JPH04126084A - 蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 産業上の利用分野 本発明は、いわゆるシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列およびそれを利用した蛋白質の遺伝子工学的な製
造法に関する。より詳細には、バチルス・プレビス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｂｒｅｖｊｓ）を宿主として用いる
蛋白質の製造法およびそれに必要なりＮＡ配列に関する
。

従来の技術とその課題 組換えＤＮＡ技術を用いて異種蛋白質を微生物等で生産
させる方法は、現在医薬品などの製造で多く用いられて
いる手法である。

大腸菌はこの様な方法に宿主として最も一般的に用いら
れているものであるか、大腸菌などでは通常、産生され
た異種蛋白質は細胞内に留る。従って異種蛋白質の精製
のためには、菌体を破壊し多くの大腸菌由来の蛋白質等
を取り除く必要がある。また、限られた細胞内で多量に
産生された異種蛋白質は多くの場合封入体を形成してし
まい、この異種蛋白質の活性を再生させるためにはしば
しば多くの労力を必要とする。

他方、枯草菌、酵母などを宿主として用いた系では、産
生された異種蛋白質か一般に宿主細胞外へ分泌されてそ
の回収か容易であるという利点かある。枯草菌などが宿
主としてこのような利点を有するのは、宿主菌の遺伝子
か特定の遺伝情報を持っていて目的とする蛋白質をいわ
ゆるシグナルペプチドと呼ばれるペプチド鎖の結合した
前駆体としていったん産生じ、これか細胞膜を通過して
細胞外またはべりプラズムに分泌され、その際にシグナ
ルペプチド鎖か切断されて成熟蛋白質となるという機構
によるとされる。

バチルス属細菌を用いた系の例としては、最適培養条件
下で１．２ｇ／ｌ　もの蛋白質を培地中に分泌するバチ
ルス・プレビス４７　（Ｓ、　Ｕｄａｋａ、（Ｉ９７Ｂ
）Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、　４０，５２
３−５２８＋　Ｓ、　Ｍｉｙａｓｈｊｒｏ。

Ｈ，Ｅｎｅｉ、　Ｋ、　Ｔａｋｊｎａｍｉ、　Ｙ、　）
ｌｉｒｏｓｅ、　Ｔ、　Ｔｓｕｃｈｉｄａａｎｄ　Ｓ、
　Ｌｌｄａｋａ（＋９８０）Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｗ、　４４゜２２９７−２３０３　）を宿主と
し、この菌株か分泌する蛋白質のひとっであるＭＷＰを
コードする遺伝子のプロモーターおよびシグナルペプチ
ドをコードする　ＤＮＡを、ヒト上皮成長因子などの外
来性遺伝子と連結し、バチルス・プレビス４７に導入す
ることにより、培地中に多量の外来遺伝子産物を分泌さ
せることに成功した例か報告されている（　Ｈ，Ｙａｍ
ａｇａｔａ、　ｅｔ、ａｌ、（Ｉ９ｇ９）　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｊ、ＵｓＡ　８Ｂ、３５８９−３５９３
　）。

しかしなから、このバチルス・プレビス４７は、少量な
がら蛋白質分解酵素を菌体外に分泌するため、産生され
た外来性遺伝子産物が、培地中で分解されてしまうとい
う可能性か存在した。

［発明の概要］ 本発明は、上記問題点を解決することを目的とし、蛋白
質分解酵素があまり分泌されていない培養初期に分泌さ
れる蛋白質ＢＢＲＰ４２を見出だし、この蛋白質をコー
ドする遺伝子の制御部位を利用した発現系を構築するこ
とにより、この目的を達成しようとするものである。

要旨 即ち、本発明はます、シグナルペプチドをコートするＤ
ＮＡに関するものであって、下記の配列（Ｉ）で実質的
に表されるシグナルペプチドをコートする塩基配列から
なるもの、である。

Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｍ
ｅｔ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｍｅｌ−Ｇｌｙ−
Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−＾１　ａ−Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　ｌ　−
Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｙ−３ｅｒ−１］　
ｅ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　ｌ　ａ−Ｍｅｔ−＾
１ａまた本発明は、発現ヘクターに関するものであり、
前記のシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、その下
流側末端に連結された所望の異種蛋白質をコードするＤ
ＮＡとを組込み、かつ、これら外来性遺伝子の発現に必
要なりＮＡを持たせたも（Ｉ） のであることを特徴とするもの、である。

さらに本発明は、所望の蛋白質の製造法に関するもので
あって、本発明によるヘクターで宿主細胞を形質転換し
、該形質転換体を培養することにより所望の蛋白質を培
地中に分泌させることを特徴とするもの、である。

効果 本発明によるシグナルペプチドをコードするＤＮＡと所
望の異種蛋白質をコードするＤＮＡとを連結させて発現
させることにより、この所望の異種蛋白質を宿主細胞外
に分詑１生産させることができる。

特に、宿主としてバチルス属細菌を用いた場合、バチル
ス属由来の蛋白質分解酵素よりも先に所望の異種蛋白質
が培地中に産生されるため、高収率で均質な蛋白質の生
産が可能となる。

［発明の詳細な説明コ シグナルペプチド 本発明によるＤＮＡは、アミノ酸配列か前記配列（Ｉ）
で実質的に表されるシグナルペプチドをコードする塩基
配列を有するものである。

このように本発明によるＤＮＡは、これかコートするア
ミノ酸配列を有するペプチドによって特定されている。

このペプチドは、細胞内で産生された生体産物を細胞外
へ分泌させる作用を有しているいわゆるシグナルペプチ
ドであって、そのアミノ酸配列か実質的に前記配列（Ｉ
）で表されるものである。ここで、［アミノ酸配列か実
質的に前記配列（Ｉ）で表されるもの」とは、このペプ
チドかいわゆるシグナルペプチドとしての作用を有する
限りアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加なと
かあってもよいことを意味する。

