JP2711148B2 - ストレプトミセスからの遺伝子発現方法 - Google Patents
ストレプトミセスからの遺伝子発現方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は異種（heterologous）生物活性蛋白質、特に
ストレプトミセス・ゲネラStreptomyces generaから選
択される宿主挿入発現系による顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子（『GM−CSF』）の分泌に関する。
ストレプトミセス・ゲネラStreptomyces generaから選
択される宿主挿入発現系による顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子（『GM−CSF』）の分泌に関する。
発明の背景 市販可能な蛋白質の生産においては、生物活性な形態
でブロス中に蛋白質を分泌する微生物の能力が重要であ
る。しかしながら、DNAが発現される細胞によって分泌
され得ない、又は生物活性な形態で蛋白質を分泌し得な
い遺伝子工学的なDNAの構築によってコードされる多数
の蛋白質がある。蛋白質がブロス中に分泌されない場合
は、ダウンストリームプロセッシングを要する。これ
は、細胞は採取される必要があり、細胞壁は破壊されね
ばならず、所望の蛋白質は純粋な形態で取り出され、次
いでこのような蛋白質は化学的に再生して（re−nature
d）、その生物活性を修復（restore）しなければならな
い。蛋白質がブロス中に分泌されるが、しかし生物活性
な形態ではない場合は、分泌後に蛋白質を処理し、生物
活性を再び保持するようにしなければならない。
でブロス中に蛋白質を分泌する微生物の能力が重要であ
る。しかしながら、DNAが発現される細胞によって分泌
され得ない、又は生物活性な形態で蛋白質を分泌し得な
い遺伝子工学的なDNAの構築によってコードされる多数
の蛋白質がある。蛋白質がブロス中に分泌されない場合
は、ダウンストリームプロセッシングを要する。これ
は、細胞は採取される必要があり、細胞壁は破壊されね
ばならず、所望の蛋白質は純粋な形態で取り出され、次
いでこのような蛋白質は化学的に再生して（re−nature
d）、その生物活性を修復（restore）しなければならな
い。蛋白質がブロス中に分泌されるが、しかし生物活性
な形態ではない場合は、分泌後に蛋白質を処理し、生物
活性を再び保持するようにしなければならない。
細胞及び微生物の中には、生物活性な形態で蛋白質を
分泌することによりダウンストリームプロセッシング
（downstream processing）と生物学的に等価なことを
行うものもある。細胞外面を通しての細胞の外部環境へ
のある蛋白質の分泌を支配する機序は未だ十分に理解さ
れているわけではない。例えば、ストレプトミセス・グ
リセウスStreptomyces griseus種は生物活性な形態で多
数の細胞外蛋白質を分泌する。生物活性がそれらの特別
な三次元分子構造に依存する商業的価値のある異種蛋白
質が、天然の細胞外蛋白質について観察されるレベルで
ストレプトミセスStreptomycesから分泌される場合は好
都合である。
分泌することによりダウンストリームプロセッシング
（downstream processing）と生物学的に等価なことを
行うものもある。細胞外面を通しての細胞の外部環境へ
のある蛋白質の分泌を支配する機序は未だ十分に理解さ
れているわけではない。例えば、ストレプトミセス・グ
リセウスStreptomyces griseus種は生物活性な形態で多
数の細胞外蛋白質を分泌する。生物活性がそれらの特別
な三次元分子構造に依存する商業的価値のある異種蛋白
質が、天然の細胞外蛋白質について観察されるレベルで
ストレプトミセスStreptomycesから分泌される場合は好
都合である。
遺伝子工学的なDNAの構築に関する文献の中には、DNA
に含まれる情報を用いる機能性蛋白質の産生はDNAのコ
ードを解読することにより解決されると仮定したものも
あった。この仮定は、蛋白質分子の複雑な三次元構造を
特定するために必要な情報がその蛋白質の一次アミノ酸
配列中に含まれる、という原則に基づいていた。しかし
ながら、1985年11月１日にCangene Corporationが出願
したProduction of Active Proteins Containing Cysti
ne Residues（シスチン残基含有活性蛋白質の産生）と
いう表題のカナダ国特許出願第449,456号明細書には、
遺伝子工学的なDNAの構築に由来するある種の蛋白質の
生物活性は正しく位置したジスルフィド結合の形成によ
ることが例証されている。宿主細胞又は微生物における
異種遺伝子の発現に関して、慣用法よりもさらに有効な
方法が探索された。そこで、その発明は、ダウンストリ
ームプロセッシングを要せずに生物活性な形態で宿主微
生物から異種蛋白質が分泌され得ることを明らかにし
た。ある発現系である種の微生物を使用すると、遺伝子
工学的なDNA構築の発現においてジスルフィド結合の形
成が促進される。それらの活性構造の重要で必然的な部
分としてシスチン残基を有する製造された蛋白質の生物
活性は、同種のジスルフィドで結合された蛋白質を発現
及び排出可能な細胞又は微生物から選択される調節（re
qulatory）ヌクレオチド配列を用いることにより達成さ
れた。そのヌクレオチド配列は、ジスルフィド結合を含
有する異種蛋白質をコードする二次ヌクレオチド配列に
遺伝子操作により結合され得る。調節ヌクレオチド配列
は細胞又は微生物からの異種蛋白質の分泌を引き起こす
蛋白質をコード化した。異種蛋白質は天然のものでも又
はデザインしたものでもよかった。
に含まれる情報を用いる機能性蛋白質の産生はDNAのコ
ードを解読することにより解決されると仮定したものも
あった。この仮定は、蛋白質分子の複雑な三次元構造を
特定するために必要な情報がその蛋白質の一次アミノ酸
配列中に含まれる、という原則に基づいていた。しかし
ながら、1985年11月１日にCangene Corporationが出願
したProduction of Active Proteins Containing Cysti
ne Residues（シスチン残基含有活性蛋白質の産生）と
いう表題のカナダ国特許出願第449,456号明細書には、
遺伝子工学的なDNAの構築に由来するある種の蛋白質の
生物活性は正しく位置したジスルフィド結合の形成によ
ることが例証されている。宿主細胞又は微生物における
異種遺伝子の発現に関して、慣用法よりもさらに有効な
方法が探索された。そこで、その発明は、ダウンストリ
ームプロセッシングを要せずに生物活性な形態で宿主微
生物から異種蛋白質が分泌され得ることを明らかにし
た。ある発現系である種の微生物を使用すると、遺伝子
工学的なDNA構築の発現においてジスルフィド結合の形
成が促進される。それらの活性構造の重要で必然的な部
分としてシスチン残基を有する製造された蛋白質の生物
活性は、同種のジスルフィドで結合された蛋白質を発現
及び排出可能な細胞又は微生物から選択される調節（re
qulatory）ヌクレオチド配列を用いることにより達成さ
れた。そのヌクレオチド配列は、ジスルフィド結合を含
有する異種蛋白質をコードする二次ヌクレオチド配列に
遺伝子操作により結合され得る。調節ヌクレオチド配列
は細胞又は微生物からの異種蛋白質の分泌を引き起こす
蛋白質をコード化した。異種蛋白質は天然のものでも又
はデザインしたものでもよかった。
Canagene Corporationが1987年７月21日に提出したCh
aracterization and Structure of Genes for Protease
A and Protease B from Streptomyces Griseus（スト
レプトミセス・グリセウスからのプロテアーゼＡ及びプ
ロテアーゼＢに関する遺伝子のキャラクタリゼーション
及び構造）という表題のカナダ国特許出願第542,678号
明細書には、同種（homogeneous）遺伝子の発現系が開
示されている。その発明は、ストレプトミセス・グリセ
ウスStreptomyces griseusからのプロテアーゼＡ及びプ
ロテアーゼＢの分泌を支配する調節ヌクレオチド配列に
関するものであった。プロテアーゼＡ及びプロテアーゼ
Ｂはストレプトミセス・グリセウスStreptomyces grise
usにおいては天然に生じる蛋白質であり、したがって、
用語的には『同種』である。その出願は、ストレプトミ
セスStreptomycesにおけるある型の同種分泌に関与する
調節ヌクレオチド配列を開示するものであった。同種発
現に関与する遺伝子発現系は異種発現に関するその他の
種々の発現系を構築するに際して有用である。
aracterization and Structure of Genes for Protease
A and Protease B from Streptomyces Griseus（スト
レプトミセス・グリセウスからのプロテアーゼＡ及びプ
ロテアーゼＢに関する遺伝子のキャラクタリゼーション
及び構造）という表題のカナダ国特許出願第542,678号
明細書には、同種（homogeneous）遺伝子の発現系が開
示されている。その発明は、ストレプトミセス・グリセ
ウスStreptomyces griseusからのプロテアーゼＡ及びプ
ロテアーゼＢの分泌を支配する調節ヌクレオチド配列に
関するものであった。プロテアーゼＡ及びプロテアーゼ
Ｂはストレプトミセス・グリセウスStreptomyces grise
usにおいては天然に生じる蛋白質であり、したがって、
用語的には『同種』である。その出願は、ストレプトミ
セスStreptomycesにおけるある型の同種分泌に関与する
調節ヌクレオチド配列を開示するものであった。同種発
現に関与する遺伝子発現系は異種発現に関するその他の
種々の発現系を構築するに際して有用である。
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（『GM−CS
F』）は白血球産生を刺激する蛋白質である。GM−CSFは
癌治療に関連して使用する生化学的医薬として非常に有
望であり、白血球の修復を促進する。天然由来のGM−CS
Fは127個のアミノ酸と２個のジスルフィド結合を有する
糖蛋白質（glycoprotein）である。GM−CSFは自然状態
でヒトにおいては痕跡量存在するにすぎず、このため天
然から単離された蛋白質の詳細な構造分析が妨げられて
いた。したがって、天然GM−CSFの構造についてのデー
タのほとんどは哺乳類細胞における相補的DNA配列及び
相補的DNAクローンの発現を分析することにより得られ
る。哺乳類細胞において発現されるGM−CSFは127個のア
ミノ酸と２個のジスルフィド結合を含有し、また14〜35
キロダルトンのサイズの範囲で異なったグリコシル化形
態で存在する。ある形態のGM−CSFは２個のＮ−連結炭
水化物基及び／又は３個のＯ−連結炭水化物基を含有し
得るが、これは外見上明らかなサイズの不均一性の原因
となる。
F』）は白血球産生を刺激する蛋白質である。GM−CSFは
癌治療に関連して使用する生化学的医薬として非常に有
望であり、白血球の修復を促進する。天然由来のGM−CS
Fは127個のアミノ酸と２個のジスルフィド結合を有する
糖蛋白質（glycoprotein）である。GM−CSFは自然状態
でヒトにおいては痕跡量存在するにすぎず、このため天
然から単離された蛋白質の詳細な構造分析が妨げられて
いた。したがって、天然GM−CSFの構造についてのデー
タのほとんどは哺乳類細胞における相補的DNA配列及び
相補的DNAクローンの発現を分析することにより得られ
る。哺乳類細胞において発現されるGM−CSFは127個のア
ミノ酸と２個のジスルフィド結合を含有し、また14〜35
キロダルトンのサイズの範囲で異なったグリコシル化形
態で存在する。ある形態のGM−CSFは２個のＮ−連結炭
水化物基及び／又は３個のＯ−連結炭水化物基を含有し
得るが、これは外見上明らかなサイズの不均一性の原因
となる。
Moonen等（1987）は、ハムスターの卵巣細胞からの分
泌によるGM−CSF産生に関する方法を報告している。GM
−CSFは、生物学的に活性である26−キロダルトン糖蛋
白質として分泌される。しかしながら、炭水化物基を酵
素的に除去することにより生物学的活性は20倍に増大さ
れ、このことは非グリコシル化形態のGM−CSFが臨床的
使用においては優れていることを示している。
泌によるGM−CSF産生に関する方法を報告している。GM
−CSFは、生物学的に活性である26−キロダルトン糖蛋
白質として分泌される。しかしながら、炭水化物基を酵
素的に除去することにより生物学的活性は20倍に増大さ
れ、このことは非グリコシル化形態のGM−CSFが臨床的
使用においては優れていることを示している。
Ernst等（1987）は、アルファ交配因子前駆体の使用
による酵母菌Saccharomyces Cerevisiaeからの分泌によ
るGM−CSF産生に関して報告している。GM−CSFは、35〜
100キロダルトンのサイズ範囲の糖蛋白質の不均質混合
物として分泌される。分泌GM−CSFの一部分のみがアル
ファ交配因子前駆体から正しく処理されて得られた。酵
母菌及び哺乳類細胞において作られるグリコシル化GM−
CSFの特異的な生物学的活性はほぼ同じであった。しか
しながら、酵母菌において産生されるGM−CSFの結合炭
水化物基の構造は哺乳類細胞で産生されるGM−CSFの天
然炭水化物基とは異なっていた。
による酵母菌Saccharomyces Cerevisiaeからの分泌によ
るGM−CSF産生に関して報告している。GM−CSFは、35〜
100キロダルトンのサイズ範囲の糖蛋白質の不均質混合
物として分泌される。分泌GM−CSFの一部分のみがアル
ファ交配因子前駆体から正しく処理されて得られた。酵
母菌及び哺乳類細胞において作られるグリコシル化GM−
CSFの特異的な生物学的活性はほぼ同じであった。しか
しながら、酵母菌において産生されるGM−CSFの結合炭
水化物基の構造は哺乳類細胞で産生されるGM−CSFの天
然炭水化物基とは異なっていた。
Burgess等（1987）は、大腸菌E.coliの細胞質からの
非グリコシル化GM−CSF様ポリペプチドの産生方法を報
告している。E.coli細胞から単離されたままのGM−CSF
様ポリペプチドはアミノ末端メチオニンを有し、また還
元され、変性されて生物学的に不活性であった。E.coli
から単離された生物学的に不活性なGM−CSF様ポリペプ
チドの生物活性な形態への変換には、in vitroでの酸化
的再生を要した。E.coli産生蛋白質中にアミノ末端メチ
オニンが存在するため、再生GM−CSF様ポリペプチドは
依然として非グリコシル化形態のGM−CSFと同等ではな
かった。
非グリコシル化GM−CSF様ポリペプチドの産生方法を報
告している。E.coli細胞から単離されたままのGM−CSF
様ポリペプチドはアミノ末端メチオニンを有し、また還
元され、変性されて生物学的に不活性であった。E.coli
から単離された生物学的に不活性なGM−CSF様ポリペプ
チドの生物活性な形態への変換には、in vitroでの酸化
的再生を要した。E.coli産生蛋白質中にアミノ末端メチ
オニンが存在するため、再生GM−CSF様ポリペプチドは
依然として非グリコシル化形態のGM−CSFと同等ではな
かった。
哺乳類細胞又は酵母菌により分泌されるGM−CSFは生
物活性を示すが、しかしグリコシル化されていない。E.
coliから単離されるGM−CSFはグリコシル化されていな
いが、しかし生物活性を示さない。したがって、GM−CS
Fを産生する慣用的方法は、培養物からのGM−CSFの形態
を臨床的使用に好ましい生物活性な、非グリコシル化GM
−CSFに変換するために、経費がかかり、時間がかか
り、あるいは非効率的なダウンストリームプロセッシン
グを要する。
物活性を示すが、しかしグリコシル化されていない。E.
