JP2688174B2 - ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの生物活性ヒト顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びその他の異種蛋白質の分泌に関する発現系 - Google Patents
ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの生物活性ヒト顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びその他の異種蛋白質の分泌に関する発現系Info
- Publication number
- JP2688174B2 JP2688174B2 JP6054123A JP5412394A JP2688174B2 JP 2688174 B2 JP2688174 B2 JP 2688174B2 JP 6054123 A JP6054123 A JP 6054123A JP 5412394 A JP5412394 A JP 5412394A JP 2688174 B2 JP2688174 B2 JP 2688174B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- streptomyces
- sequence
- csf
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は異種(heterologous)生物
活性蛋白質、特にストレプトミセス・ゲネラStreptomyc
es generaから選択される宿主挿入発現系による顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（『ＧＭ−ＣＳＦ』）
の分泌に関する。
活性蛋白質、特にストレプトミセス・ゲネラStreptomyc
es generaから選択される宿主挿入発現系による顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（『ＧＭ−ＣＳＦ』）
の分泌に関する。
【０００２】
【従来の技術】市販可能な蛋白質の生産においては、生
物活性な形態でブロス中に蛋白質を分泌する微生物の能
力が重要である。しかしながら、ＤＮＡが発現される細
胞によって分泌され得ない、又は生物活性な形態で蛋白
質を分泌し得ない遺伝子工学的なＤＮＡの構築によって
コードされる多数の蛋白質がある。蛋白質がブロス中に
分泌されない場合は、ダウンストリームプロセッシング
を要する。これは、細胞は採取される必要があり、細胞
壁は破壊されねばならず、所望の蛋白質は純粋な形態で
取り出され、次いでこのような蛋白質は化学的に再生し
て(re-natured)、その生物活性を修復（restore ）しな
ければならない。蛋白質がブロス中に分泌されるが、し
かし生物活性な形態ではない場合は、分泌後に蛋白質を
処理し、生物活性を再び保持するようにしなければなら
ない。
物活性な形態でブロス中に蛋白質を分泌する微生物の能
力が重要である。しかしながら、ＤＮＡが発現される細
胞によって分泌され得ない、又は生物活性な形態で蛋白
質を分泌し得ない遺伝子工学的なＤＮＡの構築によって
コードされる多数の蛋白質がある。蛋白質がブロス中に
分泌されない場合は、ダウンストリームプロセッシング
を要する。これは、細胞は採取される必要があり、細胞
壁は破壊されねばならず、所望の蛋白質は純粋な形態で
取り出され、次いでこのような蛋白質は化学的に再生し
て(re-natured)、その生物活性を修復（restore ）しな
ければならない。蛋白質がブロス中に分泌されるが、し
かし生物活性な形態ではない場合は、分泌後に蛋白質を
処理し、生物活性を再び保持するようにしなければなら
ない。
【０００３】細胞及び微生物の中には、生物活性な形態
で蛋白質を分泌することによりダウンストリームプロセ
ッシング(downstream processing) と生物学的に等価な
ことを行うものもある。細胞外面を通しての細胞の外部
環境へのある蛋白質の分泌を支配する機序は未だ十分に
理解されているわけではない。例えば、ストレプトミセ
ス・グリセウスStreptomyces griseus 種は生物活性な
形態で多数の細胞外蛋白質を分泌する。生物活性がそれ
らの特別な三次元分子構造に依存する商業的価値のある
異種蛋白質が、天然の細胞外蛋白質について観察される
レベルでストレプトミセスStreptomycesから分泌される
場合は好都合である。
で蛋白質を分泌することによりダウンストリームプロセ
ッシング(downstream processing) と生物学的に等価な
ことを行うものもある。細胞外面を通しての細胞の外部
環境へのある蛋白質の分泌を支配する機序は未だ十分に
理解されているわけではない。例えば、ストレプトミセ
ス・グリセウスStreptomyces griseus 種は生物活性な
形態で多数の細胞外蛋白質を分泌する。生物活性がそれ
らの特別な三次元分子構造に依存する商業的価値のある
異種蛋白質が、天然の細胞外蛋白質について観察される
レベルでストレプトミセスStreptomycesから分泌される
場合は好都合である。
【０００４】遺伝子工学的なＤＮＡの構築に関する文献
の中には、ＤＮＡに含まれる情報を用いる機能性蛋白質
の産生はＤＮＡのコードを解読することにより解決され
ると仮定したものもあった。この仮定は、蛋白質分子の
複雑な三次元構造を特定するために必要な情報がその蛋
白質の一次アミノ酸配列中に含まれる、という原則に基
づいていた。しかしながら、1985年11月 1日にCangene
Corporation が出願したProduction of Active Protein
s Containing Cystine Residues （シスチン残基含有活
性蛋白質の産生）という表題のカナダ国特許出願第 44
9,456号明細書には、遺伝子工学的なＤＮＡの構築に由
来するある種の蛋白質の生物活性は正しく位置したジス
ルフィド結合の形成によることが例証されている。宿主
細胞又は微生物における異種遺伝子の発現に関して、慣
用法よりもさらに有効な方法が探索された。そこで、そ
の発明は、ダウンストリームプロセッシングを要せずに
生物活性な形態で宿主微生物から異種蛋白質が分泌され
得ることを明らかにした。ある発現系である種の微生物
を使用すると、遺伝的工学的なＤＮＡ構築の発現におい
てジスルフィド結合の形成が促進される。それらの活性
構造の重要で必然的な部分としてシスチン残基を有する
製造された蛋白質の生物活性は、同種のジスルフィドで
結合された蛋白質を発現及び排出可能な細胞又は微生物
から選択される調節(requlatory)ヌクレオチド配列を用
いることにより達成された。そのヌクレオチド配列は、
ジスルフィド結合を含有する異種蛋白質をコードする二
次ヌクレオチド配列に遺伝子操作により結合され得る。
調節ヌクレオチド配列は細胞又は微生物からの異種蛋白
質の分泌を引き起こす蛋白質をコード化した。異種蛋白
質は天然のものでも又はデザインしたものでもよかっ
た。
の中には、ＤＮＡに含まれる情報を用いる機能性蛋白質
の産生はＤＮＡのコードを解読することにより解決され
ると仮定したものもあった。この仮定は、蛋白質分子の
複雑な三次元構造を特定するために必要な情報がその蛋
白質の一次アミノ酸配列中に含まれる、という原則に基
づいていた。しかしながら、1985年11月 1日にCangene
Corporation が出願したProduction of Active Protein
s Containing Cystine Residues （シスチン残基含有活
性蛋白質の産生）という表題のカナダ国特許出願第 44
9,456号明細書には、遺伝子工学的なＤＮＡの構築に由
来するある種の蛋白質の生物活性は正しく位置したジス
ルフィド結合の形成によることが例証されている。宿主
細胞又は微生物における異種遺伝子の発現に関して、慣
用法よりもさらに有効な方法が探索された。そこで、そ
の発明は、ダウンストリームプロセッシングを要せずに
生物活性な形態で宿主微生物から異種蛋白質が分泌され
得ることを明らかにした。ある発現系である種の微生物
を使用すると、遺伝的工学的なＤＮＡ構築の発現におい
てジスルフィド結合の形成が促進される。それらの活性
構造の重要で必然的な部分としてシスチン残基を有する
製造された蛋白質の生物活性は、同種のジスルフィドで
結合された蛋白質を発現及び排出可能な細胞又は微生物
から選択される調節(requlatory)ヌクレオチド配列を用
いることにより達成された。そのヌクレオチド配列は、
ジスルフィド結合を含有する異種蛋白質をコードする二
次ヌクレオチド配列に遺伝子操作により結合され得る。
調節ヌクレオチド配列は細胞又は微生物からの異種蛋白
質の分泌を引き起こす蛋白質をコード化した。異種蛋白
質は天然のものでも又はデザインしたものでもよかっ
た。
【０００５】Canagene Corporationが1987年 7月21日に
提出したCharacterization and Structure of Genes fo
r Protease A and Protease B from Streptomyces Gris
eus（ストレプトミセス・グリセウスからのプロテアー
ゼＡ及びプロテアーゼＢに関する遺伝子のキャラクタリ
ゼーション及び構造）という表題のカナダ国特許出願第
542,678号明細書には、同種(homogeneous) 遺伝子の発
現系が開示されている。その発明は、ストレプトミセス
・グリセウスStreptomyces griseus からのプロテアー
ゼＡ及びプロテアーゼＢの分泌を支配する調節ヌクレオ
チド配列に関するものであった。プロテアーゼＡ及びプ
ロテアーゼＢはストレプトミセス・グリセウスStreptom
yces griseus においては天然に生じる蛋白質であり、
したがって、用語的には『同種』である。その出願は、
ストレプトミセスStreptomycesにおけるある型の同種分
泌に関与する調節ヌクレオチド配列を開示するものであ
った。同種発現に関与する遺伝子発現系は異種発現に関
するその他の種々の発現系を構築するに際して有用であ
る。
提出したCharacterization and Structure of Genes fo