この配列（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は、バチルス・
プレビス４７を培養した際に、その培養初期に培地に分
泌される蛋白質であるＢＢＲＰ４２をコートする遺伝子
の解析に基づき完成されたものである。

ＢＢＲＰ４２は、下記の性状を有する新規蛋白質である
。

■５ＤＳ−ＰＡＧＥによって約４２０００の分子量を示
す。

■Ｎ末端の４番目から２００番目でのアミノ酸配列か下
記の通りである。

Ａ　ｌ　ａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈ　ｒ−８ｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａｎｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　Ｉ　ｕ
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ■バ
チルス・プレビス４７由来の蛋白質であるＭＷＰよりも
培養初期に培地中に分泌される。

シグナルペプチドをコードするＤＮＡ 本発明によるシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、
前記配列（Ｉ）をコードする塩基配列を有するもの、並
びに前記のようなシグナルペプチドとしての作用を有す
るペプチドのアミノ酸配列の変化に対応する塩基配列を
有するものである。

本発明によるＤＮＡの典型的な配列は、下記の配列（Ｉ
Ｉ）のものである。

ＡＴＧ−ＴＴＴ−ＡＧＣ−ＡＡＡ−ＡＣＡ−ＡＡＡ−＾
ＴＧ−ＧＧＡ−ＡＴＧ−ＣＴＧ−＾ＴＧ−ＧＧＡ−ＡＣ
Ｇ−ＡＴＧ−ＧＧＡ−ＧＴＡ−ＧＴＴ−ＴＴＧ−ＡＧＴ
−ＣＴＧ−（ＩＩ　）ＧＧＴ−ＡＧＣ−ＡＴＡ−ＧＧＣ
−ＧＧＡ−ＧＣＪ−ＡＴＧ−ＧＣＲ（ここで、ｊはＡ又
はＣを表わし、ＲはＡ又はＧを表わす） ペプチドのアミノ酸配列か与えられれば、それをコード
する塩基配列はいわゆる遺伝暗号表を参照して容易に定
まり、また前記したアミノ酸配列をコードする種々の塩
基配列を適宜選択することかできる。従って、本発明に
よるシグナルペプチドをコードするＤＮＡとは、その塩
基配列が前記配列（ｎ）であるもの並びにその縮重異性
体である。ここで、「縮重異性体」とは、縮重関係にあ
るコドンか使用されている点以外は塩基配列か同一で同
一のペプチドをコートするＤＮＡを意味するものとする
。

シグナルペプチドをコートするＤＮＡの取得本発明によ
るＤＮＡは、その塩基配列が定まっていることから、そ
のＤＮＡを取得するひとつの手段は、核酸合成の方法に
したかって製造することである。

また本発明によるＤＮＡは、バチルス・プレビスの遺伝
子から切り出す方法も利用可能である。

そのような方法の具体例としては、バチルス・プレビス
４７由来のゲノムライブラリーから、遺伝子工学の分野
で慣用されている方法、例えば適当なプローブによるハ
イブリダイセイゼイション法、により取得することも可
能である。そのような方法の具体例については後記実験
例を参照されたい。

シグナルペプチドをコードするＤＮＡの用途本発明によ
るＤＮＡは、シグナルペプチドをコートするＤＮＡであ
り、従ってこのＤＮＡと、このＤＮＡの下流側末端に連
結された所望の蛋白質をコードするＤＮＡとを宿主細胞
内で複製可能かつ両遺伝情報か発現可能な状態で含むＤ
ＮＡ、特に発現ベクター、の形態として宿主細胞の形質
転換を行えば、宿主細胞外に産生蛋白質を得ることかで
きる。

特に本発明によるＤＮＡをバチルス属を宿主とする宿主
−ベクター系において使用すべきベクターとして構築し
、これによりバチルス属細菌、特こバチルス・プレビス
、を形質転換して利用するのに適している。即ち、本発
明によるＤＮＡは、バチルス属細菌由来の蛋白質分解酵
素か培地に分泌されるより先に、異種蛋白質を培地に産
生させることかできるからである。

本発明による発現ベクター 従って、本発明による発現ベクターは、前記のシグナル
ペプチドをコートするＤＮＡと、その下流側末端に結合
された所望の外来性蛋白質をコードするＤＮＡとを組込
み、かつ、これら外来性遺伝子の発現に必要なりＮＡを
持たせたものであることを特徴とするもの、である。

特に本発明による発現ベクターは、前記した理由により
、バチルス属細菌を宿主とする宿主−ベクター系におい
て使用すべき発現ベクターとして構築されることか好ま
しい。

本発明によるベクター構築のための手順ないし方法は、
分子生物学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において
慣用されているものを用いればよい。

例えば、本発明によるシグナルペプチドをコドするＤＮ
Ａとして、前記した蛋白質ＢＢＲＰ４２由来のＤＮＡを
そのまま利用しようとする場合、次のような操作により
、本発明によるベクタを得ることかできる。即ち、前述
したＢＢＲＰ４２の遺伝子ライブラリーからスクリーニ
ングにより得られたＤＮＡを、大腸菌などで複製可能な
ベクターに組込みクローニングし、続いて、得られたＤ
ＮＡを、その下流側末端に所望の異種蛋白質をコードす
るＤＮＡを連結した形で、予定″の宿主で複製可能なベ
クターに組込むことにより、本発明によるベクターを得
ることができる。

バチルス属細菌を宿主として用いた場合のバチルス属細
菌で複製可能なベクターとしては、ｐＴＡ１０６０、ｐ
ＵＢｌｌｏ、ｐＥ１９４、ｐｃ１９４などのプラスミド
およびこれら由来のＤＮＡか挙げられる。