coliから単離されるGM−CSFはグリコシル化されていな
いが、しかし生物活性を示さない。したがって、GM−CS
Fを産生する慣用的方法は、培養物からのGM−CSFの形態
を臨床的使用に好ましい生物活性な、非グリコシル化GM
−CSFに変換するために、経費がかかり、時間がかか
り、あるいは非効率的なダウンストリームプロセッシン
グを要する。
したがって、分泌時に生物活性な蛋白質、特に生物活
性なGM−CSFを提供する発現系が必要とされている。こ
のような蛋白質産物は構造が生物活性を決定する訳であ
るから、構造的に従来の蛋白質産物とは異なったもので
あろう。
性なGM−CSFを提供する発現系が必要とされている。こ
のような蛋白質産物は構造が生物活性を決定する訳であ
るから、構造的に従来の蛋白質産物とは異なったもので
あろう。
発明の要約 本発明は、異種蛋白質、特にストレプトミセスStrept
omyces属から選択される宿主からの生物活性な形態での
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（『GM−CS
F』）の分泌を支配する多数の発現系に関する。本文中
では、情況により別の定義が必要な場合を除いては、
『GM−CSF』は本質的に純粋な、非グリコシル化、酸化G
M−CSF蛋白質を意味する。本発明に従って産生される生
物活性なGM−CSFは、グリコシル化されていないが、し
かしながら他の点では天然の対応物によく似ている。本
発明のGM−CSFは、その天然の対応物と同様、正しい位
置に分子間ジスルフィド結合が存在する。本発明に従っ
て産生される新規物質はGM−CSFノグリテインと呼ばれ
る。GM−CSFノグリテインは宿主生物即ちストレプトミ
セスStreptomyces属から選択される宿主から分泌される
際、十分な生物活性を有し、また天然GM−CSF糖蛋白質
の全ての構造的特徴を示す。
omyces属から選択される宿主からの生物活性な形態での
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（『GM−CS
F』）の分泌を支配する多数の発現系に関する。本文中
では、情況により別の定義が必要な場合を除いては、
『GM−CSF』は本質的に純粋な、非グリコシル化、酸化G
M−CSF蛋白質を意味する。本発明に従って産生される生
物活性なGM−CSFは、グリコシル化されていないが、し
かしながら他の点では天然の対応物によく似ている。本
発明のGM−CSFは、その天然の対応物と同様、正しい位
置に分子間ジスルフィド結合が存在する。本発明に従っ
て産生される新規物質はGM−CSFノグリテインと呼ばれ
る。GM−CSFノグリテインは宿主生物即ちストレプトミ
セスStreptomyces属から選択される宿主から分泌される
際、十分な生物活性を有し、また天然GM−CSF糖蛋白質
の全ての構造的特徴を示す。
本発明に従って、遺伝子発現系は、異種蛋白質をコー
ドする二次ヌクレオチド配列と結合する調節ヌクレオチ
ド配列を有する形で使用される。調節配列はシグナル配
列及びプロモーター配列を包含する。シグナル配列は、
ストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主から
の生物活性な形態での異種蛋白質の分泌を支配するペプ
チドをコードする。天然配列又は合成配列あるいは天然
配列と合成配列の組み合わせであってもよい二次ヌクレ
オチド配列は異種蛋白質をコードする。
ドする二次ヌクレオチド配列と結合する調節ヌクレオチ
ド配列を有する形で使用される。調節配列はシグナル配
列及びプロモーター配列を包含する。シグナル配列は、
ストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主から
の生物活性な形態での異種蛋白質の分泌を支配するペプ
チドをコードする。天然配列又は合成配列あるいは天然
配列と合成配列の組み合わせであってもよい二次ヌクレ
オチド配列は異種蛋白質をコードする。
記載の発現系は、生物活性な形態のコード化された蛋
白質のストレプトミセスStreptomyces宿主からの分泌を
もたらす。本発明の発現系は他の宿主中で使用可能であ
ると予測される。さらに、これらの発現系を、本発明の
教示に従って、GM−CSF以外の異種蛋白質の分泌をもた
らすのに用いてもよい。
白質のストレプトミセスStreptomyces宿主からの分泌を
もたらす。本発明の発現系は他の宿主中で使用可能であ
ると予測される。さらに、これらの発現系を、本発明の
教示に従って、GM−CSF以外の異種蛋白質の分泌をもた
らすのに用いてもよい。
特に、本発明は、ストレプトミセスStreptomyces属か
ら選択する宿主からの生物活性な形態での顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子（『GM−CSF』）の分泌のた
めの遺伝子発現系に関する。遺伝子発現系は、GM−CSF
をコードする二次ヌクレオチド配列に連結する調節ヌク
レオチド配列を包含する。この調節配列はシグナル配列
及びプロモーター配列を含む。シグナル配列はストレプ
トミセスStreptomyces属から選択する宿主からの生物活
性な形態でのGM−CSFの分泌を支配するペプチドをコー
ドする。天然配列又は合成配列あるいは天然配列と合成
配列の組み合わせであってもよい二次ヌクレオチド配列
は、GM−CSFをコードし得る。
ら選択する宿主からの生物活性な形態での顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子（『GM−CSF』）の分泌のた
めの遺伝子発現系に関する。遺伝子発現系は、GM−CSF
をコードする二次ヌクレオチド配列に連結する調節ヌク
レオチド配列を包含する。この調節配列はシグナル配列
及びプロモーター配列を含む。シグナル配列はストレプ
トミセスStreptomyces属から選択する宿主からの生物活
性な形態でのGM−CSFの分泌を支配するペプチドをコー
ドする。天然配列又は合成配列あるいは天然配列と合成
配列の組み合わせであってもよい二次ヌクレオチド配列
は、GM−CSFをコードし得る。
シグナル配列は、ストレプトミセスStreptomyces属か
ら選択する宿主からの異種蛋白質の分泌を支配するシグ
ナルペプチドをコードする。シグナル配列は、ストレプ
トミセス・グリセウスStreptomyces griseusプロテアー
ゼＢ、ストレプトミセス・プリカートスStreptomyces P
licatusエンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
Ｈのシグナルペプチド、これらの任意のペプチドのハイ
ブリッド、あるいはストレプトミセスStreptomyces属か
ら選択する宿主からの異種蛋白質、特にGM−CSFの分泌
を支配する任意の他のシグナルペプチドをコードし得
る。シグナル配列は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌
のシグナルペプチド又はこれらのペプチドのハイブリッ
ドをコードし得る。さらにまた、シグナル配列は、スト
レプトミセスStreptomycesと他の細菌のシグナルペプチ
ドのハイブリッドをコードし得る。
ら選択する宿主からの異種蛋白質の分泌を支配するシグ
ナルペプチドをコードする。シグナル配列は、ストレプ
トミセス・グリセウスStreptomyces griseusプロテアー
ゼＢ、ストレプトミセス・プリカートスStreptomyces P
licatusエンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
Ｈのシグナルペプチド、これらの任意のペプチドのハイ
ブリッド、あるいはストレプトミセスStreptomyces属か
ら選択する宿主からの異種蛋白質、特にGM−CSFの分泌
を支配する任意の他のシグナルペプチドをコードし得
る。シグナル配列は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌
のシグナルペプチド又はこれらのペプチドのハイブリッ
ドをコードし得る。さらにまた、シグナル配列は、スト
レプトミセスStreptomycesと他の細菌のシグナルペプチ
ドのハイブリッドをコードし得る。
異種蛋白質のアミノ末端に連結するシグナルペプチド
より成る融合蛋白質をコードするRNAの合成を指示する
プロモーター配列は、少なくとも１つの型のストレプト
ミセスStreptomycesRNAポリメラーゼホロ酵素の特異的
な結合及びそれによる転写を可能にする。プロモーター
配列は、少なくとも１種類のストレプトミセスStreptom
ycesRNAポリメラーゼホロ酵素の特異的な結合及びそれ
による転写を可能にするストレプトミセス・フラジアSt
reptomyces fradiaeのアミノグリコシドホスホトランス
フェラーゼ遺伝子（『aph』）からの配列を包含しても
よい。
より成る融合蛋白質をコードするRNAの合成を指示する
プロモーター配列は、少なくとも１つの型のストレプト
ミセスStreptomycesRNAポリメラーゼホロ酵素の特異的
な結合及びそれによる転写を可能にする。プロモーター
配列は、少なくとも１種類のストレプトミセスStreptom
ycesRNAポリメラーゼホロ酵素の特異的な結合及びそれ
による転写を可能にするストレプトミセス・フラジアSt
reptomyces fradiaeのアミノグリコシドホスホトランス
フェラーゼ遺伝子（『aph』）からの配列を包含しても
よい。
発現系をストレプトミセスStreptomycesにおいて形質
転換及び複製が可能なベクターに挿入し、このベクター
をストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主中
に挿入する。
転換及び複製が可能なベクターに挿入し、このベクター
をストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主中
に挿入する。
本発明の他の側面では、ストレプトミセスStreptomyc
es属から選択する宿主から分泌される生物活性な形態の
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の産生方法を用
いる。その方法は、生物活性な形態でのGM−CSFの分泌
を支配するペプチドをコードする配列とGM−CSFをコー
ドする配列を連結し、その配列をストレプトミセスStre
ptomyces中での形質転換及び複製が可能なベクターに挿
入し、そのベクターをストレプトミセスStreptomyces属
から選択する宿主中に挿入し、その形質転換宿主を育成
して、生物活性なGM−CSFを取り出すことを包含する。
es属から選択する宿主から分泌される生物活性な形態の
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の産生方法を用
いる。その方法は、生物活性な形態でのGM−CSFの分泌
を支配するペプチドをコードする配列とGM−CSFをコー
ドする配列を連結し、その配列をストレプトミセスStre
ptomyces中での形質転換及び複製が可能なベクターに挿
入し、そのベクターをストレプトミセスStreptomyces属
から選択する宿主中に挿入し、その形質転換宿主を育成
して、生物活性なGM−CSFを取り出すことを包含する。
本発明に従って、異種蛋白質と融合するシグナルペプ
チドをストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿
主中での異種発現（heterologous expression）により
産生する。
チドをストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿
主中での異種発現（heterologous expression）により
産生する。
本発明に従って、GM−CSFに融合するシグナルペプチ
ドをストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主
中での異種発現により産生する。
ドをストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主
中での異種発現により産生する。
本発明に従って、生物活性な蛋白質をストレプトミセ
スStreptomyces属から選択する宿主中での異種発現によ
り産生する。
スStreptomyces属から選択する宿主中での異種発現によ
り産生する。
本発明に従って、生物活性なGM−CSFをストレプトミ
セスStreptomyces属から選択する宿主中での異種発現に
より産生する。
セスStreptomyces属から選択する宿主中での異種発現に
より産生する。
組み換えDNAから誘導されるGM−CSFは、適当な宿主、
特にストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主
からの生物活性形態で分泌される。GM−CSFは分泌に際
してグルコシル化されず、また分子内ジスルフィド結合
を有する。
特にストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主
からの生物活性形態で分泌される。GM−CSFは分泌に際
してグルコシル化されず、また分子内ジスルフィド結合
を有する。
好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、発現系を使用してのストレプトミセスStre
ptomycesからの直接分泌による生物学的に活性な形態の
ヒトGM−CSFの産生方法に関するものである。
ptomycesからの直接分泌による生物学的に活性な形態の
ヒトGM−CSFの産生方法に関するものである。
本発明はまた、他の異種蛋白質の産生に使用可能な発
現ベクターに関する。発現系は、特定の蛋白質をコード
する遺伝子、正しくプロセッシングされた蛋白質の成育
媒質への分泌を支配するシグナルペプチドをコードする
核酸配列；及びその蛋白質をコードし、mRNAの転写を支
配することができるプロモーターを含有する。当業者に
は公知のように、発現系は、転写終了に関する付加的な
核酸配列や翻訳の開始と終了に関する付加的な核酸配列
を包含する。
現ベクターに関する。発現系は、特定の蛋白質をコード
する遺伝子、正しくプロセッシングされた蛋白質の成育
媒質への分泌を支配するシグナルペプチドをコードする
核酸配列；及びその蛋白質をコードし、mRNAの転写を支
配することができるプロモーターを含有する。当業者に
は公知のように、発現系は、転写終了に関する付加的な
核酸配列や翻訳の開始と終了に関する付加的な核酸配列
を包含する。
好ましい実施態様においては、発現系内に含まれる遺
伝子は蛋白質ヒトGM−CSFをコードする（Lee等,1985;Wa
ng等,1985）。GM−CSF遺伝子、特に図１におけるDNA配
列で表わされるものは、ストレプトミセスStreptomyces
のコドン使用（codon usage）に従って作られた合成DNA
である；即ち、３位にＣ又はＧを有するコドンである
（Bibb等,1985）。該遺伝子は、ストレプトミセスStrep
tomycesコドン使用あるいは任意の他のバイアス化又は
全くランダムなコドン使用によって、GM−CSFについて
の天然のcDNA配列でもよく、あるいはGM−CSFをコード
する任意の他のDNA配列でもよい。その遺伝子は、１つ
又はそれ以上のアミノ酸が天然のアミノ酸配列中で置換
され、挿入され、又は欠失されたGM−CSFの生物学的に
活性な誘導体をコードし得る。
伝子は蛋白質ヒトGM−CSFをコードする（Lee等,1985;Wa
ng等,1985）。GM−CSF遺伝子、特に図１におけるDNA配
列で表わされるものは、ストレプトミセスStreptomyces
のコドン使用（codon usage）に従って作られた合成DNA
である；即ち、３位にＣ又はＧを有するコドンである
（Bibb等,1985）。該遺伝子は、ストレプトミセスStrep
tomycesコドン使用あるいは任意の他のバイアス化又は
全くランダムなコドン使用によって、GM−CSFについて
の天然のcDNA配列でもよく、あるいはGM−CSFをコード
する任意の他のDNA配列でもよい。その遺伝子は、１つ
又はそれ以上のアミノ酸が天然のアミノ酸配列中で置換
され、挿入され、又は欠失されたGM−CSFの生物学的に
活性な誘導体をコードし得る。
発現系内に含まれる異種遺伝子は、別の有用な蛋白質
をコードする天然cDNA配列か又は合成DNA配列であって
もよい。組換えDNA配列によりコードされる特定の蛋白
質としては、キモシン、キモトリプシン、トリプシン、
アミラーゼ、リグニナーゼ、エラスターゼ、リパーゼ及
びセルラーゼといったような真核生物性分泌酵素；グル
コースイソメラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ペクチナ
ーゼ、セルラーゼ、プロティナーゼ、オキシダーゼ、リ
グニナーゼのような原核生物性分泌酵素；ヒルジン、ベ
ーター−ラクタマーゼ阻害剤、及びアルファ１−抗トリ
プシンのような酵素阻害剤；スーパーオキシドジスムタ
ーゼのような金属酵素；ファクターVIII、ファクターI
X、組織型プラスミノーゲンアクチベーター及びウロキ
ナーゼのような血液因子；プロインシュリンのようなホ
ルモン；ベータ−インターフェロン及びガンマ−インタ
ーフェロン、並びにインターロイキン−２のようなリン
フォカイン；腫瘍壊死因子、リンフォトキシン、及びイ
ンターロイキン−１のような細胞毒素；神経成長因子、
上皮成長因子、形質転換成長因子、血小板由来性成長因
子、及び繊維芽細胞成長因子のような成長因子；インタ
ーロイキン−３及び顆粒球コロニー刺激因子のような他
のコロニー刺激因子；合成抗体分子、デザインされた抗
体分子、又は遺伝子工学による抗体分子のようなイムノ
グロブリン関連分子；コレステロール受容体のような細
胞受容体；ウイルス性ヘマグルチニン、エイズ抗原及び
イムノゲン、Ｂ型肝炎抗原及びイムノゲン、手足口病ウ
イルス抗原及びイムノゲンのようなウイルス性抗原；プ
ロテインＡのような細菌表面エファクター；蛋白質殺虫
剤、殺藻剤、殺菌剤、及び殺生物剤のような毒素；心筋
梗塞蛋白質（MIP）、体重制御因子（WCF）、及び熱量率
蛋白質（CRP）のような医学的重要性を有する全身性蛋
白質などが挙げられる。
をコードする天然cDNA配列か又は合成DNA配列であって
もよい。組換えDNA配列によりコードされる特定の蛋白
質としては、キモシン、キモトリプシン、トリプシン、
アミラーゼ、リグニナーゼ、エラスターゼ、リパーゼ及
びセルラーゼといったような真核生物性分泌酵素；グル
コースイソメラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ペクチナ
ーゼ、セルラーゼ、プロティナーゼ、オキシダーゼ、リ
グニナーゼのような原核生物性分泌酵素；ヒルジン、ベ
ーター−ラクタマーゼ阻害剤、及びアルファ１−抗トリ
プシンのような酵素阻害剤；スーパーオキシドジスムタ
ーゼのような金属酵素；ファクターVIII、ファクターI
X、組織型プラスミノーゲンアクチベーター及びウロキ
ナーゼのような血液因子；プロインシュリンのようなホ
ルモン；ベータ−インターフェロン及びガンマ−インタ
ーフェロン、並びにインターロイキン−２のようなリン
フォカイン；腫瘍壊死因子、リンフォトキシン、及びイ
ンターロイキン−１のような細胞毒素；神経成長因子、
上皮成長因子、形質転換成長因子、血小板由来性成長因
子、及び繊維芽細胞成長因子のような成長因子；インタ
ーロイキン−３及び顆粒球コロニー刺激因子のような他
のコロニー刺激因子；合成抗体分子、デザインされた抗
体分子、又は遺伝子工学による抗体分子のようなイムノ
グロブリン関連分子；コレステロール受容体のような細
胞受容体；ウイルス性ヘマグルチニン、エイズ抗原及び
イムノゲン、Ｂ型肝炎抗原及びイムノゲン、手足口病ウ
イルス抗原及びイムノゲンのようなウイルス性抗原；プ
ロテインＡのような細菌表面エファクター；蛋白質殺虫
剤、殺藻剤、殺菌剤、及び殺生物剤のような毒素；心筋
梗塞蛋白質（MIP）、体重制御因子（WCF）、及び熱量率
蛋白質（CRP）のような医学的重要性を有する全身性蛋
白質などが挙げられる。
該遺伝子は、in vitroで又は培養中で活性形態にプロ
セッシングし得る生物学的に活性な蛋白質の不活性前駆
体（チモーゲン）をコードすることが可能であった。そ
の遺伝子は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が天然のアミ
ノ酸配列において置換され、挿入され、又は欠失された
有用蛋白質の生物学的に活性な誘導体をコード可能であ
った。さらに、遺伝子は、２つ又はそれ以上の有用蛋白
質の生物学的に活性な融合蛋白質、あるいは配列内の相
同位置から単一アミノ酸又はアミノ酸ブロックを交換す
ることにより作成可能な２つ又はそれ以上の相同蛋白質
のハイブリッドをコード可能であった。
セッシングし得る生物学的に活性な蛋白質の不活性前駆
体（チモーゲン）をコードすることが可能であった。そ
の遺伝子は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が天然のアミ
ノ酸配列において置換され、挿入され、又は欠失された
有用蛋白質の生物学的に活性な誘導体をコード可能であ
った。さらに、遺伝子は、２つ又はそれ以上の有用蛋白
質の生物学的に活性な融合蛋白質、あるいは配列内の相
同位置から単一アミノ酸又はアミノ酸ブロックを交換す
ることにより作成可能な２つ又はそれ以上の相同蛋白質
のハイブリッドをコード可能であった。
シグナル配列は、アミノ末端融合蛋白質として生合成
され、異種蛋白質に連結される場合、正しいアミノ末端
基を有している異種蛋白質を、媒質中へ分泌させるよう
な任意のアミノ酸配列をコードするものである。好まし
い実施態様においては、ストレプトミセス・グリセウス
Streptomyces griseusプロテアーゼＢのシグナルペプチ
ド（カナダ国特許出願第542,678号明細書。1987年７月2
1日にCangene Corporationが出願した。）がGM−CSFを
分泌させるのに用いられる：特に配列MRIKRTSNRSNAARRV
RTTAVLAGLAAVAALAVPTANAの38−アミノ酸ペプチドが好ま
しい。別の実施態様においては、GM−CSFの分泌を支配
するために使用されるシグナルペプチドは、アミノ末端
基でストレプトミセス・プリカートスStreptomyces pli
catusエンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ
（エンドＨ）シグナルペプチドの９〜34番目のアミノ酸
に連結するS.griseusプロテアーゼＢシグナルペプチド
の最初の15個のアミノ酸より成るハイブリッド（Robbin
s等,1984）：特に配列MRIKRTSNRSNAARRVRTAALALSAAAALV
LGSTAASGASAの41−アミノ酸ペプチドである。GM−CSFの
分泌は、本発明に詳記のS.plicatusエンドＨのシグナル
ペプチド；特に配列MFTPVRRRVRTAALALSAAAALVLGSTAASGA
SAの34−アミノ酸ペプチドによっても支配可能であっ
た。分泌はさらに、別のストレプトミセスStreptomyces
シグナルペプチド：特にS.griseusプロテアーゼＡ（例
えば、MTFKRFSPLSSTSRYARLLAVASGLVAAAALATPSAVA）、S.
