KR960013133B1 - 스트렙토마이세스 속으로부터 생체활성 인체 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(gm-csf) 및 기타 이형 단백질을 분비시키기 위한 발현계 - Google Patents

스트렙토마이세스 속으로부터 생체활성 인체 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(gm-csf) 및 기타 이형 단백질을 분비시키기 위한 발현계 Download PDF

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Abstract

없음

Description

스트렙토마이세스 속으로부터 생체활성 인체 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 기타 이형 단백질을 분비시키기 위한 발현계
도면에 있어서, 여러가지 간단한 형태를 사용하여 제한 부위, DNA, 벡터 및 관련 정보를 나타냈다. 당업계에 숙련된 자들에게 쉽게 이해될 수 있는 바와 같이 이러한 모든 성분을 확인할 수 있도록 표준 명명법을 사용하였다.
본 발명의 바람직한 실시태양은 도면을 참조하여 기재하였다.
제1도는 GM-CSF를 암호화하는 Pst I-HindIII 단편의 DNA 서열이다.
제2도는 벡터 pIJ680의 특이한 변형을 나타낸다.
제3도는 (a) 발현 벡터인 pAPO.GMCSF의 제한 지도 및
(b) 삽입된 BamH I-HindIII DNA 단편의 서열이다.
제4도는 (a) 발현 벡터 pAEO.GMCSF의 제한 지도 및
(b) 삽입된 BamH I-HindIII DNA 단편의 서열이다.
제5도는 (a) 발현 벡터 pAPO.G(또는 pAPO.H)의 제한 지도 및
(b) 삽입된 BamH I-Xba I (또는 BamH I-HindIII) DNA 단편의 서열이다.
제6도는 (a) 발현 벡터 pAEO.SX(또는 pAEO.SH)의 제한 지도 및
(b) 삽입된 BamH I-Xba I (또는 BamH I-HindIII) DNA 단편의 서열을 나타낸다.
제7도는 (a) 발현 벡터 pAPO.SX의 제한 지도 및
(b) 삽입된 BamH I-Xba I DNA 단편의 서열이다.
제8도는 aph 프로모터를 함유한 BamH I-Ncol DNA 단편의 서열이다.
제9도는 프로테아제 B 프로모터를 함유하고 프로테아제 B 신호펩티드 및 프로테아제 B 프로펩티드의 아미노 말단의 10 아미노산을 암호화하는 BamH I-Pst DNA 단편의 서열이다.
제10도는 프로테아제 B 신호펩티드의 카르복시 말단 및 인체 성장 호르몬의 아미노 말단을 암호화하는 HaeII-Xba I DNA 단편의 서열이다.
제11도는 프로테아제 B 신호펩티드의 아미노말단을 암호화하는 DNA 단편의 서열이다.
제12도는 프로테아제 B 신호펩티드의 카르복시 말단을 암호화하는 HaeII-Pst I DNA 단편의 서열이다.
제13도는 엔도 H 신호펩티드의 카르복시 말단의 27 아미노산을 암호화하는 Mlu I-Pst I DNA 단편의 서열이다.
제14도는 apr 신호펩티드의 카르복시 말단의 25 아미노산을 암호화하는 Mlu I-Pst I DNA의 서열이다.
제15도는 (a) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 (b) 웨스턴 블롯팅에 의한 GM-CSF 분비에 대한 분석이다.
본 발명은 이형의 생체활성 단백질, 특히 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로부터 선택된 숙주에 삽입시킨 발현계에 의한 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(이후 GM-CSF)의 분비에 관한 것이다.
상업적으로 유용한 단백질을 생산함에 있어서, 미생물이 단백질이 생체활성형으로 브로쓰내에 분비하는 능력이 중요하다. 그러나, 유전공학적으로 처리된 DNA 조립체에 의해 암호화되는 많은 단백질들을 DNA가 발현된 세포에 의해 분비되지 않거나 생체활성형으로 단백질을 분비하지 않을 수도 있다. 단백질이 브로쓰 내로 분비되지 않을 경우, 하류 부문 공정(downstream processing)이 필요하다. 이것은 세포를 수집하고, 세포벽을 파괴하고, 목적 단백질을 순수한 형태로 회수하여 상기 단백질을 그 생체활성을 회복시키기 위해 화학적으로 재생시켜야 함을 의미한다. 만약 단백질이 그의 생체활성 형태가 아닌 채로 브로쓰로 분리될 경우, 단백질이 분비된 후 그 생체활성을 회복하도록 처리해주어야 한다.
몇몇 세포 및 미생물들은 단백질을 생체활성형으로 분비함으로써 하류 부문 공정을 생물학적으로 수행한다. 세포 외측을 통하여 세포의 외부 환경으로 어떤 단백질을 분비하게 하는 기작은 아직 충분히 이해되어 있지 않다. 예를 들면, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 좋은 많은 세포외 단백질을 생물활성 형태로 분비한다. 생체활성이 그의 특별한 3차원적 분자 구조에 의해 정해지는 상업상 유용한 이형 단백질을 천연 세포외 단백질을 관찰할 수 있는 농도로 스트렙토마이세스에서 분비시킬 수 있다면 편리할 것이다.
유전공학적으로 처리한 DNA 조립체와 관계된 몇몇 문헌에 있어서, DNA 내에 포함된 정보를 사용하여 기능적인 단백질을 생성하는 것은 DNA를 해독함으로써 해결될 것으로 추측하여왔다. 이러한 가정은 단백질 분자의 복잡한 3차원 구조를 명시하는데 필요한 정보가 단백질의 일차 아미노산 서열에 내포되어 있다는 원리에 기초한 것이다. 그러나, 1985년 11월 1일 칸지 코포레이션(Cangene Corporation)에 의해 출원된 Production of Active Proteins Containing Cystine Residues라는 발명의 명칭의 캐나다 특허 출원 제449,456호는 유전공학적으로 조작한 DNA 조립체로부터 유도된 특정 단백질의 생체활성은 올바른 위치에 이황화 결합이 형성되느냐에 달려있다고 설명하고 있다. 숙주 세포 또는 미생물에서 이형 유전자를 발현시키기 위해서는 통상의 방법보다 보다 효과적인 방법을 필요로 하였다. 따라서, 본 발명은 숙주 미생물로부터 하류 부문 공정을 거치지 않고 생체활성형으로 이형 단백질을 분비시킬 수 있음을 확인하였다. 발현계와 결합시킨 특정 미생물을 사용함으로서 유전공학적으로 처리된 DNA 조립체의 발현시 이황화 결합이 형성되도록 할 수 있다. 동형 이황화 결합 단백질을 발현하고 분비할 수 있는 세포 또는 미생물로부터 선택되고 이황화 결합을 갖는 이형 단백질을 암호화 할 수 있는 제2뉴클레오티드 서열에 기능적으로 결합된 조절 뉴클레오티드 서열을 사용함으로써, 활성 구조에 내재적이고 필수적 부위로서 시스틴 잔기를 갖도록 조작된 단백질이 생체활성을 가질 수 있었다. 조절 뉴클레오티드 서열은 세포 또는 미생물로부터 이형 단백질을 분비시키는 단백질을 암호화하였다. 이형 단백질은 천연의 것이거나 고안된 것일 수 있다.
칸진 코포레이션에 의해 1987년 7월 21일에 출원된 Characterization and Structure of Genes for Protease A and Protease B from Streptomyces griseus라는 발명의 명칭의 캐나다 특허 출원 제542,628호에서는 동형 유전자 발현계를 기재하고 있다. 상기 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)로부터 프로테아제 A 및 프로테아제 B의 분비를 지시하는 조절 뉴클레오티드 서열과 관계된 것이다. 프로테아제 A 및 프로테아제 B는 스트렙토마이세스 그리세우스에서 천연적으로 생성되는 단백질이므로 동형이란 용어를 사용한다. 상기 출원은 스트렙토마이세스에서의 동형 분비중 한 형태에 관련된 조절 뉴클레오티드 서열을 기재하였다. 동형 발현에 관련된 유전자 발현계는 이형 발현을 위한 여러가지 다른 발현계를 구성하는데 유용하다.
과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 백혈구의 생성을 촉진하는 단백질이다. GM-CSF는 백혈구 세포의 회복을 돕는 암치료와 연관시켜 사용하기 위한 생물약제로서 크게 유망한 것이다. 천연적으로 생성되는 GM-CSF는 127 아미노산 및 그 이황화 결합을 갖는 당단백질이다. GM-CSF는 천연 사람원에서 소량으로만 존재하여 천연적으로 단리된 단백질의 구체적인 구조적 분석을 저해해왔다. 따라서, 천연적 GM-CSF에 대한 대부분의 구조적 통계는 포유동물 세포에 있어서 상보성 DNA 서열 및 상보성 DNA 클론의 발현으로부터 얻어진 것이다. 포유동물 세포에서 발현되는 GM-CSF는 127 아미노산 및 2 이황화 결합을 가지고, 14 내지 35KD의 크기에 걸친 상이한 글리코실화 형태로 존재한다. 어떤 형태의 GM-CSF는 두개의 N-결합 탄수화물군 및(또는) 세개의 O-결합 탄수화물군을 포함하며, 이것은 명백한 크기 이형성을 나타낸다.
문넨 등[Moonen et al(1987)]에는, 차이니스 햄스터 난모 세포로부터 분비에 의해 GM-CSF를 생성하는 방법이 기재되어 있다. GM-CSF는 생물학적으로 활성이 있는 26KD 당단백질로서 분비된다. 그러나, 생물학적 활성은 탄수화물 군을 효소로 제거함으로써 20배 증가되었으며 이것은 GM-CSF의 비글리코실화 형태가 임상 용도에 우월함을 나타낸다.
언스트(Emst et al(1987))에는 알파 교잡 인자 전구체를 사용하여 효모 맥주 효모군(Sacchromyces cerevisiae)으로부터 분비에 의해 GM-CSF를 생성하는 방법이 기재되었다. GM-CSF는 35 내지 100KD의 크기에 걸친 당단백질의 이형 혼합물로서 분비된다. 분비된 GM-CSF의 한 분획만이 알파 교잡 인자 전구체로부터 올바르게 가공되었다. 효모와 포유동물 세포에서 생성된 글리코실화 GM-CSF의 비생물활성을 거의 같다. 그러나, 효모에서 생성된 GM-CSF의 부착된 탄수화물 군의 구조는 포유동물에서 생성된 GM-CSF의 천연 탄수화물군과 상이하였다,
부르게스[Burgess et al(1987)]에는, 대장균(E. coli)의 세포질로부터 비글리코실화 GM-CSF와 유사한 폴리펩티드를 생성하는 방법이 기재되었다. 대장균 세포로부터 단리된 GM-CSF-유사 폴리펩티드는 아미노 말단의 메티오닌을 가졌고, 환원되고 변성되어 생물학적으로 불활성이었다. 대장균으로부터 단리된 생물학적으로 불활성인 GM-CSF- 유사 폴리펩티드를 생체활성형으로 전환시키려면 시험관내 산화적 재생을 필요로 하였다. 재생된 GM-CSF-유사 폴리펩티드는 여전히 대장균에서 생성한 단백질 아미노 말단에는 메티오닌이 존재하므로 비글리코실화 형태의 GM-CSF와 같지 않았다.