さらに、ベクターとして、遺伝子ライブラリーから得ら
れたシグナルペプチドをコードするＤＮＡのクローニン
グの除用いる微生物、例えば大腸菌、と蛋白質産生の際
宿主として用いる微生物、例えばバチルス属細菌、のい
ずれでも複製可能なベクター、すなわちシャトルベクタ
ー、を用いることも、ＤＮＡフラグメントを移す操作を
省略てきる点で好ましい。大腸菌とノ１チルス属細菌の
シャトルベクターとしては、例えば、ｐ　ＨＰ　１３　
（Ｐ、Ｈａｉｍａ、Ｓ、Ｂｒｏｎ、Ｇ、Ｖｅｎｅｍａ、
Ｍｏ１．Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、２０９，３３５−３４２．１９８７）　、
などのプラスミドを用いる二のかできる。

また、これらのプラスミドは、選択マーカを含むのか必
要であり、それらの選択マーカーの例としてはクロラム
フェニコール耐性、エリスロマインン耐性、ネオマイシ
ン耐性、テトラサイクリン耐性、ストレプトマイシン耐
性などが挙げられる。

本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主細胞に
導入して所望の異種蛋白質を分泌発現させるためには、
シグナルペプチドをコードするＤＮＡおよび異種蛋白質
をコードするＤＮＡからなる外来性遺伝子の発現に必要
なりＮＡ、即ちプロモーター、転写開始信号、リボゾー
ム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転
写調節信号や翻訳調節信号なと、を有していなければな
らない。

これらの各因子は、既に起源ベクターに含まれている場
合かあり、この場合には二の起源ベクターの調節因子を
そのまま用いることかできる。また前記したように蛋白
質ＢＢＲＰ４２からそのままシグナルペプチドをコード
するＤＮＡを利用する場合、シグナルペプチドをコード
するＤＮＡのみならず、プロモーターなどの制御領域も
クローニングして利用するのか有利である。

宿主としてバチルス属細菌を用いた場合、培養初期にこ
れら外来性遺伝子を発現させるプロモーターか組込まれ
てなることか特に好適である。好ましいプロモーターの
具体例としては、下記の塩基配列（ｍ）の少なくとも３
０塩基対以上を有してなるものか挙げられる。

ＴＡＣＧＡＴＴＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＣＴＴ
ＴＴＴＴＣＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＡＴＣＴＡＡＡＡＡＴ
ＡＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＣＴＴＧＧＴＣＴＴまた、この
外来性遺伝子の発現に必要なりＮＡとして転写開始点と
翻訳開始点との間に、下記の塩基配列（■）で表される
翻訳調節信号を含んでなることが好適である。

（■） ＴＡＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＣＴＡＣＡＣＧ
ＡＧＣＡＴＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＡ
Ｔ　　　　　　　　　　　　（■）本発明において産生
しうる異種蛋白質は、特に制限されない。具体例として
は、バチルス・プレビス４７を用いて外来性蛋白質を産
生した前記文献記載のｈ−ＥＧＦの他、インターフェロ
ン、各種インターロイキン、インスリン、ＮＧＦ、ＴＮ
Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、血液凝固因子節■因子、各種疾患の
特異的な抗原蛋白質などが挙げられる。

所望の蛋白質の製造法 本発明による所望の蛋白質の製造法は、前記した本発明
による発現ベクターで宿主微生物を形質転換し、該形質
転換体を培養することにより所望の蛋白質を培地中に分
泌させることを特徴とするものであることは、前記した
通りである。

宿主微生物としては細菌、特にバチルス属細菌、か用い
られる。好ましいバチルス属細菌の例としては、バチル
ス・プレビスか挙げられる。バチルス・プレビスの具体
例としては、バチルス・プレビス４７　（ＦＥＲＭ　　
Ｐ’−７２２４）　、同４８１、同１４４、同８９９な
どか挙げられる。

形質転換の方法は、この分野で慣用されているものを用
いればよい。

上記のようにして得られる形質転換体を培養すれば微生
物の細胞外（即ち培養液中）に、所望の外来性蛋白質を
産生蓄積する。

形質転換体の培養ないし培養条件は、使用宿主微生物に
対するそれと本質的に変わらない。また、培養液からの
所望の蛋白質の回収、精製も常法に従って行なうことか
できる。

［実　験　例］ 実験例１．　　バチルス・プレビス４７の培養初期上清
中の蛋白質の検索 バチルス・プレビス４７をＴｌｕｒａ培地（０，３％　
ＫＨＰＯｏ、２％　（ＮＨ４）２Ｓ０４．２　　４ゝ ０．０２５％　Ｍｇ５０　　・７Ｈ２０，０，３％ペプ
トン、０．２％　肉エキス、２％　グルコース、０，２
％　尿素及び０．０１％ウラシル）中て一夜培養した。

菌液を同しＴｌｕｒａ培地で１００倍に稀釈し、６６０
ｒ＋ｍに於ける吸光度を測定しながら３７℃で振とう培
養をおこなった。２〜１０時間後の培養液から菌体を遠
心分離により除き、その上清に９０％飽和となるように
硫安を加え４℃で静置した。その後遠心分離を行い、こ
れによって回収された沈澱のうち、吸光度か０．０１の
培養液１　ｍｌに相当する量についてＬａｅｍｍ　Ｉ　
ｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　１９７０．２２７：６８０
−６８５＞に従ってＳＤＳポリアクリルアミドケル電気
泳動を行った。ケルをクーマシブリリアンプルーて染色
したところ、すてに報告のあるＭＷＰ、ＯＷＰ　（Ｈ，
Ｙａｒｔｌａｄａ　ｅｔ。

