹼基(核酸鹼基))之製備。糖修飾也可以經作出且與其他修飾組合。
對糖部分之修飾包括核糖及去氧核糖之天然修飾以及非天然修飾。糖修飾包括(但不限於)在2'位置處之以下修飾：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基， 其中該烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。2'糖修飾亦包括(但不限於)-O[(CH2)nO]m CH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nONH2及-O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2，其中n及m為1至約10。
其他在2'位置處之修飾包括(但不限於)：C1至C10低碳烷基、經取代低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代矽烷基、RNA分裂基團、報導子基團、嵌入劑、用於改良寡核苷酸之藥物動力學特性之基團或用於改良寡核苷酸之藥效學特性之基團及具有類似特性之其他取代基。類似修飾也可以在糖上之其他位置處作出，尤其為3'末端核苷酸上之糖之3'位置或5'末端核苷酸之2'-5'連接寡核苷酸及5'位置。經修飾糖亦包括含有在橋接環氧(諸如CH2及S)處之修飾的經修飾糖。核苷酸糖類似物亦可具有糖模擬物(諸如環丁基部分)替代呋喃戊醣基糖。存在大量教示該等經修飾糖結構之製備且詳述及描述一系列鹼基修飾的美國專利，諸如美國專利第4,981,957號；第5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號；第4,845,205號；第5,130,302號；第5,134,066號；第5,175,273號；第5,367,066號；第5,432,272號；第5,457,187號；第5,459,255號；第5,484,908號；第5,502,177號；第5,525,711號；第5,552,540號；第5,587,469號；第5,594,121號；第5,596,091號；第5,614,617號；第5,681,941號及第5,700,920號，其中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。
具有經修飾糖部分之核酸之實例包括(但不限於)包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3及2'-O(CH2)2OCH3取代基之核酸。在2'位置處之取代基亦可選自烯丙基、胺基、疊氮基、硫基、O-烯丙基、O-(C1-C10烷基)、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)及O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)，其中各Rm及Rn獨立地為H或經取代或未經取代之C1-C10烷基。
在某些實施例中，本發明之核酸包括一或多種雙環核酸。在某些該等實施例中，雙環核酸包含在4'核糖基環原子與2'核糖基環原子之間的橋接。在某些實施例中，本文中提供的核酸包括一或多種雙環核酸，其中橋接包含4'至2'雙環核酸。該等4'至2'雙環核酸之實例包括(但不限於)以下式中之一者：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'及其類似物(參見美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其類似物(參見WO2009/006478；WO2008/150729；US2004/0171570；美國專利第7,427,672號；Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,209,74,118-134及WO2008/154401)。亦參見例如：Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人，Chem.Biol,2001,8,1-7；Oram等人，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美國專利第4,849,513號、第5,015,733號、第5,118,800號、第5,118,802號、第7,053,207號、第6,268,490號、第6,770,748號、第6,794,499號、第7,034,133號、第6,525,191號、第6,670,461號及第7,399,845號；國際公開案第 WO2004/106356號、第WO1994/14226號、第WO2005/021570號、第WO2007/090071號及第WO2007/134181號；美國專利公開案第US2004/0171570號、第US2007/0287831號及第US2008/0039618號；美國臨時申請案第60/989,574號、第61/026,995號、第61/026,998號、第61/056,564號、第61/086,231號、第61/097,787及第61/099,844號；及國際申請案第PCT/US2008/064591號、第PCT US2008/066154號、第PCT US2008/068922號及第PCT/DK98/00393號。
在某些實施例中，核酸可包含經連接核酸。核酸可使用任何間核酸鍵連接在一起。兩種主要類別之間核酸連接基團係藉由磷原子之存在或不存在定義。代表性的含有磷之間核酸鍵包括(但不限於)磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、胺基磷酸酯及硫代磷酸酯(P=S)。代表性的不含磷間核酸連接基團包括(但不限於)亞甲基甲基亞胺基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫二酯(-O-C(O)-S-)、硫羰基胺基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；矽氧烷(-O-Si(H)2-O-)；及N,N*-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3))。在某些實施例中，具有對掌性原子之間核酸鍵可製備為外消旋混合物、獨立的對映異構體(例如磷酸烷基酯及硫代磷酸酯)。非天然核酸可含有單一修飾。非天然核酸可含有多個在部分中之一者內或在不同部分之間的修飾。
對核酸之主鏈磷酸酯修飾包括(但不限於)甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯(橋接或非橋接)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、二硫代膦酸酯及硼烷磷酸酯，且其可以任何組合形式使用。其他非磷酸酯鍵亦可使用。
在一些實施例中，主鏈修飾(例如，膦酸甲酯、硫代磷酸酯、磷醯胺酸及二硫代磷酸酯核苷酸間鍵)可對經修飾核酸賦予免疫調節活性及/或增強其活體內穩定性。
磷衍生物(或經修飾磷酸酯基團)可連接至糖或糖類似物部分且可 為單磷酸、二磷酸酯、三磷酸酯、膦酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯或其類似者。含有經修飾磷酸酯鍵或非磷酸酯鍵的例示性聚核苷酸可在Peyrottes等人，1996,Nucleic Acids Res.24：1841-1848；Chaturvedi等人，1996,Nucleic Acids Res.24：2318-2323；及Schultz等人，(1996)Nucleic Acids Res.24：2966-2973；Matteucci,1997,Oligonucleotides as Therapeutic Agents中之「Oligonucleotide Analogs：an Overview」,(Chadwick及Cardew編)John Wiley and Sons,New York,NY；Zon,1993,Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesis and Properties中之「Oligonucleoside Phosphorothioates」,Humana Press，第165-190頁；Miller等人，1971,JACS 93：6657-6665；Jager等人，1988,Biochem.27：7247-7246；Nelson等人，1997,JOC 62：7278-7287；美國專利第5,453,496號及Micklefield,2001,Curr.Med.Chem.8：1157-1179中發現。
主鏈修飾可包含用替代部分(諸如陰離子、中性或陽離子基團)替代磷酸二酯鍵。該等修飾之實例包括：陰離子核苷間鍵；N3'至P5'胺基磷酸酯修飾；硼烷磷酸酯DNA；促寡核苷酸；中性核苷間鍵，諸如甲基磷酸酯；醯胺連接DNA；亞甲基(甲基亞胺基)鍵；甲縮醛及硫甲縮醛鍵；含有磺醯基之主鏈；嗎啉基寡聚物；肽核酸(PNA)；及帶正電去氧核糖核酸胍(DNG)寡聚物(Micklefield,2001,Current Medicinal Chemistry 8：1157-1179)。經修飾核酸可包含含有一或多種修飾之嵌合或混合主鏈，該等修飾例如磷酸酯鍵之組合，諸如磷酸二酯與硫代磷酸酯鍵之組合。
用於磷酸酯之替代物可為例如短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵。此等包括具有嗎啉基鍵(部分由核苷之糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基 及硫甲醯基主鏈；含烯烴主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及具有混合N、O、S及CH2組分部分之其他主鏈之彼等者。大量美國專利揭示如何製造及使用此等類型之磷酸酯替代物，且其包括(但不限於)美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；第5,185,444號；第5,214,134號；第5,216,141號；第5,235,033號；第5,264,562號；第5,264,564號；第5,405,938號；第5,434,257號；第5,466,677號；第5,470,967號；第5,489,677號；第5,541,307號；第5,561,225號；第5,596,086號；第5,602,240號；第5,610,289號；第5,602,240號；第5,608,046號；第5,610,289號；第5,618,704號；第5,623,070號；第5,663,312號；第5,633,360號；第5,677,437號及第5,677,439號，其中之每一者均以引用之方式併入本文中。亦應理解，在核苷酸替代物中，核苷酸之糖與磷酸酯部分兩者均可經例如醯胺型鍵(胺基乙基甘胺酸)(PNA)替代。 美國專利第5,539,082號、第5,714,331號及第5,719,262號教示如何製造及使用PNA分子，該等美國專利中之每一者均以引用之方式併入本文中。亦參見Nielsen等人，Science,1991,254,1497-1500。亦有可能將其他類型之分子(結合物)連接至核苷酸或核苷酸類似物以增強例如細胞吸收。結合物可化學連接至核苷酸或核苷酸類似物。該等結合物包括(但不限於)脂質部分，諸如膽固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)；膽酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.KY.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538)；脂族鏈，例如十二烷二醇或十一基殘基(Saison-Behmoaras等人，EM5OJ,1991,10,1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259,327-330； Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75,49-54)；磷脂，例如二-十六基-外消旋-甘油或三乙銨1-二-O-十六基-外消旋-甘油-S-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)；多元胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides,1995,14,969-973)或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra等人，Biochem.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)或十八基胺或己基胺基-羰基-羥膽固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)。大量美國專利教示該等結合物之製備，且其包括(但不限於)美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,578,717,5,580,731號；第5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,605,735號；第4,667,025號；第4,762,779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254,469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317,098號；第5,371,241；第5,391,723號；第5,416,203；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第5,595,726號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號及第5,688,941號，其中之每一者均以引用之方式併入本文中。
用於細胞輸入之核酸
在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸包含核苷酸三磷酸酯。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸包含核苷酸二磷酸酯。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸包含核苷酸單磷酸酯。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸包含核苷。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸不包含核苷酸二磷酸酯。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸不包含核苷酸單磷酸酯。在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸不包含核苷。
在一些實施例中，經歷增強的細胞吸收之核酸包含核酸類似物，例如非天然核酸。在一些實施例中，核酸之主動轉運之增強的吸收利用核苷酸三磷酸酯轉運子(NTT)，其例如來自絕對細胞內細菌或藻類質體。在一些實施例中，該等方法、組合物及套組將天然及/或非天然核苷酸併入至有機體或細胞中。
多種天然及非天然核苷酸可經輸入至細胞中。一對可經轉運至細胞中且可在併入核酸中時與細胞鹼基配對以形成UBP之非天然核苷酸三磷酸酯之一個實例包括(d)5SICS((d)5SICSTP)之三磷酸酯及(d)NaM((d)NaMTP)之三磷酸酯。一對可經轉運至細胞中且可在併入核酸中時與細胞鹼基配對以形成UBP之非天然核苷酸三磷酸酯之一個實例包括(d)TPT3((d)TPT3TP)之三磷酸酯及(d)NaM((d)NaMTP)之三磷酸酯，其可以如天然鹼基對之效率及保真度經PCR擴增。在一些實施例中，(d)TPT3包含炔丙基胺連接子(TPT3 PA )。一對可經轉運至細胞中且可在併入核酸中時與細胞鹼基配對以形成UBP之非天然核苷酸三磷酸酯之一個實例包括(d)TPT3 PA 之三磷酸酯及NaM A -dNaM對之三磷酸酯，其可以如天然鹼基對之效率及保真度經PCR擴增。該等非天然核苷酸可具有核糖或去氧核糖糖部分。5SICS、d5SICS、NAM及dNaM非天然核苷酸之結構顯示如下。
其他類型之非天然核苷酸可藉由核苷酸三磷酸酯轉運子經輸入至細胞中，諸如(d)TPT3、(d)TPT3 PA 、(d)FTPT3、(d)NaM、(d)5SICS、(d)FEMO、(d)FIMO、(d)MMO2及其組合，其中(d)意謂核鹼基可經連接至去氧核糖或核糖。此等非天然核苷酸三磷酸酯之核鹼基之結構顯示如下。
其中波浪線鑑定至(去氧)核糖或核糖之連接點，且R指示炔丙基胺連接子。糖可經磷酸化(亦即，以形成核苷酸三磷酸酯)。
多種天然存在之核苷酸三磷酸酯亦可藉由本文所描述之方法轉運。天然存在之核苷酸三磷酸酯包括具有腺苷、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸 腺嘧啶或尿嘧啶之核糖或去氧核糖核苷酸三磷酸酯。
其他類型之亦可經轉運至細胞中之經修飾或非天然核苷酸三磷酸酯之實例包括具有5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5氧基乙酸、懷丁氧苷、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w及2,6-二胺基嘌呤之彼等者。
TPT3、dTPT3、NAM及dNaM非天然核苷酸之結構顯示如下。
可用於例如輸入至細胞中之例示性核酸(或UDP)亦可包括在附錄A中所描繪的核酸結構中之任一者或多者，其中波浪線鑑定至糖部分(諸如(去氧)核糖或核糖)之連接點。
多種天然存在之核苷酸以及其他經修飾或非天然核苷酸亦可經由本文所描述之方法經轉運至細胞中。
在一些實施例中，輸入之核酸可定位在細胞之區域或細胞區室內。在一些實施例中，細胞之區域或區室可包括膜、細胞器及/或細胞溶質。舉例而言，膜可包括(但不限於)核膜、質膜、內質網膜、細胞壁、細胞膜及/或粒線體膜。在一些實施例中，膜可包括完整膜或膜之片段。舉例而言，細胞器可包括(但不限於)核仁、核、葉綠體、質體、內質網、粗糙內質網、平滑內質網、中心體、高爾基體、粒線體、液泡、頂體、自噬小體、中心粒、纖毛、眼斑(eyespot apparatus)、糖酵解酶體、乙醛酸循環體、氫化酶體、溶酶體、黑素體、殘留紡錘體、肌原纖維、桶孔覆墊、過氧化體、蛋白酶體、核糖體、小泡、羧酶體、綠色體、鞭毛、磁小體(magenetosome)、核狀體、質體、類囊體、間體、細胞骨架及/或小泡。在一些實施例中，細胞器可包括完整膜或膜之片段。舉例而言，細胞溶質可藉由質膜、細胞膜及/或細胞壁囊封。
核酸鹼基配對特性
非天然核酸可與另一核酸形成鹼基對。在一些實施例中，經穩定整合之非天然核酸為可與另一核酸(例如天然或非天然核酸)形成鹼基對之非天然核酸。在一些實施例中，經穩定整合之非天然核酸為可與另一非天然核酸形成鹼基對之非天然核酸(非天然核酸鹼基對(UBP))。舉例而言，第一非天然核酸可與第二非天然核酸形成鹼基對。舉例而言，一對可在併入核酸中時鹼基配對的非天然核苷酸三磷酸酯包括(d)5SICS((d)5SICSTP)之三磷酸酯及(d)NaM((d)NaMTP)之 三磷酸酯。舉例而言，一對可在併入核酸中時鹼基配對的非天然核苷酸三磷酸酯包括(d)TPT3((d)TPT3TP)之三磷酸酯及(d)NaM((d)NaMTP)之三磷酸酯。該等非天然核苷酸可具有核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，非天然核酸不與天然核酸(A、T、G、C)實質上形成鹼基對。在一些實施例中，經穩定整合之非天然核酸可與天然核酸形成鹼基對。
在一些實施例中，經穩定整合之非天然核酸為可形成UBP但不與四種天然核酸中之每一者實質上形成鹼基對之非天然核酸。在一些實施例中，經穩定整合之非天然核酸為可形成UBP但不與一或多種天然核酸實質上形成鹼基對之非天然核酸。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與A、T及C實質上形成鹼基對，但可與G形成鹼基對。 舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與A、T及G實質上形成鹼基對，但可與C形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與C、G及A實質上形成鹼基對，但可與T形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與C、G及T實質上形成鹼基對，但可與A形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與A及T實質上形成鹼基對，但可與C及G形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與A及C實質上形成鹼基對，但可與T及G形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與A及G實質上形成鹼基對，但可與C及T形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與C及T實質上形成鹼基對，但可與A及G形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與C及G實質上形成鹼基對，但可與T及G形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與T及G實質上形成鹼基對，但可與A及G形成鹼基對。 舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與G實質上形成鹼基對，但可與A、T及C形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可 能不與A實質上形成鹼基對，但可與G、T及C形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與T實質上形成鹼基對，但可與G、A及C形成鹼基對。舉例而言，經穩定整合之非天然核酸可能不與C實質上形成鹼基對，但可與G、T及A形成鹼基對。
能夠在活體內條件下形成非天然DNA或RNA鹼基對(UBP)之例示性非天然核苷酸可包括5SICS、d5SICS、NAM、dNaM及其組合。
靶序列/活性
核苷酸試劑有時可包含靶核苷酸序列。如本文所用之「靶核酸」序列編碼所關注之核酸、肽、多肽或蛋白質，且可為核糖核苷酸序列或去氧核糖核苷酸序列。靶核酸有時為未轉譯核糖核酸且有時為轉譯核糖核酸。未轉譯核糖核酸可包括(但不限於)小干擾核糖核酸(siRNA)、短髮夾核糖核酸(shRNA)、其他能夠進行RNA干擾之核糖核酸(RNAi)、反義核糖核酸或核糖核酸酶。可轉譯靶核苷酸序列(例如靶核糖核苷酸序列)有時編碼肽、多肽或蛋白質，該等肽、多肽或蛋白質在本文中有時被稱作「靶肽」、「靶多肽」或「靶蛋白」。
可轉譯核苷酸序列通常位於起始密碼子(核糖核酸中之AUG及去氧核糖核酸中之ATG)與終止密碼子(例如，核糖核酸中之UAA(赭石)、UAG(琥珀)或UGA(蛋白石)及去氧核糖核酸中之TAA、TAG或TGA)之間，且其在本文中有時被稱作「開放閱讀框架」(ORF)。可轉譯核苷酸序列(例如ORF)有時以不同於在另一有機體中(例如熱帶假絲酵母(C.tropicalis)將CTG編碼為絲胺酸)之方式在一個有機體中經編碼(例如，大多數有機體將CTG編碼為白胺酸)。在一些實施例中，可轉譯核苷酸序列經改變以校正在核苷酸供體有機體與核苷酸受體有機體(例如工程化有機體)之間的交替遺傳密碼(例如密碼子使用)差異。在某些實施例中，可轉譯核苷酸序列經改變以改良：(i)密碼子使用，(ii)轉錄效率，(iii)轉譯效率，(iv)其類似者及其組合。
任何肽、多肽或蛋白質，或藉由一或多種肽、多肽或蛋白質催化之活性可藉由靶核苷酸序列編碼且可經使用者選擇。代表性蛋白質包括轉運子(例如核苷酸三磷酸酯轉運子)、酶(例如，聚合酶、複製機制及其類似者(例如))及膜結合蛋白質，且包括天然存在的多肽與外源表現多肽兩者。
代表性活性(例如，在功能上相關以提供活性之酶或酶之組合)包括核苷酸三磷酸酯轉運子活性及聚合酶活性。
本文中列出適用於本文所描述之實施例的特定多肽(例如酶)。蛋白質或多肽有時來源於細胞內(例如，位於活體內宿主細胞之核、細胞溶質或間質空間中)且有時為活體內細胞膜蛋白質。在一些實施例(在上文中描述且在下文中進一步詳述)中，遺傳修飾結果可以修飾靶活性(例如，增加、實質上增加、降低或實質上降低)。
核苷酸三磷酸酯轉運子活性
葉綠體為植物之特徵細胞器，其具有兩種膜之包膜且藉由在原蟲宿主與藍藻菌(高等植物，綠藻、紅藻及灰色植物門)之間的原始內共生而產生。然而，非光合宿主經由稱為次級內共生之過程吞噬紅藻或綠藻產生另一群複雜嵌合真核生物(綠蜘藻(chloraracheans)、囊泡藻(chromalveolates))。所得光合細胞器因此展現四種限界膜。直至目前，關於跨越複雜色質體之膜的代謝流的知識有限。對涉及能量提供(核苷酸轉運子，NTT)及澱粉代謝之中間物之轉運的色質體載體蛋白質之生物化學特徵分析為跨越原始及複雜色質體之外套膜的細胞交流提供見解。
除色質體核苷酸轉運子(NTT)(其在與ADP及其他去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸之反交換中介導ATP之轉運)之外，結構上相關的蛋白質亦存在於某些細胞內活細菌物種中。特定NTT之不同生物化學特徵使得此等細胞內細菌能夠利用宿主細胞之代謝中間物。內共生細菌阿 莫氏原披衣菌(例如)具有五個NTT，該等NTT不僅為藉由ATP/ADP反交換之能量提供所必需的，且亦為來自宿主細胞之DNA及RNA組分及核苷酸衍生物之吸收所必需的。此外，在阿莫氏原披衣菌中，對應生物合成路徑在進化期間經消除。
細胞可含有或可經修飾以含有促進非天然核苷酸穿過細胞及其他膜之轉運的核苷酸三磷酸酯轉運子以使得非天然核苷酸可供用於用以併入細胞之核酸中之細胞機制。UBP可因此形成於該細胞之核酸內。 此外，該非天然三磷酸酯之存在或該UBP之複製均不表示顯著生長負擔。UBP不被核酸修復路徑有效地切除，且因此其只要非天然三磷酸酯在生長介質中可獲得即可保留。因此，所得細胞為穩定地繁殖擴展遺傳密碼符號之第一種有機體。
某些類型之核苷酸三磷酸酯轉運子與其他類型之核苷酸三磷酸酯相比更有效。舉例而言，來自某些類型之矽藻或藻類的核苷酸三磷酸酯轉運子適用於將天然及/或非天然核苷酸三磷酸酯轉運至細胞中而不產生核苷酸三磷酸酯之降解或損失，尤其在細胞及核苷酸三磷酸酯在磷酸鉀存在下經維持時。
非天然核苷酸係藉由核苷酸三磷酸酯轉運子經轉運至細胞中。如本文中所說明，多種核苷酸三磷酸酯轉運子可用於將非天然核苷酸轉運至細胞中。可用之核苷酸三磷酸酯轉運子之實例包括來自矽藻(諸如三角褐指藻、假微型海鏈藻)及/或阿莫氏原披衣菌之核苷酸三磷酸酯轉運子。
矽藻色質體依賴於藉由在其膜中之特定輸入系統之核苷酸吸收，該輸入系統使細胞器中之胞溶質核苷酸形成與核苷酸消耗互連。由於矽藻色質體被四種膜包圍，而原始色質體僅具有兩種，因此矽藻具有在額外膜中之附加轉運子。