griseusアミラーゼ、Streptomyces R61 DD−ペプチダー
ゼのシグナルペプチド、又は当業界で公知の別のStrept
omycesシグナルペプチド（Chang,1987）により支配可能
であった。分泌はまた、上記シグナルペプチド又は全般
的合成アミノ酸配列を有するシグナルペプチドのハイブ
リッドの支配下でも遂行可能であった。シグナルペプチ
ドは、グラム陽性細菌からのもの：特にバチルス・ズブ
チルスBacillus subtilusアルカリ性プロテアーゼ（ap
r）のシグナルペプチド、又は当業界で公知のグラム陽
性細菌の別のシグナルペプチド（Chang,1987）であって
もよい。シグナルペプチドはまた、グラム陰性細菌から
のもの：特に大腸菌Escherichia coli外膜プロテインＡ
のシグナルペプチド、又は当業界で公知のグラム陰性細
菌の別のシグナルペプチド（Sjostrom等,1987）であっ
てもよい。シグナルペプチドはまた、２つ又はそれ以上
の細菌シグナルペプチドのハイブリッドであってもよ
い。ある実施態様において、GM−CSFの分泌を支配する
ために使用されるシグナルペプチドは、アミノ末端基で
B.subtilusaprシグナルペプチドの６〜30番目のアミノ
酸に連結されるS.griseusプロテアーゼＢシグナルペプ
チドの最初の15個のアミノ酸より成るハイブリッド：特
に配列MRIKRTSNRSNAARRVWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAの40
−アミノ酸ペプチドである。他の実施態様においては、
StreptomycesエンドＨのシグナルペプチドをコードする
DNAと他の細菌由来のシグナルペプチドをコードするDNA
とのハイブリッドであって、StreptomycesエンドＨのシ
グナルペプチドが少くとも31個のアミノ酸を含み、アミ
ノ末端のメチオニンから30番目から34番目のアミノ酸の
間にプロセッシング部位を有するシグルペプチドであ
る。さらに他の実施態様においては、シグナルペプチド
は、アミノ末端から17個のアミノ酸が、アルギニン、リ
ジン又はその両者を含む少くとも７個のアミノ酸を含む
ものである。GM−CSFに加えて、他の異種蛋白質は、本
発明に詳記のシグナルペプチド又は当業界で公知の他の
細菌シグナルペプチドを有するストレプトミセスStrept
omycesから分泌可能であった。達成し得る分泌のレベル
は培養物の１μg/以上であるが、好ましくは1mg/以
上である。
され、異種蛋白質に連結される場合、正しいアミノ末端
基を有している異種蛋白質を、媒質中へ分泌させるよう
な任意のアミノ酸配列をコードするものである。好まし
い実施態様においては、ストレプトミセス・グリセウス
Streptomyces griseusプロテアーゼＢのシグナルペプチ
ド（カナダ国特許出願第542,678号明細書。1987年７月2
1日にCangene Corporationが出願した。）がGM−CSFを
分泌させるのに用いられる：特に配列MRIKRTSNRSNAARRV
RTTAVLAGLAAVAALAVPTANAの38−アミノ酸ペプチドが好ま
しい。別の実施態様においては、GM−CSFの分泌を支配
するために使用されるシグナルペプチドは、アミノ末端
基でストレプトミセス・プリカートスStreptomyces pli
catusエンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ
（エンドＨ）シグナルペプチドの９〜34番目のアミノ酸
に連結するS.griseusプロテアーゼＢシグナルペプチド
の最初の15個のアミノ酸より成るハイブリッド（Robbin
s等,1984）：特に配列MRIKRTSNRSNAARRVRTAALALSAAAALV
LGSTAASGASAの41−アミノ酸ペプチドである。GM−CSFの
分泌は、本発明に詳記のS.plicatusエンドＨのシグナル
ペプチド；特に配列MFTPVRRRVRTAALALSAAAALVLGSTAASGA
SAの34−アミノ酸ペプチドによっても支配可能であっ
た。分泌はさらに、別のストレプトミセスStreptomyces
シグナルペプチド：特にS.griseusプロテアーゼＡ（例
えば、MTFKRFSPLSSTSRYARLLAVASGLVAAAALATPSAVA）、S.
griseusアミラーゼ、Streptomyces R61 DD−ペプチダー
ゼのシグナルペプチド、又は当業界で公知の別のStrept
omycesシグナルペプチド（Chang,1987）により支配可能
であった。分泌はまた、上記シグナルペプチド又は全般
的合成アミノ酸配列を有するシグナルペプチドのハイブ
リッドの支配下でも遂行可能であった。シグナルペプチ
ドは、グラム陽性細菌からのもの：特にバチルス・ズブ
チルスBacillus subtilusアルカリ性プロテアーゼ（ap
r）のシグナルペプチド、又は当業界で公知のグラム陽
性細菌の別のシグナルペプチド（Chang,1987）であって
もよい。シグナルペプチドはまた、グラム陰性細菌から
のもの：特に大腸菌Escherichia coli外膜プロテインＡ
のシグナルペプチド、又は当業界で公知のグラム陰性細
菌の別のシグナルペプチド（Sjostrom等,1987）であっ
てもよい。シグナルペプチドはまた、２つ又はそれ以上
の細菌シグナルペプチドのハイブリッドであってもよ
い。ある実施態様において、GM−CSFの分泌を支配する
ために使用されるシグナルペプチドは、アミノ末端基で
B.subtilusaprシグナルペプチドの６〜30番目のアミノ
酸に連結されるS.griseusプロテアーゼＢシグナルペプ
チドの最初の15個のアミノ酸より成るハイブリッド：特
に配列MRIKRTSNRSNAARRVWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAの40
−アミノ酸ペプチドである。他の実施態様においては、
StreptomycesエンドＨのシグナルペプチドをコードする
DNAと他の細菌由来のシグナルペプチドをコードするDNA
とのハイブリッドであって、StreptomycesエンドＨのシ
グナルペプチドが少くとも31個のアミノ酸を含み、アミ
ノ末端のメチオニンから30番目から34番目のアミノ酸の
間にプロセッシング部位を有するシグルペプチドであ
る。さらに他の実施態様においては、シグナルペプチド
は、アミノ末端から17個のアミノ酸が、アルギニン、リ
ジン又はその両者を含む少くとも７個のアミノ酸を含む
ものである。GM−CSFに加えて、他の異種蛋白質は、本
発明に詳記のシグナルペプチド又は当業界で公知の他の
細菌シグナルペプチドを有するストレプトミセスStrept
omycesから分泌可能であった。達成し得る分泌のレベル
は培養物の１μg/以上であるが、好ましくは1mg/以
上である。
プロモーターは、異種蛋白質のアミノ末端基に連結さ
れるシグナルペプチドより成る融合蛋白質をコードする
RNAの合成を支配する。プロモーターは、少なくとも１
種類のストレプトミセスStreptomycesRNAポリメラーゼ
ホロ酵素の特異的結合及びそれによる転写を可能にす
る。好ましい実施態様においては、ストレプトミセス・
フラディアStreptomyces fradiaeアミノグリコシドホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子（『aph』）のプロモータ
ー（ThompsonとGray,1983）を使用して、GM−CSFに融合
されるシグナルペプチドをコードするmRNAを転写する。
れるシグナルペプチドより成る融合蛋白質をコードする
RNAの合成を支配する。プロモーターは、少なくとも１
種類のストレプトミセスStreptomycesRNAポリメラーゼ
ホロ酵素の特異的結合及びそれによる転写を可能にす
る。好ましい実施態様においては、ストレプトミセス・
フラディアStreptomyces fradiaeアミノグリコシドホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子（『aph』）のプロモータ
ー（ThompsonとGray,1983）を使用して、GM−CSFに融合
されるシグナルペプチドをコードするmRNAを転写する。
このプロモーターは、少なくとも１種のストレプトミ
セスRNAポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及びそれに
よる転写を可能とする。プロモーターは、ストレプトミ
セス・エリスレウスStreptomyces erythreusエリスロマ
イシンＥ、ストレプトミセス・コエリコロアStreptomyc
es coelicolorアガラーゼを含む別のストレプトミセス
の種Streptomyces spp.から、あるいは当業界で公知の
方法により立証されるようなプロモーター活性を有する
公知の又は未確定起源の任意の配列からのものであって
もよい。プロモーターは、１つ以上の天然プロモーター
配列又は完全合成プロモーター配列のハイブリッドであ
ってもよい。プロモーターは、向上した機能を有するプ
ロモーターの突然変異性体（version）を得るために１
つ又はそれ以上の基が置換され、挿入され又は欠失され
た天然配列又はハイブリッド配列であってもよい。突然
変異は、ランダム様式又は部位指示様式で、並びにin v
itro又は原核生物宿主細胞内で、化学的に又は酵素的に
発生し得る。
セスRNAポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及びそれに
よる転写を可能とする。プロモーターは、ストレプトミ
セス・エリスレウスStreptomyces erythreusエリスロマ
イシンＥ、ストレプトミセス・コエリコロアStreptomyc
es coelicolorアガラーゼを含む別のストレプトミセス
の種Streptomyces spp.から、あるいは当業界で公知の
方法により立証されるようなプロモーター活性を有する
公知の又は未確定起源の任意の配列からのものであって
もよい。プロモーターは、１つ以上の天然プロモーター
配列又は完全合成プロモーター配列のハイブリッドであ
ってもよい。プロモーターは、向上した機能を有するプ
ロモーターの突然変異性体（version）を得るために１
つ又はそれ以上の基が置換され、挿入され又は欠失され
た天然配列又はハイブリッド配列であってもよい。突然
変異は、ランダム様式又は部位指示様式で、並びにin v
itro又は原核生物宿主細胞内で、化学的に又は酵素的に
発生し得る。
プロモーターは、１つの転写開始部位を有する単一プ
ロモーターであっても、又は２つ以上の転写開始部位を
有する多重プロモーターであってもよい。好ましい実施
態様においては、aphプロモーターは、転写開始に関す
る２つの部位を有するDNAフラグメント上に位置する。
部位１は、翻訳イニシエーターATGのＡで転写を開始
し、一方部位２は、部位１からさらに313塩基上流で転
写を開始すると考えられる。別の実施態様では、開始部
位１のみを有するaphプロモーターを用いて、GM−CSFに
融合するシグナルペプチドをコードするmRNAを転写す
る。多重のプロモーターの各転写開始部位は、同一の又
は異なる種類のRNAポリメラーゼホロ酵素により認知さ
れ得るし、また同一又は異なる成長時間あるいは発育状
態において活性であり得る。多重の転写開始部位を有す
るプロモーターは、天然配列であってもよく、あるいは
１つ以上の天然又は合成単一プロモーター配列より成る
ハイブリッド配列であってもよい。プロモーターは、単
一であれ多重であれ、培養（構成的）中のいかなる時間
でも活性であり得るし、あるいはある種の媒地成分、代
謝物質、又は化学薬品の存否により、調節可能である。
さらに、プロモーターは、培養の温度又は化学環境の変
化により調節可能である。
ロモーターであっても、又は２つ以上の転写開始部位を
有する多重プロモーターであってもよい。好ましい実施
態様においては、aphプロモーターは、転写開始に関す
る２つの部位を有するDNAフラグメント上に位置する。
部位１は、翻訳イニシエーターATGのＡで転写を開始
し、一方部位２は、部位１からさらに313塩基上流で転
写を開始すると考えられる。別の実施態様では、開始部
位１のみを有するaphプロモーターを用いて、GM−CSFに
融合するシグナルペプチドをコードするmRNAを転写す
る。多重のプロモーターの各転写開始部位は、同一の又
は異なる種類のRNAポリメラーゼホロ酵素により認知さ
れ得るし、また同一又は異なる成長時間あるいは発育状
態において活性であり得る。多重の転写開始部位を有す
るプロモーターは、天然配列であってもよく、あるいは
１つ以上の天然又は合成単一プロモーター配列より成る
ハイブリッド配列であってもよい。プロモーターは、単
一であれ多重であれ、培養（構成的）中のいかなる時間
でも活性であり得るし、あるいはある種の媒地成分、代
謝物質、又は化学薬品の存否により、調節可能である。
さらに、プロモーターは、培養の温度又は化学環境の変
化により調節可能である。
好ましい実施態様においては、aphプロモーターを、
蛋白質、特にGM−CSFをコードする核酸配列にフレーム
内に連結されるシグナルペプチドをコードする核酸配列
に連結する。Nco I制限エンドヌクレアーゼ部位を用い
て、aphプロモーターを、シグナルペプチドをコードす
る合成オリゴヌクレオチドに連結した。この部位は、こ
の立体配座においてシグナルペプチドのアミノ末端メチ
オニンを表わすaph遺伝子の天然イニシエータATGを含有
する。ストレプトミセス・リビダンスStreptomyces liv
idansの18SリボゾームRNAの３′端に対して補完的なDNA
配列を、翻訳の開始を増大するためにこのNco I部位で
含入することができる。便宜上、Pst I部位又はNsi I部
位を、シグナルプロセッシング部位に位置させて、分泌
させるべき蛋白質をコードするDNA配列を連結する。Pst
I部位又はNsi I部位におけるGCAコドンは、シグナルペ
プチドのカルボキシ末端でのアラニンを表わす。好まし
い実施態様では、コード化シグナルペプチドのカルボキ
シ末端が、関係のあるコード化蛋白質のアミノ末端に直
接融合されるようDNA配列を形成する。配列をコードす
る付加的ペプチドをPst I部位又はNsi I部位に挿入し
て、シグナルペプチドの分泌又はプロセッシングを促進
してもよい。その結果生じるアミノ末端延長を有する蛋
白質を、自然工程により培養中に、あるいは公知の化学
的又は酵素的方法によりin vitroで除去してもよい。
蛋白質、特にGM−CSFをコードする核酸配列にフレーム
内に連結されるシグナルペプチドをコードする核酸配列
に連結する。Nco I制限エンドヌクレアーゼ部位を用い
て、aphプロモーターを、シグナルペプチドをコードす
る合成オリゴヌクレオチドに連結した。この部位は、こ
の立体配座においてシグナルペプチドのアミノ末端メチ
オニンを表わすaph遺伝子の天然イニシエータATGを含有
する。ストレプトミセス・リビダンスStreptomyces liv
idansの18SリボゾームRNAの３′端に対して補完的なDNA
配列を、翻訳の開始を増大するためにこのNco I部位で
含入することができる。便宜上、Pst I部位又はNsi I部
位を、シグナルプロセッシング部位に位置させて、分泌
させるべき蛋白質をコードするDNA配列を連結する。Pst
I部位又はNsi I部位におけるGCAコドンは、シグナルペ
プチドのカルボキシ末端でのアラニンを表わす。好まし
い実施態様では、コード化シグナルペプチドのカルボキ
シ末端が、関係のあるコード化蛋白質のアミノ末端に直
接融合されるようDNA配列を形成する。配列をコードす
る付加的ペプチドをPst I部位又はNsi I部位に挿入し
て、シグナルペプチドの分泌又はプロセッシングを促進
してもよい。その結果生じるアミノ末端延長を有する蛋
白質を、自然工程により培養中に、あるいは公知の化学
的又は酵素的方法によりin vitroで除去してもよい。
本発明の明細書に記載のシグナルペプチド、特に38−
アミノ酸プロテアーゼＢシグナルペプチド、34−アミノ
酸エンドＨシグナルペプチド、41−アミノ酸プロテアー
ゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペプチド、及び40
−アミノ酸プロテアーゼＢ−aprハイブリットシグナル
ペプチドを、異種蛋白質の分泌に関して、本発明に記載
のもの以外の発現系とともに使用し得ると予想される。
本発明に記載のシグナルペプチドを、他の発現系、特に
他のグラム陽性細菌に関する発現系（Chang,1987）、殊
にバチルス・ズブチルスBacillus subtilis及びスタフ
ィロコッカス・オウレウスStaphylococcus aureusに関
する発現系で使用してもよい。
アミノ酸プロテアーゼＢシグナルペプチド、34−アミノ
酸エンドＨシグナルペプチド、41−アミノ酸プロテアー
ゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペプチド、及び40
−アミノ酸プロテアーゼＢ−aprハイブリットシグナル
ペプチドを、異種蛋白質の分泌に関して、本発明に記載
のもの以外の発現系とともに使用し得ると予想される。
本発明に記載のシグナルペプチドを、他の発現系、特に
他のグラム陽性細菌に関する発現系（Chang,1987）、殊
にバチルス・ズブチルスBacillus subtilis及びスタフ
ィロコッカス・オウレウスStaphylococcus aureusに関
する発現系で使用してもよい。
Streptomyces以外の細菌宿主中で自然工程により、本発
明に記載のシグナルペプチドの１つをコードするDNAセ
グメントに連結し、異種蛋白質をコードするDNAセグメ
ントに連結する、プロモーターとして機能するDNAセグ
メントを含む発現系から合成可能であると予測される。
融合蛋白質は、そのアミノ末端で本発明に記載のシグナ
ルペプチドの１つを有し、そのカルボキシ末端でGM−CS
Fであり得る異種蛋白質を有するであろう。シグナルペ
プチドのカルボキシ末端は異種蛋白質のアミノ末端に直
接連結して、融合蛋白質を形成してもよい。融合蛋白質
は、細菌宿主における異種蛋白質の分泌に有用であろ
う。
明に記載のシグナルペプチドの１つをコードするDNAセ
グメントに連結し、異種蛋白質をコードするDNAセグメ
ントに連結する、プロモーターとして機能するDNAセグ
メントを含む発現系から合成可能であると予測される。
融合蛋白質は、そのアミノ末端で本発明に記載のシグナ
ルペプチドの１つを有し、そのカルボキシ末端でGM−CS
Fであり得る異種蛋白質を有するであろう。シグナルペ
プチドのカルボキシ末端は異種蛋白質のアミノ末端に直
接連結して、融合蛋白質を形成してもよい。融合蛋白質
は、細菌宿主における異種蛋白質の分泌に有用であろ
う。
プロモーター、シグナルペプチドをコードする核酸配
列、及び関係する特定の蛋白質をコードする核酸配列よ
り成る遺伝子発現系は、ストレプトミセスStreptomyces
において形質転換及び複製が可能なDNAベクター中に置
かれる。本ベクターは、pIJ101,pSLP1.2,pSCP2＊を含む
Streptomycesの天然由来のプラスミド、又はOC31を含む
Streptomycesの天然由来のファージ、あるいはStreptom
ycesにおける複製が可能な任意の非−ストレプトミセス
性プラスミド又はバクテリオファージの各々の誘導体を
含有し得る。ベクターは、宿主生物中で自律的複製が可
能であるか、あるいは宿主生物の染色体又は大型染色体
外因子への組込み（integration）を必要とする場合も
ある。後者の場合、ベクターは宿主ゲノムにおける特定
のDNA配列か又は未特定DNA配列によるin vivo組換えを
促進することができる適当な核酸配列を含有するものと
思われる。これらの配列は、プラスミド又はファージat
t部位、運搬可能因子の組換え配列、又は組込みを促す
に十分な宿主ゲノムセグメントに関する相同性を有する
任意の配列を包含し得る。Streptomycesのゲノム、殊に
Streptomyces coelicolorのDNAの5.7−kb増幅可能（amp
lifiable）単位において自然に増幅されるDNAセグメン
トはベクターに包含され、遺伝子発現系の多重コピー組
込み（multi−copy integration）を得るために使用さ
れ得る。そのベクターはまた、形質転換体の形質転換中
及びその後の培養中の両方において、宿主生物の形質転
換株の選択のための適当な遺伝子を含有する。この選択
マーカーは、チオストレプトン、カナマイシン、ビオマ