포유동물 세포 또는 효모에 의해 분비된 GM-CSF는 생체활성이 있지만 글리코실화되었다. 대장균으로부터 단리된 GM-CSF는 비글리코실화되었으나 생체활성이 없다. 따라서, GM-CSF를 생성하는 통상적인 방법은 배양물로부터 GM-CSF의 형태를 임상용에 적합한 생체활성이 있는 비글리코실화 GM-CSF로 전환시키기 위해 비싸고, 시간이 들거나 또는 비효율적인 하류 부문 공정을 필요로 한다.
결과적으로, 분비시 생체활성 단백질, 특히 생체활성 GM-CSF를 제공하는 발현계를 필요로 한다. 그러나 단백질 생성물은 구조가 생체활성을 결정하기 때문에 통상적인 단백질 생성물보다 구조상 상이할 것이다.
본 발명은 이형 단백질, 특히 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 생체활성형으로 분비하는 것을 지시하는 다수의 발현계에 관한 것이다. 본 명세서에 있어서, 내용이 달리 필요로 하지 않는한, GM-CSF는 실질적으로 순수하고, 비글리코실화되고, 산화된 GM-CSF 단백질을 의미한다. 본 발명에 의하여 생성된 생체활성 GM-CSF는 비글리코실화되었으나, 다른 점에서는 이것은 그의 천연적 대조물을 닮았다. 본 발명의 GM-CSF는 그의 천연적 대조물과 같이 올바르게 위치된 분자내 이황화 결합을 가졌다. 본 발명에 의하여 생성된 새로운 생성물은 GM-CSF는 노글리테인으로 명명하였다. GM-CSF 노글리테인은 숙주 생물체, 즉, 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주로부터의 분비시에 충분한 생체활성을 갖고 천연 GM-CSF 당단백질의 모든 구조적 특징을 나타낸다.
본 발명에 의하여, 유전자 발현계는 이형 단백질을 암호화시키는 제2뉴클로에티드 서열에 결합된 조절 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 사용하였다. 조절 서열은 신호 서열 및 프로모터 서열을 포함한다. 신호 서열은 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주로부터 생체활성형의 이형 단백질 분비를 지시하는 펩티드를 암호화한다. 천연 또는 합성 또는 천연 및 합성 서열의 조합일 수 있는 제2뉴클오티드 서열은 이형의 단백질을 암호화한다.
발현계는 생체활성형으로 암호화된 단백질의 스트렙토마이세스 숙주로부터의 분비를 지시하는 것으로 기재되었다.
본 발명의 발현계는 다른 숙주에도 사용될 수 있다고 보여진다. 더우기, 이러한 발현계는 본 발명의 지시에 따라, GM-CSF 이외에 이형 단백질의 분비를 지시하는데 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주로부터의 생체활성형의 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 분비를 위한 유전자 발현계에 관한 것이다. 유전자 발현계는 GM-CSF를 암호화하는 제2뉴클로에티드 서열에 결합된 조절 뉴클레오티드를 포함한다. 조절 서열은 신호 서열 및 프로모터 서열을 함유한다. 신호 서열은 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주로부터 생체활성형의 GM-CSF의 분비를 지시하는 펩티드를 암호화한다. 천연 또는 합성 또는 천연 및 합성 서열의 조합일 수 있는 제2뉴클레오티드 서열은 GM-CSF를 암호화할 수 있다.
신호 서열은 스트렙토마이세스 속으로 선택된 숙주로부터 이형 단백질 분비를 지시하는 신호펩티드를 암호화한다. 신호 서열은 스트렙토마이세스 그리세우스 프로테아제 B, 스트렙토마이세스 플리카투스 엔도-B-N-아세틸글루코사미니다제 H의 신호펩티드, 이들 펩티드 중 어느 것의 하이브리드, 또는 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주로부터 이형 단백질, 특히 GM-CSF의 분비를 지시하는 임의의 기타 신호펩티드를 암호화 할 수 있다. 이 신호 서열은 그람 양성 세균, 그람 음성 세균의 신호펩티드 또는 이들 펩티드의 하이브리드를 암호화할 수 있다. 더우기, 신호 서열은 스트렙토마이세스 및 기타 세균의 신호펩티드의 하이브리드를 암호화할 수 있다.
이형 단백질의 아미노 말단에 결합된 신호펩티드로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 RNA의 합성을 지시하는 프로모터 서열은 적어도 한 종류의 스트렙토마이세스 RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이전효소에 의한 전사를 허용한다. 프로모터 서열은 적어도 한 종류의 스트렙토마이세스 RNA 폴리머라제 전 효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)의 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 유전자(aph)로부터의 서열을 포함할 수 있다.
발현계를 스트렙토마이세스에서 형질전환 및 복제가능한 벡터 내로 삽입하고, 이 벡터를 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주내에 삽입시켰다.
본 발명의 또 다른 관점에 있어서, 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주로부터 생체활성형으로 분비된 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자를 생상시키는 방법을 사용하였다. 이 방법은 생체활성형으로 GM-CSF의 분비를 지시하는 펩티드를 암호화하는 서열과 GM-CSF를 암호화하는 서열을 결합시키고, 이 서열을 스트렙토마이세스에서 형질전환 및 복제가능한 벡터내로 삽입시키고, 이 벡터를 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주에 삽입시키고, 형질전환된 숙주를 성장시키고, 생체활성 GM-CSF를 회수하는 것을 포함한다.
본 발명에 따라서, 이형 단백질에 융합된 신호펩티드는 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주 내에서 이형 발현에 의해 생산된다.
본 발명에 따라서, GM-CSF에 융합된 신호펩티드는 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주 내에서 이형 발현에 의해 생산된다.
본 발명에 따라서, 생체활성 단백질은 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주 내에서 이형 발현에 의해 생산된다.
본 발명에 따라서, 생체활성 GM-CSF는 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주 내에서 이형 발현에 의해 생산된다.
재조합 DNA 유도된 GM-CSF는 적절한 숙주, 특히, 스트렙토마이세스 속으로부터 선택된 숙주로부터 생체활성형으로 분비된다. GM-CSF는 비글리코실화되었고 분비시 분자내 이황화 결합을 가졌다.
본 발명은 발현계를 사용하여 스트렙토마이세스로부터 직접 분비에 의하여 인체 GM-CSF를 생물학적으로 활성이 있는 형태로 생산시키는 방법을 기재하고 있다. 또한, 기타 이형 단백질의 생산에 사용될 수 있는 발현 벡터를 기재하고 있다. 발현계는 특정 단백질을 암호화하는 유전자, 올바르게 프로세싱된 단백질을 성장 배지 내로 분비되도록 지시하는 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 단백질을 암호화하는 mRNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 함유한다. 당업계의 전문가들에게 공지된 바와 같이, 발현계는 전사종결 및 번역 개시 및 종결을 위한 부가의 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다.
바람직한 실시태양에 있어서, 발현계 내에 함유된 유전자는 인쇄 GM-CSF 단백질을 암호화한다(Lee et al. 1985; Wang et al., 1985 참조). 구체적으로 제1도의 DNA 서열에 나타낸 GM-CSF 유전자는 스트렙토마이세스의 하기 코돈, 즉 세번째 위치에 C 또는 G를 갖는 코돈을 사용한 후에 생성된 합성 DNA이다(Bibb et al., 1985 참조). 유전자는 GM-CSF에 대한 천연 cDNA 서열 또는 스트렙토마이세스 코돈을 사용하거나 또는 다른 편중되거나 완전히 불규칙한 코돈을 사용하여 GM-CSF를 암호화하는 기타 DNA 서열일 수 있다. 이 유전자는 천연 아미노산에 있어서 1개 이상의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 GM-CSF의 생체활성 유도체를 암호화할 수 있다.
발현계내에 포함된 이형 유전자는 천연 cDNA 또는 다른 유용한 단백질을 암호화하는 합성 DNA 서열일 수 있다. 재조합 DNA 서열에 의해 암호화되는 특정 단백질은 진핵 분비 효소(예, 키모신, 키모트립신, 트립신, 아밀라제, 리그니나제, 엘라스타제, 리파제 및 셀룰라제), 원핵 분비효소(예, 글루코스 이소머라제, 아밀라제, 리파제, 펙티나제, 셀룰라제, 프로테이나제, 옥시다제, 리그니나제), 효소 억제제(예, 히루딘, B-락타마제 억제제 및 알파 1-앤티트립신) 및 금속 효소(예, 수퍼록시드 디스뮤타제), 혈액인자(예, 인자 VIII, 인자 IX, 조직형 플라스미노겐 활성화제 및 유로키나제), 호르몬(예, 프로인슐린), 림포카인(예, 베타- 및 감마- 인터페론 및 인터루킨-2), 세포독소(예, 종양 괴사 인자, 림포톡신 및 인터루킨-1), 성장인자(예, 신경 성장 인자, 상피 성장 인자, 변형 성장 인자, 혈소판-유도 생장 인자 및 섬유 아세포 생장 인자), 기타 콜로니 자극성 인자(예, 인터루킨-3 및 과립구 콜로니 자극 인자), 면역글루불린 관련 분자(예, 합성, 고안 또는 공학적으로 처리한 항체 분자), 세포 수용체(예, 콜로스테롤 수용체), 바이러스 항원(예, 바이러스의 헤마글루티닌, AIDS 항원 및 암뮤노겐, B형 간염 항원 및 면역원, 발과 입질병 바이러스 항원 및 면역원), 세균의 계면효과기(예, 단백질 A), 독소(예, 단백질 살충제, 살조제, 살진균제 및 살균제) 및 의학적으로 중요한 전신계 단백질(예, 심근 경색 단백질(MIP), 중량 조절 인자(WCF) 및 열량을 단백질(CRP)을 포함한다.
이 유전자는 생물학적으로 활성이 있는 단백질의 불활성 전구체(자이모겐)을 암호화하며 이것은 시허관내 또는 배양물에서 활성 형태로 프로세싱될 수 있다. 이 유전자는 천연 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 유용한 단백질의 생물학적으로 활성이 있는 유도체를 암호화 할 수 있다. 또한 이 유전자는 둘 이상의 유용한 단백질의 생체활성 융합 단백질, 또는 서열내의 동형의 위치로부터 단일 아미노산을 교체하거나 아미노산들을 차단시킴으로서 생산될 수 있는, 둘 이상의 동형단백질의 하이브리드를 암호화할 수 있다.