可用之核苷酸三磷酸酯轉運子之實例包括來自三角褐指藻之核苷 酸三磷酸酯轉運子，其具有NCBI寄存編號EEC44449.1(GI：217404502，蛋白質NTT1，PHATRDRAFT_49533)；EEC49227.1(GI：217409295，蛋白質NTT2，PHATRDRAFT_45145)；EEC43534.1(GI：217403582，蛋白質NTT3，PHATRDRAFT_50189)；ACI65362.1(GI：209582741，蛋白質NTT4，PHATR_46794)；EEC50831.1(GI：217410902，蛋白質NTT5，PHATRDRAFT_54110)；XP_002182967.1(GI：219125393，蛋白質NTT6，PHATRDRAFT_54907)。
來自三角褐指藻之核苷酸三磷酸酯轉運子2(PtNTT2；EEC49227.1，GI：217409295)，其具有以下序列SEQ ID NO：1
來自三角褐指藻之具有SEQ ID NO：1之核苷酸三磷酸酯轉運子2係藉由具有以下cDNA序列SEQ ID NO：2之核酸編碼
來自阿莫氏原披衣菌(菌株UWE25)之核苷酸三磷酸酯轉運子2係稱為PamTTT2，且其具有以下序列SEQ ID NO：3
以下以SEQ ID NO：4之形式提供用於以上PamTTT2蛋白質之核苷酸序列之一個實例
來自阿莫氏原披衣菌(菌株UWE25)之核苷酸三磷酸酯轉運子3的一個實例係稱為PamTTT3，且其具有以下序列SEQ ID NO：5
以下以SEQ ID NO：6之形式提供用於以上PamTTT3蛋白質之核苷酸序列之一個實例
來自阿莫氏原披衣菌(菌株UWE25)之核苷酸三磷酸酯轉運子5的一個實例係稱為PamTTT5，且其具有以下序列SEQ ID NO：7
以下以SEQ ID NO：8之形式提供以上PamTTT5蛋白質之核苷酸序列之一個實例
來自假微型海鏈藻之核苷酸三磷酸酯轉運子2之一個實例係稱為TpTTT2，且其具有以下序列SEQ ID NO：9
以下以SEQ ID NO：10之形式提供以上TpTTT2蛋白質之核苷酸序列之一個實例
來自內蓋夫芯卡體菌(Simkania negevensis)之核苷酸三磷酸酯轉 運子3之一個實例係稱為SnTTT3，且其具有以下序列SEQ ID NO：11
以下以SEQ ID NO：12之形式提供用於以上內蓋夫芯卡體菌SnTTT3蛋白質之核苷酸序列之一個實例
單核苷酸錯配導致在SEQ ID NO：11序列之位置248處之胺基酸取代，其中精胺酸(R)(其為鹼性胺基酸)經色胺酸(W)(其為非極性/疏水性胺基酸)替代。來自內蓋夫芯卡體菌之此突變核苷酸三磷酸酯轉運子3具有以下序列SEQ ID NO：13
來自內蓋夫芯卡體菌之核苷酸三磷酸酯轉運子2之一個實例係稱為SnTTT2，且其具有以下序列SEQ ID NO：14
以下以SEQ ID NO：15之形式提供用於以上具有SEQ ID NO：13之內蓋夫芯卡體菌SnTTT2蛋白質之核苷酸序列的一個實例。
來自普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)之核苷酸三磷酸酯轉運子之一個實例係稱為RPTlc1，且其具有以下序列SEQ ID NO：16
以下以SEQ ID NO：17之形式提供用於以上普氏立克次體RPTlc1蛋白質之核苷酸序列之一個實例
來自普氏立克次體之核苷酸三磷酸酯轉運子之另一實例係稱為RPTlc2，且其具有以下序列SEQ ID NO：18
以下以SEQ ID NO：19之形式提供用於以上普氏立克次體RPTlc2蛋白質之核苷酸序列之一個實例
來自普氏立克次體之核苷酸三磷酸酯轉運子之另一實例係稱為RPTlc3，且其具有以下序列SEQ ID NO：20
以下以SEQ ID NO：21之形式提供用於以上普氏立克次體RPTlc3蛋白質之核苷酸序列之一個實例
來自普氏立克次體之核苷酸三磷酸酯轉運子之另一實例係稱為RPTlc4，且其具有以下序列SEQ ID NO：22
以下以SEQ ID NO：23之形式提供用於以上普氏立克次體RPTlc4蛋白質之核苷酸序列之一個實例
來自普氏立克次體之核苷酸三磷酸酯轉運子之另一實例係稱為RPTlc5，且其具有以下序列SEQ ID NO：24
以下以SEQ ID NO：25之形式提供用於以上普氏立克次體RPTlc5蛋白質之核苷酸序列之一個實例
可用之核苷酸三磷酸酯轉運子之實例包括表1中之核苷酸三磷酸酯轉運子：
具有PtNTT2基因序列之pACS質體(pACS_PtNTT2)之序列對應於SEQ ID NO：28。
>pACS_PtNTT2：
在一些實施例中，核苷酸三磷酸酯轉運子來自細菌、植物或藻類。在一些實施例中，核苷酸三磷酸酯轉運子為TpNTT1、TpNTT2、TpNTT3、TpNTT4、TpNTT5、TpNTT6、TpNTT7、TpNTT8(假微型海鏈藻)、PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5、PtNTT6 (三角褐指藻)、GsNTT(溫泉藻(Galdieria sulphuraria))、AtNTT1、AtNTT2(擬南芥(Arabidopsis thaliana))、CtNTT1、CtNTT2(沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis))、PamNTT1、PamNTT2(阿莫氏原披衣菌)、CcNTT(卡氏凱迪菌(Caedibacter caryophilus))、RpNTT1(普氏立克次體)。
如本文所用，術語「轉運子」係指一大群膜轉運蛋白，其跨越細胞及/或小泡之膜轉運核苷酸(且特定言之為非天然或經修飾核苷酸)。 核苷轉運子可涵蓋(但不限於)平衡核苷轉運子(ENT)及濃縮核苷轉運子(CNT)。根據本發明，該術語亦涵蓋有機陰離子轉運子(OAT)及有機陽離子轉運子(OCT)。根據本發明，核苷轉運子可(例如)在包含(但不限於)以下各者之群中選擇：CNT1、CNT2、CNT3、ENT1、ENT2、OAT1、OAT3及OCT1。
核苷酸三磷酸酯轉運子可與胺基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24或其片段中之任一者至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%序列一致。核苷酸三磷酸酯轉運子亦可具有一或多種胺基酸取代，以使得其不與具有胺基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24中之任一者的核苷酸三磷酸酯轉運子相同。
一或多種核酸可編碼一或多種與核酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO： 11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24中之任一者至少約40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%序列一致的核苷酸三磷酸酯轉運子。一或多種編碼一或多種核苷酸三磷酸酯轉運子之核酸亦可具有一或多種核苷酸取代，以使得其不與具有核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24中之任一者的核苷酸三磷酸酯轉運子相同。儘管存在該等核苷酸取代，核苷酸三磷酸酯轉運子可編碼本文所描述之核苷酸三磷酸酯轉運子蛋白中之任一者。
一或多種編碼一或多種核苷酸三磷酸酯轉運子的核酸可與核酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：28中之任一者至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%序列一致。核苷酸三磷酸酯轉運子亦可具有一或多種核苷酸取代，以使得其不與具有核苷酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：28中之任一者的核苷酸三磷酸酯轉運子相同。儘管存在該等核苷酸取代，核苷酸三磷酸酯轉運子可編碼本文所描述之核苷酸三磷酸酯轉運子蛋白中之任一者。
本發明包括將非天然核酸輸入至細胞中之NTT。在一些實施例 中，NTT可經修飾以使得NTT之核苷酸結合位點經修飾以減小非天然核酸至核苷酸結合位點中之立體進入抑制。在一些實施例中，NTT可經修飾以提供與非天然核酸之一或多種非天然特徵之增加的相互作用。該等NTT可在細胞中經表現或工程化以用於將UBP穩定地輸入至細胞中。因此，本發明包括含異源或重組NTT之組合物及使用該等組合物之方法。
NTT可使用關於蛋白質工程化之方法經修飾。舉例而言，可基於晶體結構進行分子模型化以鑑定可作出突變以修飾靶活性或結合位點之NTT位置。被鑑定為替代標靶之殘基可用使用能量最小化模型化、同源性模型化及/或保守胺基酸取代以選擇之殘基來替代，諸如在Bordo等人，J.Mol.Biol.217：721-729(1991)及Hayes等人，Proc Natl Acad Sci,USA 99：15926-15931(2002)中所描述。
多種NTT中之任一者可用於本文中闡述之方法或組合物，包括例如自生物系統分離之基於蛋白質的酶及其官能變體。除非另外指示，否則提及特定NTT(諸如下文所例示之NTT)應理解為包括其官能變體。在一些實施例中，NTT為野生型NTT。在一些實施例中，NTT為經修飾或突變NTT。
具有用於非天然核酸至細胞中之改良進入及用於與非天然核苷酸在核苷酸結合區域中配位之特徵的NTT亦可使用。在一些實施例中，經修飾NTT具有經修飾核苷酸結合位點。在一些實施例中，經修飾或野生型NTT具有對於非天然核酸之不嚴格的(relaxed)特異性。
具有用於非天然核酸至活性位點區域中之改良進入及用於與非天然核苷酸在活性位點區域中配位之特徵的聚合酶亦可使用。在一些實施例中，經修飾聚合酶具有經修飾核苷酸結合位點。
在一些實施例中，經修飾NTT具有對於非天然核酸之特異性，其為野生型NTT對於非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型NTT具有對於包含經修飾糖的非天然核酸之特異性，其為野生型NTT對於天然核酸及/或不具有經修飾糖的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型NTT具有對於包含經修飾鹼基的非天然核酸之特異性，其為野生型NTT對於天然核酸及/或不具有經修飾鹼基的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於包含三磷酸酯的非天然核酸之特異性，其為野生型NTT對於包含三磷酸酯的核酸及/或不具有三磷酸酯的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。舉例而言，經修飾或野生型NTT可具有對於包含三磷酸酯的非天然核酸之特異性，其為野生型NTT對於具有二磷酸酯或單磷酸酯或不具有磷酸酯或其組合的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。
在一些實施例中，經修飾或野生型NTT具有對於非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型NTT對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型NTT具有對於包含經修飾糖的非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型NTT對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生 型NTT具有對於包含經修飾鹼基的非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型NTT對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。
NTT可根據其自核酸之解離速率來表徵。在一些實施例中，NTT具有對於一或多種天然及非天然核酸之相對較低的解離速率。在一些實施例中，NTT具有對於一或多種天然及非天然核酸之相對較高的解離速率。解離速率為可經調節以在本文中所闡述的方法中調節(tune)反應速率的NTT活性。
來自原生來源的NTT或其變體可使用分析篩檢，該分析偵測具有特定結構的非天然核酸之輸入。舉例而言，可篩檢NTT輸入非天然核酸或UBP(例如(d)5SICSTP、(d)NaMTP、(d)TPT3TP、(d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP或(d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP)之能力。可使用展示與野生型NTT相比對於非天然核酸之經修飾的特性的NTT(例如異源NTT)。舉例而言，經修飾特性可為例如在非天然核酸(或天然存在的核苷酸)存在下之Km、kcat、Vmax、NTT輸入；在非天然核酸存在下的具有NTT之細胞的平均模板閱讀-長度；NTT對於非天然核酸之特異性；非天然核酸之結合速率或產物釋放速率或其任何組合。在一個實施例中，經修飾特性為對於非天然核酸之減小的Km及/或對於非天然核酸之增加的kcat/Km或Vmax/Km。類似地，與野生型NTT相比，該NTT視情況具有增加的非天然核酸結合速率、增加的產物釋放速率及/或增加的細胞輸入速率。
同時，NTT可將天然核酸(例如A、C、G及T)輸入至細胞中。舉例而言，NTT視情況展示對於天然核酸之比輸入活性，其為對應野生型NTT之至少約5%高(例如5%、10%、25%、50%、75%、100%或更高)。視情況，NTT展示對於天然存在的核苷酸之kcat/Km或Vmax/Km， 其為野生型NTT之至少約5%高(例如約5%、10%、25%、50%、75%或100%或更高)。
本文中所用之可具有輸入具有特定結構之非天然核酸之能力的NTT亦可使用定向進化方法產生。核酸合成分析可用於篩檢具有對於多種非天然核酸中之任一者之特異性的NTT變體。舉例而言，可篩檢NTT變體將非天然核酸或UBP(例如(d)5SICSTP、(d)NaMTP、(d)TPT3TP、(d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP或(d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP)輸入至核酸中之能力。在一些實施例中，該分析為活體外分析，其例如使用重組NTT變體。在一些實施例中，該分析為活體內分析，其例如在細胞中表現NTT變體。該等定向進化技術可用於篩檢任何適合的NTT之變體對於本文中所闡述的非天然核酸中之任一者的活性。
聚合酶活性
聚合酶之特別適用的功能為催化核酸股之聚合(其使用現存核酸作為模板)。其他適用的功能在本文中別處描述。適用的聚合酶之實例包括DNA聚合酶及RNA聚合酶。
改良聚合酶非天然核酸之特異性、持續力或其他特徵之能力將在多種情形中為高度合乎需要的，在該等情形中例如需要非天然核酸併入，包括擴增、定序、標記、偵測、選殖及許多其他者。本發明提供具有對於非天然核酸之經修飾特性的聚合酶、製造該等聚合酶之方法、使用該等聚合酶之方法及將在下文之完整審查之後變得顯而易見的許多其他特徵。
本發明包括例如在DNA擴增期間將非天然核酸併入至生長模板複製物中之聚合酶。在一些實施例中，聚合酶可經修飾以使得聚合酶之活性位點經修飾以減小非天然核酸至活性位點中之立體進入抑制。在一些實施例中，聚合酶可經修飾以提供與非天然核酸之一或多種非天 然特徵之互補。該等聚合酶可在細胞中經表現或工程化以用於將UBP穩定地併入至細胞中。因此，本發明包括含異源或重組聚合酶之組合物及使用該等組合物之方法。
聚合酶可使用關於蛋白質工程化之方法經修飾。舉例而言，可基於晶體結構進行分子模型化以鑑定可作出突變以修飾靶活性之聚合酶位置。被鑑定為替代標靶之殘基可用使用能量最小化模型化、同源性模型化及/或保守胺基酸取代以選擇之殘基來替代，諸如在Bordo等人，J.Mol.Biol.217：721-729(1991)及Hayes等人，Proc Natl Acad Sci,USA 99：15926-15931(2002)中所描述。
多種聚合酶中之任一者可用於本文中闡述之方法或組合物，包括例如自生物系統分離之基於蛋白質的酶及其官能變體。除非另外指示，否則提及特定聚合酶(諸如下文所例示之聚合酶)應理解為包括其官能變體。在一些實施例中，聚合酶為野生型聚合酶。在一些實施例中，聚合酶為經修飾或突變聚合酶。
具有用於非天然核酸至活性位點區域中之改良進入及用於與非天然核苷酸在活性位點區域中配位之特徵的聚合酶亦可使用。在一些實施例中，經修飾聚合酶具有經修飾核苷酸結合位點。
在一些實施例中，經修飾聚合酶具有對於非天然核酸之特異性，其為野生型聚合酶對於非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於包含經修飾糖的非天然核酸之特異性，其為野生型聚合酶對於天然核酸及/或不具有經修飾糖的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於包含經修飾鹼基的非天然核酸之特異性，其為野生型聚 合酶對於天然核酸及/或不具有經修飾鹼基的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於包含三磷酸酯的非天然核酸之特異性，其為野生型聚合酶對於包含三磷酸酯的核酸及/或不具有三磷酸酯的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。舉例而言，經修飾或野生型聚合酶可具有對於包含三磷酸酯的非天然核酸之特異性，其為野生型聚合酶對於具有二磷酸酯或單磷酸酯或不具有磷酸酯或其組合的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。
在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於非天然核酸之不嚴格的特異性。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型聚合酶對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於包含經修飾糖的非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型聚合酶對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於包含經修飾鹼基的非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型聚合酶對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。
缺乏外切核酸酶活性可為野生型特徵或由變體或工程化聚合酶賦 予之特徵。舉例而言，exo minus克列諾片段為不具有3'至5'改正外切核酸酶活性之突變版本。
本發明方法可用於擴展任何DNA聚合酶之受質範圍，該DNA聚合酶不具有固有3'至5'外切核酸酶改正活性或其中3'至5'外切核酸酶改正活性已例如經由突變而被停用。DNA聚合酶之實例包括polA、polB(參見例如Parrel及Loeb,Nat.Struc.Biol.2001)polC、polD、polY、polX及逆轉錄酶(RT)但較佳為進行性之高保真度聚合酶(PCT/GB2004/004643)。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶實質上不具有3'至5'改正外切核酸酶活性。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶實質上不具有對於非天然核酸之3'至5'改正外切核酸酶活性。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有3'至5'改正外切核酸酶活性。在一些實施例中，經修飾或野生型聚合酶具有對於天然核酸之3'至5'改正外切核酸酶活性且實質上不具有對於非天然核酸之3'至5'改正外切核酸酶活性。
在一些實施例中，經修飾聚合酶具有3'至5'改正外切核酸酶活性，其為野生型聚合酶之改正外切核酸酶活性的至少約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾聚合酶具有對於非天然核酸之3'至5'改正外切核酸酶活性，其為野生型聚合酶對於天然核酸之改正外切核酸酶活性的至少約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。 在一些實施例中，經修飾聚合酶具有對於非天然核酸之3'至5'改正外切核酸酶活性及對於天然核酸之3'至5'改正外切核酸酶活性，其為野生型聚合酶對於天然核酸之改正外切核酸酶活性的至少約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾聚合酶具有對於天然核酸之3'至5'改正外切核酸酶活性，其為野生型聚合酶對於天然核酸之改正外切核酸酶活性的至 少約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。
在一相關態樣中，本發明提供以下各者之方法：製造經修飾聚合酶，其包括在結構上模型化親本聚合酶(例如DNA聚合酶)；鑑定一或多種複合穩定性或影響複合穩定性之核苷酸相互作用特徵、或在活性位點中之核苷酸進入或結合、或用於在活性位點處的核苷酸類似物之互補特徵；及使親本聚合酶突變以包括或移除此等特徵。舉例而言，聚合酶可經突變以改良非天然核苷酸至活性位點之立體進入或改良在非天然核苷酸與聚合酶之間的電荷-電荷或疏水相互作用。該等方法亦包括判定所得經修飾聚合酶是否展示核苷酸或非天然核苷酸至生長核酸複製物中之增加的併入(與親本聚合酶相比)。
聚合酶可根據其自核酸之解離速率來表徵。在一些實施例中，聚合酶具有對於一或多種天然及非天然核酸之相對較低的解離速率。在一些實施例中，聚合酶具有對於一或多種天然及非天然核酸之相對較高的解離速率。解離速率為可經調節以在本文中所闡述的方法中調節反應速率的聚合酶活性。
聚合酶可根據其在與特定天然及/或非天然核酸或天然及/或非天然核酸之集合一起使用時的保真度來表徵。保真度通常係指在製造核酸模板之複製物時，聚合酶將正確核酸併入至生長核酸鏈中之精確度。DNA聚合酶保真度可量測為在聚合酶-股-模板核酸二元複合中，在相同位點處競爭股合成的正確與不正確天然及非天然核酸(當天然及非天然核酸存在時(例如在相同濃度下))併入之比率。DNA聚合酶保真度可計算為比率(kcat/Km)(對於天然及非天然核酸)及比率(kcat/Km)(對於不正確天然及非天然核酸)；其中kcat及Km為在穩態酶動力學中之Michaelis-Menten參數(Fersht,(1985)Enzyme Structure and Mechanism，第2版，第350頁，W.H.Freeman & Co.,New York.，以引 用之方式併入本文中)。在一些實施例中，在具有或不具有改正活性之情況下，聚合酶具有至少約100、1000、10,000、100,000或1×106之保真度值。
來自原生來源的聚合酶或其變體可使用分析篩檢，該分析偵測具有特定結構的非天然核酸之併入。在一個實施例中，可篩檢聚合酶併入非天然核酸或UBP(例如(d)5SICSTP、(d)NaMTP、(d)TPT3TP、(d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP或(d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP)之能力。 可使用展示與野生型聚合酶相比對於非天然核酸之經修飾的特性的聚合酶(例如異源聚合酶)。舉例而言，經修飾特性可為例如在非天然核酸(或天然存在的核苷酸)存在下之Km、kcat、Vmax、聚合酶持續力；在非天然核酸存在下之藉由聚合酶之平均模板閱讀-長度；聚合酶對於非天然核酸之特異性；非天然核酸之結合速率、產物(焦磷酸酯、三磷酸酯等)釋放速率、分枝速率或其任何組合。在一個實施例中，經修飾特性為對於非天然核酸之減小的Km及/或對於非天然核酸之增加的kcat/Km或Vmax/Km。類似地，與野生型聚合酶相比，該聚合酶視情況具有增加的非天然核酸結合速率、增加的產物釋放速率及/或降低的分枝速率。
同時，聚合酶可將天然核酸(例如A、C、G及T)併入至生長核酸複製物中。舉例而言，聚合酶視情況展示對於天然核酸之比活性，其為對應野生型聚合酶之至少約5%高(例如，5%、10%、25%、50%、75%、100%或更高)，及就天然核酸(在模板存在下)而言之持續力，其為野生型聚合酶(在天然核酸存在下)之至少5%高(例如，5%、10%、25%、50%、75%、100%或更高)。視情況，聚合酶展示對於天然存在的核苷酸之kcat/Km或Vmax/Km，其為野生型聚合酶之至少約5%高(例如約5%、10%、25%、50%、75%或100%或更高)。
本文中所用之可具有併入具有特定結構之非天然核酸之能力的聚 合酶亦可使用定向進化方法產生。核酸合成分析可用於篩檢具有對於多種非天然核酸中之任一者之特異性的聚合酶變體。舉例而言，可篩檢聚合酶變體將非天然核酸或UBP(例如(d)5SICSTP、(d)NaMTP、(d)TPT3TP、(d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP或(d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP)輸入至核酸中之能力。在一些實施例中，該分析為活體外分析，其例如使用重組聚合酶變體。在一些實施例中，該分析為活體內分析，其例如在細胞中表現聚合酶變體。該等定向進化技術可用於篩檢任何適合的聚合酶之變體對於本文中所闡述的非天然核酸中之任一者的活性。
所描述的組合物之經修飾聚合酶可視情況為經修飾及/或重組Φ29型DNA聚合酶。視情況，聚合酶可為經修飾及/或重組Φ29、B103、GA-1、PZA、Φ15、BS32、M2Y、Nf、G1、Cp-1、PRD1、PZE、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722或L17聚合酶。