イシン、ヒグロマイシンのような抗生物質に対する耐性
等、あるいは宿主生物の独立栄養型（auxotrophic）又
は条件致死型（conditional lethal）等である。
列、及び関係する特定の蛋白質をコードする核酸配列よ
り成る遺伝子発現系は、ストレプトミセスStreptomyces
において形質転換及び複製が可能なDNAベクター中に置
かれる。本ベクターは、pIJ101,pSLP1.2,pSCP2＊を含む
Streptomycesの天然由来のプラスミド、又はOC31を含む
Streptomycesの天然由来のファージ、あるいはStreptom
ycesにおける複製が可能な任意の非−ストレプトミセス
性プラスミド又はバクテリオファージの各々の誘導体を
含有し得る。ベクターは、宿主生物中で自律的複製が可
能であるか、あるいは宿主生物の染色体又は大型染色体
外因子への組込み（integration）を必要とする場合も
ある。後者の場合、ベクターは宿主ゲノムにおける特定
のDNA配列か又は未特定DNA配列によるin vivo組換えを
促進することができる適当な核酸配列を含有するものと
思われる。これらの配列は、プラスミド又はファージat
t部位、運搬可能因子の組換え配列、又は組込みを促す
に十分な宿主ゲノムセグメントに関する相同性を有する
任意の配列を包含し得る。Streptomycesのゲノム、殊に
Streptomyces coelicolorのDNAの5.7−kb増幅可能（amp
lifiable）単位において自然に増幅されるDNAセグメン
トはベクターに包含され、遺伝子発現系の多重コピー組
込み（multi−copy integration）を得るために使用さ
れ得る。そのベクターはまた、形質転換体の形質転換中
及びその後の培養中の両方において、宿主生物の形質転
換株の選択のための適当な遺伝子を含有する。この選択
マーカーは、チオストレプトン、カナマイシン、ビオマ
イシン、ヒグロマイシンのような抗生物質に対する耐性
等、あるいは宿主生物の独立栄養型（auxotrophic）又
は条件致死型（conditional lethal）等である。
好ましい実施態様では、図２に略記の変法に従って、
ベクターとしてプラスミドpIJ680を採用した。第１段階
では、E.coliプラスミドpUC8の2354塩基対のPvu II断片
をpIJ680の3390位（第16部位）でPst I部位に導入した
（Hopwood等,1985）。ブラント末端Pvu II断片を図２に
示す通り、合成アダプターを用いてPst I部位の−TGCA
3′端に連結した。Pst I部位に挿入されるE.coliプラス
ミドを有するベクターは、アンピシリン選択下ではE.co
li中で、またチオストレプトン耐性についての選択にお
いてはストレプトミセスStreptomyces中で複製可能であ
る。ベクターのE.coliプラスミド部分は、ベクター中の
発現系の組み合わせを行うだけで、一旦完成プラスミド
がStreptomycesの形質転換に向けて用意されたならば必
要でなくなると思われる。例えば、Cla Iによる部分的
消化とその後のDNAリガーゼによるベクターの再環化（r
ecircularization）によって、Streptomycesを形質転換
する前にE.coliプラスミドセグメントを除去可能であ
る。
ベクターとしてプラスミドpIJ680を採用した。第１段階
では、E.coliプラスミドpUC8の2354塩基対のPvu II断片
をpIJ680の3390位（第16部位）でPst I部位に導入した
（Hopwood等,1985）。ブラント末端Pvu II断片を図２に
示す通り、合成アダプターを用いてPst I部位の−TGCA
3′端に連結した。Pst I部位に挿入されるE.coliプラス
ミドを有するベクターは、アンピシリン選択下ではE.co
li中で、またチオストレプトン耐性についての選択にお
いてはストレプトミセスStreptomyces中で複製可能であ
る。ベクターのE.coliプラスミド部分は、ベクター中の
発現系の組み合わせを行うだけで、一旦完成プラスミド
がStreptomycesの形質転換に向けて用意されたならば必
要でなくなると思われる。例えば、Cla Iによる部分的
消化とその後のDNAリガーゼによるベクターの再環化（r
ecircularization）によって、Streptomycesを形質転換
する前にE.coliプラスミドセグメントを除去可能であ
る。
第二段階では、aph遺伝子のプロモーター及びコード
領域を合成DNA配列で置き換えて、今後の構築を容易に
する。これは、合成Bgl IIリンカーGAGATCTCをCCGCGG
Sac II部位における２番目のＣに連結することにより、
pIJ680の4883位（部位第32番）でのSac II部位を変化
（Hopwood等,1985）させることを含む。ある実施態様で
は、合成リンカーCGGATCCGをAGATCT Bgl II部位のＣと
連結することによりBgl II部位をBamH I部位に変換し、
その結果、ベクターpSS2を生じる。別の実施態様におい
て、合成リンカーCAAGCTTGをTCTAGA Xba I部位のＧに
連結してXba I位部位をHind III部位に変換する。
領域を合成DNA配列で置き換えて、今後の構築を容易に
する。これは、合成Bgl IIリンカーGAGATCTCをCCGCGG
Sac II部位における２番目のＣに連結することにより、
pIJ680の4883位（部位第32番）でのSac II部位を変化
（Hopwood等,1985）させることを含む。ある実施態様で
は、合成リンカーCGGATCCGをAGATCT Bgl II部位のＣと
連結することによりBgl II部位をBamH I部位に変換し、
その結果、ベクターpSS2を生じる。別の実施態様におい
て、合成リンカーCAAGCTTGをTCTAGA Xba I部位のＧに
連結してXba I位部位をHind III部位に変換する。
pSS2のBamH I−Xba I断片は、プロモーター、シグナ
ルペプチドをコードする核酸配列、及び関係のある特定
の蛋白質をコードする核酸配列から成る発現系により置
き換え得る。便宜上、制限部位BamH I、及びXba Iを選
択したけれども、遺伝子発現系をベクターに結合するた
めには、これらに代えて、あるいはこれらに加えて、任
意の他の制限部位を使用可能であると理解すべきであ
る。発現系をBamH I部位とXba I部位の間に何れの方向
にでも挿入することができるが、しかし図２に示した通
り、好ましい配向とすることにより反時計方向の転写が
行われることになろう。これにより、Xba I部位に隣接
するaph転写ターミネーター〔オリジナルpIJ680の3955
位（部位21）と3843位（部位19）の間に位置する（Hopw
ood等,1985）〕の利用が可能になると考えられる。しか
しながら、当業界で公知の任意の転写ターミネーター
は、aphに対するものの代りに、又はそれに加えて使用
可能である。pSS2ベクターは、異種遺伝子の発現には用
いられない転写の開始に関する部位を有し得る。
ルペプチドをコードする核酸配列、及び関係のある特定
の蛋白質をコードする核酸配列から成る発現系により置
き換え得る。便宜上、制限部位BamH I、及びXba Iを選
択したけれども、遺伝子発現系をベクターに結合するた
めには、これらに代えて、あるいはこれらに加えて、任
意の他の制限部位を使用可能であると理解すべきであ
る。発現系をBamH I部位とXba I部位の間に何れの方向
にでも挿入することができるが、しかし図２に示した通
り、好ましい配向とすることにより反時計方向の転写が
行われることになろう。これにより、Xba I部位に隣接
するaph転写ターミネーター〔オリジナルpIJ680の3955
位（部位21）と3843位（部位19）の間に位置する（Hopw
ood等,1985）〕の利用が可能になると考えられる。しか
しながら、当業界で公知の任意の転写ターミネーター
は、aphに対するものの代りに、又はそれに加えて使用
可能である。pSS2ベクターは、異種遺伝子の発現には用
いられない転写の開始に関する部位を有し得る。
種々の遺伝子発現系をpSS2ベクターに挿入することに
より、発現ベクターを構築できる。ある実施態様によれ
ば、発現系pAPO.GMCSF（図３）は、GM−CSFをコードす
る核酸配列に連結されるプロテアーゼＢシグナルペプチ
ドをコードする核酸配列に連結されるaphプロモータを
含有する。別の実施態様によれば、発現系pAEO.GMCSF
（図４）は、GM−CSFをコードする置換可能な核酸配列
に連結されるプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシ
グナルペプチドをコードする核酸配列に連結されるaph
プロモーターを含有する。別の実施態様においては、発
現系pAPO.G（図５）は、置換可能な核酸配列に連結され
るプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする核酸配
列に連結されるaphプロモーターを含有する。さらに別
の実施態様では、Xba I部位に合成DNA（CTAGCAAGCTTG）
を挿入することにより、pAPO.Gから発現系pAPO.Hを構築
した。発現系pAEO.SX（図６）は、置換可能な核酸配列
に連結されるプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシ
グナルペプチドをコードする核酸配列に連結されるaph
プロモーターを含有する。さらに別の実施態様において
は、Xba I部位に合成DNA（CTAGCAAGCTTG）を挿入するこ
とにより、pAEO.SXから発現系pAEO.SHを構築した。同様
にこれに代わるものとしては、置換可能な核酸配列に連
結されるプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする
核酸配列に連結されるaphプロモーターを含有するpAPO.
SX（図７）がある。
より、発現ベクターを構築できる。ある実施態様によれ
ば、発現系pAPO.GMCSF（図３）は、GM−CSFをコードす
る核酸配列に連結されるプロテアーゼＢシグナルペプチ
ドをコードする核酸配列に連結されるaphプロモータを
含有する。別の実施態様によれば、発現系pAEO.GMCSF
（図４）は、GM−CSFをコードする置換可能な核酸配列
に連結されるプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシ
グナルペプチドをコードする核酸配列に連結されるaph
プロモーターを含有する。別の実施態様においては、発
現系pAPO.G（図５）は、置換可能な核酸配列に連結され
るプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする核酸配
列に連結されるaphプロモーターを含有する。さらに別
の実施態様では、Xba I部位に合成DNA（CTAGCAAGCTTG）
を挿入することにより、pAPO.Gから発現系pAPO.Hを構築
した。発現系pAEO.SX（図６）は、置換可能な核酸配列
に連結されるプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシ
グナルペプチドをコードする核酸配列に連結されるaph
プロモーターを含有する。さらに別の実施態様において
は、Xba I部位に合成DNA（CTAGCAAGCTTG）を挿入するこ
とにより、pAEO.SXから発現系pAEO.SHを構築した。同様
にこれに代わるものとしては、置換可能な核酸配列に連
結されるプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする
核酸配列に連結されるaphプロモーターを含有するpAPO.
SX（図７）がある。
全発現ベクターにおけるBamH I−Mlu I断片は、異な
るプロモーター及び／又はコードされたシグナルペプチ
ドアミノ末端を含有するDNA断片で置換し得る。また、p
AEO.GMCSF,pAEO.SX,pAEO.SH又はpAPO.SXのMlu I Pst I
断片、あるいはpAPO.G又はpAPO.HのMlu I−Nsi I断片は
代りのシグナルペプチドをコードするDNA断片で置換し
得る。同様に、pAEO.GMCSF又はpAEO.SHのPst I−Hind I
II断片；あるいはpAEO.SX又はpAPO.SXのPst I−Xba I断
片；あるいはpAPO.HのNsi I−Hind III断片；あるいはp
APO.GのNsi I−Xba I断片は、蛋白質をコードする別のD
NA断片で置換し得る。
るプロモーター及び／又はコードされたシグナルペプチ
ドアミノ末端を含有するDNA断片で置換し得る。また、p
AEO.GMCSF,pAEO.SX,pAEO.SH又はpAPO.SXのMlu I Pst I
断片、あるいはpAPO.G又はpAPO.HのMlu I−Nsi I断片は
代りのシグナルペプチドをコードするDNA断片で置換し
得る。同様に、pAEO.GMCSF又はpAEO.SHのPst I−Hind I
II断片；あるいはpAEO.SX又はpAPO.SXのPst I−Xba I断
片；あるいはpAPO.HのNsi I−Hind III断片；あるいはp
APO.GのNsi I−Xba I断片は、蛋白質をコードする別のD
NA断片で置換し得る。
本発明の好ましい実施態様を、以下例示する。ここに
記載の方法及び結果は実施例のためのものであり、いか
なる意味においても本発明の範囲を限定するものではな
い。
記載の方法及び結果は実施例のためのものであり、いか
なる意味においても本発明の範囲を限定するものではな
い。
調 製 菌株及びプラスミド ストレプトミセス・リビダンスStreptomyces lividan
s 66（Bibb等,1980）、並びにプラスミドpIJ61（1982に
Thompson等により開示され、S.lividans 66/TC73から単
離可能である）及びpIJ680（1985にHopwood等により開
示され、S.lividans TK24/TK425から単離可能である）
は、John Innes Instituteから入手した。全ての形質転
換において、E.coli HB101株（ATCC33694）を用いた。
プラスミドpUC8（VieiraとMessing,1982）、並びにpUC1
8及びpUC19（Norrander等,1983）はBethesda Research
Laboratoriesより購入した。プラスミドpUC680Tは、198
8年６月28日、寄託番号40466でAmerican Type Culture
collectionに寄託した。
s 66（Bibb等,1980）、並びにプラスミドpIJ61（1982に
Thompson等により開示され、S.lividans 66/TC73から単
離可能である）及びpIJ680（1985にHopwood等により開
示され、S.lividans TK24/TK425から単離可能である）
は、John Innes Instituteから入手した。全ての形質転
換において、E.coli HB101株（ATCC33694）を用いた。
プラスミドpUC8（VieiraとMessing,1982）、並びにpUC1
8及びpUC19（Norrander等,1983）はBethesda Research
Laboratoriesより購入した。プラスミドpUC680Tは、198
8年６月28日、寄託番号40466でAmerican Type Culture
collectionに寄託した。
材料 アプライドバイオシステムズApplied Biosystems社製
380A型DNAシンセサイザーを用いて、オリゴヌクレオチ
ドを合成した。オリゴヌクレオチド合成に用いたカラ
ム、ホスホアミダイト、及び試薬は、Technical Market
ing Associatesを通じて、アプライドバイオシステムズ
社から購入した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
ない、次いでDEAEセルロースクロマトグラフィーを行な
うことにより、オリゴヌクレオチドを精製した。DNAの
消化及び修飾用の酵素は、New England Biolabsより購
入し、提供者の勧告に従って使用した。放射性同位元素
〔α−32P〕dATP（3000Ci/mmol）及び〔γ−32P〕ATP
（3000Ci/mmol）はAmershamより入手した。チオストレ
プトンは、ニューヨークのSquibbCorporationより寄贈
された。
380A型DNAシンセサイザーを用いて、オリゴヌクレオチ
ドを合成した。オリゴヌクレオチド合成に用いたカラ
ム、ホスホアミダイト、及び試薬は、Technical Market
ing Associatesを通じて、アプライドバイオシステムズ
社から購入した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
ない、次いでDEAEセルロースクロマトグラフィーを行な
うことにより、オリゴヌクレオチドを精製した。DNAの
消化及び修飾用の酵素は、New England Biolabsより購
入し、提供者の勧告に従って使用した。放射性同位元素
〔α−32P〕dATP（3000Ci/mmol）及び〔γ−32P〕ATP
（3000Ci/mmol）はAmershamより入手した。チオストレ
プトンは、ニューヨークのSquibbCorporationより寄贈
された。
DNAの単離 アルカリ性溶解法（alkaline lysis procedure）（Ho
pwood等,1985）により、形質転換S.lividansのプラスミ
ドDNAを調製した。50μg/mlアンピシリンを含有するYT
培地（Miller,1972）上でE.coli形質転換株を育成し
た。急速煮沸法（HolmesとQuigley,1981）により、E.co
liから得たプラスミドDNAを精製した。全ての構築に用
いたDNA断片及びベクターを低融点アガロース上で電気
泳動により分離し、フェノール抽出及びエタノール析出
（Maniatis等,1982）により溶融アガロースから精製し
た。
pwood等,1985）により、形質転換S.lividansのプラスミ
ドDNAを調製した。50μg/mlアンピシリンを含有するYT
培地（Miller,1972）上でE.coli形質転換株を育成し
た。急速煮沸法（HolmesとQuigley,1981）により、E.co
liから得たプラスミドDNAを精製した。全ての構築に用
いたDNA断片及びベクターを低融点アガロース上で電気
泳動により分離し、フェノール抽出及びエタノール析出
（Maniatis等,1982）により溶融アガロースから精製し
た。
DNA配列決定 HPLC（Edwardson等,1986）により精製したプラスミド
DNAを、ジデオキシ法（Sanger等,1977）の変法（Hattor
i等,1985）を用いて配列決定した。必要な場合は、M13
バクテリオファージmp18及びmp19（Norrander等,1983）
中でサブクローンを調製し、−20ユニバーサルプライマ
ー（New England Biolabs）を用いてジデオキシ配列決
定反応を行なった。強固な二次構造のいくつかの領域に
おいて、圧縮及びポリメラーゼ欠損は、配列を明確にす
るためのジデオキシ反応において、デアザグアノシン
（Mizusana等,1986）（Boehringer Mannheim）類縁体の
使用を必要とした。DNASTARtmのソフトウェア（Doggett
とBlattner,1985）を用いて配列をコンパイルした。
DNAを、ジデオキシ法（Sanger等,1977）の変法（Hattor
i等,1985）を用いて配列決定した。必要な場合は、M13
バクテリオファージmp18及びmp19（Norrander等,1983）
中でサブクローンを調製し、−20ユニバーサルプライマ
ー（New England Biolabs）を用いてジデオキシ配列決
定反応を行なった。強固な二次構造のいくつかの領域に
おいて、圧縮及びポリメラーゼ欠損は、配列を明確にす
るためのジデオキシ反応において、デアザグアノシン
（Mizusana等,1986）（Boehringer Mannheim）類縁体の
使用を必要とした。DNASTARtmのソフトウェア（Doggett
とBlattner,1985）を用いて配列をコンパイルした。
実施例１ pUC680Tの作製 ストレプトミセスStreptomycesプラスミドpIJ680（１
〜２μｇ）を４分間、1.2単位のPst Iを用いた部分消化
により線状化した。線状化pIJ680プラスミドを表わす5.