신호 서열은, 아미노 말단의 융합 단백질로서 생합성되고, 이형 단백질에 연결되었을때 정확한 아미노 말단을 가진 이형 단백질을 배지내로 분비시키는 것을 지시할 수 있는 임의의 서열을 암호화할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 스트렙토마이세스 그리세우스 프로테아제 B의 신호펩티드(칸진 코포레이션에 의해 1987년 7워 21일 출원된 캐나다 출원번호 제542,648호)를 GM-CSF, 구체적으로는 MRIKRTSNRSNAARRVRTTAVLAGLAAVAALAVPTNAN 서열로 이루어진 38-아미노산 펩티드의 분비를 지시하기 위해 사용하였다. 다른 실시태양에 있어서, GM-CSF의 분비를 지시하는데 사용한 신호펩티드는 아미노 말단에서 스트렙토마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus) 엔도-B-N-아세틸글루코자미니다제 H(엔도 H) 신호펩티드(Robbins et al., 1984년 참조), 구체적으로는 MRIKRTSNRSNAARRVRTAALALSAAAALVLGSTAASGASA 서열의 41-아미노산 펩티드의 9 내지 34 아미노산에 결합된 스트렙토마이세스 그리세우스 프로테아제 B 신호펩티드의 처음 15 아미노산으로 구성된 하이브리이드이다. GM-CSF의 분비는 또한 본 발명에서 상세하게 설명된, 구체적으로는 MFTPVRRRVRTAALALSAAAALVLGSTAASGASA 서열의 34-아미노산 펩티드인, 스트렙토마이세스 플리카투스 엔도 H의 신호펩티드에 의해 지시될 수 있다. 또한 분비는 다른 스트렙토마이세스 신호펩티드, 구체적으로는 스트렙토마이세스 그리세우스 프로테아제 A, 스트렙토마이세스 그리세우스 아밀라제, 스트렙토마이세스 R61 DD-펩티다제 또는 당업계에서 공지된 또 다른 스트렙토마이세스 신호펩티드(Chang, 1987)에 의해 지시될 수 있다. 분비는 또한 상기 신호펩티드의 하이브리드 또는 전체적으로 합성한 아미노산 서열을 가진 것의 지시에 의해 수행될 수 있다. 신호펩티드는 그람- 음성 세균, 구체적으로는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 알칼린 프로테아제(apr)의 신호펩티드 또는 당업계에서 공지된 다른 그람-양성 세균의 또 다른 신호펩티드(Chagn, 1987)로부터의 것일 수 있다. 신호펩티드는 그람-음성 박테리아, 구체적으로는, 대장균(Escherichia coli) 외막 단백질 A 또는 당업계에 공지된 다른 그람-음성 박테리아의 신호펩티드(Sjostrom 등. 1987)로부터의 것일 수 있다. 신호펩티드는 또한 둘 이상의 세균성 신호펩티드의 하이브리일 수 있다. 한 실시태양에 있어서, GM-CSF의 분비를 지시하는데 사용된 신호펩티드는 아미노 말단에서 바실러스 섭틸리스 apr 신호펩티드, 구체적으로는 MRIKRTSNRSNAARRVWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQA 서열의 40-아미노산 펩티드의 6 내지 30 아미노산에 결합된 스트렙토마이세스 그리세우스 프로테아제 B 신호펩티드의 처음 15 아미노산으로 구성된 하이브리이드이다. GM-CSF 이외에, 다른 이형 단백질 이외에 본 발명에 상세히 설명된 신호펩티드 또는 당업계에 공지된 다른 세균성 신호펩티드를 갖는 스트렙토마이세스로부터 분비될 수 있다. 얻을 수 있는 분비량은 1㎍/L(배양물) 이상이거나 바람직하게는, 1mg/L(배양물) 이상이다.
프로모터는 이형 단백질의 아미노 말단에 연결된 신호펩티드로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 RNA의 합성을 지시한다. 프로모터는 스트렙토마이세스 RNA 폴리머라제 전효소의 적어도 한 형태의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae) 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 유전자(aph)의 프로모터(Thompson and Gray, 1983)를 GM-CSF에 융합된 신호펩티드를 암호화내는 mRNA를 전사하는데 사용하였다. 이 프로모터는 적어도 한 종류의 스트렙토마이세스 RNA 폴리머라제 전효소의 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용한다. 프로모터는 스트렙토마이세스 에리트레우스(Streptomyces erythreus) 에리트로마이신 E. 스트렙토마이세스 코엘리콜로(Streptomyces coelicolor) 아가라제의 서열 또는 당업계에서 공지된 방법에 의해 결정된 프로모터 활성을 가진 공지되거나 결정되지 않은 기원의 어떤 서열로부터의 것일 수 있다. 이 프로모터는 천연적이거나 또는 증진된 기능을 가진 프로모터의 돌연변이체 버젼을 얻기 위해 1개 이상의 염기가 치환, 삽입 또는 결실된 하이브리드 서열일 수 있다. 돌연변이 생산은 시험관내 또는 원핵 숙주세포 중에서, 불규칙하거나 부위 특이적 방법으로 화학적 또는 효소적으로 생산될 수 있다.
프로모터는 한 전사 개시 부위를 갖는 단일 프로모터 또는 둘 이상의 전사 개시 부위를 갖는 다중 프로모터일 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, aph 프로모터는 전사의 개시에 대한 두 부위를 갖는 DNA 단편상에 위치해 있다. 부위 1은 번역 개시 ATG의 A에서 전사를 시작하는 반면, 부위 2는 1로부터 보다 상부의 313 염기에서 전사를 시작할 것이다. 다른 실시태양에 있어서, 개시 부위 1만을 갖는 aph 프로모터는 GM-CSF에 융합된 신호펩티드를 암호화하는 mRNA를 전사하는데 사용하였다. 다중 프로머터의 전사 개시 부위는 같거나 다른 형태의 RNA 폴리머라제 전효소에 의해 인식될 수 있으며 같거나 다른 성장 시간 또는 발달 상태에서 활성이 있을 수 있다. 다중 전사 개시 부위를 갖는 프로모터는 천연 서열 또는 1개 이상의 천연 또는 합성의 단일 프로모터 서열로 구성된 하이브리드 서열일 수 있다. 단일 또는 다중 프로모터는 연속 배양기간 동안의 모든 시기에 활성이 있거나, 또는 어떤 배지 성분, 대사 물질 또는 화학 시약의 존재 또는 부재에 의해 조절될 수 있다. 더우기, 프로모터는 배양물의 온도 또는 화학적 환경을 변화시킴으로써 조절될 수 있다.
바람직한 실시태양에 있어서, aph 프로모터는 단백질, 특히, GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 프레임으로 연결된 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 연결되어 있다. aph 프로모터는 Nco I 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용함으로써 신호펩티드를 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드에 연결되어 있다. 이 부위는 aph 유전자의 천연 개시자 ATG를 함유하며 이 배치에서 신호펩티드의 아미노-말단 메티오닌을 나타낸다. 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)의 18S 리보솜 RNA의 3' 말단에 상보적인 DNA 서열은 번역 개시를 입중하기 위해 이 Nco I 부위에 포함될 것이다. 편의상, Pst I 또는 Nsi I 부위를 분비될 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 연결하기 위해 신호 프로세싱 부위에 위치시켰다. Pst I 또는 Nsi I 부위에서 GCA 코돈은 신호펩티드의 카르복시 말단에서 알라닌을 나타낸다. 바람직한 실시태양에 있어서, DNA 서열을 암호화된 신호펩티드의 카르복시 말단이 목적하는 암호화된 단백질의 아미노 말단에 직접 융합되도록 배열되었다. 부가의 펩티드를 암호화하는 서열은 신호펩티드의 분비 및 프로세싱을 촉진하도록 Pst I 또는 Nsi I 부위에 삽입될 수 있다. 아미노-말단 연장부를 가진 결과 단백질은 배양물에서 천연적인 프로세스에 의해서 또는 시험관내에서 화학적 또는 효소적 방법에 의하여 제거될 수 있다.
본 발명에 기재된 신호펩티드, 구체적으로는, 38-아미노산 프로테아제 B 신호펩티드, 34-아미노산 엔도 H 신호펩티드, 41-아미노산 프로테아제 B-엔도 H 하이브리드 신호펩티드, 40-아미노산 프로테아제 B-apr 하이브리드 신호펩티드는 이형 단백질을 분비하기 위해 본 발명에 기재된 것 이외의 발현계와 함께 사용할 수 있음은 고려할 수 있을 것이다. 본 발명에 기재된 신호펩티드는 다른 발현계, 특히 기타 그람 양성세균에 대한 발현계(Chang 1987), 구체적으로는 바실러스 섭틸리스(Bacillus Subtilis) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 발현계에서 사용할 수 있다. 융합 단백질이 스트렙토마이세스 이외에 세균 숙주에서 천연적인 프로세스에 의해 본 발명에 기재된 신호펩티드중 하나를 암호화하는 DNA 단편에 결합되고 이형 단백질을 암호화하는 DNA 세그먼트에 결합된 프로모터에서 작용하는 DNA 세그먼트 포함하는 발현계로부터 합성될 수 있다. 융합 단백질은 그의 아미노 말단에 본 발명에 기재된 한 신호펩티드 및 그의 카르복시 말단에 GM-CSF 일 수 있는 이형 단백질을 가질 수 있다. 신호펩티드의 카르복시 말단은 융합 단백질을 형성하기 위해 이형 단백질의 아미노 말단에 직접 연결될 수 있다. 융합 단백질은 세균 숙주에서의 이형 단백질의 분비에 유용할 것이다.
프로모터, 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 목적하는 특정 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 유전자 발현계는 스트렙토마이세스에서 형질전환 및 복제를 할 수 있는 DNA 벡터 위치해 있다. 이 벡터는 pIJ101, pSL1.2, pSCP2*를 함유하는 스트렙토마이세스의 천연 발생적 플라스미드 또는 OC31을 포함하는 스트렙토마이세스의 천연 발생적 플라스미드의 유도체 또는 스트렙토마이세스에서 복제할 수 있는 어떤 비-스트렙토마이세스 플라스미드 또는 박테리오 파지를 포함할 수 있다. 벡터는 숙주생물체에서 자율적으로 복제할 수 있으며, 숙주 세포의 염색체 또는 거대한 염색체의 요소로 병합되는 것을 필요로 한다. 후자의 경우에 있어서, 벡터는 숙주의 게놈에 있어서 특정 또는 비확정 DNA 서열중의 하나와 시험관내 재조합을 촉진시킬 수 있는 적절한 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 플라스미드 또는 파지 부착 부위, 형질전환 가능한 요소의 재조합 가능한 서열, 또는 병합을 촉진하는 숙주 게놈의 세그먼트와 충분한 상동성을 갖는 어떤 서열을 함유할 수 있다. 스트렙토마이세스의 게놈에서 천연적으로 증폭될 수 있는 DNA 세그먼트, 구체적으로 스트렙토마이세스 코엘리콜로(Streptomyces coelicolor)의 DNA(AUD)의 증폭가능한 5.7kb 단위는 벡터에 포함될 수 있으며 유전자 발현계의 다-복제수 병합을 얻는데 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 벡터는 또한 형질전환 과정 동안 및 그 다음의 형질전환체의 배양시기에 숙주 미생물의 형질전환 균주에 대한 선별을 제공하는 적절한 유전자를 함유할 수 있다. 이 선별 마커는 티오스트랩톤, 카나마이신, 비오마이신, 히그로마이신과 같은 항생제에 대한 저항성을 제공할 수 있거나 이것은 숙주 미생물의 타가영양 또는 조건 치사 변이제를 보충할 수 있다.