通常適用於本發明之核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶及其突變體或變化形式。DNA聚合酶及其特性尤其在DNAReplication第2版，Kornberg及Baker,W.H.Freeman,New York,N.Y.(1991)中詳細描述。適用於本發明之已知習知DNA聚合酶包括(但不限於)強烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶(Lundberg等人，1991,Gene,108：1,Stratagene)、烏茲火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)DNA聚合酶(Hinnisdaels等人，1996,Biotechniques,20：186-8,Boehringer Mannheim)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶(Myers及Gelfand 1991,Biochemistry 30：7661)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶(Stenesh及McGowan,1977,Biochim Biophys Acta 475：32)、海濱嗜熱球菌(Thermococcus litoralis)(TIi)DNA聚合酶(亦稱為VentTM DNA聚合酶，Cariello等人，1991,Polynucleotides Res,19：4193,New England Biolabs)、9°NmTM DNA聚合酶(New England Biolabs)、Stoffel片段、Thermo Sequenase®(Amersham Pharmacia Biotech UK)、TherminatorTM(New England Biolabs)、海棲熱孢菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶(Diaz及Sabino,1998 Braz J Med.Res,31：1239)、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Chien等人，1976,J.Bacteoriol,127：1550)、DNA聚合酶、鹿兒島火球菌(Pyrococcus kodakaraensis)KOD DNA聚合酶(Takagi等人，1997,Appl.Environ.Microbiol.63：4504)、JDF-3 DNA聚合酶(來自熱球菌屬JDF-3，專利申請案WO/0132887)、火球菌屬GB-D(PGB-D)DNA聚合酶(亦稱為Deep VentTM DNA聚合酶，Juncosa-Ginesta等人，1994,Biotechniques,16：820,New England Biolabs)、UlTma DNA聚合酶(來自嗜熱生物海棲熱孢菌；Diaz及Sabino,1998 Braz J.Med.Res,31：1239；PE Applied Biosystems)、Tgo DNA聚合酶(來自高氏熱球菌(thermococcus gorgonarius)，Roche Molecular Biochemicals)、大腸桿菌DNA聚合酶I(Lecomte及Doubleday,1983,Polynucleotides Res.11：7505)、T7 DNA聚合酶(Nordstrom等人，1981,J.Biol.Chem.256：3112)及古細菌DP1I/DP2 DNA聚合酶II(Cann等人，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14250)。涵蓋嗜溫性聚合酶與嗜熱性聚合酶兩者。嗜熱性DNA聚合酶包括(但不限於)ThermoSequenase®、9°NmTM、TherminatorTM、Taq、Tne、Tma、Pfu、TfI、Tth、TIi、Stoffel片段、VentTM及Deep VentTM DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、Tgo、JDF-3及其突變體、變體及衍生物。亦涵蓋作為3'外切核酸酶缺乏突變體之聚合酶。適用於本發明之逆轉錄酶包括(但不限於)來自HIV、HTLV-I、HTLV-II、FeLV、FIV、SIV、AMV、MMTV、MoMuLV之逆轉錄酶及其他反轉錄病毒(參見Levin,Cell 88：5-8(1997)；Verma,Biochim Biophys Acta.473：1-38(1977)；Wu等人，CRC Crit Rev Biochem.3：289- 347(1975))。聚合酶之其他實例包括(但不限於)9°N DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Phusion® DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、RB69 DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶及VentR® DNA聚合酶(Gardner等人(2004)「Comparative Kinetics of Nucleotide Analog Incorporation by Vent DNA Polymerase」,J.Biol.Chem.,279(12),11834-11842；Gardner及Jack「Determinants of nucleotide sugar recognition in an archaeon DNA polymerase」Nucleic Acids Research,27(12)2545-2553)。自非嗜熱性有機體分離之聚合酶可為熱不可活化的。實例為來自噬菌體之DNA聚合酶。應理解，來自多種來源中之任一者的聚合酶可經修飾以增加或降低其對高溫條件之耐受性。在一些實施例中，聚合酶可為嗜熱性的。在一些實施例中，嗜熱性聚合酶可為熱不可活化的。嗜熱性聚合酶典型地適用於高溫條件或熱循環條件，諸如用於聚合酶鏈反應(PCR)技術之熱循環條件。
另外，該等聚合酶可用於DNA擴增及/或定序應用，包括實時應用，例如在包括藉由聚合酶將非天然核酸殘基併入至DNA中之擴增或定序的情形中。在其他實施例中，併入之非天然核酸可與天然殘基相同，例如其中非天然核酸之標籤或其他部分在併入期間藉由聚合酶之作用經移除，或非天然核酸可具有一或多種將其與天然核酸區分之特徵。
核糖核苷酸還原酶活性
核糖核苷酸還原酶(RNR)(亦稱為(核苷二磷酸酯還原酶))之尤其適用的功能為催化自核糖核苷酸之去氧核糖核苷酸形成。去氧核糖核苷酸可隨後例如用於核酸股之DNA聚合之合成，該合成係使用現存核酸作為模板。其他適用的功能在本文中別處描述。RNR之天然受質可包括ADP、GDP、CDP及UDP。天然活性催化2'-去氧核苷二磷酸酯至核苷二磷酸酯之轉化。
適用的核糖核苷酸還原酶之實例包括CDP還原酶；核苷二磷酸酯還原酶；UDP還原酶；ADP還原酶；核苷二磷酸酯還原酶；核苷5'-二磷酸酯還原酶；核糖核苷酸二磷酸酯還原酶及2'-去氧核苷-二磷酸酯：氧化-硫氧還蛋白2'-氧化還原酶。
改良核糖核苷酸還原酶非天然核酸之特異性、持續力或其他特徵之能力將在多種情形中為高度合乎需要的，在該等情形中例如需要非天然核酸併入，包括擴增、定序、標記、偵測、選殖及許多其他者。 本發明提供具有對於非天然核酸之經修飾特性的核糖核苷酸還原酶、製造該等核糖核苷酸還原酶之方法、使用該等核糖核苷酸還原酶之方法及將在下文之完整審查之後變得顯而易見的許多其他特徵。
本發明包括核糖核苷酸還原酶，其催化自核糖核苷酸之去氧核糖核苷酸形成，其例如在DNA合成或擴增期間使用。在一些實施例中，核糖核苷酸還原酶可經修飾以使得核糖核苷酸還原酶之活性位點經修飾以減小非天然核酸至活性位點中之立體進入抑制。在一些實施例中，核糖核苷酸還原酶可經修飾以提供與非天然核酸之一或多種非天然特徵之互補。在一些實施例中，核糖核苷酸還原酶可經修飾以提供與非天然核酸之一或多種天然特徵之互補。該等核糖核苷酸還原酶可在細胞中經表現或工程化以用於將UBP穩定地併入至細胞中。因此，本發明包括含異源或重組核糖核苷酸還原酶之組合物及使用該等組合物之方法。
核糖核苷酸還原酶可使用關於蛋白質工程化之方法經修飾。舉例而言，可基於晶體結構進行分子模型化以鑑定可作出突變以修飾靶活性之核糖核苷酸還原酶位置。被鑑定為替代標靶之殘基可用使用能量最小化模型化、同源性模型化及/或保守胺基酸取代以選擇之殘基來替代，諸如在Bordo等人，J Mol Biol 217：721-729(1991)及Hayes等人，Proc Natl Acad Sci,USA 99：15926-15931(2002)中描述。
多種核糖核苷酸還原酶中之任一者可用於本文中闡述之方法或組合物，包括例如自生物系統分離之基於蛋白質的酶及其官能變體。除非另外指示，否則提及特定核糖核苷酸還原酶(諸如下文所例示之核糖核苷酸還原酶)應理解為包括其官能變體。在一些實施例中，核糖核苷酸還原酶為野生型聚合酶。在一些實施例中，核糖核苷酸還原酶為經修飾或突變核糖核苷酸還原酶。
可使用具有用於改良天然及/或非天然三磷酸去氧核糖核苷酸核酸至天然及/或非天然核糖核苷酸三磷酸酯之轉化的特徵之核糖核苷酸還原酶。具有用於與非天然核苷酸在活性位點區域中配位之特徵之核糖核苷酸還原酶亦可使用。在一些實施例中，經修飾核糖核苷酸還原酶具有經修飾核苷酸結合位點。在一些實施例中，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶具有對於非天然核酸之不嚴格的特異性。
在一些實施例中，經修飾核糖核苷酸還原酶具有對於非天然核酸之特異性，其為野生型核糖核苷酸還原酶對於非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶具有對於包含經修飾糖的非天然核酸之特異性，其為野生型核糖核苷酸還原酶對於天然核酸及/或不具有經修飾糖的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。 在一些實施例中，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶具有對於包含經修飾鹼基的非天然核酸之特異性，其為野生型核糖核苷酸還原酶對於天然核酸及/或不具有經修飾鹼基的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶具有對於包含三磷酸酯的非天然核酸之特異性， 其為野生型核糖核苷酸還原酶對於包含三磷酸酯的核酸及/或不具有三磷酸酯的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。舉例而言，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶可具有對於包含三磷酸酯的非天然核酸之特異性，其為野生型核糖核苷酸還原酶對於具有二磷酸酯或單磷酸酯或不具有磷酸酯或其組合的非天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。
在一些實施例中，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶具有對於非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型核糖核苷酸還原酶對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶具有對於包含經修飾糖的非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型核糖核苷酸還原酶對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶具有對於包含經修飾鹼基的非天然核酸之特異性及對於天然核酸之特異性，其為野生型核糖核苷酸還原酶對於天然核酸之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。在一些實施例中，經修飾或野生型核糖核苷酸還原酶具有對於包含三磷酸酯的非天然核酸之特異性及對於包含三磷酸酯的天然核酸之特異性，其為野生型核糖核苷酸還原酶對於天然核酸三磷酸酯之特異性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.99%。
在一相關態樣中，本發明提供以下各者之方法：製造經修飾核糖核苷酸還原酶，其包括在結構上模型化親本核糖核苷酸還原酶(例如DNA核糖核苷酸還原酶)；鑑定一或多種複合穩定性或影響複合穩定性之核苷酸相互作用特徵、或在活性位點中之核苷酸進入或結合、或用於在活性位點處的核苷酸類似物之互補特徵；及使親本核糖核苷酸還原酶突變以包括或移除此等特徵。舉例而言，核糖核苷酸還原酶可經突變以改良非天然核苷酸至活性位點之立體進入或改良在非天然核苷酸與核糖核苷酸還原酶之間的電荷-電荷或疏水相互作用。該等方法亦包括判定所得經修飾核糖核苷酸還原酶是否展示核苷酸或非天然核苷酸至生長核酸複製物中之增加的併入(與親本核糖核苷酸還原酶相比)。
核糖核苷酸還原酶可根據其自核酸之解離速率來表徵。在一些實施例中，核糖核苷酸還原酶具有對於一或多種天然及非天然核酸之相對較低的解離速率。在一些實施例中，核糖核苷酸還原酶具有對於一或多種天然及非天然核酸之相對較高的解離速率。解離速率為可經調節以在本文中所闡述的方法中調節反應速率的核糖核苷酸還原酶活性。
來自原生來源的核糖核苷酸還原酶或其變體可使用分析篩檢，該分析偵測具有特定結構的非天然核酸之併入。在一個實施例中，可篩檢核糖核苷酸還原酶併入非天然核酸或UBP(例如(d)5SICSTP、(d)NaMTP、(d)TPT3TP、(d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP或(d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP)之能力。可使用展示與野生型核糖核苷酸還原酶相比對於非天然核酸之經修飾的特性的核糖核苷酸還原酶(例如異源核糖核苷酸還原酶)。舉例而言，經修飾特性可為例如在非天然核酸(或天然存在的核苷酸)存在下之Km、kcat、Vmax、核糖核苷酸還原酶持續力；在非天然核酸存在下之藉由核糖核苷酸還原酶之周轉率；核糖核 苷酸還原酶對於非天然核酸之特異性；非天然核酸之結合速率、產物(焦磷酸酯、三磷酸酯等)釋放速率或其任何組合。在一個實施例中，經修飾特性為對於非天然核酸之減小的Km及/或對於非天然核酸之增加的kcat/Km或Vmax/Km。類似地，與野生型核糖核苷酸還原酶相比，該核糖核苷酸還原酶視情況具有增加的非天然核酸結合速率及/或增加的產物釋放速率。
同時，核糖核苷酸還原酶可將天然去氧核糖核酸(例如dA、dC及dG)處理至天然去氧核糖核酸中。舉例而言，核糖核苷酸還原酶視情況展示對於天然核酸之比活性，其為對應野生型核糖核苷酸還原酶之至少約5%高(例如，5%、10%、25%、50%、75%、100%或更高)，及為野生型聚合酶(在天然核酸存在下)之至少5%高(例如，5%、10%、25%、50%、75%、100%或更高)的kcat。視情況，核糖核苷酸還原酶展示對於天然存在的核苷酸之kcat/Km或Vmax/Km，其為野生型核糖核苷酸還原酶之至少約5%高(例如，約5%、10%、25%、50%、75%或100%或更高)。
本文中所用之可具有併入具有特定結構之非天然核酸之能力的核糖核苷酸還原酶亦可使用定向進化方法產生。核酸合成分析可用於篩檢具有對於多種非天然核酸中之任一者之特異性的核糖核苷酸還原酶變體。舉例而言，可篩檢核糖核苷酸還原酶將非天然核酸或UBP(例如(d)5SICSTP、(d)NaMTP、(d)TPT3TP、(d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP或(d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP)併入至核酸中之能力。在一些實施例中，該分析為活體外分析，其例使用重組核糖核苷酸還原酶變體。在一些實施例中，該分析為活體內分析，其例如在細胞中表現核糖核苷酸還原酶變體。該等定向進化技術可用於篩檢任何適合的核糖核苷酸還原酶之變體對於本文中所闡述的非天然核酸中之任一者的活性。
工程化細胞
本文所描述之方法及組合物(例如核酸及試劑)可用於產生工程化微生物，例如在其細胞環境內併入及複製至少一種非天然核苷酸或至少一個UBP之活細胞。所用之細胞可用編碼異源蛋白質之表現卡匣(例如能夠以對於非天然核酸之高保真度將非天然核苷酸三磷酸酯轉運至細胞及/或聚合酶中之核苷酸三磷酸酯轉運子)來遺傳轉化，以使得非天然核苷酸可被併入細胞核酸中且可例如在活體內條件下形成UBP。細胞可包含對於非天然核酸吸收之增強的活性。細胞可包含對於非天然核酸輸入之增強的活性。細胞可包含對於非天然核酸之增強的聚合酶活性。
因此，藉由實踐本發明之方法，產生活細胞，其在其核酸內併入至少一種非天然核苷酸及/或至少一個UBP。UBP可包括一對非天然、彼此鹼基配對的核苷酸，其能夠在非天然、彼此鹼基配對的核苷酸(呈其各別三磷酸酯形式)藉由核苷酸三磷酸酯轉運子之作用經吸收至細胞中時在活體內條件下形成UBP。細胞可藉由編碼核苷酸三磷酸酯轉運子之表現卡匣經遺傳轉化以使得核苷酸三磷酸酯轉運子經表現且可供用於將非天然核苷酸轉運至細胞中。細胞可藉由編碼聚合酶之表現卡匣經遺傳轉化以使得聚合酶經表現且可供用於將非天然核苷酸併入至細胞之核酸中。細胞可為原核或真核細胞。非天然、彼此鹼基配對的核苷酸對(呈其各別三磷酸酯形式)可為(d)5SICS((d)5SICSTP)之三磷酸酯及(d)NaM((d)NaMTP)之三磷酸酯。非天然、彼此鹼基配對的核苷酸對(呈其各別三磷酸酯形式)可為(d)TPT3((d)TPT3TP)之三磷酸酯及(d)NaM((d)NaMTP)之三磷酸酯。
細胞可包含模板UBP。模板UBP可為存在於細胞內之核酸上的UBP，其包含第一及第二非天然模板核酸。非天然模板核酸可與輸入之非天然核酸鹼基配對。舉例而言，輸入之核酸可藉由與存在於細胞 中之非天然模板核酸鹼基配對來形成UBP。在一些實施例中，模板UBP形成於細胞外部。在一些實施例中，模板UBP經引入至細胞中，諸如藉由轉染、電穿孔或其類似者。
細胞可為具有核酸之遺傳轉化細胞，該核酸例如為編碼能夠將非天然核苷酸轉運至細胞中之核苷酸三磷酸酯轉運子之表現卡匣。細胞可包含異源核苷酸三磷酸酯轉運子，其中異源核苷酸三磷酸酯轉運子可將天然及非天然核苷酸三磷酸酯轉運至細胞中。細胞可包含異源聚合酶，其中異源聚合酶具有對於非天然核酸之活性。
方法亦可包括在磷酸鉀及/或磷酸酶或核苷酸酶之抑制劑存在下使遺傳轉化細胞與各別三磷酸酯形式非天然核苷酸接觸。在該接觸期間或在其之後，可將細胞置放在適用於細胞之生長及複製之維持生命的介質內。可將細胞維持在維持生命的介質中以使得非天然核苷酸之各別三磷酸酯形式被併入細胞內之核酸中，且通過細胞之至少一個複製循環。非天然、彼此鹼基配對的核苷酸對(呈各別三磷酸酯形式)可包含(d)5SICS((d)5SICSTP)之三磷酸酯及(d)NaM((d)NaMTP)之三磷酸酯。非天然、彼此鹼基配對的核苷酸對(呈各別三磷酸酯形式)可包含(d)TPT3((d)TPT3TP)之三磷酸酯及(d)NaM((d)NaMTP)之三磷酸酯。細胞可為大腸桿菌，且(d)5SICSTP及(d)NaMTP或(d)TPT3TP及(d)NaMTP可藉由例如轉運子PtNTT2經有效地輸入至大腸桿菌中，其中大腸桿菌聚合酶(諸如Pol I)可有效地使用非天然三磷酸酯來複製DNA，從而將非天然核苷酸及/或UBP併入至細胞環境內之細胞核酸中。
藉由實踐本發明之方法，一般技術者可獲得活的且繁殖的細胞之群體，該群體具有在維持於個別細胞中之至少一些內之至少一種核酸內的至少一種非天然核苷酸及/或至少一個UBP，其中至少一種核酸在細胞內穩定地繁殖，且其中細胞在與適用於有機體之生長及複製的 維持生命的介質中之非天然核苷酸接觸(例如在其存在下生長)時表現適用於提供一或多種非天然核苷酸之三磷酸酯形式之細胞吸收的核苷酸三磷酸酯轉運子。
在藉由核苷酸三磷酸酯轉運子轉運至細胞中之後，非天然鹼基配對核苷酸係藉由細胞機制(例如細胞之自身DNA及/或RNA聚合酶、異源聚合酶或已使用定向進化進化之聚合酶)經併入細胞內之核酸中(Chen及Romesberg,FEBS Lett.(2014)588(2)：219-29)。非天然核苷酸可經併入細胞核酸中，該等核酸諸如基因組DNA、基因組RNA、mRNA、結構RNA、微RNA及自主複製核酸(例如，質體、病毒或載體)。
遺傳工程化細胞可藉由將核酸(例如異源核酸)引入至細胞中來產生。本文所描述之任何細胞均可為宿主細胞且可包含表現載體。在一個實施例中，宿主細胞為原核細胞。在另一實施例中，宿主細胞為大腸桿菌。在一些實施例中，細胞包含一或多種異源聚核苷酸。核酸試劑可使用各種技術經引入至微生物中。用於將異源核酸引入至各種有機體中之方法之非限制性實例包括：轉化、轉染、轉導、電穿孔、超音波介導轉化、粒子轟擊及其類似者。在一些情況下，添加載體分子(例如，雙-benzimdazolyl化合物，例如參見美國專利第5,595,899號)可增加在細胞中之DNA吸收(其藉由習知方法通常難以轉化)。習知轉化方法為技術人員可容易地獲得的且可在Maniatis等人，(1982)Molecular Cloning：a Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.中發現
遺傳轉化可藉由使用在質體、病毒載體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、黏質體及人工染色體(但不限於以上各者)中之表現卡匣直接轉移，或經由轉移細胞中之遺傳物質或載體(諸如陽離子脂質體)來獲得。該等方法在此項技術中可獲得且容易地適應於用於本文所描 述之方法。轉移載體可為任何用於將基因遞送至細胞(例如質體)中之核苷酸構築體，或作為用以遞送基因之通用策略之一部分，例如作為重組反轉錄病毒或腺病毒之一部分(Ram等人Cancer Res.53：83-88,(1993))。適當的轉染方式，包括病毒載體、化學轉染物或物理機械方法(諸如電穿孔及DNA之直接擴散)係由例如Wolff等人，Science,247,1465-1468,(1990)及Wolff,Nature,352,815-818,(1991)描述。
舉例而言，核苷酸三磷酸酯轉運子或聚合酶核酸分子、表現卡匣及/或載體可藉由任何方法經引入至細胞，該方法包括(但不限於)鈣介導轉化、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、粒子轟擊及其類似者。
細胞可包含併入細胞內之一或多種核酸中之非天然核苷酸三磷酸酯。舉例而言，細胞可為活細胞，其能夠將至少一種非天然核苷酸併入維持在細胞內之DNA或RNA內。細胞亦可在活體內條件下將至少一個包含一對非天然、彼此鹼基配對的核苷酸之UBP併入至細胞內之核酸中，其中非天然、彼此鹼基配對的核苷酸(例如呈其各別三磷酸酯形式)係藉由核苷酸三磷酸酯轉運子之作用經吸收至細胞中，其基因係藉由遺傳轉化經呈現(例如引入)至細胞中。舉例而言，在併入至維持在細胞內之核酸中之後，(d)5SICS及(d)NaM可形成穩定的UBP，其例如在生長於包含(d)5SICS及(d)NaM之維持生命的介質中時，可藉由有機體之DNA複製機制穩定地繁殖。舉例而言，在併入至維持在細胞內之核酸中之後，(d)TPT3及(d)NaM可形成穩定的UBP，其例如在生長於包含(d)TPT3及(d)NaM之維持生命的介質中時，可藉由有機體之DNA複製機制穩定地繁殖。
細胞能夠複製非天然核酸。本文中提供一種產生具有核酸之活細胞之方法，該核酸在活體內條件下將至少一種非天然核苷酸及/或至少一個UBP(其包含一對非天然、彼此鹼基配對的核苷酸)併入及/或複製至細胞之核酸中。該等方法可包括用編碼核苷酸三磷酸酯轉運子 之表現卡匣進行遺傳轉化細胞，該核苷酸三磷酸酯轉運子能夠在活體內條件下將一或多種非天然核苷酸(其呈各別三磷酸酯形式)轉運至細胞中。或者，可使用先前已經過可表現編碼核苷酸三磷酸酯轉運子之表現卡匣進行遺傳轉化的細胞。該方法亦可包括在適用於細胞之生長及複製的維持生命的介質中，使經過遺傳轉化之細胞與磷酸鉀及至少一種非天然核苷酸(例如，能夠形成UBP之兩種彼此鹼基配對的核苷酸)之各別三磷酸酯形式接觸或使前者曝露於後者，且在活體內條件下，在至少一種非天然核苷酸(例如，能夠形成UBP之兩種彼此鹼基配對的核苷酸)之各別三磷酸酯形式存在下，將該轉化細胞維持在維持生命的介質中，使其經過至少一個細胞之複製循環。
細胞可包含經穩定繁殖之非天然核酸。本文中提供一群活的且繁殖的細胞，在該群體之至少一些個別細胞之核酸內包含至少一種非天然核苷酸(例如，能夠形成UBP之兩種彼此鹼基配對的核苷酸)或至少一個UBP，作為細胞之DNA之穩定繁殖的組分，其中該細胞係經過適用於細胞吸收該成對之非天然核苷酸之三磷酸酯形式之核苷酸三磷酸酯轉運子進行遺傳轉化。細胞群體可在成對之非天然核苷酸之各別三磷酸酯形式存在下，在適用於有機體之生長及複製的維持生命的介質中生長。
細胞可包含經穩定地併入之非天然核酸。一些實施例包含細胞(例如呈大腸桿菌形式)，其將除A、G、T及C以外的核苷酸穩定地併入維持於細胞內之核酸內。舉例而言，除A、G、T及C以外的核苷酸可為(d)5SICS、(d)TPT3及(d)NaM，其在併入細胞之核酸中之後可在核酸內形成穩定的UBP。在一個態樣中，當用三磷酸酯轉運子之基因轉化的有機體在包括磷酸鉀及(d)5SICS、(d)TPT3及(d)NaM之三磷酸酯形式的維持生命的介質中生長時，非天然核苷酸及UBP可藉由有機體之複製體(replication apparatus)經穩定繁殖。
細胞可包含擴展遺傳密碼符號。細胞可包含經穩定地併入之非天然核酸。在一些實施例中，具有擴展遺傳密碼符號之細胞包含可與另一核酸(例如天然或非天然核酸)形成鹼基對(bp)之非天然核酸。在一些實施例中，具有擴展遺傳密碼符號之細胞包含與另一核酸氫鍵結之非天然核酸。在一些實施例中，具有擴展遺傳密碼符號之細胞包含不與其所鹼基配對之另一核酸氫鍵結的非天然核酸。在一些實施例中，具有擴展遺傳密碼符號的細胞包含經由疏水相互作用與另一核酸鹼基配對的非天然核酸。在一些實施例中，具有擴展遺傳密碼符號之細胞包含經由非氫鍵結相互作用與另一核酸鹼基配對的非天然核酸。具有擴展遺傳密碼符號之細胞可為複製同源核酸以形成包含非天然核酸之核酸的細胞。具有擴展遺傳密碼符號之細胞可為包含與另一非天然核酸配對之非天然核酸鹼基(UBP)之細胞。
細胞可在活體內條件下由輸入之非天然核苷酸形成UBP。在一些實施例中，磷酸鉀及/或磷酸酶及/或核苷酸酶活性之抑制劑可促進非天然核酸之轉運。方法包括使用表現異源核苷酸三磷酸酯轉運子之細胞。當該細胞與一或多種核苷酸三磷酸酯接觸時，核苷酸三磷酸酯經轉運至細胞中。細胞可處於磷酸鉀及/或磷酸酶及核苷酸酶之抑制劑存在下。非天然核苷酸三磷酸酯可藉由細胞之天然機制經併入至細胞內之核酸中，且例如可在細胞之核酸中彼此鹼基配對以形成UBP。
在一些實施例中，UBP可在曝露於非天然三磷酸酯時經併入至細胞或細胞群體中。在一些實施例中，UBP可在實質上不斷地曝露於非天然三磷酸酯時經併入至細胞或細胞群體中。在一些實施例中，UBP之複製不導致實質上減小的生長速率。在一些實施例中，異源蛋白質之複製表現(例如核苷酸三磷酸酯轉運)不導致實質上減小的生長速率。
在一些實施例中，與不具有異源基因之表現之誘發的細胞之生長 及吸收相比，在細胞中的異源基因(例如NTT)之表現之誘發導致較慢細胞生長及增加的天然及/或非天然核酸吸收。在一些實施例中，與不具有異源基因之表現之誘發的細胞之生長及吸收相比，在細胞中的異源基因(例如NTT)之表現之誘發導致增加的細胞生長及增加的天然及/或非天然核酸吸收。
在一些實施例中，與不具有異源基因之表現之誘發的細胞之生長及吸收相比，在用第一濃度之誘發試劑處理的細胞中的異源基因(例如NTT)之表現之誘發可導致較慢細胞生長及增加的天然及/或非天然核酸吸收。在一些實施例中，與用第一濃度之誘發試劑處理的細胞之生長及吸收相比，異源基因(例如NTT)之表現之誘發導致增加的細胞生長及增加的天然及/或非天然核酸吸收。
在一些實施例中，UBP係在對數生長期期間併入。在一些實施例中，UBP係在非對數生長期期間併入。在一些實施例中，UBP係在實質上線性的生長期期間併入。在一些實施例中，UBP係在生長一定時間段之後經穩定地併入至細胞或細胞群體中。舉例而言，UBP可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或50或50個以上複製之後經穩定地併入至細胞或細胞群體中。舉例而言，UBP可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時之生長之後經穩定地併入至細胞或細胞群體中。舉例而言，UBP可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天之生長之後經穩定地併入至細胞或細胞群體中。舉例而言，UBP可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月之生長之 後經穩定地併入至細胞或細胞群體中。舉例而言，UBP可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、50年之生長之後經穩定地併入至細胞或細胞群體中。