3−kb Pst I DNA断片をPst I及び仔ウシ腸アルカリホス
ファターゼを用いて消化されたE.coli（大腸菌）プラス
ミドpUC8と混合した。次いでその混合物をT4DNAリガー
ゼで結合して、E.coli中に形質転換した。その形質転換
体を、正しい組換え体に関し、プラスミドDNA分析によ
りスクリーニングした。あるプラスミド、pUC680は、pI
J680の3390位（部位番号16）でPst I部位に挿入されたp
UC8プラスミドを有した。
〜２μｇ）を４分間、1.2単位のPst Iを用いた部分消化
により線状化した。線状化pIJ680プラスミドを表わす5.
3−kb Pst I DNA断片をPst I及び仔ウシ腸アルカリホス
ファターゼを用いて消化されたE.coli（大腸菌）プラス
ミドpUC8と混合した。次いでその混合物をT4DNAリガー
ゼで結合して、E.coli中に形質転換した。その形質転換
体を、正しい組換え体に関し、プラスミドDNA分析によ
りスクリーニングした。あるプラスミド、pUC680は、pI
J680の3390位（部位番号16）でPst I部位に挿入されたp
UC8プラスミドを有した。
pIJ680のサブクローンを作製して、aphプロモーター
及びコード領域の置換を容易にした。このサブクローン
pCM680Bは、pIJ680（Hopwoodら,1985）の4883位から529
0位まで（部位番号32から１の間）の0.41−kb Sac II
−Xho I DNA断片を含有する。合成リンカーGAGATCTC
を、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片を用いて平滑末端
化されたSac II部位に結合することにより、Sac II部位
をBgl IIに変えた。新規に生成されたBgl II部位は、Xb
a I部位で終わる0.92−kbの合成DNAに隣接している。
及びコード領域の置換を容易にした。このサブクローン
pCM680Bは、pIJ680（Hopwoodら,1985）の4883位から529
0位まで（部位番号32から１の間）の0.41−kb Sac II
−Xho I DNA断片を含有する。合成リンカーGAGATCTC
を、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片を用いて平滑末端
化されたSac II部位に結合することにより、Sac II部位
をBgl IIに変えた。新規に生成されたBgl II部位は、Xb
a I部位で終わる0.92−kbの合成DNAに隣接している。
pIJ680サブクローンと連結する合成DNA断片を含有す
るpCM680Bの1.33−kb Xba I−Xho I DNA断片を、E.co
liベクターを含むpUC680の6.6−kb Xba I−Xho I DNA
断片と混合した。その混合物をT4DNAリガーゼと結合
し、E.coli中に形質転換した。その結果生じたプラスミ
ドpUC680Tを、形質転換体のプラスミドDNAを分析するこ
とにより見出した。プラスミドpUC680Tは、1988年６月2
8日、the American Type Culture Collectionに寄託番
号40466号で寄託された。
るpCM680Bの1.33−kb Xba I−Xho I DNA断片を、E.co
liベクターを含むpUC680の6.6−kb Xba I−Xho I DNA
断片と混合した。その混合物をT4DNAリガーゼと結合
し、E.coli中に形質転換した。その結果生じたプラスミ
ドpUC680Tを、形質転換体のプラスミドDNAを分析するこ
とにより見出した。プラスミドpUC680Tは、1988年６月2
8日、the American Type Culture Collectionに寄託番
号40466号で寄託された。
実施例２ pSS2の作製 pUC8の2.36−kb Pvu II断片を、T4DNAリガーゼを用い
て、配列CATCGATGのリン酸化Cla Iリンカー（New Engla
nd Biolabs）に結合した。65℃に加熱して結合反応を終
結させ、連続的リンカーを結合して生成した部位を利用
するNsi Iで消化した。2.36−kb Nsi I断片を単離し
て、pUC680Tの5.3−kb Pst I断片と混合した。その混
合物を、Nsi I及びPst Iの存在下でT4DNAリガーゼを用
いて結合した。65℃に加熱して結合反応を終結させ、E.
coli中に形質転換した。形質転換体のプラスミドDNAを
分析することにより見出されたプラスミドpSS1は、前の
方のPst I部位に第２図に示す方向で挿入されたE.coli
プラスミドセグメントを含有する。
て、配列CATCGATGのリン酸化Cla Iリンカー（New Engla
nd Biolabs）に結合した。65℃に加熱して結合反応を終
結させ、連続的リンカーを結合して生成した部位を利用
するNsi Iで消化した。2.36−kb Nsi I断片を単離し
て、pUC680Tの5.3−kb Pst I断片と混合した。その混
合物を、Nsi I及びPst Iの存在下でT4DNAリガーゼを用
いて結合した。65℃に加熱して結合反応を終結させ、E.
coli中に形質転換した。形質転換体のプラスミドDNAを
分析することにより見出されたプラスミドpSS1は、前の
方のPst I部位に第２図に示す方向で挿入されたE.coli
プラスミドセグメントを含有する。
pSS1の唯一のBgl II部位をBamH Iに変えて、プロモー
ター配列の交換を容易にした。プラスミドpSS1をBgl II
で消化して、線状化プラスミドの末端をDNAポリメラー
ゼＩのKlenow断片で塞いだ。次いで、平滑末端化DNA断
片を、T4DNAリガーゼを用いて配列CGGATCCGのリン酸化B
amH Iリンカー（New England Biolabs）に結合した。65
℃に加熱して結合反応を終結させ、BamH Iで消化した。
次いで、BamH I末端を有する精製線状プラスミドを、T4
DNAリガーゼを用いて再環化し、E.coli中に形質転換し
た。その結果生じたプラスミド、即ち本来のBgl II部位
を置換する唯一のBamH I部位を有するpSS2は、形質転換
体のプラスミドDNAを分析することにより見出された。
ター配列の交換を容易にした。プラスミドpSS1をBgl II
で消化して、線状化プラスミドの末端をDNAポリメラー
ゼＩのKlenow断片で塞いだ。次いで、平滑末端化DNA断
片を、T4DNAリガーゼを用いて配列CGGATCCGのリン酸化B
amH Iリンカー（New England Biolabs）に結合した。65
℃に加熱して結合反応を終結させ、BamH Iで消化した。
次いで、BamH I末端を有する精製線状プラスミドを、T4
DNAリガーゼを用いて再環化し、E.coli中に形質転換し
た。その結果生じたプラスミド、即ち本来のBgl II部位
を置換する唯一のBamH I部位を有するpSS2は、形質転換
体のプラスミドDNAを分析することにより見出された。
実施例３ aphプロモーターを含有するDNA断片のサブク
ローニング ストレプトミセスStreptomycesプラスミドpIJ61の2.1
−kb EcoR V−Nco I断片をSau 3A Iで消化して、適当
なベクターのBamH I部位及びNco I部位に結合した。組
換え体の中で、aphプロモーターに対応する配列を有す
る0.40−kb Sau 3A I−Nco I断片を含有するpIJ61のサ
ブクローン、即ちpAPH.4が見出された（第８図）。Nco
I部位はaph遺伝子のイニシエーターATGを含有する。
ローニング ストレプトミセスStreptomycesプラスミドpIJ61の2.1
−kb EcoR V−Nco I断片をSau 3A Iで消化して、適当
なベクターのBamH I部位及びNco I部位に結合した。組
換え体の中で、aphプロモーターに対応する配列を有す
る0.40−kb Sau 3A I−Nco I断片を含有するpIJ61のサ
ブクローン、即ちpAPH.4が見出された（第８図）。Nco
I部位はaph遺伝子のイニシエーターATGを含有する。
実施例４ プロテアーゼＢプロモーター及びシグナルペ
プチドを含有するDNA断片をサブクローニング プロテアーゼＢ遺伝子を含有した2.8−kb Bal II断
片を含むプラスミドの1.4−kb BssH II断片からプロテ
アーゼＢ遺伝子のサブクローンを調製した（1987年７月
21日にCangene Corporation社が出願したカナダ国特許
出願第542,648号）。DNAポリメラーゼＩのKlenow断片を
用いてBssH II断片の末端を塞ぎ、次いで、実施例２の
教旨に従って、リン酸化BamH Iリンカーに結合した。そ
の結果得られたBamH I末端を有する1.4−kb断片を、Bam
H Iで消化された且つアルカリホスファターゼで処理さ
れたpUC8ベクター中に結合した。その結果生じたプラス
ミドpSPRBl.4は完全なプロテアーゼＢ遺伝子を含有し
た。
プチドを含有するDNA断片をサブクローニング プロテアーゼＢ遺伝子を含有した2.8−kb Bal II断
片を含むプラスミドの1.4−kb BssH II断片からプロテ
アーゼＢ遺伝子のサブクローンを調製した（1987年７月
21日にCangene Corporation社が出願したカナダ国特許
出願第542,648号）。DNAポリメラーゼＩのKlenow断片を
用いてBssH II断片の末端を塞ぎ、次いで、実施例２の
教旨に従って、リン酸化BamH Iリンカーに結合した。そ
の結果得られたBamH I末端を有する1.4−kb断片を、Bam
H Iで消化された且つアルカリホスファターゼで処理さ
れたpUC8ベクター中に結合した。その結果生じたプラス
ミドpSPRBl.4は完全なプロテアーゼＢ遺伝子を含有し
た。
２つのアニールされたオリゴヌクレオチドGGCCTCGTCT
AGA及びAAGCTTCTAGACGAGGCCTGCAをPst I部位及びHind I
II部位に結合することによって、さらにサブクローニン
グ用にプラスミドpUC8を改造して、プラスミドpUC.PXH
とした。プラスミドpSPRBl.4をPvu IIで消化して、T4DN
Aリガーゼを用いて配列GCTGCAGCのリン酸化Pst Iリンカ
ー（New England Biolabs）に結合した。65℃に加熱し
て結合反応を終結させ、Pst I及びBamH Iで消化した。
0.49−kb BamH I−Pst I断片を精製し、次いでpUC.PXH
ベクターのBamH I及びPst I部位に結合した。その結果
生じたプラスミドpPPIは、プロモーター、シグナルペプ
チド及びプロペプチドの最初の10個のアミノ酸、即ちプ
ロテアーゼＢ遺伝子のすべてを含有した。
AGA及びAAGCTTCTAGACGAGGCCTGCAをPst I部位及びHind I
II部位に結合することによって、さらにサブクローニン
グ用にプラスミドpUC8を改造して、プラスミドpUC.PXH
とした。プラスミドpSPRBl.4をPvu IIで消化して、T4DN
Aリガーゼを用いて配列GCTGCAGCのリン酸化Pst Iリンカ
ー（New England Biolabs）に結合した。65℃に加熱し
て結合反応を終結させ、Pst I及びBamH Iで消化した。
0.49−kb BamH I−Pst I断片を精製し、次いでpUC.PXH
ベクターのBamH I及びPst I部位に結合した。その結果
生じたプラスミドpPPIは、プロモーター、シグナルペプ
チド及びプロペプチドの最初の10個のアミノ酸、即ちプ
ロテアーゼＢ遺伝子のすべてを含有した。
実施例５ プロテアーゼＢシグナルペプチドを用いた発
現系の作製 異種蛋白質分泌用にプロテアーゼＢシグナルを改造す
るために、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボキ
シ末端の９個のアミノ酸及びヒト成長ホルモンのアミノ
末端の８個のアミノ酸をコードする２つの合成オリゴヌ
クレオチド42−マー及び50−マーを使用した（第10
図）。合成オリゴヌクレオチドを３通りの結合法でプロ
テアーゼＢサブクローンpPPIの0.44−kb Bam I−Hae I
I断片（第９図）、並びにBamH I及びXba Iで消化したpS
S2のベクター断片に連結した。その結果生じたプラスミ
ドpPPO.Gは、プロテアーゼＢプロモーター及びシグナル
ペプチドを含有する0.46−kb BamH I−Nsi Iセグメン
トを有した。Nsi I部位は、プロセッシング部位（−１
位）直前にアラニン残基のGCAコドンを含有した。
現系の作製 異種蛋白質分泌用にプロテアーゼＢシグナルを改造す
るために、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボキ
シ末端の９個のアミノ酸及びヒト成長ホルモンのアミノ
末端の８個のアミノ酸をコードする２つの合成オリゴヌ
クレオチド42−マー及び50−マーを使用した（第10
図）。合成オリゴヌクレオチドを３通りの結合法でプロ
テアーゼＢサブクローンpPPIの0.44−kb Bam I−Hae I
I断片（第９図）、並びにBamH I及びXba Iで消化したpS
S2のベクター断片に連結した。その結果生じたプラスミ
ドpPPO.Gは、プロテアーゼＢプロモーター及びシグナル
ペプチドを含有する0.46−kb BamH I−Nsi Iセグメン
トを有した。Nsi I部位は、プロセッシング部位（−１
位）直前にアラニン残基のGCAコドンを含有した。
プロテアーゼシグナルペプチドの最初の15個のアミノ
酸をコードする43−マーの２つの合成オリゴヌクレオチ
ドを用いて、プロテアーゼＢのシグナルペプチドをaph
プロモーターからの発現用に改造した（第11図）。合成
オリゴヌクレオチドを、３通りの結合法で、本実施例の
教旨に従って、aphプロモーターを含有する0.40−kb B
amH I−Nco I断片（第８図）及びpPPO.GのBamH I−Mlu
Iベクター断片に連結した。その結果生じた発現ベクタ
ーpAPO.Gは、プロテアーゼＢシグナルペプチドをコード
する配列に連結されたaphプロモーターを含む0.51−kb
BamH I−Nsi Iセグメントと、蛋白質をコードする置
換可能な配列を含む0.03−kb Nsi I−Xba Iセグメント
（第５図）とを有した。
酸をコードする43−マーの２つの合成オリゴヌクレオチ
ドを用いて、プロテアーゼＢのシグナルペプチドをaph
プロモーターからの発現用に改造した（第11図）。合成
オリゴヌクレオチドを、３通りの結合法で、本実施例の
教旨に従って、aphプロモーターを含有する0.40−kb B
amH I−Nco I断片（第８図）及びpPPO.GのBamH I−Mlu
Iベクター断片に連結した。その結果生じた発現ベクタ
ーpAPO.Gは、プロテアーゼＢシグナルペプチドをコード
する配列に連結されたaphプロモーターを含む0.51−kb
BamH I−Nsi Iセグメントと、蛋白質をコードする置
換可能な配列を含む0.03−kb Nsi I−Xba Iセグメント
（第５図）とを有した。
実施例６ プロテアーゼＢシグナルペプチドを用いた代
替発現系の作製 蛋白質をコードする1.1−kb Pst I−Xba I断片を含
有するプラスミドpPCMをPst I及びXba Iで消化し、その
1.1−kb断片をpPP1ベクターのPst I部位及びXba I部位
に結合した。その結果生じたプラスミドpPP1.PCMは、単
一ベクター中にpPCMの1.1−kb Pst I−Xba I断片に連
結した、pPP1の0.49−kb BamH I−Pst I断片を含有し
た。
替発現系の作製 蛋白質をコードする1.1−kb Pst I−Xba I断片を含
有するプラスミドpPCMをPst I及びXba Iで消化し、その
1.1−kb断片をpPP1ベクターのPst I部位及びXba I部位
に結合した。その結果生じたプラスミドpPP1.PCMは、単
一ベクター中にpPCMの1.1−kb Pst I−Xba I断片に連
結した、pPP1の0.49−kb BamH I−Pst I断片を含有し
た。
異種蛋白質分泌用にプロテアーゼＢシグナルをさらに
改造するために、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカ
ルボキシ末端の９個のアミノ酸をコードする２つの合成
26−マーオリゴヌクレオチドを用いる必要があった（第
12図）。合成オリゴヌクレオチドを３通りの結合法でpP
P1の0.44−kb BamH I−Hae II断片と、BamH I及びPst
Iで消化されたpPP1.PCMのベクター断片とに連結した。
その結果生じたプラスミドpPPO.PCMは、プロテアーゼＢ
プロモーター及びシグナルペプチドを含む0.46−kb Ba
mH I−Pst Iセグメントを有した。Pst I部位はプロセッ
シング部位（＋１位）直後にアラニン残基のGCAコドン
を含有した。
改造するために、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカ
ルボキシ末端の９個のアミノ酸をコードする２つの合成
26−マーオリゴヌクレオチドを用いる必要があった（第
12図）。合成オリゴヌクレオチドを３通りの結合法でpP
P1の0.44−kb BamH I−Hae II断片と、BamH I及びPst
Iで消化されたpPP1.PCMのベクター断片とに連結した。
その結果生じたプラスミドpPPO.PCMは、プロテアーゼＢ
プロモーター及びシグナルペプチドを含む0.46−kb Ba
mH I−Pst Iセグメントを有した。Pst I部位はプロセッ
シング部位（＋１位）直後にアラニン残基のGCAコドン
を含有した。
次いで、pPPO.PCMの1,6−kb BamH I−Xba I断片を、
pSS2のBamH I−Xba Iベクター断片に結合した。その結
果生じたプラスミドpPPO−PCM/S2は、蛋白質をコードす
る合成DNAセグメントに連結されたプロテアーゼＢプロ
モーター及びシグナルペプチドを、即ちpSS2ベクター内
のすべてを含有した。
pSS2のBamH I−Xba Iベクター断片に結合した。その結
果生じたプラスミドpPPO−PCM/S2は、蛋白質をコードす
る合成DNAセグメントに連結されたプロテアーゼＢプロ
モーター及びシグナルペプチドを、即ちpSS2ベクター内
のすべてを含有した。
実施例５の教旨に従って、aphプロモーターからの発
現用に、pPPO.PCM/S2作製の際のプロテアーゼＢシグナ
ルペプチドを改造した。プロテアーゼＢシグナルペプチ
ドの最初の15個のアミノ酸をコードする43−マーのオリ
ゴヌクレオチドを、aphプロモーターを含有する0.40−k
b BamH I−Nco I断片及びpPPO.PCMのBamH I−Mlu Iベ
クター断片に３通りの結合方法で連結した。その結果生
じた発現ベクターpAPO.PCMは、プロテアーゼＢシグナル
ペプチドをコードする配列に連結されたaphプロモータ
ーを含む0.51−kb BamH I−Pst Iセグメントを有し
た。
現用に、pPPO.PCM/S2作製の際のプロテアーゼＢシグナ
ルペプチドを改造した。プロテアーゼＢシグナルペプチ
ドの最初の15個のアミノ酸をコードする43−マーのオリ
ゴヌクレオチドを、aphプロモーターを含有する0.40−k
b BamH I−Nco I断片及びpPPO.PCMのBamH I−Mlu Iベ
クター断片に３通りの結合方法で連結した。その結果生
じた発現ベクターpAPO.PCMは、プロテアーゼＢシグナル
ペプチドをコードする配列に連結されたaphプロモータ
ーを含む0.51−kb BamH I−Pst Iセグメントを有し
た。
便宜上、ベクターpAPO.PCM内において蛋白質をコード
するDNAセグメントを、0.8−kb Sac I−Xba I断片を欠
失させることにより短縮した。ベクターpAPO.PCMをSac
I及びXba Iで消化し、合成オリゴヌクレオチドCTAGAGCT
に結合することによりベクター断片を再環化した。その
結果生じた発現ベクターpAPO.SX（第７図）は、Sac I部
位及びXba I部位の双方を保持するが、プロテアーゼＢ
シグナルペプチドをコードする配列に連結したaphプロ
モーターを含有する0.51−kb BamH I−Pst Iセグメン
トと、蛋白質をコードする置換可能な配列を含有する0.