ｅｌ、（Ｉ９８１）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
　１４８，３２２−３３２）以外に、分子量的４２００
０の蛋白質のバンドか培養初期の上清に見つかり（第１
図参照）、この蛋白質をＢＢＲＰ４２と名付けた。

実験例２．　　　ＢＢＲＰ４２の精製とＮ端末のアミノ
酸配列の決定 （Ｉ）ＢＢＲＰ４２の精製 バチルス・プレビス４７をｒ＋ｕｒａ培地中て一夜培養
した菌液を実験例］と同しＴｌｕｒａ培地て１００倍に
稀釈し、６６０ｒ＋ｍにおける吸光度か０．７に達する
まで３７℃で振とう培養を行った。

氷冷した菌液に最終濃度１ｍＭになるようにＰＭＳＦ（
ｐｈｅｎｙｌｌｎｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌ
ｕｏｒｉｄｅ）を加え遠心分離によって菌体を除いた。

この上清１リツトルに対して４７４ｇの硫安を加え４℃
で静置した後、遠心分離により沈澱を除いた。この上清
１リツトルに対してさらに１５３ｇの硫安を加え４℃で
静置し、遠心分離により沈澱を回収した。沈澱を５０ｍ
Ｍ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，０）、１０
０ｄ　　ＮａＣｌ溶液に溶解し、５ｅｐ−ｐａｋカート
リッジ（ｗａｔｅｒｓ社）に通し、蛋白質を吸着させ、
同バッファーで洗浄した後、４０％のアセトニトリルで
溶出してから凍結乾燥を行った。この試料は、また相当
量の培地成分を含んでいたのでＢｌｏ−Ｇｅ１　ｐ６０
　　（バイオラット社）を充填したカラムを用いてゲル
ろ過を行いＢＢＲＰ４２を含む分画を集め、０．ＩＭの
炭酸水素アンモニウムに対して透析し、凍結乾燥を行い
アミノ酸配列決定の試料とした。

（２）　　アミノ酸配列の決定 （Ｉ）で得られた蛋白質４０μｇを、アプライドバイオ
システム社のアミノ酸配列分析装置４７７Ａを用いて、
Ｎ端末から２０残基を分析した。その結果Ｎ端末の４番
目から２００番目でのアミノ酸配列か、Ａ　Ｉａ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｎｓ−Ｌｙｓ
Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙであることか分った。

実験例３．　　　ＢＢＲＰ４２をコードする遺伝子のク
ローニングおよび塩基配列の決定 （Ｉ）　　バチルス・プレビス４７のゲノムライブラリ
ーの作成 実験例１において遠心分離した菌体を５０ｍＭＴｒ　ｉ
　５−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，０）　、５０＋ｎＭＥＤＴ
Ａ、１５％　５ｕｃｒｏｓｅに懸濁し、最終濃度５　ｍ
ｇ　／　ｍｌになるようにリゾチームを加え、３７℃で
１５分間インキユヘートした。その後、ＳＤＳおよびプ
ロナーゼＫをそれぞれ最終濃度０．　５％、５０■／ｍ
ｌになるように加え、５５℃で一夜インキユヘートした
。フェノール抽出を数回繰り返し、最後にクロロホルム
で一度抽出し、２倍量のエタノールによってＤＮＡを沈
澱させた。このＤＮＡをＭａｎｊａｔｊｓらの方法（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　１９８２゜Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）に従い、５ａｕ３Ａ１で部分消化し、アガロースゲ
ル電気泳動をおこなった。約２０ｋｂのＤＮＡ断片を含
むゲルを切出しＴＡＥバッフ−ｒ　−（４０ｄ　Ｔｒｉ
ｓ−ａｃｅｔａｔｅ、　　２ｍＭ　　ＥＤＴＡ）と共に
透析チューブに入れ、電気泳動によりＤＮＡをゲルから
溶出させた。この溶液をフェノール抽出した後、エタノ
ールによりＤＮＡを沈澱させた。染色体ＤＮＡＩμｇと
ＢａｍＨＩて切断したλｇｔｌＯＤＮＡ（ストラタシー
ン社）２μｇをエタノールで沈澱させ１０μｍのライゲ
ーションバッファー（６６ｄＴ　ｒ　ｉ　５−ＨＣ１（
ｐＨ７，６）　、６．　６ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭ　
　ＤＴＴ、Ｏ，ｌｄ　　ＡＴＰ）に溶解し、Ｔ４リガー
ゼを加えて　１６℃で一晩インキニヘートした。このう
ちの５μｍをλＤＮＡインビトロバツケイジングキット
、ギガパックコールド（ストラタジーン社製）を用いて
バッケイジングを行った。

（２）　　Ｂ　Ｂ　ＲＰ　４２をコードとする遺伝子を
持つ組換えファージのスクリーニング 前記（Ｉ）で得られたファージのうち、約５０００個を
大腸菌Ｃ６００株の培養液と共に寒天培地にまき、Ｍａ
ｎｉａｔｊｓらの方法０１ｏ１ｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉ
ｎｇ　１９８２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　１ａｂｏｌａｔｏｒｙ）従ってプラークハイブリ
ダイゼーションを行った。

プローブは、実験例２て得られた第４番目から第２０番
目のアミノ酸配列から予測される遺伝子のＤＮＡ配列の
うち、すてにクローニングされているバチルス・プレビ
ス４７由来の蛋白質であるＭＷＰ及びｏｗｐをコードす
る遺伝子（Ｔｓｕｂｏｉ　ｅｔａｔ、、　（Ｉ９８ｇ）
　、　　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７０，９３５）
のコドン使用頻度を参考にして、ＧＣＴＡＡＡＣＣＡＡ
ＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣＣＡＧＴＴＧＡＡＧＴ
ＴＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＧの配列からなる５０塩
基のＤＮＡを合成し、〔γ３２Ｐ〕ＡＴＰ及びＴ４ポリ
ヌレクオチドキナーゼにより標識したものを用いた。そ
の後、プローグと／％イブリダイズする１５個のクーロ
ンが得られた。