在一些實施例中，UBP不被細胞之DNA修復路徑有效地認可。在一些實施例中，UBP不被細胞有效地移除。在一些實施例中，UBP不被細胞有效地切除。在一些實施例中，UBP在一定時間段之後不自細胞或細胞群體有效地移除。舉例而言，UBP不可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或50或50個以上複製之後自細胞或細胞群體有效地移除。舉例而言，UBP不可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時之生長之後自細胞或細胞群體有效地移除。舉例而言，UBP不可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天之生長之後自細胞或細胞群體有效地移除。舉例而言，UBP不可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月之生長之後自細胞或細胞群體有效地移除。舉例而言，UBP不可在生長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、50年之生長之後自細胞或細胞群體有效地移除。
因此，可產生穩定地庇護擴展遺傳密碼符號之有機體。
細胞類型
許多類型之細胞/微生物可用於例如轉化或遺傳工程化。細胞可為原核或真核細胞。舉例而言，細胞可為微生物，諸如細菌細胞、真菌細胞、酵母或單細胞原蟲。或者，細胞可為真核細胞，諸如經培養動物、植物或人類細胞。細胞可存在於有機體，諸如植物或動物中。
在一些實施例中，工程化微生物為單一細胞有機體，其常常能夠分裂及增殖。微生物可包括以下特徵中之一或多者：好氧生物、厭氧生物、絲狀生物、非絲狀生物、單倍體、二倍體、營養缺陷型及/或非營養缺陷型生物。在某些實施例中，工程化微生物為原核微生物(例如細菌)，且在某些實施例中，工程化微生物為非原核微生物。在一些實施例中，工程化微生物為真核微生物(例如，酵母、真菌、阿米巴原蟲(amoeba))。在一些實施例中，工程化微生物為真菌。在一些實施例中，工程化有機體為酵母。
任何適合的酵母可經選為宿主微生物、工程化微生物、遺傳修飾有機體或用於異源或經修飾聚核苷酸之源。酵母包括(但不限於)耶氏酵母(Yarrowia yeast)(例如解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)(先前歸類為解脂假絲酵母(Candida lipolytica))、假絲酵母(Candida yeast)(例如拉考夫假絲酵母(C.revkaufi)、維斯假絲酵母(C.viswanathii)、鐵紅假絲酵母(C.pulcherrima)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、高蛋白假絲酵母(C.utilis))、紅酵母(Rhodotorula yeast)(例如黏紅酵母(R.glutinus)、牧草紅酵母(R.graminis))、紅冬孢酵母(Rhodosporidium yeast)(例如圓紅冬孢酵母(R.toruloides))、酵母屬酵母(Saccharomyces yeast)(例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)、貝酵母(S.bayanus)、巴斯德酵母(S.pastorianus)、卡爾斯伯酵母(S.carlsbergensis))、隱球酵母(Cryptococcus yeast)、毛芽胞酵母(Trichosporon yeast)(例如茁牙毛芽胞酵母(T.pullans)、皮狀毛芽胞酵母(T.cutaneum))、畢赤酵母(Pichia yeast)(例如，巴斯德畢赤酵母(P.pastoris))及油脂酵母(Lipomyces yeast)(例如，斯達油脂酵母(L.starkeyii)、產油油脂酵母(L.lipoferus))。在一些實施例中，適合的酵母為蛛網黴屬(Arachniotus)、麴菌屬(Aspergillus)、短梗黴屬(Aureobasidium)、奧氏菌屬(Auxarthron)、芽生菌屬(Blastomyces)、假絲酵母屬、金孢子菌屬(Chrysosporuim)、德巴利酵母金孢子菌屬(Chrysosporuim Debaryomyces)、球孢子菌(Coccidiodes)、隱球酵母屬、裸囊菌屬(Gymnoascus)、漢森酵母屬(Hansenula)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、伊薩酵母屬(Issatchenkta)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、油脂酵母屬、伊薩酵母屬(Lssatchenkia)、小芽孢菌屬(Microsporum)、地衣內生菌屬(Myxotrichum)、密氏菌屬(Myxozyma)、樹粉孢屬(Oidiodendron)、管囊酵母屬(Pachysolen)、青黴菌屬(Penicillium)、畢赤酵母屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、紅酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、帚黴屬(Scopulariopsis)、瘤孢屬(Sepedonium)、毛芽胞酵母屬或耶氏酵母屬。在一些實施例中，適合的酵母為以下物種之酵母：弗氏蛛網黴菌(Arachniotus flavoluteus)、黃麴黴(Aspergillus flavus)、菸麯黴(Aspergillus fumigatus)、黑麴菌(Aspergillus niger)、出芽短梗黴菌(Aureobasidium pullulans)、薩氏奧氏菌(Auxarthron thaxteri)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白假絲酵母(Candida albicans)、都柏林假絲酵母(Candida dubliniensis)、無名假絲酵母(Candida famata)、光滑假絲酵母(Candida glabrata)、高里假絲酵母(Candida guilliermondii)、克菲假絲酵母(Candida kefyr)、克魯斯假絲酵母(Candida krusei)、郎比可假絲酵母(Candida lambica)、解脂假絲酵母、魯氏假絲酵母(Candida lustitaniae)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、鐵紅假絲酵母、拉考夫假絲酵母、皺褶假絲酵母 (Candida rugosa)、熱帶假絲酵母、高蛋白假絲酵母、維斯假絲酵母、西氏假絲酵母(Candida xestobii)、克拉氏金孢子菌(Chrysosporuim keratinophilum)、粗球黴菌(Coccidiodes immitis)、白色隱球酵母液化變種(Cryptococcus albidus var.diffluens)、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隱球酵母(Cryptococcus neofomans)、漢森德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、杜氏裸囊菌(Gymnoascus dugwayensis)、異常漢森酵母(Hansenula anomala)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、西方伊薩酵母(Issatchenkia occidentalis)、東方伊薩酵母(Isstachenkia orientalis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、耐熱克魯維酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、瓦爾提克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)、產油油脂酵母、斯達油脂酵母、石膏狀小芽孢菌(Microsporum gypseum)、反折地衣內生菌(Myxotrichum deflexum)、刺樹粉孢菌(Oidiodendron echinulatum)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilis)、點青黴(Penicillium notatum)、異常畢赤酵母(Pichia anomala)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、樹幹畢赤酵母(Pichia stipitis)、圓紅冬孢酵母、黏紅酵母、牧草紅酵母、釀酒酵母、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、枝頂孢帚黴菌(Scopulariopsis acremonium)、黃瘤孢菌(Sepedonium chrysospermum)、皮狀毛芽胞酵母、茁牙毛芽胞酵母、解脂耶氏酵母或解脂耶氏酵母(先前歸類為解脂假絲酵母)。在一些實施例中，酵母為解脂耶氏酵母菌株，其包括(但不限於)ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944、ATCC20228、ATCC76982及LGAM S(7)1菌株(Papanikolaou S.及Aggelis G.,Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。在某些實施例中，酵母為假絲酵母物種(亦即假絲酵母屬)酵母。任何適合的假絲酵母物種可用於及/ 或經遺傳修飾以用於產生脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)。在一些實施例中，適合的假絲酵母物種包括(但不限於)白假絲酵母、都柏林假絲酵母、無名假絲酵母、光滑假絲酵母、高里假絲酵母、克菲假絲酵母、克魯斯假絲酵母、郎比可假絲酵母、解脂假絲酵母、魯氏假絲酵母、近平滑假絲酵母、鐵紅假絲酵母、拉考夫假絲酵母、皺褶假絲酵母、熱帶假絲酵母、高蛋白假絲酵母、維斯假絲酵母、西氏假絲酵母及任何其他本文所描述之假絲酵母屬酵母。假絲酵母屬菌株之非限制性實例包括(但不限於)sAA001(ATCC20336)、sAA002(ATCC20913)、sAA003(ATCC20962)、sAA496(US2012/0077252)、sAA106(US2012/0077252)、SU-2(ura3-/ura3-)、H5343(β氧化阻斷；美國專利第5648247號)菌株。來自假絲酵母屬酵母之任何適合的菌株均可用作用於遺傳修飾之親本菌株。
酵母屬、物種及菌株常常在遺傳內容上緊密相關以使得其可能難以區分、分類及/或命名。在一些情況下，菌株解脂假絲酵母與解脂耶氏酵母可能難以區分、分類及/或命名，且其可能在一些情況下被視為相同有機體。在一些情況下，各種熱帶假絲酵母及維斯假絲酵母之菌株可能難以區分、分類及/或命名(例如參見Arie等人，J.Gen.Appl.Microbiol.,46,257-262(2000)。某些自ATCC以及自其他商業或學術來源獲得之熱帶假絲酵母及維斯假絲酵母菌株可被視為等效的且同樣適用於本文所描述之實施例。在一些實施例中，熱帶假絲酵母及維斯假絲酵母之某些親本菌株被視為僅在名稱上不同。
任何適合的真菌可經選為宿主微生物、工程化微生物或異源聚核苷酸之源。真菌之非限制性實例包括(但不限於)麴菌屬真菌(例如寄生麴菌(A.parasiticus)、小巢狀麴菌(A.nidulans))、破囊壺菌屬(Thraustochytrium)真菌、裂殖壺菌(Schizochytrium)真菌及根黴菌屬 (Rhizopus)真菌(例如鬚根黴菌(R.arrhizus)、米根黴菌(R.oryzae)、黑根黴菌(R.nigricans))。在一些實施例中，真菌為寄生麴菌菌株，其包括(但不限於)菌株ATCC24690，且在某些實施例中，真菌為小巢狀麴菌菌株，其包括(但不限於)菌株ATCC38163。
任何適合的原核生物可經選為宿主微生物、工程化微生物或異源聚核苷酸之源。可選擇革蘭氏陰性細菌(Gram negative bacteria)或革蘭氏陽性細菌(Gram positive bacteria)。細菌之實例包括(但不限於)芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌(例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium))、不動桿菌屬(Acinetobacter)細菌、奴卡菌屬(Norcardia)細菌、黃色桿菌屬(Xanthobacter)細菌、艾氏菌屬(Escherichia)細菌(例如，大腸桿菌(例如菌株DH10B、Stbl2、DH5-α、DB3、DB3.1)、DB4、DB5、JDP682及ccdA-over(例如，美國申請案第09/518,188號)))、鏈黴菌屬(Streptomyces)細菌、伊文氏桿菌屬(Erwinia)細菌、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)細菌、沙雷菌屬(Serratia)細菌(例如黏質沙雷菌屬(S.marcessans))、假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌(例如，銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、沙門氏菌屬(Salmonella)細菌(例如，鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、傷寒沙門氏菌(S.typhi)、巨型球菌屬(Megasphaera)細菌(例如埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii))。細菌亦包括(但不限於)光合細菌(例如，綠色非硫細菌(例如綠彎菌屬(Choroflexus)細菌(例如橙色綠彎菌(C.aurantiacus))、直立原絲體(Chloronema)細菌(例如吉氏直立原絲體(C.gigateum)))、綠色硫細菌(例如綠色硫黃細菌屬(Chlorobium)細菌(例如，泥生綠色硫黃細菌(C.limicola)、暗網菌屬(Pelodictyon)細菌(例如微黃暗網菌(P.luteolum))、紫色硫細菌(例如，紅色硫黃細菌屬(Chromatium)細菌(例如硫黃菌(C.okenii)))及紫色非硫細菌(例如，紅螺菌屬(Rhodospirillum)細菌(例如深紅紅螺菌(R.rubrum))、紅細菌屬 (Rhodobacter)細菌(例如，類球紅細菌(R.sphaeroides)、莢膜紅細菌(R.capsulatus))及紅微菌屬(Rhodomicrobium)細菌(例如瓦氏紅微菌(R.vanellii))。
來自非微生物有機體之細胞可用作宿主微生物、工程化微生物或異源聚核苷酸之源。該等細胞之實例包括(但不限於)昆蟲細胞(例如果蠅屬(Drosophila)(例如黑腹果蠅(D.melanogaster))、夜蛾屬(Spodoptera)(例如草地夜蛾(S.frugiperda)Sf9或Sf21細胞)及粉夜蛾(Trichoplusa)(例如High-Five細胞)、線蟲細胞(例如秀麗隱桿線蟲(C.elegans)細胞)；禽類細胞；兩棲動物細胞(例如，有爪蟾蜍(Xenopus laevis)細胞)；爬行動物細胞；哺乳動物細胞(例如，NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、布茲(Bowes)黑素瘤及海拉(HeLa)細胞)；及植物細胞(例如擬南芥，菸草(Nicotania tabacum)、腺泡葉萼距花(Cuphea acinifolia)、等大花瓣萼距花(Cuphea aequipetala)、狹葉萼距花(Cuphea angustifolia)、附蓋萼距花(Cuphea appendiculata)、阿維吉拉萼距花(Cuphea avigera)、阿維吉拉萼距花鐵紅變種(Cuphea avigera var.pulcherrima)、腋花萼距花(Cuphea axilliflora)、巴希萼距花(Cuphea bahiensis)、貝羅尼萼距花(Cuphea baillonis)、短柄萼距花(Cuphea brachypoda)、巴氏萼距花(Cuphea bustamanta)、囊距萼距花(Cuphea calcarata)、美葉萼距花(Cuphea calophylla)、美葉萼距花亞種美索萼距花(Cuphea calophylla subsp.mesostemon)、香膏萼距花(Cuphea carthagenensis)、露珠萼距花(Cuphea circaeoides)、密花萼距花(Cuphea confertiflora)、柯達他萼距花(Cuphea cordata)、厚瓣萼距花(Cuphea crassiflora)、藍萼距花(Cuphea cyanea)、十蕊萼距花(Cuphea decandra)、齒狀萼距花(Cuphea denticulata)、二籽萼距花(Cuphea disperma)、艾氏萼距花(Cuphea epilobiifolia)、長枝萼距花(Cuphea ericoides)、黃萼距花 (Cuphea flava)、弗氏萼距花(Cuphea flavisetula)、紫斑葉萼距花(Cuphea fuchsiifolia)、高姆瑞萼距花(Cuphea gaumeri)、黏毛萼距花(Cuphea glutinosa)、異葉萼距花(Cuphea heterophylla)、虎克里亞納萼距花(Cuphea hookeriana)、細葉萼距花(Cuphea hyssopifolia)(墨西哥石南(Mexican-heather))、尖果萼距花(Cuphea hyssopoides)、火紅萼距花(Cuphea ignea)、臭味萼距花(Cuphea ingrata)、約魯萼距花(Cuphea jorullensis)、杉木萼距花(Cuphea lanceolata)、長葉萼距花(Cuphea linarioides)、拉維亞萼距花(Cuphea llavea)、羅氏萼距花(Cuphea lophostoma)、黃萼距花(Cuphea lutea)、金色萼距花(Cuphea lutescens)、美麗萼距花(Cuphea melanium)、梅爾維亞萼距花(Cuphea melvilla)、小花萼距花(Cuphea micrantha)、小瓣萼距花(Cuphea micropetala)、米姆羅德萼距花(Cuphea mimuloides)、光葉萼距花(Cuphea nitidula)、沼澤萼距花(Cuphea palustris)、同心結萼距花(Cuphea parsonsia)、巴斯庫洛姆萼距花(Cuphea pascuorum)、寡瓣萼距花(Cuphea paucipetala)、樸氏萼距花(Cuphea procumbens)、假蠅子草萼距花(Cuphea pseudosilene)、假越橘萼距花(Cuphea pseudovaccinium)、美花萼距花(Cuphea pulchra)、紅花萼距花(Cuphea racemosa)、匍匐萼距花(Cuphea repens)、柳葉萼距花(Cuphea salicifolia)、薩爾瓦多萼距花(Cuphea salvadorensis)、斯庫瑪妮萼距花(Cuphea schumannii)、無梗萼距花(Cuphea sessiliflora)、無柄萼距花(Cuphea sessilifolia)、刺芒萼距花(Cuphea setosa)、奇麗萼距花(Cuphea spectabilis)、闊葉萼距花(Cuphea spermacoce)、華麗萼距花(Cuphea splendida)、華麗萼距花變種綠黃萼距花(Cuphea splendida var.viridiflava)、斯氏萼距花(Cuphea strigulosa)、薩氏萼距花(Cuphea subuligera)、特氏萼距花(Cuphea teleandra)、賽姆德萼距花(Cuphea thymoides)、托卡尼卡萼距花(Cuphea tolucana)、尖葉萼距花 (Cuphea urens)、膨脹萼距花(Cuphea utriculosa)、藍葉柄萼距花(Cuphea viscosissima)、沃森萼距花(Cuphea watsoniana)、來提萼距花(Cuphea wrightii)及杉木萼距花(Cuphea lanceolata)。
用作宿主生物體或異源聚核苷酸之源的微生物或細胞商業上可獲得。本文所描述之微生物及細胞及其他適合的微生物及細胞可自例如Invitrogen Corporation(Carlsbad,CA)、美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas,Virginia)及農業研究菌種保藏中心(Agricultural Research Culture Collection)(NRRL；Peoria,Illinois)獲得。宿主微生物及工程化微生物可以任何適合的形式提供。舉例而言，該等微生物可以液體培養物或固體培養物(例如基於瓊脂的培養基)提供，其可為原始培養物或可已經(例如，稀釋及培養)一或多次。 微生物亦可以冷凍形式或乾燥形式(例如凍乾)提供。微生物可以任何適合的濃度提供。
用於細胞輸入之核酸之穩定化
已發現經由核苷酸三磷酸酯轉運子之主動轉運在經轉運非天然核苷酸三磷酸酯充分穩定(例如在培養基中穩定)時最佳。非天然核酸(例如d5SICSTP及dNaMTP)之初步表徵指示其在主動生長之大腸桿菌存在下降解(圖6B)。對於[α-32P]-dATP觀測到類似行為，且藉由薄層層析法對於[α-32P]-dATP所偵測到之去磷酸化產物或藉由HPLC及MALDI對於d5SICSTP及dNaMTP所偵測到之去磷酸化產物(圖6A)表明分解係藉由磷酸酶介導。在消耗培養基中觀測到最低程度至可忽略降解，其表明分解可能在周質內發生。在不具有特異性周質磷酸酶之大腸桿菌BW25113之單一基因缺失突變體(如藉由第二型N末端前導序列之存在鑑定)之培養物中未觀測到穩定性之改良，該等突變體包括phoA、ushA、appA、aphA、yjjX、surE、yfbR、yjjG、yfaO、mutT、nagD、yggV、yrfG或ymfB，其表明分解可能由於多種磷酸酶之活性而發生。
表現核苷酸三磷酸酯轉運子之細胞可以多種其他方式經修飾以促進核苷酸三磷酸酯輸入及/或改良核苷酸三磷酸酯之穩定性。舉例而言，細胞可藉由一或多個編碼磷酸酶或核苷酸酶之基因之缺失或破壞(例如突變)而經修飾。該等修飾可增加可藉由核苷酸三磷酸酯轉運子輸入的核苷酸三磷酸酯之穩定性。細胞可藉由一或多個編碼磷酸酶(諸如5'或3'核苷酸酶)之基因之缺失而經修飾。
核苷酸酶為水解酶，其催化核苷酸至核苷及磷酸酯之水解。舉例而言，其將腺苷單磷酸酯轉化成腺苷，且將鳥苷單磷酸酯轉化成鳥苷。經修飾或自細胞缺失的核苷酸酶可為5'-核苷酸酶(諸如EC 3.1.3.5)或3'-核苷酸酶(諸如EC 3.1.3.6)。在一些實施例中，其可能較適用於修飾或消除編碼5'-核苷酸酶之基因以改良可藉由核苷酸三磷酸酯轉運子輸入的核苷酸三磷酸酯之穩定性。
細胞亦可藉由一或多個編碼5'-核苷酸酶(酶進入：EC 3.1.3.5)之基因之缺失而經修飾，該等基因諸如表2中之一或多個基因。
細胞亦可藉由一或多個編碼3'-核苷酸酶之基因之缺失而經修飾，該等基因諸如表3中之一或多個基因。
表現核苷酸三磷酸酯轉運子之細胞可經修飾以減小或消除一或多種磷酸酶之活性。細胞亦可藉由一或多個編碼磷酸酶(諸如鹼性磷酸酶)之基因之缺失而經修飾。可經修飾以具有功能之損失的基因之其他實例包括phoA、ushA、appA、aphA、yjjX、surE、yfbR、yjjG、yfaO、mutT、nagD、yggV、yrfG、ymfB或其組合。在一些實施例 中，細胞在一個以上磷酸酶基因中具有功能損失突變。
細胞亦可藉由一或多個編碼聚核苷酸磷酸酶活性之基因之缺失而經修飾。細胞亦可藉由一或多個編碼核苷酸磷酸酶活性之作用於游離核苷酸之基因之缺失而經修飾。細胞亦可藉由一或多個編碼核苷酸三磷酸酶(NTP酶)、三磷酸腺苷雙磷酸酶、ATP-二磷酸酶、腺苷二磷酸酶、ADP酶、ATP二磷酸水解酶或其任何組合之基因之缺失而經修飾，該等基因諸如表4中之一或多個基因。
細胞亦可藉由一或多個編碼核苷二磷酸酯磷酸酶、核苷-二磷酸酶、硫胺焦磷酸酶、UDP酶、肌苷二磷酸酶、腺苷二磷酸酶、IDP酶、ADP酶、腺苷焦磷酸酶、鳥苷二磷酸酶、鳥苷5'-二磷酸酶、肌苷5'-二磷酸酶、尿苷二磷酸酶、尿苷5'-二磷酸酶、B型核苷二磷酸酶、GDP酶、CDP酶、核苷5'-二磷酸酶；L型核苷二磷酸酶、NDP酶、核苷二磷酸酯磷酸水解酶或其任何組合之基因之缺失而經修飾，該等基因諸如表5中所列之基因中之一或多者。
發現天然核酸(例如dATP)之細胞外穩定性在生長介質中之磷酸鉀(KPi)存在下顯著增加。KPi顯著抑制非天然三磷酸酯之去磷酸化(圖6)。該磷酸鉀添加可抑制磷酸酶表現或抑制磷酸酶活性(圖7)。如天然三磷酸酯，磷酸鉀之添加使d5SICSTP及dNaMTP之細胞外穩定性顯著增加超過2倍(圖6)。亦可測定隨轉運子誘發(例如用IPTG)變化之自含有50mM KPi之介質的[α-32P]-dATP吸收(圖8)。1mM IPTG誘發導致最大[α-32P]-dATP吸收(圖8A)。
可使用磷酸酶之抑制劑以增加一或多種非天然及/或天然核酸之穩定性。以此方式，可使用磷酸酶之抑制劑以促進核酸之細胞內輸入及轉運。可測定隨轉運子誘發(例如用IPTG)變化之自含有50mM KPi之介質的[α-32P]-dATP吸收(圖8)。
磷酸鉀可促進該轉運。在一些實施例中，磷酸酶抑制劑(例如KPi)在一定pH下促進核酸之細胞內輸入及轉運。在一些實施例中，磷酸酶抑制劑(例如KPi)在大致中性pH下促進核酸之細胞內輸入及轉運。該中性pH可為在約pH 4.5至pH 8.5之間，或在約pH 6.8至約pH 7.6或約pH 7.0至約pH 7.4之間。
在一些實施例中，磷酸酶抑制劑(例如KPi)在一定濃度下促進核酸之細胞內輸入及轉運。可使用多種磷酸酶抑制劑(例如KPi)濃度。 舉例而言，磷酸酶抑制劑(例如KPi)可以0.1mM至500mM、或0.2mM至250mM、或0.25mM至200mM、或1.0mM至150mM、或2.5mM至125mM、或5mM至100mM、或25mM至75mM、或40mM至60mM磷酸鉀之濃度存在。如所說明，50mM磷酸酶抑制劑(例如KPi)似乎對於細胞與非天然核苷酸三磷酸酯之初始接觸為充分的(圖7B)。可在添加磷酸鉀或不添加磷酸鉀之情況下使用磷酸酶之抑制劑。
在一些實施例中，核苷酸酶或磷酸酶之破壞或磷酸酶抑制劑(例如KPi)之添加可用於增加天然及非天然核苷酸三磷酸酯之半衰期。舉例而言，核苷酸酶或磷酸酶之破壞或磷酸酶抑制劑之添加可用於使天然核酸及/或非天然核酸之半衰期增加至少約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、3.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或高於100小時。