32−kb Pst I−Xba I（又はPst I−Sac I）セグメント
とを有する。
するDNAセグメントを、0.8−kb Sac I−Xba I断片を欠
失させることにより短縮した。ベクターpAPO.PCMをSac
I及びXba Iで消化し、合成オリゴヌクレオチドCTAGAGCT
に結合することによりベクター断片を再環化した。その
結果生じた発現ベクターpAPO.SX（第７図）は、Sac I部
位及びXba I部位の双方を保持するが、プロテアーゼＢ
シグナルペプチドをコードする配列に連結したaphプロ
モーターを含有する0.51−kb BamH I−Pst Iセグメン
トと、蛋白質をコードする置換可能な配列を含有する0.
32−kb Pst I−Xba I（又はPst I−Sac I）セグメント
とを有する。
実施例７ プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグ
ナルペプチドの使用した発現系の作製 エンドＨシグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレ
プトミセス用のコドン使用法（Codon usage）を用い
て、合成DNA配列を決定した。合成配列及びその相補鎖
を６つのオリゴヌクレオチドに分割した。これらのうち
最初の２つ、即ちS1.END及びS2.ENDをaphプロモーター
に連結させた（実施例11参照）。これらのうちその次の
４つ、即ちS3.END〜S6.ENDは、エンドＨシグナルペプチ
ドの残りの27個のアミノ酸をコードした（第13図）。オ
リゴヌクレオチドS4.END及びS5.END（各２μｇ）を、10
mM Tris塩酸（pH7.5）、10mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM A
TP及び５単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを含有する
20μの反応液中で37℃で30分間、別々にリン酸化し
た。リン酸化オリゴヌクレオチド（各10μ）を各々１
μｇの非リン酸化S3.END及びS6.END.並びに500mM Tris
塩酸（pH7.8）−100mM MgCl2 3μと混合して、最終容
量を31μとした。90℃で10分間、オリゴヌクレオチド
のアニーリングを行い、その後12〜16時間、室温に徐々
に冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチド（15μ
）を、50mM Tris塩酸（pH7.8）、10mM MgCl2,1mM ATP
及び1600単位のT4DNAリガーゼを含有する200μの反応
液中で、16℃で４時間、ともに結合した。次いで、エン
ドＨシグナルペプチドをコードする完全合成遺伝子を、
aphプロモーター、プロテアーゼＢシグナルペプチド、
及び置換可能な合成なDNAセグメントを含有する発現ベ
クターpAPO.SXのMlu I部位及びPst I部位に結合した
（第７図）。これは、プロテアーゼＢシグナルのアミノ
末端の15個のアミノ酸をエンドＨシグナルのカルボキシ
末端の26個のアミノ酸に連結し、プロテアーゼＢ−エン
ドＨハイブリッドシグナルペプチドを形成した。Pst I
部位は、シグナルペプチドの−１位にアラニンのGCAコ
ドンを含有する。その結果生じた発現ベクターpAEO.SX
は、プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペ
プチドをコードする配列に連結したaphプロモータを含
有する0.52−kb BamH I−Pst I断片と、蛋白質をコー
ドする置換可能な配列を含有する0.32−kb Pst I−Xba
I（又はPst I−Sac I）セグメントとを有した（第６
図）。
ナルペプチドの使用した発現系の作製 エンドＨシグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレ
プトミセス用のコドン使用法（Codon usage）を用い
て、合成DNA配列を決定した。合成配列及びその相補鎖
を６つのオリゴヌクレオチドに分割した。これらのうち
最初の２つ、即ちS1.END及びS2.ENDをaphプロモーター
に連結させた（実施例11参照）。これらのうちその次の
４つ、即ちS3.END〜S6.ENDは、エンドＨシグナルペプチ
ドの残りの27個のアミノ酸をコードした（第13図）。オ
リゴヌクレオチドS4.END及びS5.END（各２μｇ）を、10
mM Tris塩酸（pH7.5）、10mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM A
TP及び５単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを含有する
20μの反応液中で37℃で30分間、別々にリン酸化し
た。リン酸化オリゴヌクレオチド（各10μ）を各々１
μｇの非リン酸化S3.END及びS6.END.並びに500mM Tris
塩酸（pH7.8）−100mM MgCl2 3μと混合して、最終容
量を31μとした。90℃で10分間、オリゴヌクレオチド
のアニーリングを行い、その後12〜16時間、室温に徐々
に冷却した。アニールしたオリゴヌクレオチド（15μ
）を、50mM Tris塩酸（pH7.8）、10mM MgCl2,1mM ATP
及び1600単位のT4DNAリガーゼを含有する200μの反応
液中で、16℃で４時間、ともに結合した。次いで、エン
ドＨシグナルペプチドをコードする完全合成遺伝子を、
aphプロモーター、プロテアーゼＢシグナルペプチド、
及び置換可能な合成なDNAセグメントを含有する発現ベ
クターpAPO.SXのMlu I部位及びPst I部位に結合した
（第７図）。これは、プロテアーゼＢシグナルのアミノ
末端の15個のアミノ酸をエンドＨシグナルのカルボキシ
末端の26個のアミノ酸に連結し、プロテアーゼＢ−エン
ドＨハイブリッドシグナルペプチドを形成した。Pst I
部位は、シグナルペプチドの−１位にアラニンのGCAコ
ドンを含有する。その結果生じた発現ベクターpAEO.SX
は、プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペ
プチドをコードする配列に連結したaphプロモータを含
有する0.52−kb BamH I−Pst I断片と、蛋白質をコー
ドする置換可能な配列を含有する0.32−kb Pst I−Xba
I（又はPst I−Sac I）セグメントとを有した（第６
図）。
実施例８ GM−CSFをコードする合成遺伝子の作製 ストレプトミセスStreptomyces用のコドン選択法を用
いたGM−CSFアミノ酸配列の逆翻訳により合成DNA配列を
決定した。実施例７の教旨に従って、ともにアニールさ
れ、結合される16個のオリゴヌクレオチドの合成に、こ
のDNA配列及びその逆相補鎖（reverse complement）を
用いた。次いで、完全な0.48−kb合成GM−CSF遺伝子
（第１図）をpUC18のPst I部位及びXba I部位に結合
し、E.coliの形質転換に用いた。Pst I部位は−１位に
アラニンのGCAコドンを含有したが、これはプロテアー
ゼＢ及びエンドＨの発現系と矛盾しない。プラスミドDN
Aの制限分析により形質転換体をスクリーニングした
後、DNA配列分析により、合成GM−CSF遺伝子が本物であ
ることが確定された。
いたGM−CSFアミノ酸配列の逆翻訳により合成DNA配列を
決定した。実施例７の教旨に従って、ともにアニールさ
れ、結合される16個のオリゴヌクレオチドの合成に、こ
のDNA配列及びその逆相補鎖（reverse complement）を
用いた。次いで、完全な0.48−kb合成GM−CSF遺伝子
（第１図）をpUC18のPst I部位及びXba I部位に結合
し、E.coliの形質転換に用いた。Pst I部位は−１位に
アラニンのGCAコドンを含有したが、これはプロテアー
ゼＢ及びエンドＨの発現系と矛盾しない。プラスミドDN
Aの制限分析により形質転換体をスクリーニングした
後、DNA配列分析により、合成GM−CSF遺伝子が本物であ
ることが確定された。
実施例９ プロテアーゼＢシグナルペプチドを用いたGM
−CSF用発現ベクターの作製 pAPO.GのXba I部位をHind III部位に変換して、合成G
M−CSF遺伝子の挿入を容易にした。ベクターpAPO.GをXb
a Iで消化し、その結果生じた線状ベクター末端をDNAポ
リメラーゼＩのKlenow断片を用いて塞ぎ、次いでT4DNA
リガーゼを用いて配列CAAGCTTGのリン酸化Hind IIIリン
カー（New England Biolabs）に結合した。65℃に加熱
して反応を終結させ、Hind IIIで消化した。次いで、T4
DNAリガーゼを用いて、Hind III末端を有する精製線状
プラスミドを再環化した。その結果生じた発現ベクター
pAPO.Hは、プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードす
る配列に連結したaphプロモーターを含む0.51−kb Bam
H I−Nsi Iセグメントと、蛋白質をコードする置換可能
な配列を含む0.03−kb Nsi I−Hind IIIセグメントと
を有する。
−CSF用発現ベクターの作製 pAPO.GのXba I部位をHind III部位に変換して、合成G
M−CSF遺伝子の挿入を容易にした。ベクターpAPO.GをXb
a Iで消化し、その結果生じた線状ベクター末端をDNAポ
リメラーゼＩのKlenow断片を用いて塞ぎ、次いでT4DNA
リガーゼを用いて配列CAAGCTTGのリン酸化Hind IIIリン
カー（New England Biolabs）に結合した。65℃に加熱
して反応を終結させ、Hind IIIで消化した。次いで、T4
DNAリガーゼを用いて、Hind III末端を有する精製線状
プラスミドを再環化した。その結果生じた発現ベクター
pAPO.Hは、プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードす
る配列に連結したaphプロモーターを含む0.51−kb Bam
H I−Nsi Iセグメントと、蛋白質をコードする置換可能
な配列を含む0.03−kb Nsi I−Hind IIIセグメントと
を有する。
GM−CSF遺伝子を含有する、pUC.GMCSFの0.48−kb Ps
t I−Xba I断片を、T4DNAリガーゼを用いて、aphプロモ
ータを含有し、且つプロテアーゼＢシグナルペプチドを
コードするpAPO.GのBamH I−Pst Iベクター断片に結合
した。その結果得られた発現ベクターpAPO.GMCSF内で、
コードされたシグナルペプチドのカルボキシ末端をコー
ドされたGM−CSF蛋白質のアミノ末端に直接融合する。
t I−Xba I断片を、T4DNAリガーゼを用いて、aphプロモ
ータを含有し、且つプロテアーゼＢシグナルペプチドを
コードするpAPO.GのBamH I−Pst Iベクター断片に結合
した。その結果得られた発現ベクターpAPO.GMCSF内で、
コードされたシグナルペプチドのカルボキシ末端をコー
ドされたGM−CSF蛋白質のアミノ末端に直接融合する。
実施例10 プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグ
ナルペプチドを用いたGM−CSF用発現ベクターの作製 pAEO.SXのXba I部位を、実施例９の教旨に従って、Hi
nd III部位に変換した。その結果生じた発現ベクターpA
EO.SHは、プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグ
ナルペプチドをコードする配列に連結したaphプロモー
タを含む0.52−kbのBamH I−Pst Iセグメントと、蛋白
質をコードする置換可能な配列を含む0.32−kb Pst I
−Hind III（又はPst I−Sac I）セグメントを有する。
ナルペプチドを用いたGM−CSF用発現ベクターの作製 pAEO.SXのXba I部位を、実施例９の教旨に従って、Hi
nd III部位に変換した。その結果生じた発現ベクターpA
EO.SHは、プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグ
ナルペプチドをコードする配列に連結したaphプロモー
タを含む0.52−kbのBamH I−Pst Iセグメントと、蛋白
質をコードする置換可能な配列を含む0.32−kb Pst I
−Hind III（又はPst I−Sac I）セグメントを有する。
GM−CSF遺伝子を含有するpUC.GMCSFの0.48−kb Pst
I−Hind IIIを、aphプロモータを含有し、且つプロテア
ーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペプチドをコー
ドするpAEO.SHのPst I−Hind IIIベクター断片に結合し
た。その結果得られた発現ベクターpAEO.GMCSF内で、コ
ードされたシグナルペプチドのカルボキシ末端をコード
されたGM−CSF蛋白質のアミノ末端に直接融合する。
I−Hind IIIを、aphプロモータを含有し、且つプロテア
ーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペプチドをコー
ドするpAEO.SHのPst I−Hind IIIベクター断片に結合し
た。その結果得られた発現ベクターpAEO.GMCSF内で、コ
ードされたシグナルペプチドのカルボキシ末端をコード
されたGM−CSF蛋白質のアミノ末端に直接融合する。
実施例11 エンドＨシグナルペプチドを用いた発現系の
作製 pAEO.GMCSF中のシグナルペプチドのアミノ末端を、実
施例５の教旨に従って、0.44−kb BamH I−Mlu I断片
を３通りの結合法で、pAPH.4の0.40−kb BamH I−Nco
I断片、並びにアニールされたオリゴヌクレオチドS1.EN
D（CATGTTCACTCCCGTTCGGAGA）及びS2.END（CGCGTCTCCGA
ACCGGAGTGAA）で置換することにより、プロテアーゼＢ
からエンドＨに変えた。その結果生じた発現ベクターpA
EO−1.GMCSFは、エンドＨシグナルペプチドをコードす
る配列に連結したaphプロモーターを含む0.50−kb Bam
H I−Pst I断片を有した。
作製 pAEO.GMCSF中のシグナルペプチドのアミノ末端を、実
施例５の教旨に従って、0.44−kb BamH I−Mlu I断片
を３通りの結合法で、pAPH.4の0.40−kb BamH I−Nco
I断片、並びにアニールされたオリゴヌクレオチドS1.EN
D（CATGTTCACTCCCGTTCGGAGA）及びS2.END（CGCGTCTCCGA
ACCGGAGTGAA）で置換することにより、プロテアーゼＢ
からエンドＨに変えた。その結果生じた発現ベクターpA
EO−1.GMCSFは、エンドＨシグナルペプチドをコードす
る配列に連結したaphプロモーターを含む0.50−kb Bam
H I−Pst I断片を有した。
実施例12 プロテアーゼＢ−aprハイブリッドシグナル
ペプチドを用いたGM−CSF用発現ベクターの作製 aprシグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレプト
ミセスStreptomyces用のコドン使用法を用いて、合成DN
A配列を決定した。プロテアーゼＢ−aprハイブリッドシ
グナルペプチド発現ベクターの作製には、プロテアーゼ
Ｂシグナルペプチドのアミノ酸15及びaprシグナルペプ
チドのカルボキシ末端の25個のアミノ酸をコードする２
つの合成オリゴヌクレオチド、81−マーと73−マーの使
用を必要とした（第14図）。合成オリゴヌクレオチドを
アニールし、次いで発現ベクターpAEO.SHのMlu I部位及
びPst I部位に結合した（第６図）。その結果生じたプ
ラスミドpAapr.SHは、aphプロモーター、プロテアーゼ
Ｂ−aprハイブリッドシグナルペプチドをコードする配
列、及び置換可能な合成DNAセグメントを含有した。プ
ロテアーゼＢ−aprハイブリッドシグナルペプチドは、a
prシグナルペプチドのカルボキシ末端の25個のアミノ酸
に連結したプロテアーゼＢシグナルペプチドのアミド末
端の15個のアミノ酸を含有する。
ペプチドを用いたGM−CSF用発現ベクターの作製 aprシグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレプト
ミセスStreptomyces用のコドン使用法を用いて、合成DN
A配列を決定した。プロテアーゼＢ−aprハイブリッドシ
グナルペプチド発現ベクターの作製には、プロテアーゼ
Ｂシグナルペプチドのアミノ酸15及びaprシグナルペプ
チドのカルボキシ末端の25個のアミノ酸をコードする２
つの合成オリゴヌクレオチド、81−マーと73−マーの使
用を必要とした（第14図）。合成オリゴヌクレオチドを
アニールし、次いで発現ベクターpAEO.SHのMlu I部位及
びPst I部位に結合した（第６図）。その結果生じたプ
ラスミドpAapr.SHは、aphプロモーター、プロテアーゼ
Ｂ−aprハイブリッドシグナルペプチドをコードする配
列、及び置換可能な合成DNAセグメントを含有した。プ
ロテアーゼＢ−aprハイブリッドシグナルペプチドは、a
prシグナルペプチドのカルボキシ末端の25個のアミノ酸
に連結したプロテアーゼＢシグナルペプチドのアミド末
端の15個のアミノ酸を含有する。
GM−CSFのアミノ末端の９個のアミノ酸をコードする
２つの合成オリゴヌクレオチド21−マー（CCCGCCCGGTCG
CCCTCGCCG）及び29−マー（TCGACGGCGAGGGCGACCGGGCGGG
TGCA）を用いることにより、合成GM−CSF遺伝子をpAap
r.SH発現ベクターに適応させた。合成オリゴヌクレオチ
ドをアニールし、次いで３通りの結合法で、pUC、GMCSF
の0.36−kb Sal I−Hind III断片（第１図）、並びにP
st I及びHind IIIで消化されたpAapr.SHのベクター断片
に結合した。その結果得られた発現ベクターpAapr.GMCS
F内で、コードされたシグナルペプチドのカルボキシ末
端を、コードされたGM−CSF蛋白質のアミノ末端に直接
融合する。
２つの合成オリゴヌクレオチド21−マー（CCCGCCCGGTCG
CCCTCGCCG）及び29−マー（TCGACGGCGAGGGCGACCGGGCGGG
TGCA）を用いることにより、合成GM−CSF遺伝子をpAap
r.SH発現ベクターに適応させた。合成オリゴヌクレオチ
ドをアニールし、次いで３通りの結合法で、pUC、GMCSF
の0.36−kb Sal I−Hind III断片（第１図）、並びにP
st I及びHind IIIで消化されたpAapr.SHのベクター断片
に結合した。その結果得られた発現ベクターpAapr.GMCS
F内で、コードされたシグナルペプチドのカルボキシ末
端を、コードされたGM−CSF蛋白質のアミノ末端に直接
融合する。
実施例13 単一の転写開始部位を有するaphプロモータ
ーを用いたGM−CSF用発現ベクターの作製 発現ベクターpAPO.GMCSFをSac IIで消化し、その結果
生じた断片をDNAポリメラーゼＩのKlenow断片で処理し
て平滑末端化した。次いで平滑末端をもつSac II断片
を、実施例２の教旨に従ってリン酸化BamH Iリンカーに
結合した。結合混合物をBamH I及びHind IIIで消化し
て、0.62−kb断片を精製した。次いで0.62−kb BamH I
−Hind III断片を、BamH I及びHind IIIで消化されたpA