바람직한 실시태양에 있어서, 플라스미드 pIJ680은 제2도에서 언급한 변형에 의한 벡터로서 작용시키기 위해 채택하였다. 처음 단계에서, 대장균(E. coli) 플라스미드 pUC8의 2354염기쌍의 PvuII 단편을 pIJ680(Hopwood et al, 1985)의 3390위치(부위번호 16)에서 Pst I 부위내로 도입시켰다. 평활 말단 PvuII 단편을 제2도에서 나타낸 바와 같이 합성 어뎁터를 갖는 Pst I 부위의 -TGCA3' 말단에 연결시켰다. Pst I 부위에서 삽입된 대장균 플라스미드를 갖는 벡터는 앰피실린 선택하에 대장균 또는 티오스트렙톤 내성에 대한 선택하에 스트렙토마이신에서 복제할 수 있다. 벡터의 대장균 플라스미드 부위는 단지 벡터에 있어서 발현계의 어셈블리만을 촉진하고 일단 완성된 플라스미드가 스트렙토마이세스의 형질전환에 대해 준비하게 되면 필요치 않음은 이해될 것이다. 예를 들면, 대장균 플라스미드 세그먼트는 스트렙토마이세스를 형질전화하기에 앞서, Cla I으로 부분 절단에 이어 DNA 리가제로 벡터의 재순환화에 의해 제거할 수 있다.
두번째 단계에서, 프로모터 및 aph 유전자의 암호화 부위는 장차 조립을 촉진하기 위해 합성 DNA 서열로 대체하였다. 이것은 합성 BgIII 링커 GAGATCTC를 CCGCGG Sac II 부위에 있어서 두번째 C에 결찰시킴으로써 pIJ680(Hopwood et al. 1985)의 4883(부위번호 32)의 위치에서 Sac II 부위의 변경을 수반한다. 한 실시태양에 있어서, Bg1II 부위는 합성 링커 CGGATCCG를 AGATCT Ba1II 부위의 C에 결찰시킴으로써 BamHI 부위로 전환시켜 pSS2 벡터를 생성했다. 다른 실시예에 있어서, Xba I 부위는 합성 링커 CAAGCTTG를 TCTAGA Xba I 부위에 있어서 G에 결합시킴으로써 HindIII 부위로 전환시켰다.
pSS2의 BamH I-Xba I 단편은 프로모터, 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 목적하는 특정 단백질을 암호화하는 뉴클오티드 서열로 구성된 발현계로 대체될 수 있다. 제한 부위 BamH I, Xba I가 편의상 선택되었다고 하더라도, 다른 제한 부위를 유전자 발현계를 벡터에 결합시키기 위해 이것 뿐만 아니라 또는 대신에 사용할 수 있음을 이해해야 할 것인다. 비록 바람직한 방향이 제2도에 정의된 바와 마찬가지로 반시계 방향으로 전사를 허용하지라도 발현계는 BamH I 및 Xba I 부위 사이에 삽입될 수 있다. 이것은 인접한 Xba I 부위[원래 pIJ680의 3955(부위 21) 및 3843(부위 19) 사이에 위치함(Hopwood et al, 1985)]인 aph 전사 종결자를 이용하는 것을 허용한다. 그러나, 당업계에 공지된 어떤 전사종결자를 aph에 대한 종결자 뿐만 아니라 또는 대신에 사용할 수 있다. pSS2 벡터는 이형 유전자의 발현에 이용할 수 없는 전사 개시 부위에 대한 부위를 가질 수 있다.
발현 벡터는 여러가지 유전자 발현계를 pSS2 벡터에 삽입시킴으로써 조립할 수 있다. 한 실시태양에 있어서, 발현계 pAPO.GMCSF(제3도)는 GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 결합시킨 프로테아제 B 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 결합된 aph 프로모터를 함유할 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 발현계 pAEO.GMCSF(제4도)는 GM-CSF를 암호화하는 대체가능한 뉴클레오티드 서열에 결합시킨 프로테아제 B-엔도 H 하이브리드 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 결합된 aph 프로모터를 함유한다. 또 다른 실시태양에 있어서, 발현계 pAPO.G(제5도)는 대체가능한 뉴클레오티드 서열에 결합된 프로테아제 B 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 결합된 aph 프로모터를 함유한다. 또 다른 실시태양에 있어서, 발현계 pAPO.H는 합성 DNA(CTAGCAAGCTTG)를 Xba I 부위로 삽입시킴으로써 pAPO.G로부터 제조되었다. 발현계 pAEO.SX(제6도)는 대체가능한 뉴클레오티드 서열에 결합시킨 프로테아제 B-엔도 H 하이브리드 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 결합된 aph 프로모터를 함유한다. 또다른 실시태양에 있어서, 발현계 pAEO.SH는 합성 DNA(CTAGCAAGCTTG)를 Xba I 부위에 삽입시킴으로써 pAEO.SX로부터 조립하였다. 또다른 별법은 대체가능한 뉴클레오티드 서열에 연결된 프로테아제 B 신호펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 연결된 aph 프로모터를 함유한 발현계 pAPO.SX(제7도)이다.
모든 발현 벡터에 있어서 BamH I-Mlu I 단편은 상이한 프로모터 및(또는) 암호화된 신호펩티드 아미노 말단을 함유하는 DNA 단편으로 대체할 수 있다. 또한 pAEO.GMCSF, pAEO.SX, pAEO.SH 또는 pAPO.SX의 Mlu I-Pst I 단편 또는 pAPO.G 또는 pAPO.H의 Mlu I-Nsi I 단편 중의 하나를 별도의 신호펩티드를 암호화하는 DNA 단편으로 대체할 수 있다. 유사하게, pAEO,GMCSF 또는 pAEO.SH의 Pst I-HindIII 단편 또는 pAEO.SX의 Pst I-Xba I 단편 또는 pAPO.H의 Nsi I-HindIII 단편 또는 pAPO.G의 Nsi I-Xba I 단편 중의 하나를 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편으로 대체할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양은 다음의 방법에 예시하였다. 그러한 방법 및 결과는 실시예를 통하여 나타냈으며 첨부한 청구범위를 어떠한 방법으로 한정하려는 것이 아니다.
제조예
균주 및 플라스미드
스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 66(Bibb et al., 1980) 및 플라스미드 pIJ61[톰슨 등 (Thompson, et al., 1982)에 의해 기재되고 스트렙토마이세스 리비단스 66/TC 73으로부터 단리될 수 있음] 및 pIJ680[호프우드 등(Hopwood et al., 1985)에 의해 기재되고, 스트렙토마이세스 리비단스 TK24/TK425로부터 단리될 수 있음]은 존 인스 인스튜트(John Innes Instiute)로부터 구입하였다. 대장균(E. coli)(ATCC 33694)를 모든 형질전환에 사용하였다. 플라스미드 pUC8(Vieira and Messing, 1982) 및 pUC18 및 pUC19(Norrander et al., 1983)은 베테스다 리써치 래보라토리스(Bethesda Research Laboratories)로부터 구매하였다. 플라스미드 pUC680T는 1988년 6월 28일 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁 번호 제40466호로 기탁되었다.
재료
올리고뉴클레오티드들은 어플라이드 바이오시스템사(Applied Inc.)의 380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 합성에 사용한 컬럼, 포스포라미디트 및 시약들은 기술적 시판 업자를 통하여 어플라이드 바이오시스템사로 구입하였다.
올리고뉴클레오티드들은 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 이어서 DEAE 셀룰로오스 크로마토그라피에 의해 정제하였다. DNA를 소화 및 변형시키는 효소들은 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)사로부터 구매하고 공급자의 지시에 따라 사용하였다. 방사성 동위원소[α-32P]dATP(3000Ci/mmol) 및 [α-32P]ATP(3000Ci/mmol)은 아머샴(Amersham)사로부터 구입하였다. 티오스트렙톤은 뉴욕의 스퀴브 코포레이션(Squibb Corporation)에 의해 기증받았다.
DNA의 단리
형질전환된 스트렙토마이세스 리비단스의 플라스미드 DNA를 알칼린 분해방법(Hopwood et al., 1985)에 의해 제조하였다. 대장균(E. coli) 형질전환체들을 50㎍/ml 앰피실린을 함유한 YT 배지(Miller, 1972)에서 성장시켰다. 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 신속한 비등법(rapid boiling method)(Holmes Quigley, 1981)에 의해 정제하였다. 모든 조립체에 사용한 DNA 단편 및 벡터들을 저융점 아가로오스 상의 전기영동에 의해 분리하고 페놀 추출 및 에탄올 침전(Maniatis et al, 1982)에 의하여 융해된 아가로오스로부터 정제하였다.
DNA 서열화
HPLC(Edwardson et al., 1986)에 의해 정제된 플라스미드 DNA는 디데옥시법(Sanger et al., 1977)의 변형법(Hattori et al., 1985)을 사용하여 서열화하였다. 필요할 경우, 서브클론들은 M13 박테리오 파지 mp18 및 mp19(Norrander et al., 1983)에서 제조하고, 디데옥시 서열화 반응은 -20 유니버살 프라이머(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제품)를 사용하여 진행시켰다. 강한 2차 구조의 어떤 영역에 있어서, 콤프레션 및 폴리머라제 실패는 서열을 명확하기 위한 디데옥시 반응에 있어서 데아자구아노신(Mizusana et al., 1986)(Boehringer Mannheim사 제품) 유사체의 사용을 필요로 하였다. 서열들은 DNASTARtm의 소프트웨어(Doggette and Blattner, 1985)에 입력시켰다.