r Protease A and Protease B from Streptomyces Gris
eus（ストレプトミセス・グリセウスからのプロテアー
ゼＡ及びプロテアーゼＢに関する遺伝子のキャラクタリ
ゼーション及び構造）という表題のカナダ国特許出願第
542,678号明細書には、同種(homogeneous) 遺伝子の発
現系が開示されている。その発明は、ストレプトミセス
・グリセウスStreptomyces griseus からのプロテアー
ゼＡ及びプロテアーゼＢの分泌を支配する調節ヌクレオ
チド配列に関するものであった。プロテアーゼＡ及びプ
ロテアーゼＢはストレプトミセス・グリセウスStreptom
yces griseus においては天然に生じる蛋白質であり、
したがって、用語的には『同種』である。その出願は、
ストレプトミセスStreptomycesにおけるある型の同種分
泌に関与する調節ヌクレオチド配列を開示するものであ
った。同種発現に関与する遺伝子発現系は異種発現に関
するその他の種々の発現系を構築するに際して有用であ
る。
【０００６】顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
（『ＧＭ−ＣＳＦ』）は白血球産生を刺激する蛋白質で
ある。ＧＭ−ＣＳＦは癌治療に関連して使用する生化学
的医薬として非常に有望であり、白血球の修復を促進す
る。天然由来のＧＭ−ＣＳＦは127 個のアミノ酸と２個
のジスルフィド結合を有する糖蛋白質(glycoprotein)で
ある。ＧＭ−ＣＳＦは自然状態でヒトにおいては痕跡量
存在するにすぎず、このため天然から単離された蛋白質
の詳細な構造分析が妨げられていた。したがって、天然
ＧＭ−ＣＳＦの構造についてのデータのほとんどは哺乳
類細胞における相補的ＤＮＡ配列及び相補的ＤＮＡクロ
ーンの発現を分析することにより得られる。哺乳類細胞
において発現されるＧＭ−ＣＳＦは 127個のアミノ酸と
２個のジスルフィド結合を含有し、また14〜35キロダル
トンのサイズの範囲で異なったグリコシル化形態で存在
する。ある形態のＧＭ−ＣＳＦは２個のＮ−連結炭水化
物基及び／又は３個のＯ−連結炭水化物基を含有し得る
が、これは外見上明らかなサイズの不均一性の原因とな
る。
（『ＧＭ−ＣＳＦ』）は白血球産生を刺激する蛋白質で
ある。ＧＭ−ＣＳＦは癌治療に関連して使用する生化学
的医薬として非常に有望であり、白血球の修復を促進す
る。天然由来のＧＭ−ＣＳＦは127 個のアミノ酸と２個
のジスルフィド結合を有する糖蛋白質(glycoprotein)で
ある。ＧＭ−ＣＳＦは自然状態でヒトにおいては痕跡量
存在するにすぎず、このため天然から単離された蛋白質
の詳細な構造分析が妨げられていた。したがって、天然
ＧＭ−ＣＳＦの構造についてのデータのほとんどは哺乳
類細胞における相補的ＤＮＡ配列及び相補的ＤＮＡクロ
ーンの発現を分析することにより得られる。哺乳類細胞
において発現されるＧＭ−ＣＳＦは 127個のアミノ酸と
２個のジスルフィド結合を含有し、また14〜35キロダル
トンのサイズの範囲で異なったグリコシル化形態で存在
する。ある形態のＧＭ−ＣＳＦは２個のＮ−連結炭水化
物基及び／又は３個のＯ−連結炭水化物基を含有し得る
が、これは外見上明らかなサイズの不均一性の原因とな
る。
【０００７】Moonen等（1987）は、ハムスターの卵巣細
胞からの分泌によるＧＭ−ＣＳＦ産生に関する方法を報
告している。ＧＭ−ＣＳＦは、生物学的に活性である26
−キロダルトン糖蛋白質として分泌される。しかしなが
ら、炭水化物基を酵素的に除去することにより生物学的
活性は20倍に増大され、このことは非グリコシル化形態
のＧＭ−ＣＳＦが臨床的使用においては優れていること
を示している。
胞からの分泌によるＧＭ−ＣＳＦ産生に関する方法を報
告している。ＧＭ−ＣＳＦは、生物学的に活性である26
−キロダルトン糖蛋白質として分泌される。しかしなが
ら、炭水化物基を酵素的に除去することにより生物学的
活性は20倍に増大され、このことは非グリコシル化形態
のＧＭ−ＣＳＦが臨床的使用においては優れていること
を示している。
【０００８】Ernst 等（1987）は、アルファ交配因子前
駆体の使用による酵母菌Saccharomyces cerevisiaeか
らの分泌によるＧＭ−ＣＳＦ産生に関して報告してい
る。ＧＭ−ＣＳＦは、35〜100 キロダルトンのサイズ範
囲の糖蛋白質の不均質混合物として分泌される。分泌Ｇ
Ｍ−ＣＳＦの一部分のみがアルファ交配因子前駆体から
正しく処理されて得られた。酵母菌及び哺乳類細胞にお
いて作られるグリコシル化ＧＭ−ＣＳＦの特異的な生物
学的活性はほぼ同じであった。しかしながら、酵母菌に
おいて産生されるＧＭ−ＣＳＦの結合炭水化物基の構造
は哺乳類細胞で産生されるＧＭ−ＣＳＦの天然炭水化物
基とは異なっていた。
駆体の使用による酵母菌Saccharomyces cerevisiaeか
らの分泌によるＧＭ−ＣＳＦ産生に関して報告してい
る。ＧＭ−ＣＳＦは、35〜100 キロダルトンのサイズ範
囲の糖蛋白質の不均質混合物として分泌される。分泌Ｇ
Ｍ−ＣＳＦの一部分のみがアルファ交配因子前駆体から
正しく処理されて得られた。酵母菌及び哺乳類細胞にお
いて作られるグリコシル化ＧＭ−ＣＳＦの特異的な生物
学的活性はほぼ同じであった。しかしながら、酵母菌に
おいて産生されるＧＭ−ＣＳＦの結合炭水化物基の構造
は哺乳類細胞で産生されるＧＭ−ＣＳＦの天然炭水化物
基とは異なっていた。
【０００９】Burgess 等（1987）は、大腸菌 E. coliの
細胞質からの非グリコシル化ＧＭ−ＣＳＦ様ポリペプ．
チドの産生方法を報告している。 E. coli細胞から単離
されたままのＧＭ−ＣＳＦ様ポリペプチドはアミノ末端
メチオニンを有し、また還元され、変性されて生物学的
に不活性であった。 E. coliから単離された生物学的に
不活性なＧＭ−ＣＳＦ様ポリペプチドの生物活性な形態
への変換には、in vitroでの酸化的再生を要した。 E.
coli産生蛋白質中にアミノ末端メチオニンが存在するた
め、再生ＧＭ−ＣＳＦ様ポリペプチドは依然として非グ
リコシル化形態のＧＭ−ＣＳＦと同等ではなかった。
細胞質からの非グリコシル化ＧＭ−ＣＳＦ様ポリペプ．
チドの産生方法を報告している。 E. coli細胞から単離
されたままのＧＭ−ＣＳＦ様ポリペプチドはアミノ末端
メチオニンを有し、また還元され、変性されて生物学的
に不活性であった。 E. coliから単離された生物学的に
不活性なＧＭ−ＣＳＦ様ポリペプチドの生物活性な形態
への変換には、in vitroでの酸化的再生を要した。 E.
coli産生蛋白質中にアミノ末端メチオニンが存在するた
め、再生ＧＭ−ＣＳＦ様ポリペプチドは依然として非グ
リコシル化形態のＧＭ−ＣＳＦと同等ではなかった。
【００１０】
【発明が解決すべき課題】哺乳類細胞又は酵母菌により
分泌されるＧＭ−ＣＳＦは生物活性を示すが、しかしグ
リコシル化されていない。 E. coliから単離されるＧＭ
−ＣＳＦはグリコシル化されていないが、しかし生物活
性を示さない。したがって、ＧＭ−ＣＳＦを産生する慣
用的方法は、培養物からのＧＭ−ＣＳＦの形態を臨床的
使用に好ましい生物活性な、非グリコシル化ＧＭ−ＣＳ
Ｆに変換するために、経費がかかり、時間がかかり、あ
るいは非効率的なダウンストリームのプロセッシングを
要する。
分泌されるＧＭ−ＣＳＦは生物活性を示すが、しかしグ
リコシル化されていない。 E. coliから単離されるＧＭ
−ＣＳＦはグリコシル化されていないが、しかし生物活
性を示さない。したがって、ＧＭ−ＣＳＦを産生する慣
用的方法は、培養物からのＧＭ−ＣＳＦの形態を臨床的
使用に好ましい生物活性な、非グリコシル化ＧＭ−ＣＳ
Ｆに変換するために、経費がかかり、時間がかかり、あ
るいは非効率的なダウンストリームのプロセッシングを
要する。
【００１１】したがって、分泌時に生物活性な蛋白質、
特に生物活性なＧＭ−ＣＳＦを提供する発現系が必要と
されている。このような蛋白質産物は構造が生物活性を
決定する訳であるから、構造的に従来の蛋白質産物とは
異なったものであろう。
特に生物活性なＧＭ−ＣＳＦを提供する発現系が必要と
されている。このような蛋白質産物は構造が生物活性を
決定する訳であるから、構造的に従来の蛋白質産物とは
異なったものであろう。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、異種蛋白質、
特にストレプトミセスStreptomyces属から選択される宿
主からの生物活性な形態での顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（『ＧＭ−ＣＳＦ』）の分泌を支配する多
数の発現系に関する。本文中では、情況により別の定義
が必要な場合を除いては、『ＧＭ−ＣＳＦ』は本質的に
純粋な、非グリコシル化、酸化ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質を意
味する。本発明に従って産生される生物活性なＧＭ−Ｃ
ＳＦは、グリコシル化されていないが、しかしながら他
の点では天然の対応物によく似ている。本発明のＧＭ−
ＣＳＦは、その天然の対応物と同様、正しい位置に分子
間ジスルフィド結合が存在する。本発明に従って産生さ
れる新規物質はＧＭ−ＣＳＦノグリテインと呼ばれる。
ＧＭ−ＣＳＦノグリテインは宿主生物即ちストレプトミ
セスStreptomyces属から選択される宿主から分泌される
際、十分な生物活性を有し、また天然ＧＭ−ＣＳＦ糖蛋
白質の全ての構造的特徴を示す。
特にストレプトミセスStreptomyces属から選択される宿
主からの生物活性な形態での顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（『ＧＭ−ＣＳＦ』）の分泌を支配する多
数の発現系に関する。本文中では、情況により別の定義
が必要な場合を除いては、『ＧＭ−ＣＳＦ』は本質的に
純粋な、非グリコシル化、酸化ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質を意
味する。本発明に従って産生される生物活性なＧＭ−Ｃ
ＳＦは、グリコシル化されていないが、しかしながら他
の点では天然の対応物によく似ている。本発明のＧＭ−
ＣＳＦは、その天然の対応物と同様、正しい位置に分子
間ジスルフィド結合が存在する。本発明に従って産生さ