PO.Hのベクター断片に結合した。その結果生じた発現ベ
クターpA＊PO.GMCSFは、GM−CSFをコードする配列に連
結されたプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする
配列に連結した0.12−kb aphプロモータセグメントを有
した。
ーを用いたGM−CSF用発現ベクターの作製 発現ベクターpAPO.GMCSFをSac IIで消化し、その結果
生じた断片をDNAポリメラーゼＩのKlenow断片で処理し
て平滑末端化した。次いで平滑末端をもつSac II断片
を、実施例２の教旨に従ってリン酸化BamH Iリンカーに
結合した。結合混合物をBamH I及びHind IIIで消化し
て、0.62−kb断片を精製した。次いで0.62−kb BamH I
−Hind III断片を、BamH I及びHind IIIで消化されたpA
PO.Hのベクター断片に結合した。その結果生じた発現ベ
クターpA＊PO.GMCSFは、GM−CSFをコードする配列に連
結されたプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする
配列に連結した0.12−kb aphプロモータセグメントを有
した。
実施例14 GM−CSF発現系を有するS.lividansの形質転
換 S.lividans 66のプロトプラストを形質転換に用い
た。S.lividans 66の培養物を、0.5％グリシンを含むYE
ME培地（Hopwoodら,1985）中で30℃で40時間増殖させ
た。開示の方法（Hopwoodら,1985）と同様にして、採取
した菌糸をリゾチームで処理してプロトプラストを調製
し、ミラクロスMiracloth（Calbiochem Hoechst）を通
して濾過することにより精製した。プロトプラスト（４
×109個）を発現ベクター（１μｇ）のプラスミドDNAで
形質転換し、開示の方法（Hopwoodら,1985）と同様にし
て、R2YE平板上に接種した。30℃で22時間インキュベー
トした後、平板をチオストレプトン（30μg/ml）を含有
するSoft Nutrient Agarで被覆し、胞子形成が起こるま
で、30℃でインキュベートした。
換 S.lividans 66のプロトプラストを形質転換に用い
た。S.lividans 66の培養物を、0.5％グリシンを含むYE
ME培地（Hopwoodら,1985）中で30℃で40時間増殖させ
た。開示の方法（Hopwoodら,1985）と同様にして、採取
した菌糸をリゾチームで処理してプロトプラストを調製
し、ミラクロスMiracloth（Calbiochem Hoechst）を通
して濾過することにより精製した。プロトプラスト（４
×109個）を発現ベクター（１μｇ）のプラスミドDNAで
形質転換し、開示の方法（Hopwoodら,1985）と同様にし
て、R2YE平板上に接種した。30℃で22時間インキュベー
トした後、平板をチオストレプトン（30μg/ml）を含有
するSoft Nutrient Agarで被覆し、胞子形成が起こるま
で、30℃でインキュベートした。
実施例15 S.Lividans形質転換体の増殖 GM−CSF発現ベクターで形質転換されたS.lividans 66
のコロニーを、チオストレプトン（５μg/ml）を含有す
るLB培地15ml中に接種し、32℃で65時間増殖させた。15
ml組織ホモジナイザー（Tenbroeck−Bellco）を用いて
培養物を分散させて、二次培養用接種材料として用い
た。LB培地200ml＋チオストレプトン（５μg/ml）を含
有する２のバッフル付振盪フラスコに吸光度（A600）
0.2となるように接触し、環境シェーカー（240rpm）中
で２〜４日間、32℃でインキュベートした。増殖０〜96
時間目の間の適当な時点で培養物から10mlのアリコート
を取り出した。乾燥重量測定に用いる菌糸を、４℃の臨
床用遠心分離器中で4000rpmで10分間遠心分離して取り
出した。GM−CSFを含有する分泌蛋白質を含む上清画分
を分析前に−20℃で凍結した。
のコロニーを、チオストレプトン（５μg/ml）を含有す
るLB培地15ml中に接種し、32℃で65時間増殖させた。15
ml組織ホモジナイザー（Tenbroeck−Bellco）を用いて
培養物を分散させて、二次培養用接種材料として用い
た。LB培地200ml＋チオストレプトン（５μg/ml）を含
有する２のバッフル付振盪フラスコに吸光度（A600）
0.2となるように接触し、環境シェーカー（240rpm）中
で２〜４日間、32℃でインキュベートした。増殖０〜96
時間目の間の適当な時点で培養物から10mlのアリコート
を取り出した。乾燥重量測定に用いる菌糸を、４℃の臨
床用遠心分離器中で4000rpmで10分間遠心分離して取り
出した。GM−CSFを含有する分泌蛋白質を含む上清画分
を分析前に−20℃で凍結した。
実施例16 GM−CSF分泌のモニタリング GM−CSFを含有する分泌蛋白質を含む実施例15に記載
の上清画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分析し、関係のある蛋白質を、蛋白質の特異染色法によ
り染色するかあるいはWesternブロッティングにより分
析して視覚化した。培養上清の1.5mlのアリコートを、
最終濃度10％（w/v）となるようにトリクロロ酢酸（TC
A）の50％（w/v）溶液（氷上）を添加し、更にその結果
得られた混合液を約４℃で約15〜30分間インキュベート
することにより凝集させた。GM−CSFを含有する分泌蛋
白質を含む生成沈殿物を、室温で５分間、最大速度でEp
pendort遠心器中で遠心分離して収集した。2N NaOHを添
加して、再懸濁TCA沈殿物のpHをサンプル緩衝液のpHに
調整するための変法を含めて、Laemmli（1970）が記載
の方法に従って、電気泳動用に沈殿したサンプルを調整
した。Laemmli（1970）が記載した手順に従って、ポリ
アクリルアミドゲル（15％アクリルアミド）に印加し
た。上記手順により分離した蛋白質のプロフィルを、Co
omassie Brilliant Blueで染色して視覚化した（第15a
図）。
の上清画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分析し、関係のある蛋白質を、蛋白質の特異染色法によ
り染色するかあるいはWesternブロッティングにより分
析して視覚化した。培養上清の1.5mlのアリコートを、
最終濃度10％（w/v）となるようにトリクロロ酢酸（TC
A）の50％（w/v）溶液（氷上）を添加し、更にその結果
得られた混合液を約４℃で約15〜30分間インキュベート
することにより凝集させた。GM−CSFを含有する分泌蛋
白質を含む生成沈殿物を、室温で５分間、最大速度でEp
pendort遠心器中で遠心分離して収集した。2N NaOHを添
加して、再懸濁TCA沈殿物のpHをサンプル緩衝液のpHに
調整するための変法を含めて、Laemmli（1970）が記載
の方法に従って、電気泳動用に沈殿したサンプルを調整
した。Laemmli（1970）が記載した手順に従って、ポリ
アクリルアミドゲル（15％アクリルアミド）に印加し
た。上記手順により分離した蛋白質のプロフィルを、Co
omassie Brilliant Blueで染色して視覚化した（第15a
図）。
Pharmacia Low Molecular Weight Standardsと比較した
場合、約15,500ダルトンの見掛けの分子量を有して移動
する、GM−CSF遺伝子を含む細胞中に存在する新規の蛋
白質バンドが認められる（第15図に矢印で示されてい
る）。GM−CSFに対するモノクローナル抗体との交叉反
応により、このバンドはGM−CSFと同定された。ゲル電
気泳動（第15b図）によって分離された蛋白質のWestern
ブロッティングによりこの分析を行なったが、この場
合、GM−CSF形質転換体中に見出された新規の蛋白質バ
ンドは、GM−CSFすると抗体と交叉反応した。Burnette
（1981）の改良法であるTowbinら（1979）の方法に従っ
て、Westernブロッティングを行った。
場合、約15,500ダルトンの見掛けの分子量を有して移動
する、GM−CSF遺伝子を含む細胞中に存在する新規の蛋
白質バンドが認められる（第15図に矢印で示されてい
る）。GM−CSFに対するモノクローナル抗体との交叉反
応により、このバンドはGM−CSFと同定された。ゲル電
気泳動（第15b図）によって分離された蛋白質のWestern
ブロッティングによりこの分析を行なったが、この場
合、GM−CSF形質転換体中に見出された新規の蛋白質バ
ンドは、GM−CSFすると抗体と交叉反応した。Burnette
（1981）の改良法であるTowbinら（1979）の方法に従っ
て、Westernブロッティングを行った。
Coomassie Brilliant Blue染色ゲルとWesternブロッ
トの双方をスキャンさせることにより、GM−CSFの分泌
レベルの定量を行なった（表Ｉ）。Bio−Rad蛋白質アッ
セイにより上清中の総蛋白質量を測定した。
トの双方をスキャンさせることにより、GM−CSFの分泌
レベルの定量を行なった（表Ｉ）。Bio−Rad蛋白質アッ
セイにより上清中の総蛋白質量を測定した。
GM−CSFの分泌されたレベルは、pAPO.GMCSFを含有す
るS.lividansで最高である（レーン９〜10）。単一の開
始部位を有するaphプロモーターを含有するpA＊PO.GMCS
Fに関しては、わずかに低レベルの分泌GM−CSFが観察さ
れた。pAPO.GMCSF中のプロテアーゼＢシグナルペプチド
のカルボキシ末端の23個のアミノ酸（レーン５〜６）
を、pAEO.GMCSF中のエンドＨシグナルペプチドのカルボ
キシ末端の26個のアミノ酸（レーン１〜２）で、又はpA
apr.GMCSFののaphシグナルペプチドのカルボキシ末端の
25個のアミノ酸で置き換えると、分泌されたGM−CSFの
レベルが約1/3に低下した。しかしながら、分泌されたG
M−CSFのレベルは、pAEO.GMCSFのプロテアーゼＢ−エン
ドＨハイブリッドシグナルペプチドを用いた方が、pAEO
−1.GMCSFのエンドＨシグナルペプチドを用いた場合よ
りも高かったが（レーン７〜８）、これはハイブリッド
シグナルペプチドが天然のシグナルペプチドよりも良い
ことを示している。
るS.lividansで最高である（レーン９〜10）。単一の開
始部位を有するaphプロモーターを含有するpA＊PO.GMCS
Fに関しては、わずかに低レベルの分泌GM−CSFが観察さ
れた。pAPO.GMCSF中のプロテアーゼＢシグナルペプチド
のカルボキシ末端の23個のアミノ酸（レーン５〜６）
を、pAEO.GMCSF中のエンドＨシグナルペプチドのカルボ
キシ末端の26個のアミノ酸（レーン１〜２）で、又はpA
apr.GMCSFののaphシグナルペプチドのカルボキシ末端の
25個のアミノ酸で置き換えると、分泌されたGM−CSFの
レベルが約1/3に低下した。しかしながら、分泌されたG
M−CSFのレベルは、pAEO.GMCSFのプロテアーゼＢ−エン
ドＨハイブリッドシグナルペプチドを用いた方が、pAEO
−1.GMCSFのエンドＨシグナルペプチドを用いた場合よ
りも高かったが（レーン７〜８）、これはハイブリッド
シグナルペプチドが天然のシグナルペプチドよりも良い
ことを示している。
実施例17 GM−CSFの生物学的活性試験 軟質寒天中のコロニーの増殖を刺激する能力に関して
細胞を採点するメチルセルロースコロニー刺激アッセイ
により、分泌されたGM−CSFの生物学的活性を測定し
た。要約すると、造血性コロニー刺激活性アッセイ用の
非付着性骨髄細胞を、GregoryとEaves（1977）が記載し
たのと同様にして、健康成人被験者から採取したサンプ
ルより調製した。アッセイ用に、細胞を終濃度約５×10
4細胞/mlとなるよう平板培養した。培地には、Coulombe
lら（1983）及びCashmanら（1985）の報告と同様にし
て、0.8％メチルセルロース、30％ウシ胎児血清（Flo
w）、１％脱イオン化ウシ血清アルブミン（BSA,Sigma C
hemical Co.,セントルイス）、0.1mM2−メルカプトエタ
ノール、及びアルファ培地を含有させた。十分な湿度を
有する５％CO2含有空気中、37℃で一般に７〜14日の期
間の間、成長因子を含有する培地の存在中で細胞をイン
キュベートした。反転顕微鏡下、その場でコロニーを採
点した。
細胞を採点するメチルセルロースコロニー刺激アッセイ
により、分泌されたGM−CSFの生物学的活性を測定し
た。要約すると、造血性コロニー刺激活性アッセイ用の
非付着性骨髄細胞を、GregoryとEaves（1977）が記載し
たのと同様にして、健康成人被験者から採取したサンプ
ルより調製した。アッセイ用に、細胞を終濃度約５×10
4細胞/mlとなるよう平板培養した。培地には、Coulombe
lら（1983）及びCashmanら（1985）の報告と同様にし
て、0.8％メチルセルロース、30％ウシ胎児血清（Flo
w）、１％脱イオン化ウシ血清アルブミン（BSA,Sigma C
hemical Co.,セントルイス）、0.1mM2−メルカプトエタ
ノール、及びアルファ培地を含有させた。十分な湿度を
有する５％CO2含有空気中、37℃で一般に７〜14日の期
間の間、成長因子を含有する培地の存在中で細胞をイン
キュベートした。反転顕微鏡下、その場でコロニーを採
点した。
pAPO.GMCSF及びpAEO.GMCSFの両方に関して生物学的活
性の分析を行い（表II）、どちらの場合にも、10％ヒト
白血球コンディショニング培地（ヒトGM−CSFを含有）
を用いて見出されたのと同様の比率で、赤血球／混合大
型コロニーの低レベルの刺激とともに、顆粒球／マクロ
ファージ型コロニーの有意の刺激が実証された。
性の分析を行い（表II）、どちらの場合にも、10％ヒト
白血球コンディショニング培地（ヒトGM−CSFを含有）
を用いて見出されたのと同様の比率で、赤血球／混合大
型コロニーの低レベルの刺激とともに、顆粒球／マクロ
ファージ型コロニーの有意の刺激が実証された。
実施例18 GM−CSFの精製 ポリアクリルアミドゲルからGM−CSFを溶出すること
により、GM−CSFを少量精製した。増殖の約24時間目に
上清蛋白質10mlを採取し、４℃で臨床用遠心器中、4000
rpmで10分間遠心分離して菌糸を取り出した。実施例16
の教旨に従ってGM−CSFを含有する上清蛋白質を凝集
し、Laemmli（1970）の方法に従い、但しサンプル調製
及びゲルの印加に関してはHunkapillerら（1983）の改
良法に従って、15％ポリアクリルアミドゲル上を移動さ
せて分離した。Hunkapillerら（1983）が記載のゲル溶
出法によりGM−CSF蛋白質バンドを分離し、その結果得
られた蛋白質溶液を凍結乾燥により濃縮した。実施例16
の教旨に従って、溶出バンドの純度及び性質を分析し
た。
により、GM−CSFを少量精製した。増殖の約24時間目に
上清蛋白質10mlを採取し、４℃で臨床用遠心器中、4000
rpmで10分間遠心分離して菌糸を取り出した。実施例16
の教旨に従ってGM−CSFを含有する上清蛋白質を凝集
し、Laemmli（1970）の方法に従い、但しサンプル調製
及びゲルの印加に関してはHunkapillerら（1983）の改
良法に従って、15％ポリアクリルアミドゲル上を移動さ
せて分離した。Hunkapillerら（1983）が記載のゲル溶
出法によりGM−CSF蛋白質バンドを分離し、その結果得
られた蛋白質溶液を凍結乾燥により濃縮した。実施例16
の教旨に従って、溶出バンドの純度及び性質を分析し
た。
実施例19 GM−CSFのアミノ末端配列の分析 実施例18の記載と同様に培養上清のサンプルから精製
したGM−CSFサンプルは、カナダのモントリオールのthe
Institut de RechercheenBiotechnologieで分析され
た。Edman自動分解循環法（EdmanとBegg,1967）を用い
るアプライドバイオシステムズApplied Biosystems社製
気相スクエネータ上でアミノ末端配列決定を行った。蛋
白質の最初の９個のアミノ酸に関して得られた配列はAP
ARSPSPSであったが、これは予期したアミノ酸配列と一
致した。
したGM−CSFサンプルは、カナダのモントリオールのthe
Institut de RechercheenBiotechnologieで分析され
た。Edman自動分解循環法（EdmanとBegg,1967）を用い
るアプライドバイオシステムズApplied Biosystems社製
気相スクエネータ上でアミノ末端配列決定を行った。蛋
白質の最初の９個のアミノ酸に関して得られた配列はAP
ARSPSPSであったが、これは予期したアミノ酸配列と一
致した。
本発明の好ましい実施態様が詳細に記載されているけ
れども、本発明の思想又は付記のクレームの範囲を逸脱
しない限りにおいての変更は可能であると、当業者は理
解されたい。
れども、本発明の思想又は付記のクレームの範囲を逸脱
しない限りにおいての変更は可能であると、当業者は理
解されたい。
図面に関しては、制限部位、デオキシリボ核酸、ベクタ
ー、及び関連した情報を見分けるために種々の短縮形を
用いた。当業者が容易に認知できるように、これらの成
分すべてを確認するに際しては標準的用語を用いた。 本発明の好ましい実施態様を、図面で説明すると以下の
通りである。 第１図は、GM−CSFをコードするPst I−Hind III断片の
DNA配列である。 第２図は、ベクターpIJ680の特異的な入れ替え（altera
tion）を示している。 第３図は、 （ａ）発現ベクターpAPO.GMCSFの制限地図；及び （ｂ）挿入するBamH I−Hind III DNA断片の配列であ
る。 第４図は、 （ａ）発現ベクターpAEO.GMCSFの制限地図；及び （ｂ）挿入するBamH I−Hind III DNA断片の配列であ
る。 第５図は、 （ａ）発現ベクターpAPO.G（又はpAPO.H）の制御地図；
及び （ｂ）挿入するBamH I−Xba I（又はBamH I−Hind II
I）DNA断片の配列である。 第６図は、 （ａ）発現ベクターpAEO.SX（又はpAEO.SH）の制御地
図；及び （ｂ）挿入するBamH I−Xba I（又はBamH I−Hind II
I）DNA断片の配列である。 第７図は、 （ａ）発現ベクターpAPO.SXの制限地図；及び （ｂ）挿入するBamH I−Xba I DNA断片の配列である。 第８図は、aphプロモータを含むBamH I−Nco I DNA断
片の配列である。 第９図は、プロテアーゼＢプロモータを含有し、且つプ
ロテアーゼＢシグナルペプチドとプロテアーゼＢプロー
ペプチドのアミノ末端の10個のアミノ酸とをコードする
pPPIのBamH I−Pst DNA断片の配列である。 第10図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボキ
シ末端及びヒト成長ホルモンのアミノ末端をコードする
Hae II−Xba I DNA断片の配列である。 第11図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのアミノ末
端をコードするDNA断片の配列である。 第12図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボキ
シ末端をコードするHae II−Pst I DNA断片の配列であ
る。 第13図は、エンドＨシグナルペプチドのカルボキシ末端
の27個のアミノ酸をコードするMlu I−Pst I DNA断片
の配列である。 第14図は、aprシグナルペプチドのカルボキシ末端の25