실시예 1
pUC680T의 조립
스트렙토마이세스 플라스미드 pIJ680(1-2㎍)을 Pst1.2 단위로 4분 동안 부분 소화시켜 선형화하였다. 선형화된 pIJ680 플라스미드를 나타내는 5.3-kb Pst I DNA 단편을 Pst I 및 암소 장의 알칼린 포스파타제로 소화된 대장균 플라스미드 pUC18과 혼합시켰다. 이어서 이 혼합물을 T4 DNA 리가제로 결찰시키고 대장균 내로 형질전환시켰다. 형질전환체는 정확한 재조합을 위한 플라스미드 DNA의 분석에 의해 선별되었다. 한 플라스미드 pUC680는 pIJ680의 3390위치(부위번호 16)에서 Pst I 부위로 삽입시킨 pUC8 플라스미드를 가졌다.
pIJ680의 서브클론은 aph 프로모터 및 암호화 부위의 대체를 촉진하기 위해 조립하였다. 이 서브클론, pCM680B는 4883 내지 5290까지의 위치(부위번호 32 및 1)의 pIJ680(Hopwood et al, 1985)의 0.41-Kb SacII-Xho II DNA 단편을 함유한다. SacII 부위는 합성 링커 GAGATCTC를 DNA 폴리머라제 I의 클레노프 단편으로 평활말단화된 SacII 부위로 결찰시킴으로써 변경시켰다. 새로이 생성된 Bg1II 부위는 Xba I 부위로 말단화된 0.92kb의 합성 DNA에 인접한다.
pIJ680 서브클론에 연결된 합성 DNA 단편을 함유하는 pCM680B의 1.33-kb Xba I-Xbo H DNA 단편을 대장균 벡터를 함유하는 pUC680의 6.6kb Xba I-Xho I DNA 단편과 혼합시켰다. 이 혼합물을 T4 DNA 리가제로 결찰시키고 대장균 내로 형질전환시켰다. 생성된 플라스미드 pUC680T를 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분석함으로써 발견하였다. 플라스미드 pUC680T는 1988년 6월 28일 기탁번호 40466으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁하였다.
실시예 2
pSS2의 조립
pUC8의 2.36-kb Pvu II 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 CATCGATG 서열을 인산화된 Cla I 링커(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제품)에 결합시켰다. 결합 반응은 65℃에서 가열시킴으로써 종결시키고 연속 링커의 결합에 의해 발생시킨 부위를 이용한 Nsi I 으로 절단하였다. 2.36-kb Nsi I 단편을 단리하고 pUC680T의 5.3-kb Pst I 단편과 혼합하였다. 이 혼합물을 Nsi I 및 Pst I의 존재하에서 T4 DNA 리가제를 사용하여 결찰시켰다. 결찰 반응은 65℃에서 가열에 의해 종결시키고, Nsi I 으로 소화시켜 대장균 내에 형질전환시켰다. 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분석함으로써 발견된 플라스미드 pSS1은 제2도에 나타낸 방향으로 전기의 Pst I 부위내로 삽입시킨 대장균 플라스미드 세그먼트를 포함하였다.
pSS1의 유일한 Bg1II 부위는 프로모터 서열의 교환을 촉진시키기 위해 BamH I로 변경시켰다. 플라스미드 pSS1을 Bg1II로 절단하고 선형화된 플라스미드의 말단을 DNA 폴리머라제 I의 클레노프 단편으로 채웠다. 이어서, 평활 말단화 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 CGGATCCG 서열의 인산환된 BamH I 링커(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제품)에 결찰시켰다. 결찰 반응은 65℃에서 가열시킴으로써 종결시키고, BanH I으로 소화시켰다. BamH I 말단을 갖는 정제된 선형 플라스미드는 T4 DNA 리가제를 사용하여 재순환시키고 대장균 내에 형질전환시켰다. 원래의 Bg1II 부위를 대체하는 유일한 BamH I 부위를 갖는 생성된 플라스미드 pSS2는 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분석함으로써 발견되었다,
실시예 3
aph 프로모터를 함유한 DNA 단편의 서브클로닝
스트렙토마이세스 플라스미드 pIJ61의 2.1-kb EcoRV-Nco I 단편을 Sau3A I로 소화시키고 적절한 벡터의 BamH I 및 Nco I 내에 결찰시켰다. 재조합체 중에서 aph 프로모터에 대응하는 서열을 갖는 0.40-kb Nco I 단편(제8도)을 함유한 pIJ61, pAPH.4의 서브클론이 발견되었다. Nco I 부위는 aph 유전자의 개시자 ATG를 함유한다.
실시예 4
프로테아제 B 프로모터 및 신호펩티드를 함유하는 DNA 단편의 서브클로닝
프로테아제 B 유전자의 서브클론은 프로테아제 B 유전자를 포함한 2.8kb Bg1II 단편을 포함한 플라스미드의 1.4kb BssH II 단편으로부터 제조하였다(칸진 코포레이션에 의해 1987년 7월 21일 출원된 캐나다 출원 제542,648호 참조). BassH II 단편의 말단은 DNA 폴리머라제 I의 클레노프 단편을 사용하여 채우고 실시예 2의 지시에 따라서 인산화된 BamH I 링커에 결찰시켰다. BamH I 말단을 갖는 생성된 1.4kb 단편은 BamH I으로 소화시키고 알칼린 포스파타제로 처리한 pUC8 벡터내에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pSPRB1.4는 전체 프로테아제 B 유전자를 함유했다.
플라스미드 pUC8은 두 어닐링시킨 올리고뉴클레오티드 GGCCTCGTCTAGA 및 AAGCTTCTAGACGAGGCCTGCA를 Pst I 및 HindIII 부위에 결찰시켜 pUC.PXH플라스미드를 생성함으로써 더욱 서브클로닝하기 위해 채택하였다. 플라스미드 pSPRB1.4는 PvuII로 절단하고 T4 DNA 리가제를 사용하여 GCTGCAGC 서열의 인산화된 Pst I 링커(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제품)에 결찰시켰다. 결찰 반응은 65℃에서 가열함으로써 종결시키고 Pst I 및 BamH I으로 절단하였다. 0.49kb BamH I-Pst I 단편을 정제하고 이어서 pUC.PXH 벡터의 BamH I 및 Pst I 부위내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pPP1은 프로모터, 신호펩티드 및 프로펩티드의 처음 10 아미노산 및 모든 프로테아제 B 유전자를 함유하였다.
실시예 5
프로테아제 B 신호펩티드를 사용한 발현계의 조립
이형 단백질의 분비를 위한 프로테아제 B 신호펩티드의 채택은 두 합성 올리고뉴클레오티드 즉, 프로테아제 B 신호펩티드의 카르복시-말단의 9 아미노산 및 인체 성장 호르몬의 아미노-말단의 8 아미노산(제10도)을 암호화하는 42량체 및 50량체를 사용하는 것과 관련되어 있다. 합성 올리고뉴클레오티들은 프로테아제 B 서브클론 pPP1 의 0.44kb BamH I-Hae II 단편(제9도) 및 BamH I 및 Xba I 으로 소화된 pSS2의 벡터 단편에 3-방향 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pPPO.G는 프로테아제 B 프로모터 및 신호펩티드를 함유한 0.46kg BamH I-Nsi I 세그먼트를 가졌다. Nsi I 부위는 프로세싱 부위(-1 위치)에 바로 선행하는 알리닌 잔기에 대한 GCA코돈을 함유하였다.
프로테아제 B의 신호펩티드는 프로테아제 신호펩티드의 처음 15 아미노산(제11도)을 암호화하는 두 합성 43량체를 사용하여 aph 프로모터로부터의 발현을 위해 채택하였다. 합성 올리고뉴클레오티들은 본 실시예의 지시에 따라 aph 프로모터를 포함한 0.40kb BamH I-Nco 단편(제8도) 및 pPPO.G의 BamIH-MluI에 3- 방향으로 결찰시켰다. 생성된 발현 벡터 pAPO.G는 프로테아제 B 신호펩티드를 암호화하는 서열에 연결된 aph 프로모터를 포함하는 0.5kb BamH I-Nsi I 세그먼트 및 단백질을 암호화하는 대체가능한 서열을 포함하는 0.03kb Nsi-Xba I 세그먼트를 가졌다.
실시예 6
프로테아제 B 신호펩티드를 사용한 별도의 발현계의 제조
단백질을 암호화하는 1.1kb Pst I-Xba I 단편을 함유한 플라스미드 pPCM을 Pst I 및 Xba I으로 소화시키고, 1.1kb 단편을 pPP1 벡터의 Pst I 및 Xba I 부위에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pPP1.PCM은 단일 벡터내에 pPCM의 1.1kb Pst I-Xba I 단편에 연결된 0.49kb BamH I-Pst I 단편을 함유했다.
이형 단백질의 분비를 위한 프로테아제 B 신호의 부가적인 채택은 프로테아제 B 신호펩티드의 카르복시-말단의 3 아미노산(제12도)을 암호화하는 두 합성 26량체 올리고뉴클레오티드의 사용을 수반하였다. 합성 올리고뉴클레오티들은 pPP1의 0.44kb BamH I-HaeII 단편 및 BamH I 및 Pst I로 소화시킨 pPP1.PCM의 벡터 단편에 3-방향 결찰로 연결시켰다. 생성된 플라스미드 pPPO.PCM은 프로테아제 B 프로모터 및 신호펩티드를 함유한 0.46kb BamH I-Pst I 세그먼트를 가졌다. Pst I 부위는 프로세싱 부위(+1 위치) 바로 다음의 알라닌 잔기에 대한 GCA 코돈을 함유하였다.
이어서, pPPO.PCM의 1.6kb BamH I-Xba I 단편을 pSS2의 BamH I-Xba I 벡터 단편에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pPPO.PCM/S2는 모든 pSS2 벡터에 있어서 단백질을 암호화하는 합성 DNA 세그먼트에 연결된 프로테아제 B 프로모터 및 신호펩티드를 함유하였다.
pPPO.PCM/S2 조립시에, 프로테아제 B의 신호펩티드는 실시예 5의 지시에 의해 aph 프로모터로부터 발현을 위해 채택하였다. 프로테아제 B 신호펩티드의 처음 15개의 아미노산을 암호화하는 43량체 올리고뉴클레오티드는 aph 프로모터를 함유한 0.4kb BamH I-Nco I 단편 및 pPPO.PCM의 BamH I-Mlu I 벡터 단편에 3방향 결찰로 연결시켰다. 생성된 발현 벡터 pAPO.PCM은 프로테아제 B 신호펩티드를 암호화하는 서열에 연결된 aph 프로모터를 함유한 0.51kb BamH I-Pst I 세그먼트를 가졌다.
편의상, 벡터 pAPO.PCM에서 단백질을 암호화하는 DNA 세그먼트는 0.8kb Sac I-Xba I 단편을 결실시킴으로써 축소시켰다. 벡터 pAPO.PCM을 Sac I 및 Xba I 으로 소화시키고, 벡터 단편을 합성 올리고뉴클레오티드 CTAGAGCT에 대해 결찰시킴으로서 재순환시켰다. 두 Sac I 및 Xba I에 대한 부위를 보유하는 생성된 발현 벡터 pAPO.SX(제7도)는 프로테아제 B 신호펩티드를 암호화하는 서열에 연결된 aph 프로모터를 함유한 0.5kb BamH I-Pst I 세그먼트 및 단백질을 암호화하는 대체가능한 서열을 함유한 0.32kb Pst I-Xba I (또는 Pst I-Sac I) 세그먼트를 가졌다.