れる新規物質はＧＭ−ＣＳＦノグリテインと呼ばれる。
ＧＭ−ＣＳＦノグリテインは宿主生物即ちストレプトミ
セスStreptomyces属から選択される宿主から分泌される
際、十分な生物活性を有し、また天然ＧＭ−ＣＳＦ糖蛋
白質の全ての構造的特徴を示す。
【００１３】本発明に従って、遺伝子発現系は、異種蛋
白質をコードする二次ヌクレオチド配列と結合する調節
ヌクレオチド配列を有する形で使用される。調節配列は
シグナル配列及びプロモーター配列を包含する。シグナ
ル配列は、ストレプトミセスStreptomyces属から選択す
る宿主からの生物活性な形態での異種蛋白質の分泌を支
配するペプチドをコードする。天然配列又は合成配列あ
るいは天然配列と合成配列の組み合わせであってもよい
二次ヌクレオチド配列は異種蛋白質をコードする。
白質をコードする二次ヌクレオチド配列と結合する調節
ヌクレオチド配列を有する形で使用される。調節配列は
シグナル配列及びプロモーター配列を包含する。シグナ
ル配列は、ストレプトミセスStreptomyces属から選択す
る宿主からの生物活性な形態での異種蛋白質の分泌を支
配するペプチドをコードする。天然配列又は合成配列あ
るいは天然配列と合成配列の組み合わせであってもよい
二次ヌクレオチド配列は異種蛋白質をコードする。
【００１４】記載の発現系は、生物活性な形態のコード
化された蛋白質のストレプトミセスStreptomyces宿主か
らの分泌をもたらす。本発明の発現系は他の宿主中で使
用可能であると予測される。さらに、これらの発現系
を、本発明の教示に従って、ＧＭ−ＣＳＦ以外の異種蛋
白質の分泌をもたらすのに用いてもよい。
化された蛋白質のストレプトミセスStreptomyces宿主か
らの分泌をもたらす。本発明の発現系は他の宿主中で使
用可能であると予測される。さらに、これらの発現系
を、本発明の教示に従って、ＧＭ−ＣＳＦ以外の異種蛋
白質の分泌をもたらすのに用いてもよい。
【００１５】特に、本発明は、ストレプトミセスStrept
omyces属から選択する宿主からの生物活性な形態での顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子（『ＧＭ−ＣＳ
Ｆ』）の分泌のための遺伝子発現系に関する。遺伝子発
現系は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする二次ヌクレオチド配
列に連結する調節ヌクレオチド配列を包含する。この調
節配列はシグナル配列及びプロモーター配列を含む。シ
グナル配列はストレプトミセスStreptomyces属から選択
する宿主からの生物活性な形態でのＧＭ−ＣＳＦの分泌
を支配するペプチドをコードする。天然配列又は合成配
列あるいは天然配列と合成配列の組み合わせであっても
よい二次ヌクレオチド配列は、ＧＭ−ＣＳＦをコードし
得る。
omyces属から選択する宿主からの生物活性な形態での顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子（『ＧＭ−ＣＳ
Ｆ』）の分泌のための遺伝子発現系に関する。遺伝子発
現系は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする二次ヌクレオチド配
列に連結する調節ヌクレオチド配列を包含する。この調
節配列はシグナル配列及びプロモーター配列を含む。シ
グナル配列はストレプトミセスStreptomyces属から選択
する宿主からの生物活性な形態でのＧＭ−ＣＳＦの分泌
を支配するペプチドをコードする。天然配列又は合成配
列あるいは天然配列と合成配列の組み合わせであっても
よい二次ヌクレオチド配列は、ＧＭ−ＣＳＦをコードし
得る。
【００１６】シグナル配列は、ストレプトミセスStrept
omyces属から選択する宿主からの異種蛋白質の分泌を支
配するシグナルペプチドをコードする。シグナル配列
は、ストレプトミセス・グリセウスStreptomyces gris
eus プロテアーゼＢ、ストレプトミセス・プリカートス
Streptomyces Plicatusエンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼＨのシグナルペプチド、これらの任意の
ペプチドのハイブリッド、あるいはストレプトミセスSt
reptomyces属から選択する宿主からの異種蛋白質、特に
ＧＭ−ＣＳＦの分泌を支配する任意の他のシグナルペプ
チドをコードし得る。シグナル配列は、グラム陽性細
菌、グラム陰性細菌のシグナルペプチド又はこれらのペ
プチドのハイブリッドをコードし得る。さらにまた、シ
グナル配列は、ストレプトミセスStreptomycesと他の細
菌のシグナルペプチドのハイブリッドをコードし得る。
omyces属から選択する宿主からの異種蛋白質の分泌を支
配するシグナルペプチドをコードする。シグナル配列
は、ストレプトミセス・グリセウスStreptomyces gris
eus プロテアーゼＢ、ストレプトミセス・プリカートス
Streptomyces Plicatusエンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼＨのシグナルペプチド、これらの任意の
ペプチドのハイブリッド、あるいはストレプトミセスSt
reptomyces属から選択する宿主からの異種蛋白質、特に
ＧＭ−ＣＳＦの分泌を支配する任意の他のシグナルペプ
チドをコードし得る。シグナル配列は、グラム陽性細
菌、グラム陰性細菌のシグナルペプチド又はこれらのペ
プチドのハイブリッドをコードし得る。さらにまた、シ
グナル配列は、ストレプトミセスStreptomycesと他の細
菌のシグナルペプチドのハイブリッドをコードし得る。
【００１７】異種蛋白質のアミノ末端に連結するシグナ
ルペプチドより成る融合蛋白質をコードするＲＮＡの合
成を指示するプロモーター配列は、少なくとも１つの型
のストレプトミセスStreptomycesＲＮＡポリメラーゼホ
ロ酵素の特異的な結合及びそれによる転写を可能にす
る。プロモーター配列は、少なくとも１種類のストレプ
トミセスStreptomycesＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特
異的な結合及びそれによる転写を可能にするストレプト
ミセス・フラジアStreptomyces fradiae のアミノグリ
コシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（『aph 』）か
らの配列を包含してもよい。
ルペプチドより成る融合蛋白質をコードするＲＮＡの合
成を指示するプロモーター配列は、少なくとも１つの型
のストレプトミセスStreptomycesＲＮＡポリメラーゼホ
ロ酵素の特異的な結合及びそれによる転写を可能にす
る。プロモーター配列は、少なくとも１種類のストレプ
トミセスStreptomycesＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特
異的な結合及びそれによる転写を可能にするストレプト
ミセス・フラジアStreptomyces fradiae のアミノグリ
コシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（『aph 』）か
らの配列を包含してもよい。
【００１８】発現系をストレプトミセスStreptomycesに
おいて形質転換及び複製が可能なベクターに挿入し、こ
のベクターをストレプトミセスStreptomyces属から選択
する宿主中に挿入する。
おいて形質転換及び複製が可能なベクターに挿入し、こ
のベクターをストレプトミセスStreptomyces属から選択
する宿主中に挿入する。
【００１９】本発明の他の側面では、ストレプトミセス
Streptomyces属から選択する宿主から分泌される生物活
性な形態の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の産
生方法を用いる。その方法は、生物活性な形態でのＧＭ
−ＣＳＦの分泌を支配するペプチドをコードする配列と
ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列を連結し、その配列をス
トレプトミセスStreptomyces中での形質転換及び複製が
可能なベクターに挿入し、そのベクターをストレプトミ
セスStreptomyces属から選択する宿主中に挿入し、その
形質転換宿主を育成して、生物活性なＧＭ−ＣＳＦを取
り出すことを包含する。
Streptomyces属から選択する宿主から分泌される生物活
性な形態の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の産
生方法を用いる。その方法は、生物活性な形態でのＧＭ
−ＣＳＦの分泌を支配するペプチドをコードする配列と
ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列を連結し、その配列をス
トレプトミセスStreptomyces中での形質転換及び複製が
可能なベクターに挿入し、そのベクターをストレプトミ
セスStreptomyces属から選択する宿主中に挿入し、その
形質転換宿主を育成して、生物活性なＧＭ−ＣＳＦを取
り出すことを包含する。
【００２０】本発明に従って、異種蛋白質と融合するシ
グナルペプチドをストレプトミセスStreptomyces属から
選択する宿主中での異種発現（heterologous expressio
n ）により産生する。
グナルペプチドをストレプトミセスStreptomyces属から
選択する宿主中での異種発現（heterologous expressio
n ）により産生する。
【００２１】本発明に従って、ＧＭ−ＣＳＦに融合する
シグナルペプチドをストレプトミセスStreptomyces属か
ら選択する宿主中での異種発現により産生する。 本発
明に従って、生物活性な蛋白質をストレプトミセスStre
ptomyces属から選択する宿主中での異種発現により産生
する。
シグナルペプチドをストレプトミセスStreptomyces属か
ら選択する宿主中での異種発現により産生する。 本発
明に従って、生物活性な蛋白質をストレプトミセスStre
ptomyces属から選択する宿主中での異種発現により産生
する。