（３）　　Ｂ　Ｂ　ＲＰ　４２をコードする遺伝子の塩
基配列の決定 前記（２）で得られたファージＤＮＡについて、Ｅｃｏ
ＲＩで切断後サザンブロットハイプラダイゼーションを
行ったところ、前述のプローブは６、　６ｋｂの断片に
ハイブリダイズした。そこで１つのクローンについて、
そのＥｃｏＲＩ断片をｐＵｃ１８　（宝酒造社製）のＥ
ｃｏＲＩサイトに挿入してＤＮＡを調整し、制限酵素地
図を作成した（第２図）。さまざまな制限酵素によって
切断したＤＮＡについて前述のプローブを用いてサザン
ハイプラダイゼーションを行ったところ、１．７ｋｂの
５ａｃｌ−Ｐｓｔｌ断片にハイブリダイズした。この領
域を含む３．７ｋｂの５ａｌｌ−ｓｐｈ　Ｉ断片をｐＨ
５Ｇ３９９　（宝酒造社製）の５ａｌｌとｓｐｈ　Ｉサ
イトの間に挿入し、得られたプラスミドＤＮＡを５ａｌ
ｌとＫｐｎｌて切断後、エクソヌクレアーゼ■とマング
ビーンヌクレアーゼでＤＮＡを段階的に消化してデレー
ションミュータントを作成した（Ｈｅｊｎｋｏｆｆ　（
Ｉ９８４）、　Ｇｅｎｅ。

２８．３５１−）。各デレーンヨンミュータントのＤＮ
Ａを単離して７−ｄｅａｚａ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ｋ
ｊｔ（Ｌｊｎｉｔｅｄｓｔａｔｅｓ　Ｂｊｏｃｈｅｍｉ
ｅａｌ　ｅｏｒｐｏｌａｔｉｏｎ）を用いて塩基配列の
決定を行った。第３図に、デレーションミュータントの
１つであるｐＢＲＥ−１のＥｃｏＲＩサイトからＨｉｎ
ｄＩ［Ｉサイトまでの塩基配列を示す。塩基配列データ
を解析したところ、第３図に示すように、２３７塩基対
から１６０７塩基対にかけて、４５７個のコドンから成
るオープンリーディングフレームか見つかった。実験例
２て得られた１７個のアミノ酸配列は、このオプンリー
ディングフレームから翻訳したアミノ酸配列の３２残基
から４８残基に見つかった。培地中に見つかるＢＢＲＰ
４２は、２９残基目のアラニンのＮ端末側で切断されて
おり、ここよりＮ端末側か分泌シグナルとして働いてい
ると考えられる。１番から２８番のアミノ酸中には、翻
訳開始のＮｅｔになり得る部分が、６ケ所ある。１番の
Ｎｅｔを翻訳開始部位とした時の構造は、すてに調べら
れているバチルス属分泌シグナルに共通なＮ端末側から
順に、親水性部位−疎水性部位一切断部位からなる構造
とよく一致する。

（４）　　転写開始点の決定 ＢＢＲＰ４２をコードとする遺伝子の転写開始点を決定
するため第３図の２２５塩基対から２４４塩基対までの
配列に相補的な２０塩基のＤＮＡを合成し、プライマー
エクステンションをおこなった（Ｊｏｎｅｓ、　Ｋ、Ａ
、（Ｉ９８５）　Ｃａ１ｌ　４２，５５９−５７２）　
。Ｍ、Ｚ、Ｇｊｌｍａｎらの方法（Ｃｅｌ　Ｉ　、　３
５　、２８５−２９３）に従って分離したバチルス・プ
レビス４７のＲＮＡと、〔γ３２Ｐ）ＡＴＰおよびＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼで標識した上記プライマーを
アニールさせ逆転写酵素を用いて相補鎖を合成した。

この産物を７Ｍ尿素／１０％アクリルアミドゲルゲルで
マーカーと共に電気泳動し、その長さを測定した。オー
トラジオグラフィーの結果、６０塩基と６１塩基のバン
ドが確認でき、このことからＢＢＲＰ４２をコードとす
る遺伝子の転写開始点は、第３図の１８５塩基目のＧと
１８４塩基目のＴであると結論した。１８５番目のＧが
メジャーであり、１８４番目のＴはマイナーである。

実験例４．　発現単位ベクターの構築 実験例３で得られたデレーションミュータントのうち、
第３図に示すＤＮＡ断片を持つプラスミドｐＢＲＥ−１
から、ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌによって、プロモーター、
シグナルペプチド、およびＢＢＲＰ４２のＮ末端領域を
含むＤＮＡ断片を切出し、プラスミドベクターのｐＵｃ
１８のＥｃｏＲＩとＰｓｔｌの間に挿入してｐＢＲＥ−
２を作成した。このｐＢＲＥ−２のうち、Ｂｓｍ１サイ
トとＰｓｔＩサイトの間のＤＮＡを、５　′ ＧＡＴＧＧＧＡＡＣＧＡＴＧＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＴＣ
ＡＧＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＴＡＧＧＧＡＣＴＡＣＣＣ
ＴＴＧＣＴＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＧＡＣ
ＣＣＡＴＣＧＴＡＴＣＣ３′ ３′ ５′ から成る一対の合成りＮＡでおき変えることにより、ｐ
ＢＲＥ−３を作成した。このプラスミドは、ＢＢＲＰ４
２をコードする遺伝子のプロモーターＢＢＲＰ４２のシ
グナルペプチドをコードし、さらに下流にはＮｃｏ　Ｉ
、ＢａｍＨＩ、Ｘｂａ　Ｉ。