在一些實施例中，核苷酸酶或磷酸酶之破壞或磷酸酶抑制劑(例如KPi)之添加可用於增加天然核酸及/或非天然核酸之穩定性以使得天然或非天然核酸細胞內濃度至少為天然或非天然核酸對於聚合酶之K M值。舉例而言，核苷酸酶或磷酸酶之破壞或磷酸酶抑制劑之添加可用於增加天然及非天然核苷酸三磷酸酯之穩定性以使得其細胞內濃度為至少約天然或非天然核酸對於聚合酶之K M值的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、3.0、13.5、 14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或高於100倍。
套組
上文關於例示性反應混合物及反應方法闡述的組分之各種組合可以套組形式提供。該套組可包括彼此分離之個別組分，其例如在獨立容器或封裝中攜載。套組可包括本文中闡述的組分之一或多種子組合，該等一或多種子組合與套組之其他組分分離。該等子組合可為可組合的以產生本文中所闡述的反應混合物(或經組合以進行本文中所闡述的反應)。在特定實施例中，存在於個別容器或封裝中之組分之子組合不足以進行本文中所闡述的反應。
然而，套組整體可包括容器或封裝之集合，該等容器或封裝之內含物可經組合以進行本文中所闡述之反應。
套組可包括適合的封裝材料以容納套組之內含物。封裝材料可藉由熟知方法建構，較佳以提供無菌、無污染物環境。本文中所用之封裝材料可包括例如，在經出售以用於與核酸定序系統一起使用之商業套組中所慣用之封裝材料。例示性封裝材料包括(但不限於)玻璃、塑膠、紙、箔及其類似者，其能夠將本文中所闡述的組分固定在固定界限內。
封裝材料可包括標籤，其指示組分之特定用途。在對於存在於套組中之組分之特定組合適當的情況下，由標記所指示的套組用途可為本文中所闡述的方法中之一或多者。舉例而言，標記可指示套組適用於合成聚核苷酸之方法或適用於測定核酸之序列的方法。
封裝試劑或組分之使用說明書亦可包括於套組中。說明書將通常包括描述反應參數之有形表現，諸如待混合的套組組分及樣品之相對量、試劑/樣品摻合物之維持時間段、溫度、緩衝條件及其類似者。
應理解，並非所有對於特定反應所必需的組分均需存在於特定套組中。實際上，一或多種額外組分可由其他來源提供。與套組一起提供之說明書可鑑定待提供之額外組分及其可自何處獲得。
根據本發明之一態樣，提供適用於例如使用由本發明所提供的方法將非天然核酸穩定地併入至細胞核酸中以用於製備遺傳工程化細胞之套組。在一個實施例中，本發明之套組包括遺傳工程化細胞及一或多種非天然核酸。
在另一實施例中，本發明之套組包括引子，其結合至含有非天然核酸之核酸分子之一部分。在另一實施例中，套組包括微陣列，其含有結合至含有非天然核酸及所關注之靶基因之至少一個片段的核酸分子之一部分的引子。在一些實施例中，許多試劑可在本發明之套組中提供，其中僅一些應與特定反應或程序一起使用。舉例而言，可提供多個引子，其中僅兩者為特定施加所需要的。
在另一實施例中，本發明之套組提供細胞及核酸分子，其含有用於引入至細胞中之異源基因以由此來提供遺傳工程化細胞。舉例而言，本發明提供表達載體，其包含在此段中所描述的上文中之實施例中之任一者之核酸。在一個實施例中，前述之表現載體進一步包含可操作地連接至聚核苷酸序列之重組調節序列。
核酸試劑及工具
核酸試劑有時包含一或多個ORF。ORF可來自任何適合的源，有時來自基因組DNA、mRNA、反轉錄RNA或互補DNA(cDNA)或包含前述中之一或多者之核酸庫，且其來自任何含有所關注之核酸序列、所關注之蛋白質或所關注之活性之有機體物種。可自其獲得ORF之有機體之非限制性實例例如包括細菌、酵母、真菌、人類、昆蟲、線蟲、牛、馬、犬、貓、大鼠或小鼠。在一些實施例中，本文所描述之核酸試劑、蛋白質試劑、蛋白質片段試劑或其他試劑係經分離或純 化。
核酸試劑有時包含鄰近於ORF之核苷酸序列，其係與ORF結合經轉譯且編碼胺基酸標籤。編碼標籤之核苷酸序列定位成核酸試劑中之ORF之3'及/或5'，從而在藉由ORF所編碼之蛋白質或肽之C末端或N末端處編碼標籤。可利用任何不廢止活體外轉錄及/或轉譯之標籤且其可由技術人員適當選擇。標籤可促進所要ORF產物自培養物或醱酵培養基之分離及/或純化。
標籤例如有時特異性地結合固相或可偵測標記之分子或部分，從而能夠分離、純化及/或偵測藉由ORF編碼的蛋白質或肽。在一些實施例中，標籤包含以下要素中之一或多者：FLAG(例如DYKDDDDKG)、V5(例如GKPIPNPLLGLDST)、c-MYC(例如EQKLISEEDL)、HSV(例如QPELAPEDPED)、流感血球凝集素、HA(例如YPYDVPDYA)、VSV-G(例如YTDIEMNRLGK)、細菌麩胱甘肽-S-轉移酶、麥芽糖結合蛋白、抗生蛋白鏈菌素-或抗生物素蛋白-結合標籤(例如pcDNATM6 BioEaseTM Gateway®生物素化系統(Biotinylation System)(Invitrogen))、硫氧還蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-醣蛋白、螢光蛋白(例如綠色螢光蛋白或其許多顏色變體(例如，黃色、紅色、藍色)中之一者)、聚離胺酸或聚精胺酸序列、聚組胺酸序列(例如His6)或其他螯合金屬(例如，鈷、鋅、銅)之序列及/或結合至含砷分子之富含半胱胺酸序列。在某些實施例中，富含半胱胺酸標籤包含胺基酸序列CC-Xn-CC，其中X為任何胺基酸且n為1至3，且富含半胱胺酸序列有時為CCPGCC。在某些實施例中，標籤包含富含半胱胺酸要素及聚組胺酸要素(例如CCPGCC及His6)。
標籤常常便利地結合至結合搭配物。舉例而言，某些標籤結合至抗體(例如FLAG)且有時特異性結合至小分子。舉例而言，聚組胺酸標籤特異性螯合二價金屬，諸如鎳、銅、鋅及鈷；聚離胺酸或聚精胺 酸標籤特異性結合至鋅指；麩胱甘肽S-轉移酶標籤結合至麩胱甘肽；且富含半胱胺酸之標籤特異性結合至含砷分子。含砷分子包括LUMIOTM劑(Invitrogen,California)，諸如FlAsHTM(EDT2[4',5'-雙(1,3,2-二硫砷雜環戊烷-2-基)螢光素-(1,2-乙二硫醇)2])及ReAsH試劑(例如，美國專利第5,932,474號、第6,054,271號、第6,451,569號及第6,008,378號；美國專利公開案第US2003/0083373號；及國際公開案第WO99/21013號)。該等抗體及小分子有時經連接至固相以用於靶蛋白或靶肽之便利分離。
標籤有時包含信號序列或定位信號序列。信號序列可在靶蛋白或靶肽之N末端處併入，且有時在C末端處併入。信號序列之實例為技術人員已知，且其易於併入至核酸試劑中，且常常根據進行核酸試劑之表現的有機體而經選擇。在一些實施例中，信號序列將經轉譯蛋白質或肽定位至細胞膜。信號序列之實例包括(但不限於)核靶信號(例如，SV40病毒大T抗原之類固醇受體序列及N末端序列)；粒線體靶信號(例如，形成兩性螺旋之胺基酸序列)；過氧化體靶信號(例如，來自釀酒酵母之YFG中之C端序列)；及分泌信號(例如，來自釀酒酵母中之轉化酶、配對因子α、PHO5及SUC2之N末端序列；枯草芽孢桿菌蛋白之多個N末端序列(例如Tjalsma等人，Microbiol.Molec.Biol.Rev.64：515-547(2000))；α澱粉酶信號序列(例如，美國專利第6,288,302號)；果膠解離酶信號序列(例如，美國專利第5,846,818號)；前膠原信號序列(例如，美國專利第5,712,114號)；OmpA信號序列(例如，美國專利第5,470,719號)；lam β信號序列(例如，美國專利第5,389,529號)；短芽孢桿菌(B.brevis)信號序列(例如，美國專利第5,232,841號)；及巴斯德畢赤酵母信號序列(例如，美國專利第5,268,273號)。
標籤有時緊鄰由ORF編碼之胺基酸序列(亦即，無介入序列)，且有時標籤實質上鄰近於由ORF編碼的胺基酸序列(例如，存在介入序 列)。介入序列有時包括用於蛋白酶之識別位點，其適用於分裂來自靶蛋白或肽之標籤。在一些實施例中，介入序列例如藉由因子Xa(例如，識別位點I(E/D)GR)、凝血酶(例如，識別位點LVPRGS)、腸激酶(例如，識別位點DDDDK)、TEV蛋白酶(例如，識別位點ENLYFQG)或PreScissionTM蛋白酶(例如，識別位點LEVLFQGP)分裂。
介入序列有時在本文中被稱作「連接子序列」且其可為由技術人員所選擇之任何適合的長度。連接子序列有時長度為約1至約20個胺基酸，且有時長度為約5至約10個胺基酸。技術人員可選擇連接子長度以實質上保留靶蛋白或肽功能(例如，除非藉由連接子分離，否則標籤可減小靶蛋白或肽功能)、在蛋白酶分裂位點存在時增強標籤自靶蛋白或肽之解離(例如，當連接子存在時分裂可被增強)且增強標籤/靶蛋白產物與固相之相互作用。連接子可具有任何適合的胺基酸成分(content)，且常常包含更高比例的具有相對較短側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸及蘇胺酸)。
核酸試劑有時包括在標籤要素與插入要素或ORF之間的終止密碼子，其可適用於轉譯具有或不具有標籤之ORF。識別終止密碼子(上文所描述)之突變tRNA分子抑制轉譯終止且從而被指定為「抑制因子tRNA」。抑制因子tRNA可導致胺基酸之插入及轉譯超出終止密碼子之繼續(例如，美國專利申請案第60/587,583號；Eggertsson等人，(1988)Microbiological Review 52(3)：354-374及Engleerg-Kukla等人(1996)在Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology，第60章，第909至921頁中；Neidhardt等人編，ASM Press,Washington,DC)。已知多種抑制因子tRNA，包括(但不限於)supE、supP、supD、supF及supZ抑制因子，其抑制琥珀終止密碼子之轉譯之終止；supB、glT、supL、supN、supC及supM抑制因子，其抑制赭石終止密碼子之功能；及glyT、trpT及Su-9抑制因子，其抑制蛋白石終 止密碼子之功能。通常，抑制因子tRNA含有一或多種在tRNA之反密碼子環中的突變，其允許tRNA與一般充當終止密碼子之密碼子鹼基配對。突變tRNA經裝入其同源胺基酸殘基，且同源胺基酸殘基經插入至轉譯多肽中(當遇到終止密碼子時)。增強終止抑制因子之效率(亦即，增加終止密碼子通讀)之突變已經鑑定。此等突變包括(但不限於)在uar基因(亦稱為prfA基因)中之突變；在ups基因中之突變；在sueA、sueB及sueC基因中之突變；在rpsD(ramA)及rpsE(spcA)基因中之突變及在rplL基因中之突變。
因此，包含位於ORF與標籤之間的終止密碼子之核酸試劑在無抑制因子tRNA存在於轉譯系統中時可僅產生轉譯ORF，且在抑制因子tRNA存在於系統中時可產生轉譯ORF-標籤融合物。抑制因子tRNA可在用編碼tRNA之核酸轉染的細胞中產生(例如，含有人類tRNA-Ser抑制因子基因之不能進行複製的腺病毒可經轉染至細胞中，或含有酵母或細菌tRNA抑制因子基因之YAC可經轉染至酵母細胞中(例如))。用於合成抑制因子tRNA及用於轉譯具有或不具有標籤之ORF的載體為技術人員可獲得的(例如，Tag-On-DemandTM套組(Invitrogen Corporation,California)；Tag-On-DemandTM Suppressor Supernatant Instruction Manual,B版本，2003年6月6日；Tag-On-DemandTM Gateway® Vector Instruction Manual,B版本，2003年6月20日；及Capone等人，EMBO J.,4：213,1985)。
核酸或核酸試劑可包含某些要素，例如調節要素，其常常根據核酸之預期用途經選擇。以下要素中之任一者可包括於核酸試劑中或自排除。核酸試劑例如可包括一或多種以下核苷酸要素或所有以下核苷酸要素：一或多種啟動子要素、一或多個5'未轉譯區域(5'UTR)、一或多個可插入靶核苷酸序列之區域(「插入要素」)、一或多個靶核苷酸序列、一或多個3'未轉譯區域(3'UTR)及一或多種選擇要素。核酸試劑 可具備該等要素中之一或多者，且其他要素可在核酸經引入至所要有機體中之前插入至核酸中。在一些實施例中，所提供之核酸試劑包含啟動子、5'UTR、視情況選用之3'UTR及插入要素，靶核苷酸序列係藉由該插入要素插入(亦即選殖)至核苷酸試劑中。在某些實施例中，所提供之核酸試劑包含啟動子、插入要素及視情況選用之3'UTR，且5'UTR/靶核苷酸序列係與視情況選用之3'UTR一起插入。該等要素可以任何適用於在所選表現系統中表現(例如，在所選有機體中表現，或在不含細胞之系統中表現(例如))的次序來配置，且在一些實施例中，核酸試劑在5'至3'方向上包含以下要素：(1)啟動子要素、5'UTR及插入要素；(2)啟動子要素、5'UTR及靶核苷酸序列；(3)啟動子要素、5'UTR、插入要素及3'UTR；及(4)啟動子要素、5'UTR、靶核苷酸序列及3'UTR。
核酸試劑(例如表現卡匣及/或表現載體)可包括多種調節要素，包括啟動子、強化子、轉譯起始序列、轉錄終止序列及其他要素。「啟動子」通常為在位於關於轉錄起始位點相對固定的位置時發揮作用之DNA之序列。舉例而言，啟動子可在核苷酸三磷酸酯轉運子核酸區段上游。「啟動子」含有RNA聚合酶與轉錄因子之基本相互作用所需的核心要素，且可含有上游要素及反應要素。「強化子」通常係指在距轉錄起始位點不固定之距離處起作用的DNA之序列，且可為至轉錄單元之5'或3"。此外，強化子可在內含子內以及在編碼序列自身內。其長度通常在10與300之間，且其呈順式作用。強化子起作用以增加附近啟動子之轉錄。如啟動子，強化子亦常常含有介導轉錄之調節的反應要素。強化子常常決定表現之調節。
如上文所指出，核酸試劑亦可包含一或多個5'UTR及一或多個3'UTR。舉例而言，用於真核宿主細胞(例如，酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或成核細胞)及原核宿主細胞(例如，病毒、細菌)之表 現載體可含有發信以用於終止轉錄(其可影響mRNA表現)的序列。此等區域可經轉錄為編碼mRNA之組織因子蛋白之未轉譯部分中之聚腺苷酸化區段。3"未轉譯區域亦包括轉錄終止位點。在一些較佳實施例中，轉錄單元包含聚腺苷酸化區域。此區域之一個益處為其增加經轉錄單元將如mRNA一般經處理及轉運之可能性。已明確聚腺苷酸化信號於表現構築體中之鑑定及使用。在一些較佳實施例中，同源聚腺苷酸化信號可用於轉基因(transgene)構築體。
5'UTR可包含一或多種對於其所起源之核苷酸序列為內源的要素，且有時包括一或多種外源性要素。5'UTR可起源於例如來自任何適合的有機體(例如，病毒、細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物)之任何適合的核酸，諸如基因組DNA、質體DNA、RNA或mRNA。技術人員可基於所選表現系統(例如，在所選有機體中表現，或在不含細胞之系統中表現(例如))來選擇用於5'UTR之適當的要素。5'UTR有時包含技術人員已知的以下要素中之一或多者：強化子序列(例如，轉錄或轉譯的)、轉錄起始位點、轉錄因子結合位點、轉譯調節位點、轉譯起始位點、轉譯因子結合位點、附屬蛋白結合位點、反饋調節劑結合位點、Pribnow盒、TATA盒、-35要素、E-盒(螺旋-環-螺旋結合要素)、核糖體結合位點、複製子、內部核糖體進入位點(IRES)、靜止子要素及其類似者。在一些實施例中，啟動子要素可經分離以使得所有對於適當條件性調節所必需的5'UTR要素均包含於啟動子要素片段中或包含於啟動子要素片段之功能子序列內。
核酸試劑中之5'UTR可包含轉譯強化子核苷酸序列。轉譯強化子核苷酸序列常常位於核酸試劑中之啟動子與靶核苷酸序列之間。轉譯強化子序列常常結合至核糖體，有時為18S rRNA結合核糖核苷酸序列(亦即，40S核糖體結合序列)且有時為內部核糖體進入序列(IRES)。IRES通常經由多種特異性分子間相互作用與精確置放之與40S核糖體 子單元接觸的RNA三級結構形成RNA骨架。核糖體強化子序列之實例為已知的且可由技術人員鑑定(例如，Mignone等人，Nucleic Acids Research 33：D141-D146(2005)；Paulous等人，Nucleic Acids Research 31：722-733(2003)；Akbergenov等人，Nucleic Acids Research 32：239-247(2004)；Mignone等人，Genome Biology 3(3)：reviews0004.1-0001.10(2002)；Gallie,Nucleic Acids Research 30：3401-3411(2002)；Shaloiko等人，DOI：10.1002/bit.20267；及Gallie等人，Nucleic Acids Research 15：3257-3273(1987))。
轉譯強化子序列有時為真核序列，諸如克紮克(Kozak)共同序列或其他序列(例如，水螅(hydroid polyp)序列，基因庫(GenBank)寄存編號U07128)。轉譯強化子序列有時為原核序列，諸如夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)共同序列。在某些實施例中，轉譯強化子序列為病毒核苷酸序列。轉譯強化子序列有時來自植物病毒之5'UTR，該植物病毒例如菸草嵌紋病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)、苜蓿嵌紋病毒(Alfalfa Mosaic Virus，AMV)、菸草蝕刻病毒(Tobacco Etch Virus，ETV)、馬鈴薯病毒Y(Potato Virus Y，PVY)、蕪菁嵌紋(poty)病毒(Turnip Mosaic Virus)及豌豆種子媒介嵌紋病毒(Pea Seed Borne Mosaic Virus)。在某些實施例中，來自TMV之長度約為67個鹼基的ω序列係以轉譯強化子序列(例如，不含鳥苷核苷酸且包括長度為25個核苷酸之聚(CAA)中心區域)之形式包括於核酸試劑中。
3'UTR可包含一或多種對於其所起源之核苷酸序列為內源的要素，且有時包括一或多種外源性要素。3'UTR可起源於例如來自任何適合的有機體(例如，病毒、細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物)之任何適合的核酸，諸如基因組DNA、質體DNA、RNA或mRNA。技術人員可基於所選表現系統(例如，在所選有機體中表現(例如))來選擇用於3'UTR之適當的要素。3'UTR有時包含技術人員已 知的以下要素中之一或多者：轉錄調節位點、轉錄起始位點、轉錄終止位點、轉錄因子結合位點、轉譯調節位點、轉譯終止位點、轉譯起始位點、轉譯因子結合位點、核糖體結合位點、複製子、強化子要素、靜止子要素及聚腺苷尾部。3'UTR常常包括聚腺苷尾部且有時不包括聚腺苷尾部，且若聚腺苷尾部存在，則一或多個腺苷部分可經添加或自其缺失(例如，約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50個腺苷部分可經添加或減去)。
在一些實施例中，5'UTR及/或3'UTR之修飾可用於改變(例如，增加、添加、降低或實質上消除)啟動子之活性。啟動子活性之變化可繼而改變肽、多肽或蛋白之活性(例如酶活性(例如))，其係藉由由包含經修飾5'或3'UTR之可操作連接的啟動子要素改變所關注之核苷酸序列之轉錄來達成。舉例而言，在某些實施例中，微生物可藉由遺傳修飾經工程化以表現包含經修飾5'或3'UTR之核酸試劑，該核酸試劑可添加新穎活性(例如，通常不在宿主生物體中發現之活性)或藉由增加自可操作地連接於所關注的核苷酸序列(例如，所關注之同源或異源核苷酸序列)之同源或異源啟動子之轉錄來增加現存活性之表現。 在一些實施例中，微生物可藉由遺傳修飾經工程化以表現包含經修飾5'或3'UTR之核酸試劑，該核酸試劑可藉由減小或實質上消除自可操作地連接於所關注的核苷酸序列之同源或異源啟動子之轉錄來降低活性之表現(在某些實施例中)。
來自表現卡匣或表現載體之核苷酸三磷酸酯轉運子之表現可由任何能夠在原核細胞或真核細胞中表現之啟動子控制。啟動子要素通常為DNA合成及/或RNA合成所需。啟動子要素常常包含DNA之可促進特定基因之轉錄的區域，該促進係藉由提供用於對應於基因之RNA之合成的起始位點。在一些實施例中，啟動子通常定位於靠近其所調節的基因處、定位於基因上游(例如，基因之5')，且在與基因之有義股 相同的DNA股上。在一些實施例中，啟動子要素可自基因或有機體分離，且經插入成與聚核苷酸序列功能性連接以允許經改變及/或調節之表現。用於核酸之表現的非原生啟動子(例如，通常不與給定核酸序列相關之啟動子)常常稱為異源啟動子。在某些實施例中，異源啟動子及/或5'UTR可經插入成與聚核苷酸功能性連接，該聚核苷酸編碼具有如本文所描述的所要活性之多肽。如本文中關於啟動子所用之術語「可操作地連接」及「與......功能性連接」係指在編碼序列與啟動子要素之間的關係。當來自編碼序列之經由轉錄之表現係藉由啟動子要素調節或控制時，啟動子與編碼序列可操作地連接或功能性連接。 術語「可操作地連接」及「與......功能性連接」在本文中關於啟動子要素可互換地經利用。
啟動子常常與RNA聚合酶相互作用。聚合酶為催化藉由使用先前存在之核酸試劑的核酸合成的酶。當模板為DNA模板時，RNA分子在蛋白質合成之前經轉錄。具有適合用於本發明方法之聚合酶活性之酶包括任何在具有所選模板之所選系統中呈活性以合成蛋白質的聚合酶。在一些實施例中，在本文中亦稱為啟動子要素之啟動子(例如異源啟動子)可經可操作地連接於核苷酸序列或開放閱讀框架(ORF)。自啟動子要素之轉錄可催化對應於可操作地連接於啟動子之核苷酸序列或ORF序列的RNA之合成，其繼而導致所要肽、多肽或蛋白質之合成。
啟動子要素有時展現對於調節控制之反應。啟動子要素亦有時可藉由選擇性劑調節。亦即，自啟動子要素之轉錄有時可響應於環境、營養或內部條件或信號(例如，熱誘導性啟動子、光調節啟動子、反饋調節啟動子、激素影響啟動子、組織特異性啟動子、氧及pH影響啟動子、響應於選擇性劑(例如康黴素(kanamycin))之啟動子及其類似者(例如))之變化而經啟動、關閉、上調或下調。頻繁地受環境、營養 或內部信號影響之啟動子受到在啟動子處或靠近啟動子處結合之信號(直接或間接)影響，該信號在某些條件下增加或降低靶序列之表現。
用於本文所描述之實施例的可影響自啟動子要素之轉錄的選擇性或調節劑之非限制性實例包括(但不限於)：(1)編碼產物之核酸區段，該等產物提供針對以其他方式呈毒性之化合物之耐受性(例如抗生素)；(2)編碼產物之核酸區段，該等產物以其它方式在受體細胞中為缺乏的(例如，必需產物、tRNA基因、營養缺陷型標記)；(3)編碼抑制基因產物之活性的產物之核酸區段；(4)編碼產物之核酸區段，該等產物可容易地經鑑定(例如，表現型標記，諸如抗生素(例如，β-內醯胺酶)、β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、強化型藍螢光蛋白(CFP)及細胞表面蛋白質)；(5)結合產物之核酸區段，該等產物以其他方式對細胞存活率及/或功能有害；(6)以其他方式抑制在上文第1到5號中描述的核酸區段中之任一者之活性的核酸區段(例如，反義寡核苷酸)；(7)結合修飾受質的產物之核酸區段(例如，限制性核酸內切酶)；(8)可用於分離或鑑定所要分子之核酸區段(例如，特異性蛋白質結合位點)；(9)編碼可以其他方式為非功能性的特異性核苷酸序列之核酸區段(例如，用於分子之亞群之PCR擴增)；(10)當不存在時直接或間接向特定化合物賦予耐受性或敏感性之核酸區段；(11)編碼產物之核酸區段，該等產物為毒性的或在受體細胞中將相對無毒化合物轉化成毒性化合物(例如，單純疱疹(Herpes simplex)胸苷激酶、胞嘧啶脫胺酶)；(12)抑制含有其的核酸分子之複製、分配或遺傳可能性的核酸區段；及/或(13)編碼條件性複製功能之核酸區段，該等複製功能例如在某些宿主或宿主細胞菌株中或在某些環境條件(例如，溫度、營養條件及其類似者)下之複製。在一些實施例中，可添加調節或選擇性劑以改變有機體所經受之現存生長條件(例如，在液體培養物中之生長、在醱酵槽中之生 長、在固體養分培養盤上之生長及其類似者(例如))。
在一些實施例中，啟動子要素之調節可用於改變(例如，增加、添加、降低或實質上消除)肽、多肽或蛋白質之活性(例如酶活性(例如))。舉例而言，在某些實施例中，微生物可藉由遺傳修飾經工程化以表現核酸試劑，該核酸試劑可添加新穎活性(例如，通常不在宿主生物體中發現之活性)或藉由增加自可操作地連接於所關注的核苷酸序列(例如，所關注之同源或異源核苷酸序列)之同源或異源啟動子之轉錄來增加現存活性之表現。在一些實施例中，微生物可藉由遺傳修飾經工程化以表現核酸試劑，該核酸試劑可藉由減小或實質上消除自可操作地連接於所關注的核苷酸序列之同源或異源啟動子之轉錄來降低活性之表現(在某些實施例中)。
編碼異源蛋白質(例如核苷酸三磷酸酯轉運子)之核酸可插入至任何適合的表現系統中或與其一起使用。在一些實施例中，核酸試劑有時經穩定地整合至宿主生物體之染色體中，或核酸試劑可缺失宿主染色體之一部分(在某些實施例中)(例如，遺傳修飾有機體，其中宿主基因組之變化賦予選擇性地或較佳地維持攜載遺傳修飾之所要有機體的能力)。可選擇該等核酸試劑(例如，其變化的基因組向有機體賦予可選性狀之核酸或遺傳修飾有機體)導引所要蛋白質或核酸分子之產生的能力。當需要時，可改變核酸試劑以使得密碼子編碼(i)相同胺基酸，其係使用不同於在原生序列中所規定的tRNA之tRNA，或(ii)不同於正常胺基酸之胺基酸，包括非習知或非天然胺基酸(包括經可偵測標記之胺基酸)。
藉由使用可為載體(諸如質體)之一部分的表現卡匣有效地實現重組表現。載體可包括啟動子，其可操作地連接於編碼核苷酸三磷酸酯轉運子之核酸。載體亦可包括其他如本文所描述之轉錄及轉譯所需的要素。表現卡匣、表現載體及卡匣或載體中之序列可對於非天然核苷 酸所接觸的細胞為異源的。舉例而言，核苷酸三磷酸酯轉運子序列可對於細胞為異源的。
可產生多種適用於攜載、編碼及/或表現核苷酸三磷酸酯轉運子之原核及真核表現載體。該等表現載體包括例如pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC及酵母載體。該等載體可用於例如多種活體內及活體外情形。可用之原核啟動子之非限制性實例包括SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lac或麥芽糖啟動子。可用之真核啟動子之非限制性實例包括組成性啟動子，例如病毒啟動子，諸如CMV、SV40及RSV啟動子，以及可調節啟動子，例如誘導性或可抑制啟動子，諸如tet啟動子、hsp70啟動子及藉由CRE調節之合成啟動子。用於細菌表現之載體包括pGEX-5X-3，且用於真核表現之載體包括pCIneo-CMV。可用之病毒載體包括與慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、小兒麻痹病毒、AIDS病毒、神經元營養病毒、辛德比及其他病毒相關之病毒載體。亦適用的為與此等病毒共有使其適用作載體之特性的任何病毒家族。可用之反轉錄病毒載體包括在Verma,American Society for Microbiology，第229至232頁，Washington,(1985)中描述之反轉錄病毒載體。舉例而言，該等反轉錄病毒載體可包括鼠類馬洛尼白血病病毒(Murine Maloney Leukemia virus)MMLV及其他表現所要特性之反轉錄病毒。病毒載體通常含有非結構早期基因、結構晚期基因、RNA聚合酶III轉錄物、複製及殼體化所必需之反轉末端重複序列及用以控制病毒基因組之轉錄及複製的啟動子。當工程化為載體時，病毒通常經移除早期基因中之一或多者，且基因或基因/啟動子卡匣經插入至病毒基因組中替代經移除之病毒核酸。