【００２２】本発明に従って、生物活性なＧＭ−ＣＳＦ
をストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主中
での異種発現により産生する。
をストレプトミセスStreptomyces属から選択する宿主中
での異種発現により産生する。
【００２３】組み換えＤＮＡから誘導されるＧＭ−ＣＳ
Ｆは、適当な宿主、特にストレプトミセスStreptomyces
属から選択する宿主から生物活性形態で分泌される。Ｇ
Ｍ−ＣＳＦは分泌に際してグルコシル化されず、また分
子内ジスルフィド結合を有する。
Ｆは、適当な宿主、特にストレプトミセスStreptomyces
属から選択する宿主から生物活性形態で分泌される。Ｇ
Ｍ−ＣＳＦは分泌に際してグルコシル化されず、また分
子内ジスルフィド結合を有する。
【００２４】本発明は、発現系を使用してのストレプト
ミセスStreptomycesからの直接分泌による生物学的に活
性な形態のヒトＧＭ−ＣＳＦの産生方法に関するもので
ある。
ミセスStreptomycesからの直接分泌による生物学的に活
性な形態のヒトＧＭ−ＣＳＦの産生方法に関するもので
ある。
【００２５】本発明はまた、他の異種蛋白質の産生に使
用可能な発現ベクターに関する。発現系は、特定の蛋白
質をコードする遺伝子、即ち正しくプロセッシングされ
た蛋白質の成育媒質への分泌を支配するシグナルペプチ
ドをコードする核酸配列；及びその蛋白質をコードし、
ｍＲＮＡの転写を支配することができるプロモーターを
含有する。当業者には公知のように、発現系は、転写終
了に関する付加的な核酸配列や翻訳の開始と終了に関す
る付加的な核酸配列を包含する。
用可能な発現ベクターに関する。発現系は、特定の蛋白
質をコードする遺伝子、即ち正しくプロセッシングされ
た蛋白質の成育媒質への分泌を支配するシグナルペプチ
ドをコードする核酸配列；及びその蛋白質をコードし、
ｍＲＮＡの転写を支配することができるプロモーターを
含有する。当業者には公知のように、発現系は、転写終
了に関する付加的な核酸配列や翻訳の開始と終了に関す
る付加的な核酸配列を包含する。
【００２６】好ましい実施態様においては、発現系内に
含まれる遺伝子は蛋白質ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードする
（Lee 等，1985；Wang等，1985）。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝
子、特に図１におけるＤＮＡ配列で表わされるものは、
ストレプトミセス Streptomycesのコドン使用(codon u
sage）に従って作られた合成ＤＮＡである；即ち、３位
にＣ又はＧを有するコドンである（Bibb等，1985）。該
遺伝子は、ストレプトミセスStreptomycesコドン使用あ
るいは任意の他のバイアス化又は全くランダムなコドン
使用によって、ＧＭ−ＣＳＦについての天然のｃＤＮＡ
配列でもよく、あるいはＧＭ−ＣＳＦをコードする任意
の他のＤＮＡ配列でもよい。その遺伝子は、１つ又はそ
れ以上のアミノ酸が天然のアミノ酸配列中で置換され、
挿入され、又は欠失されたＧＭ−ＣＳＦの生物学的に活
性な誘導体をコードし得る。
含まれる遺伝子は蛋白質ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードする
（Lee 等，1985；Wang等，1985）。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝
子、特に図１におけるＤＮＡ配列で表わされるものは、
ストレプトミセス Streptomycesのコドン使用(codon u
sage）に従って作られた合成ＤＮＡである；即ち、３位
にＣ又はＧを有するコドンである（Bibb等，1985）。該
遺伝子は、ストレプトミセスStreptomycesコドン使用あ
るいは任意の他のバイアス化又は全くランダムなコドン
使用によって、ＧＭ−ＣＳＦについての天然のｃＤＮＡ
配列でもよく、あるいはＧＭ−ＣＳＦをコードする任意
の他のＤＮＡ配列でもよい。その遺伝子は、１つ又はそ
れ以上のアミノ酸が天然のアミノ酸配列中で置換され、
挿入され、又は欠失されたＧＭ−ＣＳＦの生物学的に活
性な誘導体をコードし得る。
【００２７】発現系内に含まれる異種遺伝子は、別の有
用な蛋白質をコードする天然ｃＤＮＡ配列か又は合成Ｄ
ＮＡ配列であってもよい。組換えＤＮＡ配列によりコー
ドされる特定の蛋白質としては、キモシン、キモトリプ
シン、トリプシン、アミラーゼ、リグニナーゼ、エラス
ターゼ、リパーゼ及びセルラーゼといったような真核生
物性分泌酵素；グルコースイソメラーゼ、アミラーゼ、
リパーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロティナー
ゼ、オキシダーゼ、リグニナーゼのような原核生物性分
泌酵素；ヒルジン、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、及び
アルファ1-抗トリプシンのような酵素阻害剤；スーパー
オキシドジスムターゼのような金属酵素；ファクターVI
II、ファクターIX、組織型プラスミノーゲンアクチベー
ター及びウロキナーゼのような血液因子；プロインシュ
リンのようなホルモン；ベータ−インターフェロン及び
ガンマ−インターフェロン、並びにインターロイキン-2
のようなリンフォカイン；腫瘍壊死因子、リンフォトキ
シン、及びインターロイキン-1のような細胞毒素；神経
成長因子、上皮成長因子、形質転換成長因子、血小板由
来性成長因子、及び繊維芽細胞成長因子のような成長因
子；インターロイキン-3及び顆粒球コロニー刺激因子の
ような他のコロニー刺激因子；合成抗体分子、デザイン
された抗体分子、又は遺伝子工学による抗体分子のよう
なイムノグロブリン関連分子；コレステロール受容体の
ような細胞受容体；ウイルス性ヘマグルチニン、エイズ
抗原及びイムノゲン、Ｂ型肝炎抗原及びイムノゲン、手
足口病ウイルス抗原及びイムノゲンのようなウイルス性
抗原；プロテインＡのような細菌表面エフェクター；蛋
白質殺虫剤、殺藻剤、殺菌剤、及び殺生物剤のような毒
素；心筋梗塞蛋白質（ＭＩＰ）、体重制御因子（ＷＣ
Ｆ）、及び熱量率蛋白質（ＣＲＰ）のような医学的重要
性を有する全身性蛋白質などが挙げられる。
用な蛋白質をコードする天然ｃＤＮＡ配列か又は合成Ｄ
ＮＡ配列であってもよい。組換えＤＮＡ配列によりコー
ドされる特定の蛋白質としては、キモシン、キモトリプ
シン、トリプシン、アミラーゼ、リグニナーゼ、エラス
ターゼ、リパーゼ及びセルラーゼといったような真核生
物性分泌酵素；グルコースイソメラーゼ、アミラーゼ、
リパーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロティナー
ゼ、オキシダーゼ、リグニナーゼのような原核生物性分
泌酵素；ヒルジン、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、及び
アルファ1-抗トリプシンのような酵素阻害剤；スーパー
オキシドジスムターゼのような金属酵素；ファクターVI
II、ファクターIX、組織型プラスミノーゲンアクチベー
ター及びウロキナーゼのような血液因子；プロインシュ
リンのようなホルモン；ベータ−インターフェロン及び
ガンマ−インターフェロン、並びにインターロイキン-2
のようなリンフォカイン；腫瘍壊死因子、リンフォトキ
シン、及びインターロイキン-1のような細胞毒素；神経
成長因子、上皮成長因子、形質転換成長因子、血小板由
来性成長因子、及び繊維芽細胞成長因子のような成長因
子；インターロイキン-3及び顆粒球コロニー刺激因子の
ような他のコロニー刺激因子；合成抗体分子、デザイン
された抗体分子、又は遺伝子工学による抗体分子のよう
なイムノグロブリン関連分子；コレステロール受容体の
ような細胞受容体；ウイルス性ヘマグルチニン、エイズ
抗原及びイムノゲン、Ｂ型肝炎抗原及びイムノゲン、手
足口病ウイルス抗原及びイムノゲンのようなウイルス性
抗原；プロテインＡのような細菌表面エフェクター；蛋
白質殺虫剤、殺藻剤、殺菌剤、及び殺生物剤のような毒
素；心筋梗塞蛋白質（ＭＩＰ）、体重制御因子（ＷＣ
Ｆ）、及び熱量率蛋白質（ＣＲＰ）のような医学的重要
性を有する全身性蛋白質などが挙げられる。
【００２８】該遺伝子は、in vitroで又は培養中で活性
形態にプロセッシングし得る生物学的に活性な蛋白質の
不活性前駆体（チモーゲン）をコードすることが可能で
あった。その遺伝子は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が
天然のアミノ酸配列において置換され、挿入され、又は
欠失された有用蛋白質の生物学的に活性な誘導体をコー
ド可能であった。さらに、遺伝子は、２つ又はそれ以上
の有用蛋白質の生物学的に活性な融合蛋白質、あるいは
配列内の相同位置から単一アミノ酸又はアミノ酸ブロッ
クを交換することにより作成可能な２つ又はそれ以上の
相同蛋白質のハイブリッドをコード可能であった。
形態にプロセッシングし得る生物学的に活性な蛋白質の
不活性前駆体（チモーゲン）をコードすることが可能で
あった。その遺伝子は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が
天然のアミノ酸配列において置換され、挿入され、又は
欠失された有用蛋白質の生物学的に活性な誘導体をコー
ド可能であった。さらに、遺伝子は、２つ又はそれ以上
の有用蛋白質の生物学的に活性な融合蛋白質、あるいは
配列内の相同位置から単一アミノ酸又はアミノ酸ブロッ
クを交換することにより作成可能な２つ又はそれ以上の
相同蛋白質のハイブリッドをコード可能であった。
【００２９】シグナル配列は、アミノ末端融合蛋白質と
して生合成され、異種蛋白質に連結される場合、正しい
アミノ末端基を有して、媒質中への異種蛋白質の分泌を
指示可能な任意のアミノ酸配列をコード可能であった。
好ましい実施態様においては、ストレプトミセス・グリ
セウスStreptomyces griseusプロテアーゼＢ（カナダ国
特許出願第542,678 号明細書。1987年 7月21日にCangen
e Corporation が出願した。）を用いてＧＭ−ＣＳＦ：
特に配列ＭＲＩＫＲＴＳＮＲＳＮＡＡＲＲＶＲＴＴＡＶ
ＬＡＧＬＡＡＶＡＡＬＡＶＰＴＡＮＡの38−アミノ酸ペ