실시예 7
프로테아제 B-엔도 H 하이브리드 신호펩티드를 사용한 발현계의 조립.
합성 DNA 서열은 엔도 H 신호펩티드 스트렙토마이세스를 위한 코돈 용도의 아미노산 서열을 사용하여 고안되었다. 합성 서열 및 그의 상보체를 6개의 올리고뉴클레오티드로 분할하였다. 이 S1.END 및 S2.END의 처음 2개는 aph 프로모터(실시예 11 참조)에 연결시켰다. S3.END 내지 S6.END의 이들 4개는 엔도 H 신호펩티드의 잔여 27 아미노산(제13도)을 암호화하였다. 올리고뉴클레오티드 S4.END 및 S5.END(각각 2㎍)은 20㎕ 반응액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 2.5mM DTT, 0.5mM ATP 및 5 단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제) 중의 37℃에서 30분 동안 별개로 인산화시켰다. 인산화된 올리고뉴클레오티드(각각 10㎕)를 비인산화된 S3.END 및 S6.END 각각 1㎍ 및 500mM=HCl(pH 7.8)-100mM MgCl23㎕을 최종 용적 31㎕ 중에서 혼합하였다. 올리고뉴클레오티드의 어닐링은 90℃에서 10분 동안 행하고, 이어 12 내지 16시간 동안 실온까지 천천히 냉각시켰다. 어닐링시킨 올리고뉴클레오티드(15㎕)을 반응액(50mMTris-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl2, 1mM ATP, 및 1600 단위의 T4 DNA 리가제) 200㎕중의 16℃에서 4시간 동안 결찰시켰다. 이어서, 엔도 H 신호펩티드를 암호화하는 완전한 합성 유전자 세그먼트를 발현 벡터 pAPO.SX의 M1u I 및 Pst I 부위에 결찰시켰으며, 이것은 aph 프로모터, 프로테아제 B 신호펩티드 및 대체가능한 합성 DNA 세그먼트(제7도)를 함유하였다. 이것을 프로테아제 B-엔도 H 하이브리드 신호펩티드를 형성하기 위해 프로테아제 B 신호의 아미노 말단의 15 아미노산을 엔도 H 신호의 카르복시 말단의 26 아미노산에 연결시켰다. Pst I 부위는 신호펩티드의 -1 위치에서 알라닌에 대한 GCA 코돈을 함유한다. 생성된 발현 벡터 pAEO.SX는 프로테아제 B- 엔도 H 하이브리드 신호펩티드를 암호화하는 서열에 연결된 aph 프로모터를 함유한 0.52kb BamH-Pst I 단편 및 단백질을 암호화하는 대체가능한 서열을 함유한 0.32kb Pst I-Xba I (또는 Pst I-Sac I) 세그먼트를 가졌다(제6도).
실시예 8
GM-CSF를 암호화하는 합성 유전자의 조립
합성 DNA 서열은 스트렙토마이세스에 대한 코돈 선택(codon selection)을 사용하여 GM-CSF 아미노산 서열의 역 번역(back translation)에 의해 고안되었다. 이 DNA 서열 및 그의 역 상보체 (reverse complement)는 16 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용하였으며 이것을 실시예 7의 지시에 따라 어닐링하여 함께 결찰시켰다. 이어서, 완전한 0.48kb 합성 GM-CSF 유전자(제1도)를 pUC18의 Pst I 및 Xba I 부위내에 결찰시키고 대장균을 형질전환시키는데 사용하였다. Pst I 부위는 -1위치에서 알라닌에 대한 GCA 코돈을 함유하였으며 이것은 프로테아제 B 및 엔도 H 발현계와 일치하는 것이다. 플라스미드 DNA의 제한 분석에 의해 형질전환체를 선별한 후, 합성 GM-CSF 유전자는 DNA 서열 분석에 의해 진정한 것으로 결정되었다.
실시예 9
프로테아제 B 신호 펩티드를 사용한 GM-CSF 발현계의 조립
pAPO.G의 Xba I 부위를 GM-CSF 유전자의 삽입을 촉진하기 위해 HindIII 부위로 전환시켰다. 벡터 pAPO.G를 Xba I으로 분해시키고, 생성된 선형 벡터의 말단을 DNA 폴리머라제 I의 클레노프 단편을 사용하여 채운 후, T4 DNA 리가제를 사용하여 CAAGCTTG 서열의 인산화된 HindIII 링커(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제품)에 결찰시켰다. 반응을 65℃에서 가열함으로써 종결시키고 HindIII로 소화시켰다. 이어서, HindIII 말단을 갖는 정제 선형 플라스미드 T4 DNA 리가제를 사용하여 재순환시켰다. 생성된 발현 벡터 pAPO.H는 프로테아제 B 신호 펩티드를 암호화하는 서열에 연결된 aph 프로모터를 함유한 0.51kb BamH I-Nsi I 세그먼트 및 단백질을 암호화하는 대체가능한 서열을 함유한 0.03kb Nsi I-Hind III 세그먼트를 가졌다. GM-CSF 유전자를 함유한 pUC.GMCSF의 0.48kb Pst I-Xba I 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 aph 프로모터를 함유하고 프로테아제 B 신호 펩티드를 암호화하는 pAPO.G의 BamH I-Pst I 벡터 단편에 결찰시켰다. 생성된 발현 벡터 pAPO.GMCSF에 있어서, 암호화된 신호 펩티드의 카르복시 말단은 암호화된 GM-CSF 단백질의 아미노 말단에 직접 융합시켰다.
실시예 10
프로테아제 B-엔도 H 하이브리드 신호 펩티드를 사용한 GM-CSF의 발현 벡터의 조립
pAEO.SX의 Xba I 부위를 실시예 9의 지시에 따라 HindIII 부위로 전환시켰다. 생성된 발현 벡터 pAEO.SH는 프로테아제 B-엔도 H 하이브리드 신호 펩티드를 암호화하는 서열에 연결된 aph 프로모터를 함유한 0.52kb BamH I-Pst I 세그먼트 및 단백질을 암호화하는 대체가능한 서열을 함유한 0.32kb Pst I-HinIII(또는 Pst I-Sac I) 세그먼트를 갖는다.
GM-CSF 유전자를 함유한 pUC.GMCSF의 0.48kb pst I-HindIII를 aph 프로모터 및 프로테아제 B-엔도 H 하이브리드 신호 펩티드를 함유한 pAEO.SH의 Pst I-HindIII 벡터 단편에 결찰시켰다. 생성된 발현 벡터 pAEO.GMCSF에 있어서, 암호화된 신호 펩티드의 카르복시 말단을 암호화된 GM-CSF 단백질의 아미노 말단에 직접 융합시켰다.
실시예 11
엔도 H 신호 펩티드를 사용한 발현계의 조립
pAEO.GMCSF중의 신호 펩티드의 아미노 말단은 실시예 5의 지시에 따라 pAPH.4의 0.40kb BamH I-Nco I 단편 및 어닐링시킨 올리고뉴클레오티드 S1.END(CATGTTCACTCCCGTTCGGAGA) 및 S2.END(CGCGTCTCCGAACCGG-AGTGAA)에 의해 3반향-결찰로 대체시킴으로써 프로테아제 B로부터 엔도 H를 변경시켰다. 생성된 발현 벡터 pAEO-1.GMCSF는 엔도 H 신호 펩티드를 암호화하는 서열에 연결된 aph 프로모터를 함유한 0.50kb BamH I-Pst I 단편을 가졌다.
실시예 12
프로테아제 B-apr 하이브리드 신호 펩티드를 사용한 GM-CSF의 발현 벡터의 조립
합성 DNA 서열은 apr 신호 펩티드의 아미노산 서열을 사용하고 스트렙토마이세스의 코돈을 사용하여 고안하였다. 프로테아제 B-apr 하이브리드 신호 펩티드 발현 벡터의 조립은 프로테아제 B 신호 펩티드의 15 아미노산 및 apr 신호 펩티드의 카르복시 말단 25 아미노산(제14도)을 암호화하는 두 합성 올리고뉴클레오티드 81량체 및 73량체의 사용을 수반하였다. 합성 올리고뉴클레오티드들을 어닐링시키고 이어서, 발현벡터 pAEO.SH(제6도)의 Mlu I 및 Pst I 부위에 결합시켰다. 생성된 플라스미드 pAarp.SH는 aph 프로모터, 프로테아제 B-apr 하이브리드 세그먼트를 펩티드를 암호화하는 서열 및 대체가능한 합성 DNA 절편을 함유하였다. 프로테아제 B-apr 하이브리드 신호 펩티드 apr 신호 펩티드의 카르복시 말단 25 아미노산에 연결된 프로테아제 B 신호 펩티드의 아미노 말단 15 아미노산을 함유한다.
합성 GM-CSF 유전자는 GM-CSF의 아미노 말단 9 아미노산을 암호화하는 두 합성 올리고뉴클레오티드, 21량체(CCCGCCCGGTCGCCCTCGCCG) 및 29량체(TCGACGGCGAGGGCGACCGGGCGGGTGCA)를 사용함으로써, pAapr.SH 발현 벡터에 채택하였다. 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고 이어서 pUC.GMCSF의 0.36kb Sal I-HindIII 단편(제1도) 및 Pst I 및 HindIII으로 소화된 pAapr.SH의 벡터 단편에 3- 방향 결찰로 연결시켰다. 생성된 발현 벡터 pAapr.GMCSF에 있어서, 암호화된 신호 펩티드의 카르복시 말단은 암호화된 GM-CSF 단백질의 아미노 말단에 직접 융합시켰다.
실시예 13
단일 전사 개시 부위를 가진 aph 프로모터를 사용한 GM-CSF의 사용한 GM-CSF의 발현벡터의 조립
발현 벡터 pAPO.GMCSF를 SacII로 절단하고, 생성된 단편을 DNA 폴리머라제 I의 클레노프 단편으로 처리하여 평활 말단으로 만들었다. 이어서, 평활 말단화 Sac II 단편을 실시예 2의 지시에 따라 인산화된 BamH I 링커에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 BamH I 및 HindIII로 소화시키고 0.62kb 단편을 정제하였다. 이어서 0.62kb BamH I-HindIII 단편을 BamH I 및 HindIII로 절단시킨 pAPO.H의 벡터 단편에 결찰시켰다. 생성된 발현 벡터 pA*PO.GMCSF는 GM-CSF를 암호화하는 서열에 연결된 프로테아제 B 신호 펩티드를 암호화하는 서열에 연결킨 0.12kb aph 프로모터 세그먼트를 가졌다.