Ｐｓｔｌ、５ｐｈｌ、ＨｉｎｄＩ［Ｉサイトから成るポ
リクローニングサイトを持っている。このＮｃｏＩサイ
トに異種蛋白質遺伝子を直接連結することによって一つ
の発現単位を作成することができる。ＮＣＯＩで切断す
ることによりシグナルペプチドの最後のアミノ酸のＡｈ
ａをコードするＤＮＡ部分が切断されてしまうため遺伝
子を連結する場合には、その５′末端にＡｌａをコード
するＤＮＡを付加しておく必要がある。またこのプラス
ミドは、バチルス・プレビス中では複製できないのでｐ
ＢＲＥ−３上で作成した発現単位をバチルス・プレビス
４７中で複製可能なプラスミドに移す必要かある。例え
ば、異種蛋白質遺伝子をｐＢＲＥ−３に組込んたプラス
ミドからＥｃｏＲＩとＨｉ　ｎ　ｄｍて切出したＤＮＡ
断片を、ｐＨＰｌ３などのバチルス中でも複製可能なシ
ャトルベクターの適当なサイトに挿入することか必要で
ある。

以下に、Ｂ、　１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｃｉｓのα−アミ
ラーゼとヒト上皮成長因子を発現させた例を示す。

実験例５．　　　Ｂ、　ｌ１ｃｈｅｎｊｆ’ｏｒ１ｓ　
ｃｘ−アミラーゼの発現ベクターの構築およびバチルス
・プレビス４７のでの発現 Ｂ、　１ｊｃｈｅｎｊｆｏｒｒｉｓ　ａ−アミラーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐ　Ｔ　Ｎ　１　（Ｔ、Ｙｕｕｋ
ｉ、ｅｔ　ａｌ、（Ｉ９８５）Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
９８．１１４７−）からＢａｍＨＩＢｃｌｌで切出した
ＤＮＡ断片を、実験例４て作成したｐＢＲＥ−３のＢａ
ｍＨ］サイドに挿入し、アミラーゼ遺伝子が正しい方向
に入ったものを選択して、ｐＡＭＹ−１を作成した。こ
のプラスミドからＮｃｏｌ、Ｅｃｏ４７Ｉ［１で不要な
部分を取り去り、代りに から成る一対の合成りＮＡを挿入することによってｐＡ
ＭＹ−２を作成した。ｐＡＭＹ−２は、ＢＢＲＰ４２を
コードする遺伝子のプロモーターＢＢＲＰ４２のシグナ
ルペプチドとそれに続いてＢ、　ｌ１ｃｈｅｎｉｆｏｒ
ＩＩｌｊｓのα−アミラーゼをコードする］つの発現単
位を持っている。さらにｐＡＭＹ−２からＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄｌｌＩで発現単位をふくむＤＮＡを切出し、大
腸菌、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓのシャトルベクターのひと
つであるｐＨＰｌ　ＢのＥｃｏＲＩ　　ＨｉｎｄＩ［Ｉ
サイトに挿入することによってｐＡＭＹ−３を作成した
。このプラスミドを用いて、高橋らの方法（ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｊｏｌ、（Ｉ９１１１３）１５６、１１３０−
１１３４）に従い、バチルス・プレビス４７を形質転換
した。得られた形質転換体を、１０μｇ　／　ｍｌのエ
リスロマイシンを含むＴ２培地（］％　ペプトン、０．
５％　肉エキス、０．２％　酵母エキス、１％　グルコ
ース）に植え３７℃で振とう培養を行った。培養液から
菌体を遠心分離により取り除き、上清中のアミラーゼ活
性をＨ，Ｆｕｗａの方法の松崎変法（）、Ｂｊｏｃｈｉ
ｉｓｔｒｙ　４１，５８３゜１９５４）により測定した
。その結果、アミラーゼか培地中に分泌されていること
か確認された。

実験例６．　　　ｐＡＭＹ−３によって形質転換された
バチルス・プレビス４７か分泌するアミラーゼの定量 実験例５で得られたｐＡＭＹ−３を含むバチルス・プレ
ビス４フ形質転換体を、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイ
シンを含むＴ２培地、２００μｇ／ｍ１のエリスロマイ
シンを含むＴ２培地、２００μｇ／ｍｌのエリスロマイ
シンを含むＬＳ培地（Ｉ％ペプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．２５％食塩）または１％グルコースと２００μ
ｇのエリスロマイシンを含むＬＳ培地に植え、３７℃で
振とう培養を行った。２４時間ごとに培養液の一部を取
り、遠心によって菌体を除いた上清をアミラーゼ酵素液
として活性測定に用いた。上清中のアミラーゼ活性の測
定は、実験例５と同様に、Ｈ，Ｐｕｖａの方法の松崎変
方を用いて行った。第７図に上清中に分泌されるアミラ
ーゼ活性の時間経緯を示す。

２４時間の時点では２００μｇ　／　ｍｌのエリスマイ
シンを含むＬＳ培地での分泌が最も良く、次いて２００
μｇ　／　ｍｌのエリスロマイシンを含むＴ２培地、１
％グルコースと２００μｇ　／　ｍｌのエリスロマイシ
ンを含むＬＳ培地、１０ｇｇ　／　ｍｌのエリスロマイ
シンを含むＴ２培地の順であった。しかし培養時間か７
２時間になると、１０ｇｇ　／　ｍｌのエリスロマイシ
ンを含むＴ２培地、１％グルコースと２００μｇ　／　
ｍｌのエリスロマイシンを含むＬＳｔｌ、２００μｇ　
／　ｍｌのエリスロマイシンを含むＬＳ培地、２００μ
ｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＴ２培地の順となっ
た。７２時間後の１０ｇｇ　／　ｍｌのエリスロマイシ
ンを含むＴ２培地では１ｍｌ当たり９２０ユニツトのア
ミラーゼが分泌されていた。