選殖
此項技術中已知的任何便利的選殖策略均可用以將要素(諸如 ORF)併入至核酸試劑中。已知方法可用以獨立於插入要素將要素插入至模板中，諸如(1)在一或多個現存限制酶位點處分裂模板且接合所關注之要素，及(2)藉由使包括一或多個適合的限制酶位點之寡核苷酸引子雜交及藉由聚合酶鏈反應以擴增來將限制酶位點添加至模板(本文中更詳述地描述)。其他選殖策略利用一或多個存在的或經插入至核酸試劑中的插入位點，諸如用於PCR之寡核苷酸引子雜交位點(例如)及本文所描述之其他位點。在一些實施例中，選殖策略可與基因操作組合，該基因操作諸如重組(例如，將具有所關注之核酸序列之核酸試劑重組至待修飾的有機體之基因組中，如本文中進一步描述)。在一些實施例中，經選殖ORF可藉由用一或多個所關注之ORF以工程化微生物來產生(直接或間接)經修飾或野生型核苷酸三磷酸酯轉運子及/或聚合酶，該微生物包含核苷酸三磷酸酯轉運子活性或聚合酶活性之變化的活性。
可藉由使核酸與一或多種特異性分裂劑接觸來使核酸特異性地分裂。特異性分裂劑常常將根據在特定位點處之特定核苷酸序列特異性地分裂。酶特異性分裂劑之實例包括(但不限於)核酸內切酶(例如，去氧核糖核酸酶(例如，去氧核糖核酸酶I、去氧核糖核酸酶II)；核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶E、核糖核酸酶F、核糖核酸酶H、核糖核酸酶P)；CleavaseTM酶；Taq DNA聚合酶；大腸桿菌DNA聚合酶I及真核結構特異性核酸內切酶；鼠類FEN-1核酸內切酶；I型、II型或III型限制性核酸內切酶，諸如Acc I、Afl III、Alu I、Alw44 I、Apa I、Asn I、Ava I、Ava II、BamH I、Ban II、Bcl I、Bgl I、Bgl II、Bln I、Bsm I、BssH II、BstE II、Cfo I、CIa I、Dde I、Dpn I、Dra I、EcIX I、EcoR I、EcoR I、EcoR II、EcoR V、Hae II、Hae II、Hind II、Hind III、Hpa I、Hpa II、Kpn I、Ksp I、Mlu I、MIuN I、Msp I、Nci I、Nco I、Nde I、Nde II、Nhe I、Not I、Nru I、Nsi I、Pst I、Pvu I、Pvu II、Rsa I、Sac I、Sal I、Sau3A I、Sca I、ScrF I、Sfi I、Sma I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Sty I、Swa I、Taq I、Xba I、Xho I)；醣苷酶(例如，尿嘧啶-DNA醣苷酶(UDG)、3-甲基腺嘌呤DNA醣苷酶、3-甲基腺嘌呤DNA醣苷酶II、嘧啶水合-DNA醣苷酶、FaPy-DNA醣苷酶、胸腺嘧啶錯配-DNA醣苷酶、次黃嘌呤-DNA醣苷酶、5-羥甲基尿嘧啶DNA醣苷酶(HmUDG)、5-羥甲基胞嘧啶DNA醣苷酶或1,N6-乙烯橋-腺嘌呤DNA醣苷酶)；外切核酸酶(例如，外切核酸酶III)；核糖核酸酶及DNA酶。樣品核酸可用化學劑處理，或使用經修飾核苷酸合成，且經修飾核酸可經分裂。在非限制性實例中，樣品核酸可用以下各者處理：(i)烷基化劑，諸如甲亞硝脲，其產生若干烷基化鹼基，包括N3-甲基腺嘌呤及N3-甲基鳥嘌呤，其藉由烷基嘌呤DNA-醣苷酶識別及分裂；(ii)亞硫酸氫鈉，其導致DNA中之胞嘧啶殘基之去胺基化以形成可藉由尿嘧啶N-醣苷酶分裂之尿嘧啶殘基；及(iii)將鳥嘌呤轉化成其氧化形式8-羥基鳥嘌呤之化學劑，該8-羥基鳥嘌呤可藉由甲醯嘧啶DNA N-醣苷酶分裂。化學分裂方法之實例包括(但不限於)烷基化(例如，硫代磷酸酯-修飾核酸之烷基化)；含P3'-N5'-磷醯胺酸之核酸之酸不穩定性之分裂；及核酸之四氧化鋨及哌啶處理。
在一些實施例中，核酸試劑包括一或多個重組酶插入位點。重組酶插入位點為在核酸分子上之識別序列，該核酸分子參與藉由重組蛋白之整合/重組反應。舉例而言，用於Cre重組酶之重組位點為loxP，其為34鹼基對序列，其包含側接8鹼基對核心序列之兩個13鹼基對反轉重複序列(其充當重組酶結合位點)(例如，Sauer,Curr.Opin.Biotech.5：521-527(1994))。重組位點之其他實例包括attB、attP、attL及attR序列及其突變體、片段、變體及衍生物，其係藉由重組蛋白λ Int且藉由輔助蛋白質整合宿主因子(IHF)、FIS及切除酶(Xis)識別 (例如，美國專利第5,888,732號、第6,143,557號、第6,171,861號、第6,270,969號、第6,277,608號及第6,720,140號；美國專利申請案第09/517,466號及第09/732,914號；美國專利公開案第US2002/0007051號；及Landy,Curr.Opin.Biotech.3：699-707(1993))。
選殖核酸之重組酶之實例在Gateway®系統(Invitrogen,California)中，其包括至少一個用於活體內或活體外選殖所要核酸分子之重組位點。在一些實施例中，系統利用含有至少兩個不同的位點特異性重組位點之載體，該等重組位點常常係基於噬菌體λ系統(例如，att1及att2)，且為自野生型(att0)位點突變的。各突變位點具有對於相同類型之其同源搭配物att位點(亦即，其結合搭配物重組位點)之獨特的特異性(例如，attB1與attP1，或attL1與attR1)，且不會與另一突變類型之重組位點或與野生型att0位點交叉反應。不同的位點特異性允許所要分子之定向選殖或鍵聯，因此提供所選殖分子之所要定向。藉由重組位點側接之核酸片段係使用Gateway®系統藉由替代可選標記(例如ccdB)而經選殖及次選殖，該可選標記係藉由受體質體分子(有時稱為目標載體(Destination Vector))上之att位點側接。所要純系(clone)隨後藉由ccdB敏感宿主菌株之轉化及受體分子上之標記之正選擇而經選擇。用於負選擇之類似策略(例如，使用毒性基因)可用於其他有機體，諸如哺乳動物及昆蟲中之胸苷激酶(TK)。
核酸試劑有時含有一或多種複製起點(ORI)要素。在一些實施例中，模板包含兩種或兩種以上ORI，其中一種在一種有機體(例如細菌)中有效地起作用，且另一種在另一有機體(例如，真核生物，如酵母(例如))中有效地起作用。在一些實施例中，ORI可在一個物種(例如釀酒酵母(例如))中有效地起作用，且另一ORI可在不同物種(例如，粟酒裂殖酵母(例如))中有效地起作用。核酸試劑亦有時包括一或多個轉錄調節位點。
核酸試劑(例如表現卡匣或載體)可包括編碼標記產物之核酸序列。標記產物係用於判定基因是否已經遞送至細胞且在遞送後是否經表現。實例標記基因包括大腸桿菌lacZ基因，其編碼β-半乳糖苷酶及綠色螢光蛋白。在一些實施例中，標記可為可選標記。當該等可選標記經成功地轉移至宿主細胞中時，經轉化宿主細胞可在置放於選擇性壓力下之情況下存活。存在兩種廣泛使用之不同種類的選擇性方案。第一類係基於細胞之代謝及使用缺乏獨立於補充培養基生長之能力的突變細胞株。第二類為顯性選擇，其係指用於任何細胞類型之選擇方案，且其不需要使用突變細胞株。此等方案通常使用藥物以使宿主細胞停止生長。具有新穎基因之彼等細胞將表現蛋白質轉運抗藥性且將在選擇中存活。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素(neomycin)(Southern等人，J.Molec.Appl.Genet.1：327(1982))、黴酚酸(mycophenolic acid)(Mulligan等人，Science 209：1422(1980))或潮黴素(Sugden等人，Mol.Cell.Biol.5：410-413(1985))。
核酸試劑可包括一或多種選擇要素(例如，用於核酸試劑之存在之選擇，且不用於可經選擇性調節之啟動子要素之活化的要素)。常常使用已知方法利用選擇要素以判定細胞中是否包括核酸試劑。在一些實施例中，核酸試劑包括兩種或兩種以上選擇要素，其中一種在一種有機體中有效地起作用，且另一種在另一有機體中有效地起作用。選擇要素之實例包括(但不限於)：(1)編碼產物之核酸區段，該等產物提供針對以其他方式呈毒性之化合物之耐受性(例如抗生素)；(2)編碼產物之核酸區段，該等產物以其它方式在受體細胞中為缺乏的(例如，必需產物、tRNA基因、營養缺陷型標記)；(3)編碼抑制基因產物之活性的產物之核酸區段；(4)編碼產物之核酸區段，該等產物可容易地經鑑定(例如，表現型標記，諸如抗生素(例如，β-內醯胺酶)、β-半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋 白(RFP)、強化型藍螢光蛋白(CFP)及細胞表面蛋白質)；(5)結合產物之核酸區段，該等產物以其他方式對細胞存活率及/或功能有害；(6)以其他方式抑制在上文第1到5號中描述的核酸區段中之任一者之活性的核酸區段(例如，反義寡核苷酸)；(7)結合修飾受質的產物之核酸區段(例如，限制性核酸內切酶)；(8)可用於分離或鑑定所要分子之核酸區段(例如，特異性蛋白質結合位點)；(9)編碼可以其他方式為非功能性的特異性核苷酸序列之核酸區段(例如，用於分子之亞群之PCR擴增)；(10)當不存在時直接或間接向特定化合物賦予耐受性或敏感性之核酸區段；(11)編碼產物之核酸區段，該等產物為毒性的或在受體細胞中將相對無毒化合物轉化成毒性化合物(例如，單純疱疹胸苷激酶、胞嘧啶脫胺酶)；(12)抑制含有其的核酸分子之複製、分配或遺傳可能性的核酸區段；及/或(13)編碼條件性複製功能之核酸區段，該等複製功能例如在某些宿主或宿主細胞菌株中或在某些環境條件(例如，溫度、營養條件及其類似者)下之複製。
核酸試劑可呈任何適用於活體內轉錄及/或轉譯之形式。核酸有時為質體(諸如超螺旋質體)，有時為酵母人工染色體(例如YAC)、有時為線性核酸(例如，由PCR或由限制性消化產生之線性核酸)，有時為單股且有時為雙股。核酸試劑有時係藉由擴增方法製備，諸如聚合酶鏈反應(PCR)方法或轉錄介導之擴增方法(TMA)。在TMA中，兩種酶用於等溫反應以產生藉由光發射所偵測到之擴增產物(例如，Biochemistry 1996年6月25日；35(25)：8429-38)。標準PCR方法為已知的(例如，美國專利第4,683,202號、第4,683,195號、第4,965,188號及第5,656,493號)，且通常循環進行。各循環均包括熱變性，其中雜交核酸解離；冷卻，其中引子寡核苷酸雜交；及藉由聚合酶(亦即Taq聚合酶)之寡核苷酸延伸。PCR循環方法之一實例為在95℃下處理樣品5分鐘；重複四十五個以下循環：95℃ 1分鐘；59℃ 1分鐘、10秒及72 ℃ 1分30秒；且隨後在72℃下處理樣品5分鐘。使用商業上可獲得之熱循環器頻繁地進行多個循環。PCR擴增產物在分析之前有時在較低溫度下(例如，在4℃下)儲存一定時間且有時經冷凍(例如，在-20℃下)。
核酸斷裂
在某些實施例中，核酸可來自庫或可自來自所關注之有機體的經酶促消化、剪切或音波處理基因組DNA(例如經斷裂)獲得。在一些實施例中，經受斷裂或分裂之核酸可具有約5至約10,000個鹼基對、約100至約1,000個鹼基對、約100至約500個鹼基對或約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000個鹼基對之標稱、平均(average)或平均(rmean)長度。碎片可藉由此項技術中之任何適合的方法產生，且核酸碎片之平均、平均或標稱長度可由一般技術者藉由選擇適當的片段產生程序來控制。在一些實施例中，片段DNA可經尺寸選擇以獲得具有特定尺寸範圍之核酸片段。
可藉由一般技術者已知的各種方法使核酸斷裂，該等方法包括(但不限於)物理、化學及酶促方法。該等方法之實例在US2005/0112590中描述。一般技術者可選擇特定方法以產生非特異性分裂片段或特異性分裂片段。可產生非特異性分裂片段樣品核酸之方法之實例包括(但不限於)：使樣品核酸與使核酸曝露於剪切力之設備接觸(例如，使核酸穿過針筒針；使用French壓力機)；使樣品核酸曝露於照射(例如，γ、x射線、UV照射；片段尺寸可藉由照射強度控制)；在水中煮沸核酸(例如，產生約500個鹼基對片段)及使核酸曝露於酸及鹼水解方法。
擴增
適用於本文所描述之實施例之核酸有時係藉由此項技術中已知的任何擴增方法(例如，PCR、RT-PCR及其類似者)經擴增。當使用通常難以培養之有機體(例如，生長緩慢、需要特殊培養條件及其類似者)時，核酸擴增可為尤其有益的。
用於擴增核酸之例示性方法包括聚合酶鏈反應(PCR)(Mullis等人，(1986)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.51pt.1：263；Cleary等人，(2004)Nature Methods 1：241；及美國專利第4,683,195號及第4,683,202號)；錨定PCR；RACE PCR；接合鏈反應(LCR)(Landegran等人，(1988)Science 241：1077-1080；及Nakazawa等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：360-364)；自持序列複製(Guatelli等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1874)；轉錄擴增系統(Kwoh等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1173)；Q-β複製酶(Lizardi等人，(1988)BioTechnology 6：1197)；遞歸PCR(Jaffe等人，(2000)J.Biol.Chem.275：2619；及Williams等人，(2002)I Biol.Chem.277：7790)；在美國專利第6,391,544號、第6,365,375號、第6,294,323號、第6,261,797號、第6,124,090號及第5,612,199中描述之擴增方法；等溫擴增(例如，圓周開卷擴增(RCA))；超支化圓周開卷擴增(HRCA)；股位移擴增(SDA)；解螺旋酶依賴性擴增(HDA)；PWGA；聚合酶及/或接合酶鏈反應；熱循環(PCR)或等溫(例如，RCA、hRCA、SDA、HDA、PWGA)或使用熟習此項技術者所熟知的技術之任何其他核酸擴增方法。
在一些實施例中，可進行有限擴增反應，其亦稱為預擴增。預擴增為有限量之擴增歸因於所進行之較小數目的循環(例如10個循環)而發生之方法。預擴增可允許一定量之擴增，但在指數期之前停止擴增，且其通常產生約500個所要核苷酸序列之複製物。使用預擴增亦可在標準PCR反應中限制與耗乏反應物相關的不準確性。
定序
定序可經由此項技術中已知的典型桑格定序方法來實現。在一些實施例中，定序可使用高產量定序方法進行，該等高產量定序方法中之一些允許在其剛併入生長股之後或在其併入生長股後立即偵測經定序之核苷酸，例如，序列偵測為實質上即時或為即時的。在一些情況下，高產量定序每小時產生至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少100,000或至少500,000個序列閱讀；各閱讀為每一閱讀至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120或至少150個鹼基(每一閱讀500至1,000個鹼基)。
高產量定序方法可包括(但不限於)大規模平行標籤定序(MPSS，Lynx Therapeutics)、Polony定序、454焦磷酸定序、Illumina(Solexa)定序、SOLiD定序、在半導體上定序、DNA奈米球定序、HelioscopeTM單分子定序、單分子SMRTTM定序、單分子即時(RNAP)定序、奈米孔DNA定序及/或藉由雜交之定序(例如使用DNA微陣列之非酶促方法)或微流體桑格定序。
同源性及一致性
除本文所提供之經調節啟動子序列、調節序列及編碼聚核苷酸之外，核酸試劑可包括與前述各者(或與互補序列)80%或80%以上一致的聚核苷酸序列。亦即，可利用與本文所描述之核苷酸序列至少80%或80%以上、81%或81%以上、82%或82%以上、83%或83%以上、84%或84%以上、85%或85%以上、86%或86%以上、87%或87%以上、88%或88%以上、89%或89%以上、90%或90%以上、91%或91%以上、92%或92%以上、93%或93%以上、94%或94%以上、95%或95%以上、96%或96%以上、97%或97%以上、98%或98%以上或99%或99%以上一致的核苷酸序列。如本文所用之術語「一致」係指當彼 此相比較時具有實質上相同的核苷酸序列之兩個或兩個以上核苷酸序列。一個用於判定兩個核苷酸序列或胺基酸序列是否實質上一致的測試為測定共有的一致核苷酸序列或胺基酸序列之百分比。
序列一致性之計算可如下進行。出於最佳比較目的將序列比對(例如，可在第一及第二胺基酸或核酸序列中之一者或兩者中引入間隙以用於最優比對，且可出於比較目的忽略非同源序列)。出於比較目的經比對之參考序列之長度有時為參考序列長度之30%或30%以上、40%或40%以上、50%或50%以上，常常為60%或60%以上且更常常為70%或70%以上、80%或80%以上、90%或90%以上或100%。隨後在兩個序列中比較分別在對應核苷酸或多肽位置處之核苷酸或胺基酸。當第一序列中之位置由相同核苷酸或胺基酸佔據為在第二序列中之對應位置時，核苷酸或胺基酸被認為在彼位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比隨該等序列共有的一致位置數目變化，其中考慮為了兩個序列之最佳對準而引入的間隙數目及各間隙長度。
可使用數學演算法實現序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比。可使用Meyers及Miller,CABIOS 4：11-17(1989)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權數殘基表、空隙長度處罰12及空隙處罰4來測定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：444-453(1970)演算法(其已併入GCG軟體套件中之GAP程式(可在http位址www.gcg.com獲得)中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來測定。兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG軟體套件中之GAP程式(可在http位址www.gcg.com獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來測定。常常使用之一組參數為 Blossum 62計分矩陣，其空隙開放處罰為12，空隙擴展處罰為4，且讀框轉移空隙處罰為5。
序列一致性亦可藉由在嚴格條件下進行之雜交分析來測定。嚴格雜交條件之一實例為在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(ssC)中在約45℃下雜交，接著在0.2×SSC、0.1% SDS中在50℃下洗滌一或多次。嚴格雜交條件之另一實例為在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45℃下雜交，接著在0.2×SSC、0.1% SDS中在55℃下洗滌一或多次。嚴格雜交條件之另一實例為在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45℃下雜交，接著在0.2×SSC、0.1% SDS中在60℃下洗滌一或多次。通常，嚴格雜交條件為在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45℃下雜交，接著在0.2×SSC、0.1% SDS中在65℃下洗滌一或多次。更通常地，嚴格性條件為0.5M磷酸鈉、7% SDS在65℃下，接著在0.2×SSC、1% SDS下在65℃下洗滌一或多次。
定義
如本文所用，除非另外指示，否則冠詞「一/一種」意謂一或多個/一或多種(除非另外明確規定)。如本文所用，除非另外指示，否則諸如「含有(contain)」、「含有(containing)」、「包括(include)」、「包括(including)」及其類似者之術語意謂「包含」。如本文所用，除非另外指示，否則術語「或」可為合取或非合取的。如本文所用，除非另外指示，否則任何實施例可與任何其他實施例組合。如本文所用，除非另外指示，否則本文中之一些本發明實施例涵蓋數值範圍。當範圍存在時，該等範圍包括範圍端點。另外，範圍內之每一子範圍及值均如同其經明確寫出一般而存在。
如本文所用之術語「擴增(amplify)」、「擴增(amplification)」、「擴增反應」或「擴增(amplifying)」係指任何用於倍增核酸之靶序列之複製物的活體外方法。擴增有時係指靶核酸之「指數」增加。然而， 如本文所用之「擴增」亦可係指核酸之選擇靶序列數目之線性增加，但其不同於單次、單引子延伸步驟。
如本文所用，「雙環核苷」係指具有包含糖環(包括(但不限於)呋喃醣)之糖部分的核苷，該糖環包含連接糖環之兩個碳原子以形成第二環之橋鍵。在某些實施例中，該橋鍵在糖環位置處將5員糖環基團之4'碳連接至2'碳。
如本文所用，術語「互補分裂反應」係指在相同核酸上使用不同分裂試劑或藉由改變相同分裂試劑之分裂特異性以使得產生相同標靶或參考核酸或蛋白質之替代性分裂模式而進行的分裂反應。在某些實施例中，所關注之核酸可用一或多種特異性分裂劑(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10種以上特異性分裂劑)在一或多個反應容器中處理(例如，所關注之核酸係在獨立容器中用各特異性分裂劑處理)。
如本文所用之術語「DNA聚合酶」包括已經修飾之DNA聚合酶，該修飾係藉由例如天然方法(諸如轉譯後加工)或非天然方法(諸如化學修飾)來達成。該等修飾可在肽主鏈、胺基酸側鏈或N末端或C末端上發生。修飾包括例如乙醯化；醯化；ADP-核糖基化；醯胺化；黃素、血紅素基團、核苷酸或核苷酸衍生物、脂質或脂質衍生物之共價連接；環化反應；二硫橋接；甲基化及去甲基化；胱胺酸鍵聯；甲醯化；γ-羧化；糖基化；羥基化；磷酸化及胺基酸之tRNA介導添加。
當提及微生物或細胞時，如本文所用之術語「工程化」係指包括不同於存在於用作修飾之起點的微生物或細胞(例如，宿主微生物/細胞或未經修飾之有機體/細胞)中之活性的一或多種活性之經修飾有機體或細胞。工程化微生物通常由於遺傳修飾而出現，其通常由熟習此項技術者使用可容易獲得之技術來引入或選擇。適用於產生變化活性 之方法之非限制性實例包括：引入異源聚核苷酸(例如，核酸或基因整合，亦稱為「敲入(knock in)」；移除內源性聚核苷酸；改變現存內源性核酸序列之序列(例如，定點突變誘發)；破壞現存內源性核酸序列(例如，敲除(knock out)及轉座子或插入要素介導之突變誘發)；選擇變化活性，其中該選擇導致可穩定遺傳之天然存在的活性之變化(例如，導致有機體之基因組中之核酸序列或經複製且傳遞至子細胞上之表觀遺傳核酸之變化)；基於PCR之突變誘發及其類似者。
如本文所用之術語「遺傳修飾」係指促進在工程化微生物中之靶核酸之轉運(例如輸入)之任何適合的核酸添加、移除或改變。基因修飾包括(但不限於)：在一或多個位置中在宿主生物體之原生核酸中插入一或多種核苷酸、在一或多個位置中在宿主生物體之原生核酸中缺失一或多種核苷酸、在一或多個位置中在宿主生物體之原生核酸中修飾或取代一或多種核苷酸、將非原生核酸插入至宿主生物體中(例如，插入自主複製載體)及移除宿主生物體中之非原生核酸(例如，移除載體)。
如本文所用，在一些實施例中，術語「異源」核酸係指不存在於宿主微生物中之核酸序列。在某些實施例中，異源聚核苷酸以不同於在宿主微生物中之量(例如，不同複本數)存在，其可例如藉由將特定核苷酸序列之較多複製物引入至宿主微生物中來實現(例如，特定核苷酸序列可為在宿主染色體自主之核酸中或可經插入至染色體中)。 異源核酸在一些實施例中係來自不同有機體，且在某些實施例中係來自相同類型之有機體但來自外部來源(例如，重組來源)。如本文所用，當用於提及蛋白質、啟動子或核酸時，術語「異源」係指已經由某種方法操控之蛋白質、啟動子或核酸。舉例而言，異源核酸、異源編碼區或異源啟動子包括核酸、編碼區或啟動子，該核酸、編碼區或啟動子通常不在其已經引入之物種中或通常不連接至其已連接之核 酸。異源核酸或蛋白質因此包括對於一種類型之有機體為原生的但已經由某種方法(例如，置放於不同染色體位置中、經突變、經添加多個複製物、經連接至非原生啟動子或強化子要素等)被改變之核酸或蛋白質。異源基因包括包含基因之cDNA形式的基因序列。舉例而言，當異源編碼區經接合至包含調節元素(諸如未經發現與編碼區天然相關之啟動子)之核苷酸序列時，或當異源編碼區與未在自然界中發現之染色體之部分(例如，在其中藉由編碼區編碼之蛋白質通常未經表現之基因座中表現的基因)相關時，異源編碼區可區別於內源編碼區。類似地，異源啟動子可為連接至其在自然界中未連接的編碼區之啟動子。
如本文所用之術語「經分離」係指自其原始環境(例如，若其為天然存在的，則為天然環境，或若其外源地表現，則為宿主細胞)移除，且因此「藉由人類之手」自其原始環境改變的物質。
如本文所用，「經修飾核苷」係指與天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少一個修飾的核苷。該修飾可在糖部分處及/或在核鹼基處。
如本文所用之術語「突變誘發」係指對核酸(例如，核酸試劑或宿主染色體(例如))之隨後用於在宿主或經修飾有機體中產生產物之任何修飾。突變誘發之非限制性實例包括缺失、插入、取代、重排、點突變、抑制因子突變及其類似者。突變誘發方法為此項技術中已知且為技術人員可容易地獲得的。突變誘發方法之非限制性實例在本文中描述且亦可在Maniatis等人，(1982)Molecular Cloning：a Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.中發現。突變誘發之另一非限制性實例可使用Stratagene(San Diego,CA)「QuickChange」套組根據製造商之說明進行。
如本文所用之術語「原生序列」係指如在其天然環境中所發現之 未經修飾的核苷酸序列(例如，如在有機體中發現的核苷酸序列)。
如本文所用之「核酸修飾」係指存在於經修飾核酸分子(與通常或天然存在的核酸分子相比)中之變化，通常為化學變化。可能已對核酸之任何組分(例如對主鏈、糖組分或鹼基)進行修飾。藉助於實例，經修飾核酸可具有硫代磷酸酯主鏈而非天然存在的磷酸二酯主鏈。此類修飾通常對於待用於治療之核酸進行。修飾及經修飾核酸在本文中進一步描述。
如本文所用，「核鹼基」係指核苷之雜環鹼基部分。核鹼基可為天然存在的、可經修飾、可不帶有與天然鹼基之類似性且可例如藉由有機合成來合成。在某些實施例中，核鹼基可包含任何能夠與另一核酸之鹼基氫鍵結或完全缺乏氫鍵之原子或原子組。在某些實施例中，非天然核鹼基可不為衍生自天然核鹼基。在某些實施例中，非天然核鹼基可為合成核鹼基。應注意，非天然核鹼基不一定具有鹼性特性，然而為簡單起見而將其稱為核鹼基。當提及核鹼基時，「(d)」指示核鹼基可連接至去氧核糖或核糖。
如本文所用，「核苷」係指包含核鹼基部分及糖部分之化合物。 核苷包括(但不限於)天然存在的核苷(如在DNA及RNA中發現)、無鹼基核苷、經修飾核苷及具有模擬鹼基及/或糖基團之核苷。核苷可用多種取代基中之任一者修飾。核苷可為經由核酸鹼基與還原性糖基團之間的醣苷連接形成的醣苷化合物。應注意，術語「核酸鹼基」意欲涵蓋腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及其衍生物。不以任何方式限制以上衍生物之類型。