실시예 14
GM-CSF 발현계를 사용한 스트렙토마이세스 리비단스(Stre[tpmyces lividans])의 형질전환
스트렙토마이세스 리비단스 66의 원형질체를 형질 전환에 사용하였다. 스트렙토마이세스 리비단스 66의 배양물을 0.5% 글리신을 함유한 YEME 배지(Hopwood et al., 1985)에서 30℃로 40시간 동안 설장시켰다. 원형질체는 라이소자임 처리에 의해 수확한 균사체로부터 제조하고 호프우드(Hopwood et al., 1985)가 기재한 바와 같이 Miracloth[칼바이오켐 훽스트(Calbiochem Hoechst)사 제품]을 통하여 여과에 의해 정제하였다. 원형질체(40×10)를 발현 벡터의 플라스미드 DNA(1㎍)로 형질전환시키고 호프우드(Hopwood et al., 1985)가 기재한 대로 R2YE 플레이트상에 살포하였다. 30℃에서 22시간 동안 배양시킨 후, 플레이트들은 티오스트렙톤(30㎍/ml)을 함유한 부드러운 영양 아가(Soft Nutrient Agar)로 덮어 씌우고, 포자형성이 일어날때까지 37℃에서 배양시키도록 하였다.
실시예 15
스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) 형질전환체의 성장
GM-CSF 발현 벡터로 형질전환시킨 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) 66의 10 콜로니를 티오스트렙톤 5μ/ml을 함유한 LB 배지 15ml에 접종시키고, 32℃에서 65시간 동안 성장시켰다. 배양체를 조직 균등기[텐브로엑크-벨코(Tenbroeck-Dello)사 제품]을 제2배양을 위한 접종물로서 사용하였다.
200ml LB 배지 및 티오스트렙톤(5g/ml)을 함유한 21 배플 진탕 플라스크를 0.2의 A600에 접종하고 주변 진당기(240rpm) 중에서 32℃로 2 내지 4 일간 배양시켰다. 10ml 분할표본을 0 내지 96시간의 성장 시간중 적당한 시간에서 배양물로부터 제거하였다. 건조 중량 측정에 사용되는 균사체를 4000rpm에서 10분간 원심분리 함으로써 제거하였다. GM-CSF를 포함한 분비 단백질을 함유하는 상층 분획을 분석전에 -20℃에서 동결시켰다.
실시예 16
GM-CSF 분비의 확인
GM-CSF를 포함하는 분비된 단백질을 함유한 실시예 15에 기재된 상층액 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하고 목적하는 단백질 또는 단백질들을 단백질 특이성 염료로 염색시키거나 웨스턴 블롯팅 분석에 의하여 관찰하였다. 배양 상층액의 1.5ml 정제수를 50% 냉 트리클로로아세트산(TCA) 용액 [최종농도 10%(w/v)]의 첨가 및 4℃에서 약 15-30분 동안 생성된 혼합물을 배양시킴으로써 농축시켰다. 형성된 침전물은 GM-CSF를 포함한 분리 단백질을 함유하고 이는 실온에서 약 5분 동안 최대 속도로 에펜도르프 원심분리기에서 원심분리에 의해 수집하였다.
침전된 시료는 재현탁 TCA 침전물의 PH를 2N NaOH의 첨가에 의한 시료 완충액의 pH로 조정한 변형을 행하여 램믈리(Laemmli, 1970)에 의해 기재된 방법에 따라 전기영동을 위해 제조하였다. 폴리아크릴아미드 겔(15% 아크릴 아미드)는 램믈리의 방법에 의해 진행시켰다.
상기 방법에 의해 분리된 단백질의 윤곽은 쿠마시 브릴리어트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색함으로써 가시화되었다(제15a도). 파마시아 저분자량 표본[Low Molecular Weigh standard(제15도)에서 화살로 표시함]에 비교하여 약 15,000달톤의 겉보기 분자량으로 이동한 GM-CSF 유전자를 함유한 세포에 신규 단백질 밴드가 존재하였다. 이 밴드는 GM-CSF에 대한 단일클론 항체와의 교차반응에 의하여 GM-CSF로서 동정되었다. 이 분석은 신규 단백질 밴드가 GM-CSF에 대해 배양된 항체와 교차 반응하는 GM-CSF 형질전환체에서 발견된 겔 전기영동(제15b도)에 의해 분리된 단백질을 웨스턴 블롯팅하여 수행하였다. 웨스턴 블롯팅은 토우빈 등(Towbin et al., 1979)의 방법을 변형한 부르네트(Burnette, 1981)의 방법에 따라서 행하였다.
GM-CSF 분비 농도의 정량화는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색한 겔 및 웨스턴 블롯트(표 1)을 측정하여 행하였다. 상층액에 있어서 전체 단백질은 바이오라드(Bio-Rad) 단백질 분석에 의하여 결정하였다.
분비된 GM-CSF의 농도는 pAPO.GMCSF(레인 9-10)을 포함한 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans)에서 가장 높았다. 약간 낮은 농도의 분비 GM-CSF를 pA*PO.GMCSF(레인 11-12)에서 관찰하였고 이것은 단일 개시 부위를 가진 aph 프로모터를 포함했다. pAPO.GMCSF(레인 5-6)중의 프로테아제 B 신호 펩티드의 카르복시 말단 23 아미노산의, pAEO.GMCSF(레인 1-2)중의 엔도 H 신호 펩티드의 카르복시 말단의 26 아미노산 또는 pAapr.GMCSF의 aph 신호 펩티드의 카르복시 말단의 25 아미노산에 의한 치환은 3배 낮은 농도의 농도는 GM-CSF를 초래하였다. 그러나, 분비 GM-CSF의 분비는 pAEO-1. GMCSF(레인 7-8)의 엔도 H 신호 펩티드를 사용하는 것보다 pAEO.GMCSF의 프로테아제 B-엔도 H 하이브리드신호 펩티드를 사용함으로써 더 높았으며, 이는 하이브리드 신호 펩티드가 천연 신호 펩티드보다 유리함을 나타낸다.
실시예 17
GM-CSF의 생체활성의 측정
분비 GM-CSF의 생물학적 활성은 세포가 연질 아가중에서 콜로니의 성장을 자극하는 그들의 능력에 기록되는 메틸셀룰로오스 콜로니 자극 분석에 의하여 측정 하였다. 요약하여 조혈제 콜로니-자극 활성 분석에 대한 비-고착 골수 세포는 그레고리 및 이브스(Gregory and Eaves, 1977)에 의해 기재된 바와 같이 건장한 성인으로부터 얻은 시료에서 제조하였다. 분석을 위해 세포들을 약 5×104세포/ml 최종 농도로 위치시켰다. 배양 배지는 0.8% 메틸셀룰로오스, 30% 태아 송아지 혈청(유동성), 1% 탈이온 소 혈청 알부민 [BSA, 시그마 케미칼사(세인트 루이스소재) 제품], 0.1mM 2-메르캅토에탄올 및 콜롬벨 등(Coulombel et al., 1983) 및 카스만(Cashman et al., 1985)에 의해 기재된 알파 배지를 함유하였다. 세포들은 성장 인자를 함유한 배지의 존재하에서 공지중의 충분한 습도가 있는 5% CO2에서 일반적으로 7-14의 시간 주기 동안 37℃에서 배양시켰다. 콜로니들은 도립 현미경하에서 그 위치인 채로 기록되었다.
생물학적 활성의 분석은 두 pAPO.GMCSF 및 pAEO.GMCSF(표 2)에 대해 행하였으며 두 경우에 있어서, 10% 인체 백혈구 조건 배지(인체 GM-CSF를 포함함)에서 발견된 바와 같이 동일한 비율의 거대 적혈구/혼합 콜로니가 저농도로 자극되고 가진 과립구/대식세포형 콜로니가 충분히 자극된 것으로 입증되었다.
[표 1]
스트렙토마이세스 리비단스(S.lividans) 66에서 형질 전환된 다른 조립체로부터의 GM-CSF의 발현
Figure kpo00001
[표 2]
pAPO.GMCSF 및 pAEO.GMCSF의 상층액의 콜로니 자극 활성 및 다른 이형 유전자로 형질전환된 음성 대조 시료
Figure kpo00002
* 응용할 수 없음.
실시예 18
GM-CSF의 정제
GM-CSF는 폴리아크릴아미드 겔로부터 GM-CSF를 용출하여 소량으로 정제하였다. 상층액 단백질의 10ml을 약 24시간의 성장시에 수확하고 균사체는 임상 원심분리기로 4℃에서 10분 동안 4000rpm으로 원심 분리하여 제거하였다. GM-CSF를 함유한 상층액 단백질을 실시예 16의 지시에 따라 농축시키고 램믈리(Laemmli, 1970)의 방법을 시료 제조 및 겔의 이동에 대해 변형시킨 훈카필러(Hunkapiller, et al., 1983)에 의해 개재된 방법에 의하여 15% 폴리아크릴아미드겔 이동에 의해 분리하였다. GM-CSF 단백질 밴드는 훈카필러 등에 의해 기재된 겔 용출 방법에 의하여 단리하고 생성된 용액을 동결건조에 의해 농축시켰다. 용출 밴드의 순도 및 성질은 실시예 16의 지시에 분석하였다.
실시예 19
GM-CSF의 아미노 말단 서열의 분석
실시예 18의 기재된 바와 같이 배양물 상층액의 시료로부터 정제된 GM-CSF의 시료를 Institut de Rechercheen Biotechnologie사(몬트리올 소재, 캐나다)에 의해 분석하였다. 아미노 말단 서열화는 에드만 자동 분해 고리화 기술(Edman automated degradation cycling technique)(Edman and Begg, 1967)을 사용하여 어플라이드 바이오 시스템스 가스상 서열기(Applied Biosystems Gas Phase Sequenator)상에서 행하였다. 단백질의 처음 9 아미노산에 대해 얻은 서열은 APARSPSPS로서 예견한 아미노산과 일치한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 상세하게 설명하였으나 여러 변형들은 본 발명의 정신이나 하기 청구 범위의 영역을 벗어남이 없이 바람직한 실시예에 행할 수 있음을 당업계에서 숙련된 자들에게는 이해될 것이다.
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Claims (40)

  1. 분자내 이황화 결합을 갖는 비글리코실화 이형 단백질을 암호화하는 제2의 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 결합된 조절 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 이 조절 뉴클레오티드 서열은 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주로부터 생체활성형의 상기 이형 단백질의 분비를 지시하는 펩티드를 암호화하는 것인 유전자 발현계.