実験例７．　　ヒト上皮成長因子（ｈ−ＥＧＦ）発現ベ
クターの構築およびバチルス・プレビス４７ての発現 ヒト上皮成長因子は、５８アミノ酸からなる比較的小さ
なポリペプチドであり、本実験例では、ヒト上皮成長因
子をコードするＤＮＡとして化学合成したものを用いた
。ＤＮＡを合成する際、上流にはシグナル配列の最後の
Ａｌａをコードする配列を、下流には終止フトンをコー
トするＴＡＡを含みさらに両端には、ＮｃｏｌおよびＸ
ｂａｌサイトに結合可能なりＮＡを４本に分けて合成し
た。この合成りＮＡをｐＢＲＥ−３のＮｃｏｌＸｂａｌ
サイトに挿入してｐＥＧＦ−１を作成した。このプラス
ミドからＥｃｏＲＩとＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩによって切出
したＤＮＡ断片をｐＨＰ１３に挿入することによってｐ
ＥＧＦ−２を作成した。この発現ベクターを実験例５と
同様にバチルス・プレビス４７に導入した。得られた形
質転換体を１０ｇｇ　／　ｍｌのエリスロマイシンを含
むＴ２培地に植え、３７℃で振とう培養を行った。菌体
を除いた上清中のｈ−ＥＧＦを、抗ｈ−ＥＧＦ抗体を用
いて調べた結果、上°清中にｈ−ＥＧＦの存在が確認さ
れた。

実施例８．　　　ｐＥＧＦ−２によって形質転換された
バチルス・プレビス４７の分泌するｈ−ＥＧＦの定量 実験例７で得られたｐＥＧＦ−２によって形質転換され
たバチルス・プレビス４７を１０ｇｇ／ｍ１のエリスロ
マイシンを含むＴ２培地に植え３７℃で振とう培養を行
った。２４時間ごとに培養液の一部を取り、遠心によっ
て菌体を除いた上清中のｈ−ＥＧＦの濃度をヒト上皮成
長因子に対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ
法（Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　＋ｎｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、２Ｇｒｅｅ
ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ａ
ｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｊｅｎｃｅ１９８９
）により定量した。標準試料として精製された組み換え
ヒトＥＧＦ　（アース製薬株式会社製）を用いた。第８
図にその結果を示す。

ｈ−ＥＧＦの量は４８時間まで増加し、それ以上の培養
では増加しなかった。この時のｈ−ＥＧＦの量は１ｍｌ
当たり１０．５μｇであった。

実施例９．　バチルス・プレビス４７により分泌された
ｈ−ＥＧＦの精製およびＮ末のアミノ酸配列の確認 バチルス・プレビス４７より分ｌ・されたｈ−ＥＧＦの
Ｎ末のシグナルペプチドか正しく切断されているどうか
を確認するためｈ−ＥＧＦの精製を行った。実験例７で
得られたｐＥＧＦ−２によって形質転換されたバチルス
・プレビス４７を１０ｇｇ／ｍｌのエリスロマイシンを
含むＬＳ培地に植え、３７℃で４８時間聞損う培養を行
った。

培養上清４０ｍ１に９．７２ｇの硫安を加え、４℃で１
時間静置した後、遠心により残渣を取除き、ＢＵＴＹＬ
−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　６５０　Ｓ　（トーソー株式会
社製）を充填したカラムに吸着させ、４０％硫安を含む
ＰＢＳ　（０，８％ＮａＣ１０，０２％ＫＣＩ。

０．１４４％Ｎａ２ＨＰＯ４，０，０２４％ＫＨ２ＰＯ
４ｐ）１７．４）で洗浄後、硫安濃度を４０％から０％
に徐々に落とし、ｈ−ＥＧＦを溶出させた。溶出液のう
ちｈ−ＥＧＦを含む分画をさらに高速液体クロマトグラ
フィーで精製するため、Ｃ１８カラム（ハイパー高速液
体クロマトグラフィー用充填カラム　ＬｉＣｈｒｏｓｐ
ｈｅｒ　　１００ＲＰ−１８、関東化学株式会社）に吸
着させ、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む０％から４
０％のアセトニトリル溶液のグラジェントによりｈＥＧ
Ｆを溶出させた。ｈ−ＥＧＦを含む分画を取り、その一
部を用いＮ末２０個のアミノ酸配列分析をおこなった（
ＡＢ１社製４７７Ａ）。得られたアミノ酸配列は、 ＾５ｎ−８ｅｒ−＾５ｐ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｈｊｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−
Ｘ−Ｌｅｕ−Ｈｊｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘであ
った。Ｘは解読不明の残基を示す。Ｎ末のアミノ酸残基
はＡｓｎでありヒト上皮成長因子のＮ末の残基と−致し
、シグナル配列が正しく切断されていることが確認され
た。また、解読不明の残基とは、アミノ酸か修飾されて
いるために分析できない場合と、アミノ酸が　Ｃｙｓ残
基である場合かあるが、今回得られたアミノ酸配列中の
Ｘ残基に対応するヒト上皮成長因子のアミノ酸残基はす
べてＣｙｓ残基であることからＸはＣｙｓに対応し、バ
チルス・プレビス　４７より分泌されたｈ−ＥＧＦのＮ
末２０個のアミノ酸配列は正しい配列を持っていると結
論される。

実施例１０．　　バチルス・プレビス４７によるサル由
来のプロインシュリン誘導体の分泌発現バチルス・プレ
ビス４７におけるサル由来のプロインシュリン誘導体の
分泌発現について検討した。用いた遺伝子は第９図に示
されているものである。