プチドの分泌を支配する。別の実施態様においては、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦの分泌を支配するために使用されるシグナル
ペプチドは、アミノ末端基でストレプトミセス・プリカ
ートスStreptomyces plicatusエンド−β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼＨ（エンドＨ）シグナルペプチド
の 9〜34番目のアミノ酸に連結するS. griseusプロテア
ーゼＢシグナルペプチドの最初の15個のアミノ酸より成
るハイブリッド(Robbins等，1984）：特に配列ＭＲＩＫ
ＲＴＳＮＲＳＮＡＡＲＲＶＲＴＡＡＬＡＬＳＡＡＡＡＬ
ＶＬＧＳＴＡＡＳＧＡＳＡの41−アミノ酸ペプチドであ
る。ＧＭ−ＣＳＦの分泌は、本発明に詳記のS. plicatu
s エンドＨのシグナルペプチド；特に配列ＭＦＴＰＶＲ
ＲＲＶＲＴＡＡＬＡＬＳＡＡＡＡＬＶＬＧＳＴＡＡＳＧ
ＡＳＡの34−アミノ酸ペプチドによっても支配可能であ
った。分泌はさらに、別のストレプトミセスStreptomyc
es シグナルペプチド：特に S. griseus プロテアーゼ
Ａ、 S. griseus アミラーゼ、Streptomyces Ｒ61 Ｄ
Ｄ−ペプチダーゼのシグナルペプチド、又は当業界で公
知の別のStreptomycesシグナルペプチド（Chang, 198
7）により支配可能であった。分泌はまた、上記シグナ
ルペプチド又は全般的合成アミノ酸配列を有するシグナ
ルペプチドのハイブリッドの支配下でも遂行可能であっ
た。シグナルペプチドは、グラム陽性細菌からのもの：
特にバチルス・ズブチルスBacillus subtilusアルカリ
性プロテアーゼ(apr) のシグナルペプチド、又は当業界
で公知のグラム陽性細菌の別のシグナルペプチド（Chan
g, 1987 ）であってもよい。シグナルペプチドはまた、
グラム陰性細菌からのもの：特に大腸菌Escherichia co
li外膜プロテインＡのシグナルペプチド、又は当業界で
公知のグラム陰性細菌の別のシグナルペプチド（Sjostr
om等，1987）であってもよい。シグナルペプチドはま
た、２つ又はそれ以上の細菌シグナルペプチドのハイブ
リッドであってもよい。ある実施態様において、ＧＭ−
ＣＳＦの分泌を支配するために使用されるシグナルペプ
チドは、アミノ末端基で B. subtilusapr シグナルペプ
チドの 6〜30番目のアミノ酸に連結される S. griseus
プロテアーゼＢシグナルペプチドの最初の15個のアミノ
酸より成るハイブリッド：特に配列ＭＲＩＫＲＴＳＮＲ
ＳＮＡＡＲＲＶＷＩＳＬＬＦＡＬＡＬＩＦＴＭＡＦＧＳ
ＴＳＳＡＱＡの40−アミノ酸ペプチドである。他の実施
態様においては、StreptomycesエンドＨのシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡと他の細菌由来のシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡとのハイブリッドであって、St
reptomycesエンドＨのシグナルペプチドが少くとも31個
のアミノ酸を含み、アミノ末端のメチオニンから30番目
から34番目のアミノ酸の間にプロセッシング部位を有す
るシグルペプチドである。さらに他の実施態様において
は、シグナルペプチドは、アミノ末端から17個のアミノ
酸が、アルギニン、リジン又はその両者を含む少くとも
７個のアミノ酸を含むものである。ＧＭ−ＣＳＦに加え
て、他の異種蛋白質は、本発明に詳記のシグナルペプチ
ド又は当業界で公知の他の細菌シグナルペプチドを有す
るストレプトミセスStreptomycesから分泌可能であっ
た。達成し得る分泌のレベルは培養物の 1μｇ／ｌ以上
であるが、好ましくは 1mg／ｌ以上である。
して生合成され、異種蛋白質に連結される場合、正しい
アミノ末端基を有して、媒質中への異種蛋白質の分泌を
指示可能な任意のアミノ酸配列をコード可能であった。
好ましい実施態様においては、ストレプトミセス・グリ
セウスStreptomyces griseusプロテアーゼＢ（カナダ国
特許出願第542,678 号明細書。1987年 7月21日にCangen
e Corporation が出願した。）を用いてＧＭ−ＣＳＦ：
特に配列ＭＲＩＫＲＴＳＮＲＳＮＡＡＲＲＶＲＴＴＡＶ
ＬＡＧＬＡＡＶＡＡＬＡＶＰＴＡＮＡの38−アミノ酸ペ
プチドの分泌を支配する。別の実施態様においては、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦの分泌を支配するために使用されるシグナル
ペプチドは、アミノ末端基でストレプトミセス・プリカ
ートスStreptomyces plicatusエンド−β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼＨ（エンドＨ）シグナルペプチド
の 9〜34番目のアミノ酸に連結するS. griseusプロテア
ーゼＢシグナルペプチドの最初の15個のアミノ酸より成
るハイブリッド(Robbins等，1984）：特に配列ＭＲＩＫ
ＲＴＳＮＲＳＮＡＡＲＲＶＲＴＡＡＬＡＬＳＡＡＡＡＬ
ＶＬＧＳＴＡＡＳＧＡＳＡの41−アミノ酸ペプチドであ
る。ＧＭ−ＣＳＦの分泌は、本発明に詳記のS. plicatu
s エンドＨのシグナルペプチド；特に配列ＭＦＴＰＶＲ
ＲＲＶＲＴＡＡＬＡＬＳＡＡＡＡＬＶＬＧＳＴＡＡＳＧ
ＡＳＡの34−アミノ酸ペプチドによっても支配可能であ
った。分泌はさらに、別のストレプトミセスStreptomyc
es シグナルペプチド：特に S. griseus プロテアーゼ
Ａ、 S. griseus アミラーゼ、Streptomyces Ｒ61 Ｄ
Ｄ−ペプチダーゼのシグナルペプチド、又は当業界で公
知の別のStreptomycesシグナルペプチド（Chang, 198
7）により支配可能であった。分泌はまた、上記シグナ
ルペプチド又は全般的合成アミノ酸配列を有するシグナ
ルペプチドのハイブリッドの支配下でも遂行可能であっ
た。シグナルペプチドは、グラム陽性細菌からのもの：
特にバチルス・ズブチルスBacillus subtilusアルカリ
性プロテアーゼ(apr) のシグナルペプチド、又は当業界
で公知のグラム陽性細菌の別のシグナルペプチド（Chan
g, 1987 ）であってもよい。シグナルペプチドはまた、
グラム陰性細菌からのもの：特に大腸菌Escherichia co
li外膜プロテインＡのシグナルペプチド、又は当業界で
公知のグラム陰性細菌の別のシグナルペプチド（Sjostr
om等，1987）であってもよい。シグナルペプチドはま
た、２つ又はそれ以上の細菌シグナルペプチドのハイブ
リッドであってもよい。ある実施態様において、ＧＭ−
ＣＳＦの分泌を支配するために使用されるシグナルペプ
チドは、アミノ末端基で B. subtilusapr シグナルペプ
チドの 6〜30番目のアミノ酸に連結される S. griseus
プロテアーゼＢシグナルペプチドの最初の15個のアミノ
酸より成るハイブリッド：特に配列ＭＲＩＫＲＴＳＮＲ
ＳＮＡＡＲＲＶＷＩＳＬＬＦＡＬＡＬＩＦＴＭＡＦＧＳ
ＴＳＳＡＱＡの40−アミノ酸ペプチドである。他の実施
態様においては、StreptomycesエンドＨのシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡと他の細菌由来のシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡとのハイブリッドであって、St
reptomycesエンドＨのシグナルペプチドが少くとも31個
のアミノ酸を含み、アミノ末端のメチオニンから30番目
から34番目のアミノ酸の間にプロセッシング部位を有す
るシグルペプチドである。さらに他の実施態様において
は、シグナルペプチドは、アミノ末端から17個のアミノ
酸が、アルギニン、リジン又はその両者を含む少くとも
７個のアミノ酸を含むものである。ＧＭ−ＣＳＦに加え
て、他の異種蛋白質は、本発明に詳記のシグナルペプチ
ド又は当業界で公知の他の細菌シグナルペプチドを有す
るストレプトミセスStreptomycesから分泌可能であっ
た。達成し得る分泌のレベルは培養物の 1μｇ／ｌ以上
であるが、好ましくは 1mg／ｌ以上である。
【００３０】プロモーターは、異種蛋白質のアミノ末端
基に連結されるシグナルペプチドより成る融合蛋白質を
コードするＲＮＡの合成を支配する。プロモーターは、
少なくとも１種類のストレプトミセスStreptomycesＲＮ
Ａポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及びそれによる転
写を可能にする。好ましい実施態様においては、ストレ
プトミセス・フラディアStreptomyces fradiae アミノ
グリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（『aph
』）のプロモーター(Thompson とGray，1983）を使用
して、ＧＭ−ＣＳＦに融合されるシグナルペプチドをコ
ードするｍＲＮＡを転写する。
基に連結されるシグナルペプチドより成る融合蛋白質を
コードするＲＮＡの合成を支配する。プロモーターは、
少なくとも１種類のストレプトミセスStreptomycesＲＮ
Ａポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及びそれによる転
写を可能にする。好ましい実施態様においては、ストレ
プトミセス・フラディアStreptomyces fradiae アミノ
グリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（『aph
』）のプロモーター(Thompson とGray，1983）を使用
して、ＧＭ−ＣＳＦに融合されるシグナルペプチドをコ
ードするｍＲＮＡを転写する。
【００３１】このプロモーターは、少なくとも１種のス
トレプトミセスＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特異的結
合及びそれによる転写を可能とする。プロモーターは、
ストレプトミセス・エリスレウスStreptomyces erythr