  2. 분자내 이황화 결합을 갖는 비글리코실화 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 암호화하는 제2의 뉴클레오티드 서열에 결합된 조절 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 이 조절 뉴클레오티드 서열은 스트렙토마이세스속으로부터 선택된 숙주로부터 생체활성형의 상기 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)의 분비를 지시하는 펩티드를 암호화하는 것인 유전자 발현계.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조절 뉴클레오티드 서열이 신호 서열 및 프로모터 서열로 이루어진 것인 유전자 발현계.
  4. 제1 또는 2항에 있어서, 상기 제2의 뉴클레오티드 서열이 제1도에 나타낸 것인 유전자 발현계.
  5. 제3항에 있어서, 상기 신호 서열이 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B의 신호 펩티드를 암호화하거나, 스트렙토마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus) 엔도-B-N-아세틸글루코사미니다제 H의 신호 펩티드, 그람 양성 박테리아의 신호 펩티드 또는 그람 음성 박테리아의 신호 펩티드를 암호화하는 것인 유전자 발현계.
  6. 제3항에 있어서, 상기 신호 서열이 스트렙토마이세스(Streptomyces)속의 신호 펩티드의 하이브리드. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B 및 스트렙토마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus) 엔도-B-N-아세틸글루코사미니다제 H의 신호 펩티드의 하이브리드, 박테리아의 신호 펩티드의 하이브리드, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 및 박테리아의 신호 펩티드의 하이브리드, 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus Subtilis) 알칼린 프로테아제의 신호 펩티드의 하이브리드를 암호화하는 것인 유전자 발현계.
  7. 제1항, 2항, 5항 및 6항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조절 뉴클레오티드 서열이 다중 프로모터 서열을 포함하는 것인 유전자 발현계.
  8. 제1항, 2항, 5항 및 6항중 어느 한의 항에 있어서, 상기 조절 뉴클레오티드 서열이 다중 프로모터 서열을 포함하고, 프로모터 서열중 하나가 기타 프로모터 서열에 비하여 상이한 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 것인 유전자 발현계.
  9. 제1항, 2항, 5항 및 6항중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조절 뉴클레오티드 서열이 다중 프로모터 서열을 포함하고, 상기 프로모터 서열이 같은 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 것인 유전자 발현계.
  10. 제3항에 있어서, 상기 프로모터 서열이 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 것인 유전자 발현계.
  11. 제3항에 있어서, 상기 프로모터 서열이 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)의 아미노 글리코시드 포스포트란 스퍼라제 유전자로부터의 서열로 이루어지는 것인 유전자 발현계.
  12. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B와 스트렙토마이세스 플리카투(Streptomyces plicatus) 엔도-B-N-아세틸글루코 사미니다제 H의 신호 펩티드의 하이브리드를 암호화 하는 DNA 신호 서열.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신호 펩티드의 아미노산 서열이 MRIKRTSNRSNAARRVRTAALALSAAAALVLGSTAASGASA인 DNA 신호 서열.
  14. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 A, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 아밀라제 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) R61 DD-펩티다제로부터 선택된 신호 펩티드의 하이브리드를 암호화하는 DNA 신호 서열.
  15. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 알칼린 프로테아제의 신호 펩티드의 하이브리드를 암호화하는 DNA 신호 서열.
  16. 제16항에 있어서, 상기 신호 펩티드의 아미노산 서열이 MRIKRTSNRSNAARRVWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQA인 DNA 신호 서열.
  17. 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B의 신호 펩티드 부분, 및 스트렙토 마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus) 엔도-B-N-아세틸글루코사미니다제 H의 신호 펩티드 부분을 암호화하는 신호 서열, 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이전효소에 의한 전사를 허용하는 프로모터 서열 및 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 상기 신호서열은 상기 프로모터 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열에 공유결합되어 있는 유전자 발현계.
  18. 제12항, 13항, 14항, 15항 또는 16항에 따른 신호 서열, 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 프로모터 서열 및 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 상기 신호 서열이 상기 프로모터 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열에 공유결합되어 있는 유전자 발현계.
  19. 제12항, 13항, 14항, 15항 또는 16항에 따른 신호 서열, 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)의 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 유전자로부터의 프로모터 서열 및 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어지며, 상기 신호 서열이 상기 프로모터 서열 및 상기 뉴클레오티드 서열에 공유결합 되어 있는 유전자 발현계.
  20. 제1, 2, 5, 6 또는 17항의 유전자 발현계로 이루어진, 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질전환 및 복제가능한 벡터.
  21. 제1, 2, 5, 6 또는 17항의 유전자 발현계로 이루어진, 스트렙토마이세스에서 형질전환 및 복제가능한 벡터 pSS2.
  22. 제1, 2, 5, 6 또는 17항의 발현계를 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질전환 및 복제가능한 벡터에 삽입시키고, 상기 벡터를 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주에 삽입시키는 것으로 이루어지는 유전자 발현방법.
  23. 제1, 2, 5, 6 또는 17항의 발현계로 이루어진, 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질전환 및 복제 가능한 벡터를 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주에 삽입시키는 것으로 이루어지는 유전자 발현방법.
  24. (a) 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전자를 허용하는 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)의 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 유전자로부터의 프로모터 서열, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B의 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열, 및 이형 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 등의 DNA 서열을 결합시키고, (b) 상기 DNA 서열을 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질전환 및 복제가능한 벡터에 삽입시키고, (c) 상기 벡터를 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주에 삽입시키고, 형질전환
    된 숙주를 성장시키고, (d) 생체활성 단백질을 회수하는 것으로 이루어지는, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로부터 선택된 숙주로부터 분리된 생체활성형의 이형 단백질을 생산하는 방법.
  25. (a) 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)의 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 유전자로부터의 프로모터 서열, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B의 신호 펩티드의 부분 및 스트렙토마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus) 엔도-B-N-아세틸글루코사미니다제 H의 신호 펩티드의 부분을 암호화하는 신호 서열, 및 이형 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드서열 등의 DNA 서열을 결합시키고, (b) 상기 DNA 서열을 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질전환 및 복제가능한 벡터에 삽입시키고, (c) 상기 벡터를 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주에 삽입시키고, 형질전환된 숙주를 성장시키고, (d) 생체활성 단백질을 회수하는 것으로 이루어지는, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주로부터 분비된 생체활성형의 이형 단백질을 생산하는 방법.
  26. (a) 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)의 아미노글리코시 포스포트란스퍼라제 유전자로부터의 프로모터 서열, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B의 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열, 및 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열 등의 DNA 서열을 결합시키고, (b) 상기 서열을 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질전환 및 복제 가능한 벡터에 삽입시키고, (c) 상기 벡터를 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주에 삽입시키고, 형질전환된 숙주를 성장시키고, (d) 생체활성 GM-CSF를 회수하는 것으로 이루어지는, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주로부터 분비된 생체활성형의 과립구 대식세포 콜로니 자극인자를 생산하는 방법.
  27. (a) 스트렙토마이세스(Streptomyces) RNA 폴리머라제 전효소의 특이적 결합 및 이 전효소에 의한 전사를 허용하는 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)의 아미노글리코시드 포스포트란스퍼라제 유전자로부터의 프로모터 서열, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B의 신호 펩티드의 부분 및 스트렙토마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus) 엔도-B-N-아세틸글루코사미니다제 H의 신호 펩티드의 부분을 암호화하는 신호 서열 및 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열 등의 DNA 서열을 결합시키고, (b) 상기 DNA 서열을 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질전환 및 복제가능한 벡터에 삽입시키고, (c) 상기 벡터를 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주에 삽입시키고, 형질전환된 숙주를 성장시키고, (d) 생체활성 GM-CSF를 회수하는 것으로 이루어지는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주로부터 분비된 생체활성형의 과립구 대식세포 콜로니 자극인자를 생산하는 방법.
  28. 신호 펩티드 및 분자내 이황화 결합을 가지며 N-말단 메티오닌이 없는 비글리코실화 이형 단백질을 포함하는 제1, 2 또는 23항의 유전자 발현계에 의하여 암호화된 융합 단백질.
  29. 제24, 25, 26 또는 27항의 방법에 의해 생산되고, 비글리코실화되며, 분자내 이황화 결합을 가지며, N-말단 메티오닌이 없는 생체활성 단백질.
  30. 비글리코실화되고 분자내 이황화 결합을 갖고, N-말단 메티오닌이 없는, 적합한 숙주로부터 분비된 제조합 DNA로 유도된 GM-CSF.
  31. 비글리코실화되고 분자내 이황화 결합을 갖고, N-말단 메티오닌이 없으며, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로부터 선택된 숙주로부터 분비된 제조합 DNA로 유도된 GM-CSF.
  32. 분자내 이황화 결합을 갖는 비글리코실화 이형 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 결합된 조절 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 조절 뉴클레오티드 서열은 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 결합된 프로모터 서열로 이루어지고, 상기 신호 펩티드는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주로부터 생체활성형의 상기 이형 단백질의 분비를 지시할 수 있고, 상기 신호 펩티드는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속의 신호 펩티드의 하이브리드인 유전자 발현계.
  33. 제32항에 있어서, 상기 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B 및 스트렙토마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus) 엔도-B-N-아세틸글루코사미니다제 H의 신호 펩티드의 하이브리드, 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제 B 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus Subtilis) 알칼린 프로테아제의 신호 펩티드의 하이브리드인 유전자 발현계.
  34. 제32항에 있어서, 상기 이형 단백질이 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)인 유전자 발현계.
  35. 제33항에 있어서, 상기 이형 단백질이 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)인 유전자 발현계.
  36. 제32항 또는 33항에 따른 유전자 발견계로 이루어진, 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질 전환 및 복제가능한 벡터.
  37. 제35항에 있어서, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)를 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열이 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열인 유전자 발현계.
  38. 제32항, 33항, 34항, 35항 또는 37항의 유전자 발현계를 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질 전환 및 복제가능한 벡터에 삽입시키고 상기 벡터를 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주에 삽입시키는 것으로 이루어진 유전 발현방법.
  39. 제32항, 33항, 34항, 35항 또는 37항에 따른 유전자 발현계로 이루어진 제조합 DNA 분자에 의해 형질 전환된 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주 세포.
  40. (a) 제1항, 제2항, 6항, 17항, 32항, 33항, 34항, 35항 또는 37항에 따른 유전자 발현계로 이루어진, 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 형질 전환 및 복제가능한 벡터로 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주를 형질전환시키고, (b) 상기 벡터로 형질전환되어진 숙주의 배양물을 이형 단백질을 생체활성형으로 발현시키고 분비시키는 조건하에 성장시키고, (c) 상기 배양물로부터 상기 이형 단백질은 회수하는 것으로 이루어지는, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속으로부터 선택된 숙주로부터 분비된 생체활성형의 이형 단백질을 생산하는 방법.
KR1019890010594A 1988-07-18 1989-07-25 스트렙토마이세스 속으로부터 생체활성 인체 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(gm-csf) 및 기타 이형 단백질을 분비시키기 위한 발현계 KR960013133B1 (ko)

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