この誘導体は、サルのプロインシュリンのＮ末端にＭｅ
ｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ
−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇの人工的アミノ酸配
列が付加されている。この誘導体をコードするＤＮＡ断
片を実験例４て得られた発現ベクターｐＢＲＥ−３の Ｎｃｏｌと５ａｌｌサイトの間に挿入し、ｐＩＮ７９０
ｄｌを作製した。このプラスミドからＥｃｏＲｌとＨｉ
ｎｄｌｌＩによって切り出した発現単位を、ｐＨＰ１３
のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｍサイトの間に挿入し、ｐＩＮ
Ｔ９０ｄ’２を作製した。このｐｌＮＴ９０ｄ２をバチ
ルス・プレビス４７に導入し、得られた形質転換体を２
００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＴ２培地に植
え、３７℃で４８時間聞損う培養を行った。培養液１ｍ
ｌを取り、遠心により菌体を取除いた上清を凍結乾燥り
、　ＬａｅｎＩＩｌｌｊの方法（前述）に従ってＳＤＳ
ポリアクリルアミド電気泳動で蛋白を分離した。

さらに蛋白を電気泳動的にナイロン膜に転写し、抗ヒト
インシュリン抗体およびホースラディシュ・パーオキシ
ダーゼで標識した二次抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ−Ｂ
ｌｏｔｔｊｎｇを行った（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　
ｖｏｌ、２　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＾５ｓ
ｏｃｊａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃ
ｊｅｎｃｅ　１９８９）　ｏその結果、第１０図に示す
ように、抗ヒトインシュリン抗体と反応する単一の蛋白
質のバンドか確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実験例１て得た、培養初期に培地中に分泌さ
れた蛋白質について行った５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の結果を示す図である。 第２図は、ＢＢＲＰ４２をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の制限酵素地図を示す図である。 第３図は実施例３で作成したデレーションミュータント
の一つであるｐＢＲＥ−１のＥｃｏＲｌからＨｉｎｄｍ
までの塩基配列及びＢＢＲＰ４２のアミノ酸配列を示す
図である。 ここで、１から１３塩基対および１７９１から１７９６
塩基対までは、ベクター由来のクローニングサイドを表
わす。 ↑□は転写開始点を示す。 ↑２は分泌シグナル（翻訳開始点）の起点である。 ↑３はＢＢＲＰ４２の起点である。 第４図は、発現単位ベクターの作成の過程を示す図であ
る。 第５図は、Ｂ、Ｉｊｃｈｅｎｊｆｏｒｍｊｓ　ａ−アミ
ラーゼ発現ベクターの構築の過程を示す図である。 第６図は、ヒト上皮成長因子発現ベクターの構築の過程
を示す図である。 第７図は、ｐＡＭＹ−３によって形質転換されたバチル
ス・プレビス４７が分泌するα−アミラーゼ活性の培養
時間による変化を示すグラフである。図中で−・−は１
０μｇ　／　ｍｌのエリスロマイシンを含むＴ２培地、
−ム一は２００μｇ　／　ｍｌのエリスロマイシンを含
むＴ２培地、−■−は２００μｇ　／　ｍｌのエリスロ
マイシンを含むＬＳ培地、−＋−は２００μｇ　／　ｍ
ｌのエリスロマイシンと１％のグルコースを含むＬＳ培
地で培養した時の培地中のアミラーゼ活性をそれぞれ示
す。 第８図は、ｐＥＧＦ−２によって形質転換されたバチル
ス・プレビス４７が分泌するｈ−ＥＧＦの培養時間によ
る変化を示すグラフである。 第９図は、サルのプロインシュリン誘導体のアミノ酸配
列およびその塩基配列を示す図である。 第１０図は、ｐＩＮＴ９０ｄ２によって形質転換された
バチルス・プレビス４７から分泌された蛋白質をウェス
タンプティングによって解析した結果を示す図である。 レーン１は大腸菌で発現されたサルのプロインシュリン
誘導体、レーン２はバチルス・プレビス４７から分泌さ
れたものを調べたものである。矢印はプロインシュリン
誘導体を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の配列（ I ）で実質的に表されるシグナルペ
   プチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】（ I ） ２、シグナルペプチドをコードする塩基配列が下記の配
   列（II）のものである、請求項１記載のＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】（II） （ここで、ＪはＡ又はＣを表わし、ＲはＡ又はＧを表わ
   す） ３、請求項１または２記載のシグナルペプチドをコード
   するＤＮＡと、その下流側末端に連結された所望の異種
   蛋白質をコードするＤＮＡとを組込み、かつ、これら外
   来性遺伝子の発現に必要なＤＮＡを持たせたものである
   ことを特徴とする、発現ベクター。 ４、宿主細胞を培養したとき培養初期に前記外来性遺伝
   子を発現させるプロモーターを含んでなる、請求項３記
   載のベクター。 ５、プロモーターが下記の塩基配列（III）の少なくと
   も３０塩基対以上を有してなるものである、請求項３ま
   たは４記載のベクター。 【遺伝子配列があります】（III） ６、下記の塩基配列（IV）で表される翻訳調節信号を転
   写開始点と翻訳開始点との間に含んでなる、請求項３−
   ５いずれか一項記載のベクター。 【遺伝子配列があります】（IV） ７、請求項３−６のいずれか一項記載のベクターで宿主
   細胞を形質転換し、該形質転換体を培養することにより
   所望の蛋白質を培地中に分泌させることを特徴とする、
   所望の蛋白質の製造法。 ８、宿主細胞がバチルス属細菌である、請求項７記載の
   製造法。 ９、バチルス属細菌がバチルス・ブレビスである、請求
   項８記載の製造法。