eus エリスロマイシンＥ、ストレプトミセスコエリコロ
アStreptomyces coelicolorアガラーゼを含む別のスト
レプトミセスの種Streptomyces spp.から、あるいは当
業界で公知の方法により立証されるようなプロモーター
活性を有する公知の又は未確定起源の任意の配列からの
ものであってもよい。プロモーターは、１つ以上の天然
プロモーター配列又は完全合成プロモーター配列のハイ
ブリッドであってもよい。プロモーターは、向上した機
能を有するプロモーターの突然変異性体(version) を得
るために１つ又はそれ以上の基が置換され、挿入され又
は欠失された天然配列又はハイブリッド配列であっても
よい。突然変異は、ランダム様式又は部位指示様式で、
並びにin vitro又は原核生物宿主細胞内で、化学的に又
は酵素的に発生し得る。
トレプトミセスＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特異的結
合及びそれによる転写を可能とする。プロモーターは、
ストレプトミセス・エリスレウスStreptomyces erythr
eus エリスロマイシンＥ、ストレプトミセスコエリコロ
アStreptomyces coelicolorアガラーゼを含む別のスト
レプトミセスの種Streptomyces spp.から、あるいは当
業界で公知の方法により立証されるようなプロモーター
活性を有する公知の又は未確定起源の任意の配列からの
ものであってもよい。プロモーターは、１つ以上の天然
プロモーター配列又は完全合成プロモーター配列のハイ
ブリッドであってもよい。プロモーターは、向上した機
能を有するプロモーターの突然変異性体(version) を得
るために１つ又はそれ以上の基が置換され、挿入され又
は欠失された天然配列又はハイブリッド配列であっても
よい。突然変異は、ランダム様式又は部位指示様式で、
並びにin vitro又は原核生物宿主細胞内で、化学的に又
は酵素的に発生し得る。
【００３２】プロモーターは、１つの転写開始部位を有
する単一プロモーターであっても、又は２つ以上の転写
開始部位を有する多重プロモーターであってもよい。好
ましい実施態様においては、 aphプロモーターは、転写
開始に関する２つの部位を有するＤＮＡフラグメント上
に位置する。部位1 は、翻訳イニシエーターＡＴＧのＡ
で転写を開始し、一方部位2 は、部位1 からさらに 313
塩基上流で転写を開始すると考えられる。別の実施態様
では、開始部位1 のみを有する aphプロモーターを用い
て、ＧＭ−ＣＳＦに融合するシグナルペプチドをコード
するｍＲＮＡを転写する。多重のプロモーターの各転写
開始部位は、同一の又は異なる種類のＲＮＡポリメラー
ゼホロ酵素により認知され得るし、また同一又は異なる
成長時間あるいは発育状態において活性であり得る。多
重の転写開始部位を有するプロモーターは、天然配列で
あってもよく、あるいは１つ以上の天然又は合成単一プ
ロモーター配列より成るハイブリッド配列であってもよ
い。プロモーターは、単一であれ多重であれ、培養（構
成的）中のいかなる時間でも活性であり得るし、あるい
はある種の媒地成分、代謝物質、又は化学薬品の存否に
より、調節可能である。さらに、プロモーターは、培養
の温度又は化学環境の変化により調節可能である。
する単一プロモーターであっても、又は２つ以上の転写
開始部位を有する多重プロモーターであってもよい。好
ましい実施態様においては、 aphプロモーターは、転写
開始に関する２つの部位を有するＤＮＡフラグメント上
に位置する。部位1 は、翻訳イニシエーターＡＴＧのＡ
で転写を開始し、一方部位2 は、部位1 からさらに 313
塩基上流で転写を開始すると考えられる。別の実施態様
では、開始部位1 のみを有する aphプロモーターを用い
て、ＧＭ−ＣＳＦに融合するシグナルペプチドをコード
するｍＲＮＡを転写する。多重のプロモーターの各転写
開始部位は、同一の又は異なる種類のＲＮＡポリメラー
ゼホロ酵素により認知され得るし、また同一又は異なる
成長時間あるいは発育状態において活性であり得る。多
重の転写開始部位を有するプロモーターは、天然配列で
あってもよく、あるいは１つ以上の天然又は合成単一プ
ロモーター配列より成るハイブリッド配列であってもよ
い。プロモーターは、単一であれ多重であれ、培養（構
成的）中のいかなる時間でも活性であり得るし、あるい
はある種の媒地成分、代謝物質、又は化学薬品の存否に
より、調節可能である。さらに、プロモーターは、培養
の温度又は化学環境の変化により調節可能である。
【００３３】好ましい実施態様においては、 aphプロモ
ーターを、蛋白質、特にＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸
配列にフレーム内に連結されるシグナルペプチドをコー
ドする核酸配列に連結する。ＮcoＩ制限エンドヌクレア
ーゼ部位を用いて、 aphプロモーターを、シグナルペプ
チドをコードする合成オリゴヌクレオチドに連結した。
この部位は、この立体配座においてシグナルペプチドの
アミノ末端メチオニンを表わす aph遺伝子の天然イニシ
エータＡＴＧを含有する。ストレプトミセス・リビダン
スStreptomyces lividansの18ＳリボゾームＲＮＡの
3′端に対して補完的なＤＮＡ配列を、翻訳の開始を増
大するためにこのＮcoＩ部位で含入することができる。
便宜上、ＰstＩ部位又はＮsiＩ部位を、シグナルプロセ
ッシング部位に位置させて、分泌させるべき蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を連結する。ＰstＩ部位又はＮsiＩ
部位におけるＧＣＡコドンは、シグナルペプチドのカル
ボキシ末端でのアラニンを表わす。好ましい実施態様で
は、コード化シグナルペプチドのカルボキシ末端が、関
係のあるコード化蛋白質のアミノ末端に直接融合される
ようＤＮＡ配列を形成する。配列をコードする付加的ペ
プチドをＰstＩ部位又はＮsiＩ部位に挿入して、シグナ
ルペプチドの分泌又はプロセッシングを促進してもよ
い。その結果生じるアミノ末端延長を有する蛋白質を、
自然工程により培養中に、あるいは公知の化学的又は酵
素的方法によりin vitro で除去してもよい。
ーターを、蛋白質、特にＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸
配列にフレーム内に連結されるシグナルペプチドをコー
ドする核酸配列に連結する。ＮcoＩ制限エンドヌクレア
ーゼ部位を用いて、 aphプロモーターを、シグナルペプ
チドをコードする合成オリゴヌクレオチドに連結した。
この部位は、この立体配座においてシグナルペプチドの
アミノ末端メチオニンを表わす aph遺伝子の天然イニシ
エータＡＴＧを含有する。ストレプトミセス・リビダン
スStreptomyces lividansの18ＳリボゾームＲＮＡの
3′端に対して補完的なＤＮＡ配列を、翻訳の開始を増
大するためにこのＮcoＩ部位で含入することができる。
便宜上、ＰstＩ部位又はＮsiＩ部位を、シグナルプロセ
ッシング部位に位置させて、分泌させるべき蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を連結する。ＰstＩ部位又はＮsiＩ
部位におけるＧＣＡコドンは、シグナルペプチドのカル
ボキシ末端でのアラニンを表わす。好ましい実施態様で
は、コード化シグナルペプチドのカルボキシ末端が、関
係のあるコード化蛋白質のアミノ末端に直接融合される
ようＤＮＡ配列を形成する。配列をコードする付加的ペ
プチドをＰstＩ部位又はＮsiＩ部位に挿入して、シグナ
ルペプチドの分泌又はプロセッシングを促進してもよ
い。その結果生じるアミノ末端延長を有する蛋白質を、
自然工程により培養中に、あるいは公知の化学的又は酵
素的方法によりin vitro で除去してもよい。
【００３４】本発明の明細書に記載のシグナルペプチ
ド、特に38−アミノ酸プロテアーゼＢシグナルペプチ
ド、34−アミノ酸エンドＨシグナルペプチド、41−アミ
ノ酸プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペ
プチド、及び40−アミノ酸プロテアーゼＢ-aprハイブリ
ットシグナルペプチドを、異種蛋白質の分泌に関して、
本発明に記載のもの以外の発現系とともに使用し得ると
予測される。本発明に記載のシグナルペプチドを、他の
発現系、特に他のグラム陽性細菌に関する発現系（Chan
g ，1987）、殊にバチルス・ズブチルスBacillussubtil
is及びスタフィロコッカス・オウレウスStaphylococcus
aureusに関する発現系で使用してもよい。
ド、特に38−アミノ酸プロテアーゼＢシグナルペプチ
ド、34−アミノ酸エンドＨシグナルペプチド、41−アミ
ノ酸プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペ
プチド、及び40−アミノ酸プロテアーゼＢ-aprハイブリ
ットシグナルペプチドを、異種蛋白質の分泌に関して、
本発明に記載のもの以外の発現系とともに使用し得ると
予測される。本発明に記載のシグナルペプチドを、他の
発現系、特に他のグラム陽性細菌に関する発現系（Chan
g ，1987）、殊にバチルス・ズブチルスBacillussubtil
is及びスタフィロコッカス・オウレウスStaphylococcus
aureusに関する発現系で使用してもよい。
【００３５】Streptomyces以外の細菌宿主中で自然工程
により、本発明に記載のシグナルペプチドの１つをコー
ドするＤＮＡセグメントに連結し、異種蛋白質をコード
するＤＮＡセグメントに連結する、プロモーターとして
機能するＤＮＡセグメントを含む発現系から合成可能で
あると予測される。融合蛋白質は、そのアミノ末端で本
発明に記載のシグナルペプチドの１つを有し、そのカル
ボキシ末端でＧＭ−ＣＳＦであり得る異種蛋白質を有す
るであろう。シグナルペプチドのカルボキシ末端は異種
蛋白質のアミノ末端に直接連結して、融合蛋白質を形成
してもよい。融合蛋白質は、細菌宿主における異種蛋白
質の分泌に有用であろう。
により、本発明に記載のシグナルペプチドの１つをコー
ドするＤＮＡセグメントに連結し、異種蛋白質をコード
するＤＮＡセグメントに連結する、プロモーターとして