個のアミノ酸をコードするMlu I−Pst I DNA断片の配
列である。 第15図は、 （ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び （ｂ）WesternブロッティングによるGM−CSF分泌の分析
結果を示す。
ー、及び関連した情報を見分けるために種々の短縮形を
用いた。当業者が容易に認知できるように、これらの成
分すべてを確認するに際しては標準的用語を用いた。 本発明の好ましい実施態様を、図面で説明すると以下の
通りである。 第１図は、GM−CSFをコードするPst I−Hind III断片の
DNA配列である。 第２図は、ベクターpIJ680の特異的な入れ替え（altera
tion）を示している。 第３図は、 （ａ）発現ベクターpAPO.GMCSFの制限地図；及び （ｂ）挿入するBamH I−Hind III DNA断片の配列であ
る。 第４図は、 （ａ）発現ベクターpAEO.GMCSFの制限地図；及び （ｂ）挿入するBamH I−Hind III DNA断片の配列であ
る。 第５図は、 （ａ）発現ベクターpAPO.G（又はpAPO.H）の制御地図；
及び （ｂ）挿入するBamH I−Xba I（又はBamH I−Hind II
I）DNA断片の配列である。 第６図は、 （ａ）発現ベクターpAEO.SX（又はpAEO.SH）の制御地
図；及び （ｂ）挿入するBamH I−Xba I（又はBamH I−Hind II
I）DNA断片の配列である。 第７図は、 （ａ）発現ベクターpAPO.SXの制限地図；及び （ｂ）挿入するBamH I−Xba I DNA断片の配列である。 第８図は、aphプロモータを含むBamH I−Nco I DNA断
片の配列である。 第９図は、プロテアーゼＢプロモータを含有し、且つプ
ロテアーゼＢシグナルペプチドとプロテアーゼＢプロー
ペプチドのアミノ末端の10個のアミノ酸とをコードする
pPPIのBamH I−Pst DNA断片の配列である。 第10図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボキ
シ末端及びヒト成長ホルモンのアミノ末端をコードする
Hae II−Xba I DNA断片の配列である。 第11図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのアミノ末
端をコードするDNA断片の配列である。 第12図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボキ
シ末端をコードするHae II−Pst I DNA断片の配列であ
る。 第13図は、エンドＨシグナルペプチドのカルボキシ末端
の27個のアミノ酸をコードするMlu I−Pst I DNA断片
の配列である。 第14図は、aprシグナルペプチドのカルボキシ末端の25
個のアミノ酸をコードするMlu I−Pst I DNA断片の配
列である。 第15図は、 （ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び （ｂ）WesternブロッティングによるGM−CSF分泌の分析
結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (56)参考文献 特開 昭61−158782（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−174396（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502682（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．169，Ｎｏ．８ （1987） Ｐ．3778−3784 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．294 （1981) Ｐ．176−178 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．77，Ｎｏ．７ （1980） Ｐ．3988−3942
Claims (19)
- 【請求項１】（ｉ）（ａ）プロモーター配列、 （ｂ）前記プロモーター配列に結合したDNAシグナル配
列であって、前記DNAシグナル配列は、ストレプトミセ
スのプロテアーゼＢのシグナルペプチドとストレプトミ
セスのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ
のシグナルペプチドのハイブリッドシグナルペプチド又
は、ストレプトミセスのプロテアーゼＢのシグナルペプ
チドとバチルスのアルカリ性プロテアーゼのシグナルペ
プチドのハイブリッドシグナルペプチドであるもの、及
び （ｃ）異種ヒト蛋白質をコードするDNA配列であって、
該シグナルペプチドが、グリコシル化されず、１つ以上
のジスルフィド結合を有する形態の該異種ヒト蛋白質の
ストレプトミセス属から選択した宿主からの分泌を支配
することができるもの、 から成るDNA配列を結合し； （ii）ストレプトミセス内の形質転換及び複製が可能な
ベクターに該結合DNA配列を挿入し；及び （iii）ストレプトミセス属から選択した宿主に前記結
合DNA配列を含むベクターを挿入し、該形質転換宿主を
増殖させること； から成る遺伝子発現方法。 - 【請求項２】（ａ）以下のDNA配列を連結し、 （ｉ）プロモーターDNA配列、 （ii）前記プロモーターDNA配列に結合したDNAシグナル
配列であって、前記DNAシグナル配列は、ストレプトミ
セスのプロテアーゼＢ由来のシグナルペプチドをコード
し、グリコシル化されていなく分子内にジスルフィド結
合を有しＮ−末端メチオニンを有していない顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）をストレプト
ミセス属から選ばれた宿主において分泌させることがで
きるものであり、及び （iii）分子内にジスルフィド結合を有する顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）をコードするD
NA配列； （ｂ）ストレプトミセスにおいて形質転換及び複製が可
能なベクターに前記連結したDNA配列を挿入し； （ｃ）前記連結したDNAを有する前記ベクターをストレ
プトミセス属から選ばれた宿主に挿入し；並びに （ｄ）前記挿入されたベクターを有する前記宿主を増殖
せしめ、分泌された生物活性を有しグリコシル化されて
いなく分子内にジスルフィド結合を有しＮ−末端メチオ
ニンを有していない顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子（GM−CSF）を得ることからなる、生物活性を有し
グリコシル化されていなく分子内にジスルフィド結合を
有しＮ−末端メチオニンを有していない顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子（GM−CSF）を宿主から分泌さ
せる方法。 - 【請求項３】前記エンド−β−アセチルグルコサミニダ
ーゼＨのシグナルペプチドが、少なくとも31個のアミノ
酸を含み、アミノ端のメチオニンから後の30番目及び34
番目のアミノ酸の間にプロセッシング部位を有するもの
である、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項４】前記プロテアーゼＢのシグナルペプチド
が、以下のアミノ酸配列： MRIKRTSNRSNAARRVRTTAVLAGLAAVAALAVPTANA の少くともアミノ末端部分を有する、特許請求の範囲第
１項ないし第３項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】前記エンド−β−アセチルグルコサミニダ
ーゼＨのシグナルペプチドが、以下のアミノ酸配列： MFTPVRRRVRTAALALSAAAALVLGSTAASGASA の少くともアミノ末端部分を有する、特許請求の範囲第
１項、第３項又は第４項に記載の方法。 - 【請求項６】前記ハイブリッドシグナルペプチドが、以
下のアミノ酸配列： MRIKRTSNRSNAARRVRTAALALSAAAALVLGSTAASGASA を有する、特許請求の範囲第１項及び第３項ないし第５
項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】前記ハイブリッドシグナルペプチドが、以
下のアミノ酸配列： MRIKRTSNRSNAARRVWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQA を有する、特許請求の範囲第１項及び第３項ないし第５
項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】前記、ストレプトミセスが、ストレプトミ
セス・プリカートス又はストレプトミセス・グリセウス
である、特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか
一項に記載の方法。 - 【請求項９】前記DNAシグナル配列が天然又は合成DNAを
含む、特許請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか一
項に記載の方法。 - 【請求項１０】前記DNAシグナル配列が野生型又は突然
変異型DNAを含む、特許請求の範囲第１項ないし第９項
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】前記シグナル配列にコードされたシグナ
ルペプチドの17個のアミノ末端部アミノ酸が、アルギニ
ン、リジン又はその両者を含む少なくとも７個の残基を
含む、特許請求の範囲第１項及び第３項ないし第10項の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】ベクターがpSS2である、特許請求の範囲
第１項ないし第11項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１３】回収された蛋白質からシグナルペプチド
の全部又は一部が除去されている、特許請求の範囲第１
項ないし第12項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】前記異種ヒト蛋白質が顆粒球マクロファ
ージコロニー刺激因子（GM−CSF）である、特許請求の
範囲第１項及び第３項ないし第13項のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項１５】前記異種ヒト蛋白質又は顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子をコードするDNA配列が天然又
は合成又はそれらの組合せである、特許請求の範囲第１
項ないし第14項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１６】前記顆粒球マクロファージコロニー刺激
因子をコードするDNA配列が第１図に示されている、特
許請求の範囲第２項又は第14項又は第15項に記載の方
法。 - 【請求項１７】前記異種ヒト蛋白質が、インターロイキ
ン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３
又は顆粒球コロニー刺激因子である、特許請求の範囲第
１項、第３項ないし第13項及び第15項のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項１８】前記プロモーター配列が、ストレプトミ
セスRNAポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及びそれに
よる転写が可能な、ストレプトミセス・フラディアのア
ミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子由来の
配列を含む、特許請求の範囲第１項ないし第17項のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項１９】前記プロモーター配列が多重プロモータ
ー配列を含む、特許請求の範囲第１項ないし第18項のい
ずれか一項に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA000572956A CA1295567C (en) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte, macrophage-colony stimulating factor (gm-csf) and other heterologous proteins from streptomyces |
| CA572,956 | 1988-07-25 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6054123A Division JP2688174B2 (ja) | 1988-07-25 | 1994-03-24 | ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの生物活性ヒト顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びその他の異種蛋白質の分泌に関する発現系 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0286782A JPH0286782A (ja) | 1990-03-27 |
| JP2711148B2 true JP2711148B2 (ja) | 1998-02-10 |
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ID=4138439
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|---|---|---|---|
| JP1192426A Expired - Fee Related JP2711148B2 (ja) | 1988-07-25 | 1989-07-25 | ストレプトミセスからの遺伝子発現方法 |
| JP6054123A Expired - Fee Related JP2688174B2 (ja) | 1988-07-25 | 1994-03-24 | ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの生物活性ヒト顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びその他の異種蛋白質の分泌に関する発現系 |
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|---|---|---|---|
| JP6054123A Expired - Fee Related JP2688174B2 (ja) | 1988-07-25 | 1994-03-24 | ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの生物活性ヒト顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びその他の異種蛋白質の分泌に関する発現系 |
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| FR2666588B1 (fr) * | 1990-09-10 | 1994-02-11 | Pasteur Institut | Sequence nucleotidique regulatrice de l'initiation de transcription. |
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| JP2818146B2 (ja) * | 1996-06-20 | 1998-10-30 | 株式会社精工技研 | 光ファイバ端面研磨装置 |
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|---|---|---|---|---|
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| GB8315579D0 (en) * | 1983-06-07 | 1983-07-13 | Biogen Nv | Streptomyces expression systems |
| EP0337359B1 (en) * | 1984-07-06 | 1998-10-21 | Novartis AG | Lymphokine production and purification |
| US4745056A (en) * | 1984-10-23 | 1988-05-17 | Biotechnica International, Inc. | Streptomyces secretion vector |
| CA1295563C (en) * | 1985-11-01 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Production of active proteins containing cystine residues |
| CA1295566C (en) * | 1987-07-21 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Characterization and structure of genes for protease a and protease b from streptomyces griseus |
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- 1988-07-25 CA CA000572956A patent/CA1295567C/en not_active Expired - Lifetime
-
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- 1989-07-24 AT AT89113607T patent/ATE291629T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-24 EP EP89113607A patent/EP0352707B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-24 DE DE68929531T patent/DE68929531D1/de not_active Expired - Lifetime
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1994
- 1994-03-24 JP JP6054123A patent/JP2688174B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６９，Ｎｏ．８ （１９８７） Ｐ．３７７８−３７８４ |
| Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２９４ （１９８１） Ｐ．１７６−１７８ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，Ｎｏ．７ （１９８０） Ｐ．３９８８−３９４２ |
Also Published As
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