術語「核苷酸」係指一種化合物，其中以上核苷之糖部分與磷酸形成酯，更佳為單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。該核苷或核苷酸之糖部分可為呋喃核糖基、2'-去氧呋喃核糖基或具有在2'位置處之取代基的2'-取代呋喃核糖基。同樣地，磷酸部分可為硫代磷酸。亦即，糖 及磷酸部分可呈與在其已知核苷、核苷酸或衍生物中所發現的相同形式。糖部分為呋喃核糖基之核糖核苷酸可用作構成RNA之組分。糖部分為去氧呋喃核糖基之去氧核糖核苷酸可用作構成DNA之組分。核苷酸可為進一步包含磷酸酯連接基團之核苷。核苷酸可包括含有磷酸酯部分之核苷。如本文所用，「經連接核苷」可由磷酸酯鍵連接或可不由其連接，且因此包括「經連接核苷酸」。
如本文所用之術語「探針」或「引子」係指以鹼基-特異性方式與核酸分子之互補股雜交的寡核苷酸。探針可包括引子，其可為單股寡核苷酸探針，該探針可充當模板定向DNA合成或擴增之起始點，該擴增使用包括(但不限於)聚合酶鏈反應(PCR)及接合酶鏈反應(LCR)之方法以用於擴增靶序列。如本文所描述之寡核苷酸可包括核酸序列之區段或片段或其互補序列。在一些實施例中，DNA區段可在5與10,000個鄰近鹼基之間，且可在5、10、12、15、20或25個核苷酸至10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000或10,000個核苷酸範圍內變化。除DNA及RNA之外，探針及引子可包括多肽核酸(PNA)，如Nielsen等人，Science 254：1497-1500(1991)中所描述。探針或引子可包含核苷酸序列之區域，其與核酸分子之至少約15個、通常約20至25個，且在某些實施例中約40、50、60或75個連續核苷酸雜交。
如本文所用之術語「蛋白質」係指具有藉由肽鍵連接的胺基酸序列之分子。此術語包括融合蛋白、寡肽、肽、環狀肽、多肽及多肽衍生物(原生或重組)，且亦包括其片段、衍生物、同源物及變體。
如本文關於分子所用之術語「純化」並不指絕對純。實際上，「純化」係指組合物中之物質，其與其所起源之樣品相比含有除所關注之物質以外較少的相同類別之物質物種(例如，核酸或蛋白質物種)。若例如為核酸或蛋白質，則「純化」係指組合物中之物質，其 與其所起源之樣品相比含有除所關注之核酸或蛋白質以外較少的核酸物種或蛋白質物種。有時，蛋白質或核酸為「實質上純」，其指示蛋白質或核酸代表至少50%之蛋白質或核酸(以組合物之質量計)。通常，實質上純的蛋白質或核酸以組合物之質量計為至少75%，且有時以組合物之質量計至少為95%。
如本文所用，「信號序列」或「定位信號序列」係指將經轉譯蛋白質或肽定位至系統中之組分的序列。
如本文所用之術語「特異性分裂劑」係指可在一或多個特異性位點處分裂核酸之試劑，有時為化學物質或酶。
如本文所用，術語「嚴格條件」係指用於雜交及洗滌之條件。嚴格條件為熟習此項技術者已知且可在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.,6.3.1-6.3.6(1989)中發現。彼參考文獻中描述水性及非水性方法且可使用任一者。
如本文所用，「糖部分」意謂天然或經修飾糖環。
如本文所用，「載體(vector)」係指任何含有外源性DNA之載體(carrier)。因此，載體為在不導致降解的情況下將外源性核酸轉運至細胞中之試劑，且包括在其所遞送至的細胞中產生核酸表現之啟動子。載體包括(但不限於)質體、病毒核酸、病毒、噬菌體核酸、噬菌體、黏質體及人工染色體。
實例
應理解，以下實例不應理解為限制於本文所描述之特定方法、方案及組合物等，且因而可變化。本文中所用之以下術語僅出於描述特定實施例之目的，且不意欲限制本文所揭示之實施例之範疇。
實例1： 製備電感受態(electrocompetent)C41(DE3)-pACS
使新鮮轉化的大腸桿菌C41(DE3)-pACS之單一純系在補充有鏈黴 素(50μg/ml)及KPi(50mM)之2×YT培養基(3ml)中生長隔夜。在100倍稀釋為相同培養基(300ml)且在37℃下過度生長(outgrowth)至0.20之OD600之後，添加IPTG至1mM之最終濃度以誘發PtNTT2表現。在40min之後，使培養物迅速地冷卻至0℃，用無菌水(3×150ml)洗滌，且使其再懸浮於10%甘油(1.5ml)中。
電穿孔及回收
將電感受態C41(DE3)-pACS細胞(50μL)之等分試樣與pINF(2μL，400ng)混合，且在0.2cm間隙槽中電穿孔。添加預升溫之2×YT培養基(0.95ml，50μg/ml鏈黴素、1mM IPTG、50mM KPi)，且在混合之後，移除45μL且將其與補充有0.25mM dNaMTP及d5SICSTP之105μl相同培養基(3.3×稀釋度)組合。允許所得混合物在37℃下在振盪(210rpm)下回收1h。
生長及分析
在回收之後，將細胞離心，且廢培養基(0.15ml)經移除且藉由HPLC分析其核苷酸組成(圖12A)。使細胞再懸浮於新鮮2×YT培養基(1.5ml，50μg/ml鏈黴素、100μg/ml安比西林(ampicillin)、1mM IPTG、50mM KPi、0.25mM dNaMTP、0.25mM d5SICSTP)中且使其在37℃下在振盪(250rpm)下生長。在經定義時間點，測定OD600，且等分試樣(100μl)經移除及離心(8000rfu，持續5min，4℃)。藉由HPLC分析廢培養基之核苷酸組成，且藉由旋轉柱純化(Zymo Research Corp.)回收pINF。UBP之保持力係藉由如下文所描述之PCR擴增及凝膠電泳或定序來表徵。資料表示三個獨立實驗之平均值。當在不進行電穿孔之情況下添加pINF時，未觀測到PCR產物，其消除了未經擴增之質體作為PCR產物源(圖12B)。
物質
2×YT、2×YT瓊脂、IPTG、安比西林及鏈黴素係自Fisher Scientific獲得。安比西林及鏈黴素分別在100μg/ml及50μg/ml下使用。含有核苷酸轉運子之pET-16b構築體、pET16b-RpNTT2、C41(DE3)大腸桿菌菌株。質體pUC19來自Thermo Scientific及pCDF-1b來自EMD Millipore。質體係使用PureLink快速質體DNA小規模純化套組(PureLink Quick Plasmid DNA Miniprep Kit)(Life Technologies)純化。OneTaq、DeepVent、Q5熱起始高保真度DNA聚合酶及所有限制性核酸內切酶都自New England Biolabs獲得。通常，PCR反應經分成多個等分試樣，其中一個使用0.5×Sybr Green I(Life Technologies)即時追蹤；在PCR之後，等分試樣經重組，藉由旋轉柱(DNA Clean and Concentrator-5；Zymo Research,Irvine,CA)在20μl水中溶離來純化，隨後在瓊脂糖凝膠上經分離，接著經條帶切除及回收(Zymoclean凝膠DNA回收套組)，用20μl水溶離(除非另外說明)。用1×Sybr Gold(Life Technologies)染色PAGE凝膠30min，用1×Sybr Gold澆鑄瓊脂糖凝膠。使用配備有520DF30過濾器(Bio-Rad)之分子成像劑凝膠Doc XR+使凝膠可視化，且用Quantity One軟體(Bio-Rad)定量。所用之例示性DNA寡核苷酸之序列在表8中顯示。天然寡核苷酸係購自商業來源。除非另外說明，否則dsDNA之濃度係藉由螢光染料結合(Quant-iT dsDNA HS分析套組，Life Technologies)量測。ssDNA之濃度係藉由在260nm下之UV吸附使用NanoDrop 1000(Thermo Scientific)測定。[α-32P]-dATP(25μCi)。經聚乙烯亞胺纖維素預塗佈之Bakerflex® TLC培養盤(0.5mm)。dNaM胺基磷酸酯、dNaM及d5SICS核苷。dNaM及d5SICS之游離核苷在Ludwig條件下經轉化成對應三磷酸酯。在藉由陰離子交換層析法(DEAE Sephadex A-25)接著為逆相(C18)HPLC及經由Dowex 50WX2-鈉柱之溶離來純化之後，兩種三磷酸酯均經凍乾且保持在-20℃下直至使用。d5SICSTP類似物dTPT3TP及生物素標記dNaMTP類似物dMMO2 SSBIO TP4如先前所報導製成。進行MALDI- TOF質譜分析。
建構NTT表現質體
PtNTT2基因係自質體pET-16b-PtNTT2使用引子PtNTT2-fwd及PtNTT2-rev擴增；TpNTT2基因係自質體pET-16b-TpNTT2使用引子TpNTT2-fwd及TpNTT2-rev擴增。pCDF-1b之線性片段係使用引子pCDF-1b-fwd及pCDF-1b-rev產生。片段經純化。pCDF-1b片段(100ng，4.4×10-14mol)及PtNTT2(78ng，4.4×10-14mol)或TpNTT2(85ng，4.4×10-14mol)片段隨後使用無限制環狀聚合酶延伸選殖組裝在一起，其係在1×OneTaq反應緩衝液、調節至3.0mM之MgSO4、0.2mM dNTP及0.02U/μl OneTaq DNA中在以下熱循環條件下進行：初始變性(96℃，1min)；10個變性循環(96℃，30s)、降落退火(54℃至49.5℃，持續30s(-0.5℃每循環))、68℃之延伸持續5min及最終延伸(68℃，5min)。完成後，樣品經純化且用於大腸桿菌XL10之熱休克轉化。在含有鏈黴素之LB瓊脂上選擇個別菌落，且藉由菌落PCR用引子PtNTT2-fwd/rev或TpNTT2-fwd/rev對其分析。NTT基因之存在係藉由定序及雙重消化(double digestion)確認，該雙重消化係用ApaI/EcoO109I限制性核酸內切酶以以下預期模式進行：pCDF-1b-PtNTT2(2546/2605bp)、pCDF-1b-TpNTT2(2717/2605bp)、pCDF-1b(1016/2605bp)。pCDF-1b/PtNTT2質體(亦即pACS)之完整核苷酸序列係以SEQ ID NO：1之形式提供。
實例2：用以定量核苷三磷酸酯吸收之通用方案 生長條件
用pCDF-1b-PtNTT2新鮮轉化之大腸桿菌C41(DE3)在具有鏈黴素之2×YT中生長隔夜，隨後將其稀釋(1：100)成補充有50mM磷酸鉀(KPi)及鏈黴素之新鮮2×YT培養基(每一[α-32P]-dATP之吸收1ml培養物；每一d5SICSTP或dNaMTP之吸收2ml培養物)。相同地處理具有 非活性轉運子pET-16b-RpNTT2之陰性對照物，除了使用安比西林而非鏈黴素。使細胞生長至約0.6之OD600，藉由添加IPTG(1mM)誘發表現。允許培養物再生長一小時(最終OD600約為1.2)，且隨後如下文所描述使用改編自Haferkamp等人之方法直接分析其吸收。
製備培養基部分
向培養基添加dNaMTP或d5SICSTP(各10mM)至0.25mM之最終濃度。用基質在振盪下在37℃下培育細胞30min且隨後將其粒化(8,000rfu，5min，4℃)。將培養基部分之等分試樣(40μl)與乙腈(80μl)混合以沈澱蛋白質，且隨後在RT下培育30min。緊接著藉由HPLC分析樣品或將其儲存在-80℃下直至分析。以離心(12,000rfu，10min，RT)開始分析，隨後丟棄集結粒，且將上澄液減小體積至約20μl，使其再懸浮於95% 0.1M TEAB(pH 7.5)、5%乙腈中達至50μl之最終體積，且藉由HPLC分析。
製備細胞質部分
為分析非天然核苷三磷酸酯之細胞內去磷酸化，使細胞集結粒經受冰冷KPi(50mM)之3×100μl洗滌。隨後使集結粒再懸浮於250μl冰冷KPi(50mM)中且用250μl PureLink快速質體DNA小規模純化套組之溶解緩衝液L7(200mM NaOH、1% w/v SDS)溶解，其後在RT下培育所得溶液5min。添加沈澱緩衝液N4(350μl，3.1M乙酸鉀，pH 5.5)，且混合樣品至均質。在離心(>12,000rfu，10min，RT)之後，將含有非天然核苷酸之上澄液施加至用乙腈(1ml)及95% 0.1M TEAB(pH 7.5)、5%乙腈(1ml)預洗滌之C18固相萃取柱。隨後用95% 0.1M TEAB(pH 7.5)、5%乙腈洗滌該柱，且用1ml 50%乙腈：50%三乙銨碳酸氫鹽(TEAB)0.1M(pH 7.5)溶離核苷酸。將溶離劑減小體積至約50μl，且在HPLC分析之前用95% 0.1M TEAB(pH 7.5)、5%乙腈將其體積調節至100μl。
HPLC
將樣品施加至LC柱(3μm C18 300Å，250mm×4.6mm)，且使其在40min內在1ml/min之流動速率下經受用20% 0.1M TEAB(pH 7.5)；80%乙腈之0-40%線性梯度。
定量
注射系列包括兩個含有5nmol dNaMTP或d5SICSTP之額外對照樣品。對於對照與未知樣品兩者積分在對應於三磷酸酯、二磷酸酯、單磷酸酯及游離核苷之峰下的面積(藉由MALDI-TOF確認)。在峰積分之後，未知峰與對於來自萃取步驟之損失(對於dNaM及d5SICS分別為62%及70%損失)經調節的對照峰之比率提供樣品中之部分中之每一者之量的量度。為測定細胞內之非天然核苷酸之相對濃度，輸入之非天然核苷酸量隨後除以細胞體積，該體積係由(1μm3)之單個大腸桿菌細胞之體積乘以各培養物中之細胞數目(1.0之OD600等於1×109個細胞每毫升)來計算。RpNTT2樣品用作陰性對照物，且其信號被減去以解釋來自培養基之核苷酸物種之任何不完全洗滌。
dATP吸收
為分析dATP之細胞內去磷酸化，在NTT之誘發之後，吸收反應係藉由添加dATP(外加[α-32P]-dATP)至0.25mM之最終濃度，接著在37℃下在振盪下培育30min來起始。隨後離心培養物(8,000rfu，5min，RT)。藉由薄層層析法(TLC)分析上澄液，同時在藉由TLC分析上澄液(1.5μl)之前，用冰冷KPi(50mM，100μl)洗滌細胞集結粒3次以移除過量放射性基質，將其用NaOH(0.2M，100μl)溶解且離心(10,000rfu，5min，RT)以粒化細胞碎片。
TLC分析
將樣品(1μl)施加在0.5mm聚乙二亞胺纖維素TLC培養盤上，且首先藉由甲酸鈉(0.5M，pH 3.0)溶離30秒，隨後藉由甲酸鈉(2.5M，pH 3.0)溶離2.5min，且最終藉由甲酸鈉(4.0M，pH 3.0)溶離40min。培養盤使用空氣加熱槍經乾燥，且藉由磷光成像儀(phosphorimage)及成像軟體定量。
實例3：經開發以用於自細胞萃取核苷酸用於HPLC分析之方法
為最小化溶解及三磷酸酯萃取方案對細胞內之核苷三磷酸酯之分解的作用，發現以下萃取工序，其產生出乎意料地最高回收率及低程度之分解(表9)。細胞經生長、洗滌，且隨後將5nmol dNaMTP或d5SICSTP添加至集結粒，隨後使其經受各種類型之萃取，包括沸水、熱乙醇、冷甲醇、冷凍及融化、溶菌酶、玻璃珠、NaOH、三氯乙酸(TCA)與氟利昂(Freon)及過氯酸(PCA)與KOH。對照物之回收率及組成係藉由HPLC定量。方法3，亦即用NaOH細胞溶解(表6)經發現為出乎意料地有效且可複製。在添加NaOH之前使集結粒再懸浮於冰冷KPi(50mM，250μl)中以在細胞溶解之後降低去磷酸化(方法4)。
a所有核苷酸(3P、2P、1P及核苷)之回收率。b計算為在萃取之前及之後的3P組合物之比率(%)
實例4：建構pINF 製備非天然插入物
含有dNaM之TK-1-dNaM寡核苷酸係使用固相DNA合成用超溫和DNA合成胺基磷酸酯在CPG超溫和支撐物(1μmol)及核酸合成儀上製備。在合成之後，藉由用濃縮氫氧化氨在50℃下處理隔夜脫除DMT-ON寡核苷酸之保護基，將其純化且隨後使其經受8M脲8% PAGE。藉由UV造影使凝膠可視化，切除對應於75mer之條帶，且藉由壓碎及浸泡萃取、過濾(0.45μm)及在Sephadex G-25上最終脫鹽來回收DNA。 單股寡核苷酸之濃度係藉由在260nm下之UV吸附來測定(其中dNaM在260nm下之消光係數假定等於dA之消光係數。TK-1-dNaM(4ng)隨後藉由PCR在以下條件下擴增：1×OneTaq反應緩衝液、經調節至3.0mM之MgSO4、0.2mM dNTP、0.1mM dNaMTP、0.1mM d5SICSTP類似物dTPT3TP、1μM引子pUC19-融合-fwd及pUC19-融合-rev中之每一者及0.02U/μl OneTaq DNA聚合酶(在總共4×50μl反應物中)，其係在以下熱循環條件下：初始變性(96℃，1min)，接著為12個變性循環(96℃，10s)、退火(60℃，15s)及延伸(68℃，2min)。進行不具有非天然三磷酸酯之類似PCR以在類似條件下獲得完全天然的插入物以用於建構天然對照質體。使反應物經受旋轉柱純化且隨後藉由4%瓊脂糖凝膠純化靶PCR產物(122bp)。
pUC19線性化
pUC19(20ng)係藉由PCR在以下條件下擴增：1×Q5反應緩衝液、經調節至3.0mM之MgSO4、0.2mM dNTP、1μM各引子pUC19-lin-fwd及pUC19-lin-rev及0.02U/μl Q5熱起始高保真度DNA聚合酶(在總共4×50μl反應物中，其中一個反應含有0.5×Sybr Green I)，其係在以下熱循環條件下：初始變性(98℃，30s)、20個變性循環(98℃，10s)、退火(60℃，15s)及延伸(72℃，2min)及最終延伸(72℃，5min)。所要PCR產物(2611bp)係藉由4%瓊脂糖凝膠純化。
pINF及天然對照質體之PCR組裝
線性片段係自pUC19使用引子pUC19-lin-fwd及pUC19-lin-rev擴增。將所得產物(800ng，4.6×10-13mol)與天然或非天然插入物(參見上文)(56ng，7.0×10-13mol)組合且藉由環狀重疊延伸PCR在以下條件下組裝：1×OneTaq反應緩衝液、經調節至3.0mM之MgSO4、0.2mM dNTP、0.1mM dNaMTP、0.1mM d5SICSTP類似物dTPT3TP及0.02U/μl OneTaq DNA聚合酶(在總共4×50μl反應物中，其中一個反應含有0.5×Sybr Green I)，其係使用以下熱循環條件：初始變性(96℃，1min)、12個變性循環(96℃，30s)、退火(62℃，1min)及延伸(68℃，5min)、最終延伸(68℃，5min)及緩慢冷卻(在-0.1℃/s之速率下68℃至10℃)。PCR產物係藉由在1%瓊脂糖上之限制消化分析，且直接用於大腸桿菌轉化。使用具有dNaM及dTPT3TP之d5SICS類似物dTPT3對替代d5SICSTP，因為含有dTPT3-dNaM之DNA與含有d5SICS-dNaM之DNA相比經更佳地PCR擴增，且此促進高品質pINF(UBP含量>99%)之建構。
實例5：大腸桿菌中之pINF複製 製備電感受態細胞
藉由熱休克用200ng pACS質體轉化C41(DE3)細胞，且在補充有鏈黴素之2×YT瓊脂上選擇轉化體隔夜。使新鮮轉化的C41(DE3)-pACS之單一純系在補充有鏈黴素及KPi(50mM)之2×YT培養基(3ml)中生長隔夜。在100倍稀釋為相同新鮮2×YT培養基(300ml)之後，使細胞在37℃下生長直至其達到0.20之OD600，此時添加IPTG至1mM之最終濃度以誘發PtNTT2表現。使細胞再生長40min，且隨後藉由在冰水中快速冷卻伴以充分振盪來停止生長。在預冷離心機中離心(2400rfu，10min，4℃)之後，移除廢培養基，且藉由用冰冷無菌水(3×150ml)洗滌來製備細胞用於電穿孔。在洗滌之後，使細胞再懸 浮於冰冷10%甘油(1.5ml)中且將其分成50μl等分試樣。若需儲存以用於後續使用，則將細胞冷凍。使用新鮮製備的細胞，且可使用冷凍細胞。
電穿孔及回收
將細胞之等分試樣與2μl質體(400ng)混合，轉移至0.2cm間隙電穿孔槽中，且使用Bio-Rad基因脈波產生器根據製造商之建議(電壓25kV、電容器2.5μF、電阻器200Ω、時間常數4.8ms)將其電穿孔。添加預升溫之2×YT培養基(0.95ml，鏈黴素、1mM IPTG、50mM KPi)，且在混合之後，取得45μl且將其與補充有0.25mM dNaMTP及d5SICSTP之105μl相同培養基(3.33×稀釋度)組合。
生長及分析
在回收之後，將細胞離心(4000rfu，5min，4℃)，且廢培養基(0.15ml)經移除且藉由HPLC分析其核苷酸組成。使細胞再懸浮於新鮮2×YT培養基(1.5ml，鏈黴素、安比西林、1mM IPTG、50mM KPi、0.25mM dNaMTP、0.25mM d5SICSTP)中且在37℃下(同時振盪(250rpm))生長隔夜，其產生與回收培養基相比10×之稀釋度或與最初經轉化之細胞相比33.3×之稀釋度。在15h、19h、24h、32h、43h、53h、77h、146h之後取得等分試樣(100μl)，測定OD600，且使細胞離心(8000rfu，5min，4℃)。藉由HPLC分析廢培養基之核苷酸組成，且pINF及pACS質體混合物係藉由經由旋轉柱(溶離於30μl水中)回收經純化，且其藉由限制消化分析。UBP在pINF質體上之保持力係藉由生物素凝膠移位遷移率分析及定序來定量。
將轉化培養基(10μl)以10×及50×稀釋度擴散到含有鏈黴素之2×YT瓊脂上以測定在37℃下隔夜生長之後的活菌落形成單位來計算經轉化pINF分子之數目。對於天然對照質體類似地進行轉化、回收及生長。另外，類似於pINF轉化操作及處理陰性對照物，除了不使其經 受電穿孔(圖11)。在至少6天之後未觀測到陰性對照樣品之生長。未偵測到陰性對照物之PCR擴增。因此，未擴增pINF質體係經由細胞生長攜載且之後錯誤地經偵測為經繁殖之質體。
實例6：保真度量測 藉由PCR之DNA生物素化
來自生長實驗(圖3及圖4)之pINF與pACS質體之純化混合物(1ng)係藉由PCR在以下條件下擴增：1×OneTaq反應緩衝液、經調節至3.0mM之MgSO4、0.3mM dNTP、0.1mM生物素標記dNaMTP類似物dMMO2 SSBIO TP、0.1mM d5SICSTP、1μM引子pUC19-seq-fwd及pUC19-seq-rev中之每一者、0.02U/μl OneTaq DNA聚合酶及0.0025U/μl DeepVent DNA聚合酶(在25μl之總體積中於CFX連接即時PCR偵測系統(CFX Connect Real-Time PCR Detection System)(Bio-Rad)中)，其係在以下熱循環條件下：初始變性(96℃，1min)、10個變性循環(96℃，30s)、退火(64℃，30s)及延伸(68℃，4min)。如在物質(Materials)中所描述純化PCR產物，且將所得生物素標記DNA雙螺旋體(5μl，25ng至50ng)與抗生蛋白鏈菌素(1μl，1μg/μl，Promega)在磷酸酯緩衝液(50mM磷酸鈉(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA)中混合，在37℃下培育30min，與5×非變性裝載緩衝液混合，且將其裝載到6%非變性PAGE上。在110V下操作30min之後，凝膠經可視化及定量。以下顯示所得片段(194bp)(SEQ ID NO：26)，引子區域為帶下劃線的且非天然核苷酸以粗體顯示(X=dNaM或其生物素標記類似物dMMO2 SSBIO )。
抗生蛋白鏈菌素移位校準
為建立抗生蛋白鏈菌素(SA)移位與序列之UBP在群體(UBP)中的部分之間的校準曲線，開發了PCR方法，其中反應外加有DeepVent。 該方法改良含有d5SICS-dMMO2 SSBIO 之DNA經擴增之保真度。校準係在類似條件下進行。為定量UBP之淨保持力，製備TK-1-dNaM模板與其天然對應物之九種混合物(具有已知非天然與天然比率)，使其經受藉由PCR之生物素化，且藉由遷移率移位分析在6%非變性PAGE上對其分析。為進行校準，在類似條件下歷經用pUC19-融合引子之九個PCR循環擴增TK-1-dNaM模板與其天然對應物之混合物(具有已知非天然與天然模板比率)(0.04ng)，且類似於來自本文所描述之生長實驗之樣品對其分析。重複三次進行實驗，將抗生蛋白鏈菌素移位(SAS，%)繪製為UBP含量(UBP，%)之函數，且資料擬合於線性方程式：方程式1：SAS=0.77×UBP+2.0 R2=0.999。
其中UBP對應於UBP在細胞複製之後於分析樣品中之保持力(%)，且係由SAS移位使用方程式1計算。
質體擴增之計算
在用pINF轉化之後將細胞塗佈在含有安比西林及抗生蛋白鏈菌素之2×YT瓊脂上，且在37℃下隔夜生長後計數菌落。假定經轉化細胞含有一個質體分子。菌落計數對應於經細胞吸收之質體初始量。在隔夜生長之後(圖4)，由一定體積之細胞培養物純化質體且將其定量。由於純化質體DNA表示pINF與pACS質體之混合物，進行用NdeI外切核酸酶之消化限制分析，其線性化兩種質體，接著使用1%瓊脂糖凝膠。以下提供用三個重複實驗中之一者進行的對於19h時間點之計算之實例。
計算19h之後的質體擴增之實例：
已知(或經量測)參數：
由於在純化期間的質體回收低於100%，因此吾人之計算低估擴增程度(A)且因此低估倍增數目(n)。
保真度(每一倍增之保持力)以如下關係關於UBP(F)之保持力f"=F
且由於n=log2(A)，因此保真度被計算為
實例7：藉由定序之保真度量測(圖3E) 用於定序之片段產生
在隔夜生長之後的pINF與pACS質體之純化混合物(1ng)係藉由PCR在以下條件下擴增：1×OneTaq反應緩衝液、經調節至3.0mM之MgSO4、0.2mM dNTP、0.1mM dNaMTP、0.1mM d5SICSTP類似物dTPT3TP、1μM引子pUC19-seq2-fwd及pUC19-seq-rev中之每一者(參見下文)及0.02U/μl OneTaq DNA聚合酶(在25μl之總體積中)，其係在以下熱循環條件下：變性(96℃，1min)及10個變性循環(96℃，30s)、退火(64℃，30s)及延伸(68℃，2min)。產物係藉由旋轉柱純化，經定量以量測DNA濃度且隨後如下文所描述經定序。以下顯示定序片段(304bp)，其中引子區域為帶下劃線的，且非天然核苷酸以粗體顯示(X=dNaM)。
桑格定序
循環定序反應(10μl)係在9800快熱循環器(9800 Fast Thermal Cycler)(Applied Biosystems)上用含有1ng模板及6pmol定序引子pUC19-seq-rev之BigDye終止劑v3.1循環定序套組(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit)(Applied Biosystems)之循環定序混合物(Cycle Sequencing Mix)(0.5μl)在以下熱循環條件下進行：初始變性(98℃，1min)及25個變性循環(96℃，10s)、退火(60℃，15s)及延伸(68℃，2.5min)。完成後，殘餘染料終止劑自反應移除。產物用去離子水自珠粒溶離出且經直接定序。收集定序跡線且用成像軟體分析。
桑格定序跡線之分析
分析桑格定序跡線以確定UBP之保持力。簡言之，非天然核苷酸 之存在導致定序特徵曲線之急劇終止，而天然核苷酸之突變導致「通讀」。此通讀之程度在標準化之後與UBP之保持力反向相關。原始定序跡線係藉由首先調節用於定序分析軟體之起始及終止點，且隨後對於在經定義點內之峰對於各通道(A、C、G及T)單獨地確定平均信號強度來分析。此係在定序跡線於非天然核苷酸之前(區段L)及在其之後(區段R)的部分單獨地進行。在對於定序衰變之標準化之後的R/L比率(R/L) 標準 及在對照未經擴增樣品中之通讀之後的R/L比率(R/L=0.55(R/L)標準+7.2對應於天然序列在池中之百分比(Malyshev等人)。因此，在PCR期間之UBP併入之總保持力(F)被計算為：