機能するＤＮＡセグメントを含む発現系から合成可能で
あると予測される。融合蛋白質は、そのアミノ末端で本
発明に記載のシグナルペプチドの１つを有し、そのカル
ボキシ末端でＧＭ−ＣＳＦであり得る異種蛋白質を有す
るであろう。シグナルペプチドのカルボキシ末端は異種
蛋白質のアミノ末端に直接連結して、融合蛋白質を形成
してもよい。融合蛋白質は、細菌宿主における異種蛋白
質の分泌に有用であろう。
【００３６】プロモーター、シグナルペプチドをコード
する核酸配列、及び関係する特定の蛋白質をコードする
核酸配列より成る遺伝子発現系は、ストレプトミセスSt
reptomycesにおいて形質転換及び複製が可能なＤＮＡベ
クター中に存在する。本ベクターは、ｐＩＪ101 ，ｐＳ
ＬＰ1.2 ，ｐＳＣＰ2 * を含むStreptomycesの天然由来
のプラスミド、又はＯＣ31を含むStreptomycesの天然由
来のファージ、あるいはStreptomycesにおける複製が可
能な任意の非−ストレプトミセス性プラスミド又はバク
テリオファージの各々の誘導体を含有し得る。ベクター
は、宿主生物中で自律的複製が可能であるか、あるいは
宿主生物の染色体又は大型染色体外因子への統合（inte
gration ）を必要とする場合もある。後者の場合、ベク
ターは宿主ゲノムにおける特定のＤＮＡ配列か又は未確
定ＤＮＡ配列によるin vivo組換えを促進することがで
きる適当な核酸配列を含有するものと思われる。これら
の配列は、プラスミド又はファージatt 部位、運搬可能
因子の組換え配列、又は統合を促すに十分な宿主ゲノム
セグメントに関する相同性を有する任意の配列を包含し
得る。Streptomycesのゲノム、殊にStreptomyces coel
icolorのＤＮＡの5.7-kb増幅可能（amplifiable ）単位
において自然に増幅されるＤＮＡセグメントはベクター
に包含され、遺伝子発現系の多重−複写統合（multi-co
py integration）を得るために使用され得る。そのベク
ターはまた、形質転換体の形質転換中及びその後の培養
中の両方において、宿主生物の形質転換株に関する選択
をもたらす適当な遺伝子を含有する。この選択の標識物
質は、チオストレプトン、カナマイシン、ビオマイシ
ン、ヒグロマイシンのような抗生物質に対する耐性を提
供し得るし、あるいは宿主生物の独立栄養型（auxotrop
hic ）又は条件致死型(conditional lethal)突然変異株
を補完し得る。
する核酸配列、及び関係する特定の蛋白質をコードする
核酸配列より成る遺伝子発現系は、ストレプトミセスSt
reptomycesにおいて形質転換及び複製が可能なＤＮＡベ
クター中に存在する。本ベクターは、ｐＩＪ101 ，ｐＳ
ＬＰ1.2 ，ｐＳＣＰ2 * を含むStreptomycesの天然由来
のプラスミド、又はＯＣ31を含むStreptomycesの天然由
来のファージ、あるいはStreptomycesにおける複製が可
能な任意の非−ストレプトミセス性プラスミド又はバク
テリオファージの各々の誘導体を含有し得る。ベクター
は、宿主生物中で自律的複製が可能であるか、あるいは
宿主生物の染色体又は大型染色体外因子への統合（inte
gration ）を必要とする場合もある。後者の場合、ベク
ターは宿主ゲノムにおける特定のＤＮＡ配列か又は未確
定ＤＮＡ配列によるin vivo組換えを促進することがで
きる適当な核酸配列を含有するものと思われる。これら
の配列は、プラスミド又はファージatt 部位、運搬可能
因子の組換え配列、又は統合を促すに十分な宿主ゲノム
セグメントに関する相同性を有する任意の配列を包含し
得る。Streptomycesのゲノム、殊にStreptomyces coel
icolorのＤＮＡの5.7-kb増幅可能（amplifiable ）単位
において自然に増幅されるＤＮＡセグメントはベクター
に包含され、遺伝子発現系の多重−複写統合（multi-co
py integration）を得るために使用され得る。そのベク
ターはまた、形質転換体の形質転換中及びその後の培養
中の両方において、宿主生物の形質転換株に関する選択
をもたらす適当な遺伝子を含有する。この選択の標識物
質は、チオストレプトン、カナマイシン、ビオマイシ
ン、ヒグロマイシンのような抗生物質に対する耐性を提
供し得るし、あるいは宿主生物の独立栄養型（auxotrop
hic ）又は条件致死型(conditional lethal)突然変異株
を補完し得る。
【００３７】好ましい実施態様では、図２に略記の変法
に従って、ベクターとしてプラスミドｐＩＪ680 を採用
した。第１段階では、 E. coliプラスミドｐＵＣ8 の23
54塩基対のＰvuII断片をｐＩＪ680 の3390位（第16部
位）でＰstＩ部位に導入した（Hopwood 等，1985）。ブ
ラント末端ＰvuII断片を図２に示す通り、合成アダプタ
ーを用いてＰstＩ部位の−ＴＧＣＡ 3′端に連結した。
ＰstＩ部位に挿入されるE. coliプラスミドを有するベ
クターは、アンピシリン選択下では E. coli中で、また
チオストレプトン耐性についての選択においてはストレ
プトミセスStreptomyces中で複製可能である。ベクター
の E. coliプラスミド部分は、ベクター中の発現系の集
合を促すにすぎず、一旦完成プラスミドがStreptomyces
の形質転換に向けて用意されたならば必要でなくなると
思われる。例えば、ＣlaＩによる部分的消化とその後の
ＤＮＡリガーゼによるベクターの再環化（recirculariz
ation ）によって、Streptomycesを形質転換する前に
E. coliプラスミドセグメントを除去可能である。
に従って、ベクターとしてプラスミドｐＩＪ680 を採用
した。第１段階では、 E. coliプラスミドｐＵＣ8 の23
54塩基対のＰvuII断片をｐＩＪ680 の3390位（第16部
位）でＰstＩ部位に導入した（Hopwood 等，1985）。ブ
ラント末端ＰvuII断片を図２に示す通り、合成アダプタ
ーを用いてＰstＩ部位の−ＴＧＣＡ 3′端に連結した。
ＰstＩ部位に挿入されるE. coliプラスミドを有するベ
クターは、アンピシリン選択下では E. coli中で、また
チオストレプトン耐性についての選択においてはストレ
プトミセスStreptomyces中で複製可能である。ベクター
の E. coliプラスミド部分は、ベクター中の発現系の集
合を促すにすぎず、一旦完成プラスミドがStreptomyces
の形質転換に向けて用意されたならば必要でなくなると
思われる。例えば、ＣlaＩによる部分的消化とその後の
ＤＮＡリガーゼによるベクターの再環化（recirculariz
ation ）によって、Streptomycesを形質転換する前に
E. coliプラスミドセグメントを除去可能である。
【００３８】第二段階では、 aph遺伝子のプロモーター
及びコード領域を合成ＤＮＡ配列で置き換えて、今後の
構築を容易にする。これは、合成ＢglIIリンカーＧＡＧ
ＡＴＣＴＣをＣＣＧＣＧＧ ＳacII部位における２番目
のＣに連結することにより、ｐＩＪ680 の4883位（部位
第32番）でのＳacII部位を変化(Hopwood等，1985）させ
ることを含む。ある実施態様では、合成リンカーＣＧＧ
ＡＴＣＣＧをＡＧＡＴＣＴ ＢglII部位のＣと連結する
ことによりＢglII部位をＢamＨＩ部位に変換し、その結
果、ベクターｐＳＳ2 を生じる。別の実施態様におい
て、合成リンカーＣＡＡＧＣＴＴＧをＴＣＴＡＧＡ Ｘ
baＩ部位のＧに連結してＸbaＩ位部位をＨinｄIII 部位
に変換する。
及びコード領域を合成ＤＮＡ配列で置き換えて、今後の
構築を容易にする。これは、合成ＢglIIリンカーＧＡＧ
ＡＴＣＴＣをＣＣＧＣＧＧ ＳacII部位における２番目
のＣに連結することにより、ｐＩＪ680 の4883位（部位
第32番）でのＳacII部位を変化(Hopwood等，1985）させ
ることを含む。ある実施態様では、合成リンカーＣＧＧ
ＡＴＣＣＧをＡＧＡＴＣＴ ＢglII部位のＣと連結する
ことによりＢglII部位をＢamＨＩ部位に変換し、その結
果、ベクターｐＳＳ2 を生じる。別の実施態様におい
て、合成リンカーＣＡＡＧＣＴＴＧをＴＣＴＡＧＡ Ｘ
baＩ部位のＧに連結してＸbaＩ位部位をＨinｄIII 部位
に変換する。
【００３９】ｐＳＳ2 のＢamＨＩ−ＸbaＩ断片は、プロ
モーター、シグナルペプチドをコードする核酸配列、及
び関係のある特定の蛋白質をコードする核酸配列から成
る発現系により置き換え得る。便宜上、制限部位ＢamＨ
Ｉ、及びＸbaＩを選択したけれども、遺伝子発現系をベ
クターに結合するためには、これらに代えて、あるいは
これらに加えて、任意の他の制限部位を使用可能である
と理解すべきである。発現系をＢamＨＩ部位とＸbaＩ部
位の間に何れの方向にでも挿入することができるが、し
かし図２に示した通り、好ましい配向とすることにより
反時計方向の転写が行われることになろう。これによ
り、ＸbaＩ部位に隣接する aph転写ターミネーター〔オ
リジナルｐＩＪ680 の3955位（部位21）と3843位（部位
19）の間に位置する（Hopwood 等，1985）〕の利用が可
能になると考えられる。しかしながら、当業界で公知の
任意の転写ターミネーターは、 aphに対するものの代り
に、又はそれに加えて使用可能である。ｐＳＳ2 ベクタ
ーは、異種遺伝子の発現には用いられない転写の開始に
関する部位を有し得る。
モーター、シグナルペプチドをコードする核酸配列、及
び関係のある特定の蛋白質をコードする核酸配列から成
る発現系により置き換え得る。便宜上、制限部位ＢamＨ
Ｉ、及びＸbaＩを選択したけれども、遺伝子発現系をベ
クターに結合するためには、これらに代えて、あるいは
これらに加えて、任意の他の制限部位を使用可能である
と理解すべきである。発現系をＢamＨＩ部位とＸbaＩ部
位の間に何れの方向にでも挿入することができるが、し
かし図２に示した通り、好ましい配向とすることにより
反時計方向の転写が行われることになろう。これによ
り、ＸbaＩ部位に隣接する aph転写ターミネーター〔オ
リジナルｐＩＪ680 の3955位（部位21）と3843位（部位
19）の間に位置する（Hopwood 等，1985）〕の利用が可
能になると考えられる。しかしながら、当業界で公知の
任意の転写ターミネーターは、 aphに対するものの代り