超過20%通讀在pUC19-seq2-fwd引子方向上使用對照質體pINF發生。進行相對方向(pUC19-seq-rev)之定序且將其用於計量隨生長變化之保真度及UDP保持力(表7)。原始定序跡線在圖3F中顯示。
實例8：非天然核酸之聚合酶併入
將測試反應混合物添加至多孔培養盤之孔，其中各孔含有連接至孔之底部的經引發(primed)DNA模板。測試反應混合物含有聚合酶變體及非天然核酸，非天然核酸具有(1)鹼基部分，其與模板之適當位置互補以用於將發生之精確延伸，及(2)連接至糖部分的生物素標記部分。在用於延伸發生之充分的培育時間(例如，用於具有具已知反應性之聚合酶與非天然核酸之對照反應)之後，移除反應混合物，洗滌培養盤之孔以移除殘餘非天然核酸，且將顯色試劑添加至孔中。顯色試劑包括經標記抗生蛋白鏈菌素分子，其能夠結合至連接至孔底部的已併入非天然核酸之核酸分子。抗生蛋白鏈菌素分子上之標記為此項技術中已知的多種標記中之任一者。再次洗滌培養盤以移除未結合的經標記抗生蛋白鏈菌素分子。隨後使用多孔盤讀取器偵測標記。來自經標記抗生蛋白鏈菌素之信號的存在指示具有併入非天然核酸之能力的聚合酶。藉由改變液相試劑之反應時間及或濃度使用相同分析以 測定動力學或其他定量參數。藉由輕微修改上文所例示之試劑對於其他非天然核酸進行類似篩檢。
實例9：TPT3、(d)FTPT3、(d)NaM、(d)5SICS、(d)FEMO、(d)FIMO及/或(d)MMO2至DNA中之聚合酶併入
在30℃下將聚合酶(15μg/ml)與20nM DNA一起在緩衝液(50mM TRIS(pH 7.5)、0.05% Tween 20、6mM MgS04、1mM EDTA、50mM NaCl)中培育。對於各濃度取得時間為零時的等分試樣，且隨後以10μM、5μM、2μM或1μM最終濃度添加TPT3、(d)FTPT3、(d)NaM、(d)5SICS、(d)FEMO、(d)FIMO及/或(d)MMO2以起始反應。在30℃下培育試管，且在0.33min、0.66min、1min、2min、5min及15min時自4個反應試管取得等分試樣以用於淬滅及15%脲丙烯醯胺凝膠分析。向剩餘反應試管添加1mM dNTP，且在又10min之後取得等分試樣用於凝膠分析(追蹤)。
隨後取得由以上聚合酶延伸反應產生的凝膠之像片。結果顯示引子隨時程變化變為較大條帶，較大條帶之量隨時間增加。較大條帶表明向DNA添加(d)TPT3、(d)FTPT3、(d)NaM、(d)5SICS、(d)FEMO、(d)FIMO及/或(d)MMO2(亦即，延伸一個鹼基)。在添加天然dNTP之後，聚合酶能夠將引子延伸至模板之末端，從而表明添加(d)TPT3、(d)FTPT3、(d)NaM、(d)5SICS、(d)FEMO、(d)FIMO及/或(d)MMO2不產生3'阻斷引子且聚合酶能夠與天然及非天然核酸一起延伸引子。與在較低濃度(1μM)下相比，併入在較高濃度(10μM)下較快，且該併入顯示時間依賴性，其指示真正的酶併入。
結果表明出人意料之發現，即聚合酶可具有對於(d)TPT3、(d)FTPT3、(d)NaM、(d)5SICS、(d)FEMO、(d)FIMO及/或(d)MMO2及天然核酸之選擇性引子延伸反應性。
實例10：產生具有擴展遺傳密碼符號之細胞
本文所描述之實驗說明八種不同NTT在大腸桿菌C41(DE3)中之基於質體的表現(表9A)。檢查[α-32P]-dATP之吸收，其作為非天然三磷酸酯之替代物(圖5)。dATP係藉由來自三角褐指藻(PtNTT2)及假微型海鏈藻(TpNTT2)之NTT有效地轉運至細胞中。出乎意料地，發現來自阿莫氏原披衣菌(PamNTT2及PamNTT5)之NTT亦輸入dATP。PamNTT2與PamNTT5兩者均展現dATP之可量測吸收(圖5)。PtNTT2顯示最高活性，且其與TpNTT2兩者均展現較寬特異性，從而使得其成為用於輸入核苷酸三磷酸酯之推定NTT。
含有d5SICS-dNaM之DNA之複製已用不同聚合酶活體外證實，但尤其為用A族聚合酶(諸如大腸桿菌DNA聚合酶I(Pol I)之克列諾片段)證實。儘管大多數大腸桿菌基因組係藉由Pol III複製，但質體係集中於藉由Pol I之UBP複製而經工程化。附屬質體(pACS)係藉由插入PtNTT2基因而衍生自pCDF-1b(圖10)。資訊質體(pINF)係藉由用dNaM替代dT505(pUC19定位(map)之標準編號可在http：//www.thermoscientificbio.com/uploadedFiles/Resources/pUC18-pUC19-map.pdf下載獲得)而衍生自pUC19。此將UBP 362nts置放於ColE1起點下游(圖10)。質體pINF(亦即資訊質體)係由pUC19藉由用dNaM替代dT505使用固相合成及環狀延伸PCR來建構(圖3A及圖10)。用相對於d5SICS之類似物(dTPT3)配對之dNaM替代在位置505處之dA-dT對。此將UBP定位於ColE1複製起點之下游，其中主要股複製係藉由Pol I介導且在TK-1 Okazaki處理位點內，其中滯後股合成亦預期由Pol I介導。合成pINF係使用d5SICS類似物建構，因為若複製活體內發生，則該類似物應有效地經d5SICS替代，且因此使得有可能將活體內複製pINF與合成pINF區別開來。
為判定大腸桿菌可否使用輸入之非天然三磷酸酯以穩定地繁殖pINF，C41(DE3)細胞首先用編碼PtNTT2之pCDF-1b質體(下文稱為 pACS，對於附屬質體，圖10，且參見下文Seq ID No.1)轉化，且在含有0.25mM之兩種非天然三磷酸酯、50mM KPi及1mM IPTG之培養基中生長以誘發轉運子產生。細胞隨後用pINF轉化，且在1h回收時間段之後，用補充有安比西林之相同培養基將培養物稀釋10倍，且經由培養物濁度監測生長(圖3A及表9A及表9B)。
所描繪NTT之受質特異性(K M，μM)
如藉由生長15h及19h之後pINF與pACS之莫耳比測定的pINF之OD600及相對質體複本數。X=NaM且Y=5SICS。
作為對照物，細胞亦用pUC19轉化，或在不存在IPTG或非天然三磷酸酯之情況下生長。在IPTG存在下生長較慢，其可能歸因於轉運子誘發之作用。然而，添加d5SICSTP及dNaMTP在不存在pINF的情況下僅導致生長之輕微下降，且其在pINF存在下消除生長滯後(圖3B)。此指示非天然三磷酸酯無毒性且為pINF之有效複製所需要的。
為判定pINF是否在保持UBP之情況下經繁殖，吾人在生長15h之 後自細胞回收質體。引入UBP僅導致質體複本數之較小減小(<2倍，表9B)，且基於回收質體量及轉化效率，pINF在生長期間經擴增2×107倍(約24次倍增)。
為測定UBP保持力之程度，回收質體經消化，經去磷酸化為單一核苷，且藉由LC-MS/MS對其分析。儘管dNaM之偵測及定量藉由其不良斷裂效率及較低產物離子計數(在背景技術中)經排除，但可清楚地觀測到d5SICS之信號(圖3C)。外部校準曲線係使用非天然核苷建構且藉由確定該非天然核苷在合成寡核苷酸中與dA之比率而經證實(表7)。使用所得校準曲線，吾人確定在回收pINF中dA與d5SICS之比率為1106比1，當與1325比1之預期比率相比時，其表明存在大致每一質體一個UBP。在對照實驗(其中轉運子未經誘發，或未向培養基添加非天然三磷酸酯，或使用pUC19而非pINF)中未偵測到d5SICS(圖3C)，從而表明其存在係由UBP之複製導致而不由非天然三磷酸酯相對於天然核苷酸之誤插入導致。重要地，由於合成pINF包含d5SICS之類似物，且d5SICS僅作為添加至培養基中的三磷酸酯經提供，因此其在pINF中之存在確認活體內複製。
圍繞核苷酸505之pINF區域隨後在d5SICSTP及生物素標記dNaMTP類似物存在下經PCR擴增。藉由抗生蛋白鏈菌素凝膠移位之分析顯示，67%之擴增DNA包含生物素(圖3D)。在對照實驗(其中轉運子未經誘發，或未向培養基添加非天然三磷酸酯)中未偵測到移位，從而表明移位需要非天然三磷酸酯之輸入。類似地，對於自經相同處理之對照細胞(其用pUC19轉化)分離之DNA未觀測到凝膠移位，從而表明移位係由UBP之保持力導致而不由非天然三磷酸酯相對於天然核苷酸之誤插入導致。基於由對於DNA(含有dNaM)之對照混合物之擴增產物所觀測到的移位而建構的校準曲線(或其完全天然對應物(方法))，所觀測到之凝膠移位對應於86%之UBP保持力，其繼而對應 於99.4%(0.994=0.86)之保真度(每一倍增之保持力)。
為確認UBP之較高保持力，在d5SICSTP及dNaMTP存在下PCR擴增pINF之相同區域，且藉由桑格定序分析產物(圖3E)。UBP之存在導致定序反應之突然終止，且因此UBP保持力之程度可由在UPB併入位點之前及其之後在層析圖中之峰之振幅之比率來定量。自在不具有PtNTT2誘發或未經添加非天然三磷酸酯之情況下生長的培養物分離的pINF之定序層析圖未顯示終止。相反，自在具有PtNTT2誘發或經添加非天然三磷酸酯之情況下生長的細胞分離的pINF之擴增產物之層析圖在預期位置處顯示突然終止。在通讀偵測之下限經評估為5%(對應於95%保持力)之情況下，此使得UBP複製之保真度之下限為99.7%。來自兩組實驗之保真度估計值對應於約10-3之錯誤率，其與一些聚合酶與天然DNA之固有錯誤率類似。
UBP在15h生長時間段內之較高保持力指示其不被DNA修復路徑有效地切除。為進一步支持此結論，吾人重複了實驗，但監測UBP保持力、細胞生長及非天然三磷酸酯分解高達6天(圖4)。
在生長15h及19h時，培養物分別達到約0.9及約1.2之OD600，且d5SICSTP與dNaMTP兩者僅分解至其初始0.25mM濃度之17%至20%及10%至16%(圖12A)。與上述實驗一致，UBP在15h之後的保持力分別為97±5%及>95%(如藉由凝膠移位及定序所測定)，且在19h之後為91±3%及>95%。隨著培養物進入生長停滯期且三磷酸酯完全分解，質體損失開始與複製競爭(圖12B及圖12C)，但即使此時，UBP之保持力在3天及6天時仍分別保持在約45%及約15%。此外，當d5SICS-dNaM損失時，其經dA-dT替代，其與Kf之突變光譜一致。最終，保持力相對於時間曲線之形狀為生長相對於時間曲線之形狀的鏡像。綜合而言，此等資料強烈支持以下結論：UBP之損失係由複製介導之誤配(其在非天然三磷酸酯分解之後為不可避免的)導致且不由DNA修復 路徑之活動導致。
實例11：具有增加的NTT活性之細胞之定向進化
在天然dNTP及一或多種非天然核酸存在下培育含有內源性NTT之細胞。與細胞接觸之天然dNTP中之一或多者之濃度隨時間及生長緩慢降低。與細胞接觸之非天然核酸中之一或多者之濃度隨時間及生長緩慢增加。使存活細胞經受另外輪之曝露以增加非天然核酸之濃度且減小天然dNTP之濃度。分析存活細胞、溶解物或純化NTT之結合動力學、非天然核酸之輸入、複製及/或併入。使用PCR及定序方法進一步分析展現非天然核酸之增加的輸入、複製及/或併入(與含有內源性NTT之初始細胞相比)的細胞池之NTT變體。細胞及/或NTT變體序列之資訊用於產生重組蛋白質及核酸試劑以用於在如上文所描述之宿主細胞中表現。此外，遺傳工程化細胞經工程化，其與含有內源性NTT之初始細胞相比含有非天然核酸之增加的輸入活性、複製活性及/或併入。
實例12：具有對於非天然核酸之聚合酶活性的細胞之定向進化
在天然dNTP及一或多種非天然核酸存在下培育含有內源性聚合酶之細胞。與細胞接觸之天然dNTP中之一或多者之濃度隨時間及生長緩慢降低。與細胞接觸之非天然核酸中之一或多者之濃度隨時間及生長緩慢增加。使存活細胞經受另外輪之曝露以增加非天然核酸之濃度且減小天然dNTP之濃度。分析存活細胞、溶解物或純化聚合酶之非天然核酸複製及/或併入。使用PCR及定序方法進一步分析展現非天然核酸之增加的輸入、複製及/或併入(與含有內源性聚合酶之初始細胞相比)的細胞池之聚合酶變體。細胞及/或聚合酶變體序列之資訊用於產生重組蛋白質及核酸試劑以用於在如上文所描述之宿主細胞中表現。此外，遺傳工程化細胞經工程化，其與含有內源性聚合酶之初始細胞相比含有非天然核酸之增加的聚合酶活性、複製活性及/或併 入。
其他實施例
除非另外解釋，否則本文中所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。以下參考文獻含有本文中可用之方法及組合物之實施例：由Merck Research Laboratories,2006(ISBN 0-911910-18-2)公佈之The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第18版；由Jones & Bartlett Publishing,2007(ISBN-13：9780763740634)公佈之Benjamin Lewin,Genes IX；由Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)公佈之Kendrew等人(編)，The Encyclopedia of Mol.Biology；及由VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)公佈之Robert A.Meyers(編)，Mol.Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference。
本發明之標準程序例如在以下各者中描述：Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1989)；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986)；或Methods in Enzymology：Guide to Molecular Cloning Techniques第152卷，S.L.Berger及A.R.Kimmerl(編)，Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987)。Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)(Fred M.Ausubel等人編，John Wiley and Sons,Inc.)、Current Protocols in Protein Science(CPPS)(John E.coligan等人編，John Wiley and Sons,Inc.)、Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.coligan等人編John Wiley and Sons, Inc.)、Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等人編，John Wiley and Sons,Inc.)、R.Ian Freshney之Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique,Publisher：Wiley-Liss；第5版(2005)及Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology，第57卷，Jennie P.Mather及David Barnes編，Academic Press，第1版，1998)，其均以全文引用之方式併入本文中。
本文中揭示可用於本文所揭示之方法及組合物、可與本文所揭示之方法及組合物結合使用、可用於製備本文所揭示之方法及組合物或作為本文所揭示之方法及組合物之產物的分子、物質、組合物及組分。應理解，當揭示此等物質之組合、子組、相互作用、群等時，且在無法明確揭示此等分子及化合物之各各種個別及集體組合及排列之特定提及時，其中各者均在本文中特異性地涵蓋及描述。舉例而言，除非特定地相反指示，否則若揭示及論述核苷酸或核酸及論述多種可對包括核苷酸或核酸之多種分子作出之修飾，則核苷酸或核酸之每一組合及排列及可能之修飾均特定地經涵蓋。此概念適用於本申請案之全部態樣，包括(但不限於)在製造及使用所揭示分子及組合物之方法中之步驟。因此，若存在多個可進行之額外步驟，則應理解，此等額外步驟中之每一者可與所揭示方法之任何特定實施例或實施例之組合一起進行，且各該組合特定地經涵蓋且應將其視為經揭示的。
在以上說明書中提及之所有公開案、專利及專利申請案均特此以引用之方式併入。所描述的本發明之方法、組合物及套組之各種修改及變化形式將在不背離本發明之範疇及精神之情況下為熟習此項技術者顯而易見。儘管已結合特定實施例描述本發明，但應理解如所主張之本發明不應過度限制於該等特定實施例。實際上，熟習此項技術者所顯而易見的對於用於所描述之進行本發明之模式的各種修改意欲在本發明之範疇內。其他實施例係在申請專利範圍中。
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<223> 合成聚核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成聚核苷酸
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<213> 人工序列
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<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> dNaM
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<223> 合成聚核苷酸
<400> 50

Claims (17)

  1. 一種細胞，其包含：至少一個非天然鹼基對(UBP)，其中該至少一個UBP包含第一非天然核苷酸及第二非天然核苷酸，及編碼藻類核苷酸三磷酸酯轉運子(NTT)、植物NTT或細菌NTT之異源核酸，其中該第一及第二非天然核苷酸之至少一者為輸入之非天然核苷酸。
  2. 如請求項1之細胞，其中該異源NTT將該第一非天然核苷酸或該第二非天然核苷酸轉運至該細胞中。
  3. 如請求項1之細胞，其中該NTT係來自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum，Pt)NTT2、假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana，Tp)NTT2、阿莫氏原披衣菌(Protochlamydia amoebophila，Pam)NTT2、阿莫氏原披衣菌(Pam)NTT5或其組合。
  4. 如請求項1之細胞，其中該NTT係TpNTT1、TpNTT2、TpNTT3、TpNTT4、TpNTT5、TpNTT6、TpNTT7、TpNTT8、PtNTT1、PtNTT2,PtNTT3、PtNTT4,PtNTT5、PtNTT6、GsNTT、AtNTT1,AtNTT2、CtNTT1、CtNTT2、PamNTT1、PamNTT2、CcNTT或RpNTT1。
  5. 如請求項1之細胞，其中該NTT編碼與SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、14、16、18、19、20、22或24中之任一者至少60%一致的胺基酸序列。
  6. 如請求項1之細胞，其中與各別野生型細胞相比，該細胞包含增強輸入非天然核苷酸、增強併入非天然核苷酸至該細胞之核酸中，或減少降解非天然核酸。
  7. 如請求項6之細胞，其中該細胞進一步包含至少一個模板UBP，其包含至少一種非天然模板核酸。
  8. 如請求項7之細胞，其中該第一或第二非天然核苷酸包含非天然鹼基。
  9. 如請求項8之細胞，其中該非天然鹼基係選自由以下各者組成之群：2-胺基腺嘌呤-9-基；2-胺基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-硫尿嘧啶；2-硫基-胸腺嘧啶；2-硫胞嘧啶；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及烷基衍生物；2-胺基-腺嘌呤；2-胺基-丙基-腺嘌呤；2-胺基吡啶；2-吡啶酮；2'-去氧尿苷；2-胺基-2'-去氧腺苷；3-去氮鳥嘌呤；3-去氮腺嘌呤；4-硫基-尿嘧啶；4-硫基-胸腺嘧啶；尿嘧啶-5-基；次黃嘌呤-9-基(I)；5-甲基-胞嘧啶；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；5-溴及5-三氟甲基尿嘧啶及胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶；5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基-尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-尿嘧啶；5-取代、5-鹵基、5-取代嘧啶；5-羥基胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-氯胞嘧啶；氯化胞嘧啶；環胞嘧啶；胞嘧啶阿拉伯糖苷；5-氟胞嘧啶；氟嘧啶；氟尿嘧啶；5,6-二氫胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；羥基脲；碘尿嘧啶；5-硝基胞嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-氟尿嘧啶及5-碘尿嘧啶；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-烷基衍生物；6-氮雜嘧啶；6-偶氮-尿嘧啶；6-偶氮胞嘧啶；氮雜胞嘧啶；6-偶氮-胸腺嘧啶；6-硫基-鳥嘌呤；7-甲基鳥嘌呤；7-甲基腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤；7-去氮鳥苷；7-去氮-腺嘌呤；7-去氮-8-氮雜鳥嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤；8-氮雜腺嘌呤；8-鹵基、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基及8-羥基取代腺嘌呤及鳥嘌呤；N4-乙基胞嘧啶；N-2取代嘌呤；N-6取代嘌呤；O-6取代嘌呤；彼等增加雙螺旋體形成之穩定性者；通用核酸；疏水性核酸；混雜核酸；尺寸擴展核酸；氟化核酸；三環嘧啶；啡噁嗪胞嘧啶核苷([5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)；啡噻嗪胞嘧啶核苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G-鉗結構物；啡噁嗪胞嘧啶核苷(9-(2-胺基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)；咔唑胞嘧啶核苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞嘧啶核苷(H-吡啶并[3',2'：4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；次黃嘌呤；黃嘌呤；4-乙醯胞嘧啶；5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶；5-羧甲基胺基甲基-2-硫尿苷；5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶；二氫尿嘧啶；β-D-半乳糖基Q核苷；肌苷；N6-異戊烯基腺嘌呤；1-甲基鳥嘌呤；1-甲基肌苷；2,2-二甲基鳥嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鳥嘌呤；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N6-腺嘌呤；7-甲基鳥嘌呤；5-甲基胺基甲基尿嘧啶；5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶；β-D-甘露糖基Q核苷；5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶；5-甲氧基尿嘧啶；2-甲基硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5氧基乙酸；懷丁氧苷(wybutoxosine)；假尿嘧啶；Q核苷(queosine)；2-硫胞嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯；尿嘧啶-5-氧基乙酸；5-甲基-2-硫尿嘧啶；3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶；(acp3)w及2,6-二胺基嘌呤及彼等嘌呤或嘧啶鹼基經雜環置換者。
  10. 如請求項8之細胞，其中該非天然鹼基係選自由以下各者組成之群：
    Figure TWI638047B_C0001
    其中R為官能基。
  11. 如請求項10之細胞，其中該官能基係選自由以下各者組成之群：親和力標籤，諸如生物素、螢光團；烷基；烯基；炔基；苯基；苄基；鹵基；羥基；羰基；醛；鹵甲醯基；碳酸酯；羧酸酯；羧基；酯；甲氧基；氫過氧基；過氧基；醚；半縮醛；半縮酮；縮醛；縮酮；原酸酯；亞甲基二氧基；原碳酸酯；甲醯胺；一級胺；二級胺；三級胺；一級氯胺酮；二級氯胺酮；一級醛亞胺；二級醛亞胺；醯亞胺；疊氮化物；偶氮；氰酸酯；異氰酸酯；硝酸酯；腈；異腈；亞硝基氧基；硝基；亞硝基；吡啶基；硫氫基；硫化物；二硫化物；亞磺醯基；亞磺酸基；磺酸基；硫氰酸酯；異硫氰酸酯；碳硫醯基；膦基；膦醯基；磷酸酯；二羥硼基；
    Figure TWI638047B_C0002
    酸酯、二取代硼酸(borino)、二取代硼酸酯(borinate)及其組合。
  12. 一種產生遺傳修飾細胞之方法，其包含：(a)提供展現第一非天然核苷酸之野生型輸入量的細胞；及(b)將異源NTT引入至細胞中，從而與該第一非天然核苷酸輸入至在缺乏該異源NTT下展現該第一非天然核苷酸之野生型輸入量之相當(equivalent)細胞中之量相比，增強該第一非天然核苷酸之輸入量，其中該異源NTT係藻類NTT、植物NTT或細菌NTT，其中在該細胞中該第一非天然核苷酸與第二非天然核苷酸形成UBP。
  13. 如請求項12之方法，其進一步包含使該包含該異源NTT之細胞與該第一非天然核苷酸接觸。
  14. 如請求項12之方法，其中該包含該異源NTT之細胞進一步包含至少一個包含非天然模板核酸之模板UBP。
  15. 一種將非天然鹼基對(UBP)併入至細胞中之方法，其包含；(a)使包含異源NTT之細胞與非天然核苷酸接觸；及(b)培養該細胞一定時間段；其中該異源NTT將該非天然核苷酸轉運至該細胞中，其中該異源NTT係藻類NTT、植物NTT或細菌NTT，且其中該非天然核苷酸於該細胞中形成至少一個UBP。
  16. 如請求項15之方法，其中該包含該異源NTT之細胞進一步包含至少一個包含非天然模板核酸之模板UBP。
  17. 一種遺傳工程化細胞之方法，其包含：(a)使包含異源NTT之細胞與液體接觸，該液體包含：(i)一定濃度之非天然核酸，及(ii)一定濃度之天然核酸，其中該異源NTT係藻類NTT或植物NTT；(b)培養該細胞一定時間段；(c)增加該非天然核酸之濃度與該天然核酸之濃度的比率；及(d)重複(b)及(c)一或多次。
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