に、又はそれに加えて使用可能である。ｐＳＳ2 ベクタ
ーは、異種遺伝子の発現には用いられない転写の開始に
関する部位を有し得る。
【００４０】種々の遺伝子発現系をｐＳＳ2 ベクターに
挿入することにより、発現ベクターを構築できる。ある
実施態様によれば、発現系ｐＡＰＯ．ＧＭＣＳＦ（図
３）は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列に連結され
るプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする核酸配
列に連結される aphプロモータを含有する。別の実施態
様によれば、発現系ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ（図６）は、
ＧＭ−ＣＳＦをコードする置換可能な核酸配列に連結さ
れるプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペ
プチドをコードする核酸配列に連結される aphプロモー
ターを含有する。別の実施態様においては、発現系ｐＡ
ＰＯ．Ｇ（図９）は、置換可能な核酸配列に連結される
プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする核酸配列
に連結される aphプロモーターを含有する。さらに別の
実施態様では、ＸbaＩ部位に合成ＤＮＡ（ＣＴＡＧＣＡ
ＡＧＣＴＴＧ）を挿入することにより、ｐＡＰＯ．Ｇか
ら発現系ｐＡＰＯ．Ｈを構築した。発現系ｐＡＥＯ．Ｓ
Ｘ（図１１）は、置換可能な核酸配列に連結されるプロ
テアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペプチドを
コードする核酸配列に連結される aphプロモーターを含
有する。さらに別の実施態様においては、ＸbaＩ部位に
合成ＤＮＡ（ＣＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧ）を挿入するこ
とにより、ｐＡＥＯ．ＳＸから発現系ｐＡＥＯ．ＳＨを
構築した。同様にこれに代わるものとしては、置換可能
な核酸配列に連結されるプロテアーゼＢシグナルペプチ
ドをコードする核酸配列に連結される aphプロモーター
を含有するｐＡＰＯ．ＳＸ（図１４）がある。
挿入することにより、発現ベクターを構築できる。ある
実施態様によれば、発現系ｐＡＰＯ．ＧＭＣＳＦ（図
３）は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列に連結され
るプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする核酸配
列に連結される aphプロモータを含有する。別の実施態
様によれば、発現系ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ（図６）は、
ＧＭ−ＣＳＦをコードする置換可能な核酸配列に連結さ
れるプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペ
プチドをコードする核酸配列に連結される aphプロモー
ターを含有する。別の実施態様においては、発現系ｐＡ
ＰＯ．Ｇ（図９）は、置換可能な核酸配列に連結される
プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする核酸配列
に連結される aphプロモーターを含有する。さらに別の
実施態様では、ＸbaＩ部位に合成ＤＮＡ（ＣＴＡＧＣＡ
ＡＧＣＴＴＧ）を挿入することにより、ｐＡＰＯ．Ｇか
ら発現系ｐＡＰＯ．Ｈを構築した。発現系ｐＡＥＯ．Ｓ
Ｘ（図１１）は、置換可能な核酸配列に連結されるプロ
テアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルペプチドを
コードする核酸配列に連結される aphプロモーターを含
有する。さらに別の実施態様においては、ＸbaＩ部位に
合成ＤＮＡ（ＣＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧ）を挿入するこ
とにより、ｐＡＥＯ．ＳＸから発現系ｐＡＥＯ．ＳＨを
構築した。同様にこれに代わるものとしては、置換可能
な核酸配列に連結されるプロテアーゼＢシグナルペプチ
ドをコードする核酸配列に連結される aphプロモーター
を含有するｐＡＰＯ．ＳＸ（図１４）がある。
【００４１】全発現ベクターにおけるＢamＨＩ−ＭluＩ
断片は、異なるプロモーター及び／又はコードされたシ
グナルペプチドアミノ末端を含有するＤＮＡ断片で置換
し得る。また、ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ，ｐＡＥＯ．Ｓ
Ｘ，ｐＡＥＯ．ＳＨ又はｐＡＰＯ．ＳＸのＭluＩ−Ｐst
Ｉ断片、あるいはｐＡＰＯ．Ｇ又はｐＡＰＯ．ＨのＭlu
Ｉ−ＮsiＩ断片は代りのシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ断片で置換し得る。同様に、ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳ
Ｆ又はｐＡＥＯ．ＳＨのＰstＩ−ＨinｄIII 断片；ある
いはｐＡＥＯ．ＳＸ又はｐＡＰＯ．ＳＸのＰstＩ−Ｘba
Ｉ断片；あるいはｐＡＰＯ．ＨのＮsiＩ−ＨinｄIII 断
片；あるいはｐＡＰＯ．ＧのＮsiＩ−ＸbaＩ断片は、蛋
白質をコードする別のＤＮＡ断片で置換し得る。
断片は、異なるプロモーター及び／又はコードされたシ
グナルペプチドアミノ末端を含有するＤＮＡ断片で置換
し得る。また、ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ，ｐＡＥＯ．Ｓ
Ｘ，ｐＡＥＯ．ＳＨ又はｐＡＰＯ．ＳＸのＭluＩ−Ｐst
Ｉ断片、あるいはｐＡＰＯ．Ｇ又はｐＡＰＯ．ＨのＭlu
Ｉ−ＮsiＩ断片は代りのシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ断片で置換し得る。同様に、ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳ
Ｆ又はｐＡＥＯ．ＳＨのＰstＩ−ＨinｄIII 断片；ある
いはｐＡＥＯ．ＳＸ又はｐＡＰＯ．ＳＸのＰstＩ−Ｘba
Ｉ断片；あるいはｐＡＰＯ．ＨのＮsiＩ−ＨinｄIII 断
片；あるいはｐＡＰＯ．ＧのＮsiＩ−ＸbaＩ断片は、蛋
白質をコードする別のＤＮＡ断片で置換し得る。
【００４２】本発明の好ましい実施態様を、以下例示す
る。ここに記載の方法及び結果は実施例のためのもので
あり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定する
ものではない。
る。ここに記載の方法及び結果は実施例のためのもので
あり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定する
ものではない。
【００４３】調 製 菌株及びプラスミド ストレプトミセス・リビダンスStreptomyces lividans
66（Bibb等，1980）、並びにプラスミドｐＩＪ61（19
82にThompson等により開示され、S. lividans66／ＴＣ
73から単離可能である）及びｐＩＪ680 （1985にHopwoo
d 等により開示され、 S. lividans ＴＫ24／ＴＫ425
から単離可能である）は、JohnInnesInstitute から入
手した。全ての形質転換において、E. coli ＨＢ101
株（ＡＴＣＣ33694)を用いた。プラスミドｐＵＣ8 （Vi
eiraとMessing,1982）、並びにｐＵＣ18及びｐＵＣ19(N
orrander等，1983）はBethesda Research Laboratories
より購入した。プラスミドｐＵＣ680 Ｔは、1988年 6月
28日、寄託番号 40466でAmerican Type Culture collec
tionに寄託した。
66（Bibb等，1980）、並びにプラスミドｐＩＪ61（19
82にThompson等により開示され、S. lividans66／ＴＣ
73から単離可能である）及びｐＩＪ680 （1985にHopwoo
d 等により開示され、 S. lividans ＴＫ24／ＴＫ425
から単離可能である）は、JohnInnesInstitute から入
手した。全ての形質転換において、E. coli ＨＢ101
株（ＡＴＣＣ33694)を用いた。プラスミドｐＵＣ8 （Vi
eiraとMessing,1982）、並びにｐＵＣ18及びｐＵＣ19(N
orrander等，1983）はBethesda Research Laboratories
より購入した。プラスミドｐＵＣ680 Ｔは、1988年 6月
28日、寄託番号 40466でAmerican Type Culture collec
tionに寄託した。
【００４４】材 料 アプライドバイオシステムズApplied Biosystems社製38
0 Ａ型ＤＮＡシンセサイザーを用いて、オリゴヌクレオ
チドを合成した。オリゴヌクレオチド合成に用いたカラ
ム、ホスホアミダイト、及び試薬は、Technical Market
ing Associatesを通じて、アプライドバイオシステムズ
社から購入した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
ない、次いでＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーを
行なうことにより、オリゴヌクレオチドを精製した。Ｄ
ＮＡの消化及び修飾用の酵素は、New England Biolabs
より購入し、提供者の勧告に従って使用した。放射性同
位元素〔α−32Ｐ〕ｄＡＴＰ（3000Ｃi ／mmol）及び
〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（3000Ｃi ／mmol）はAmershamより
入手した。チオストレプトンは、ニューヨークのSquibb
Corporation より寄贈された。
0 Ａ型ＤＮＡシンセサイザーを用いて、オリゴヌクレオ
チドを合成した。オリゴヌクレオチド合成に用いたカラ
ム、ホスホアミダイト、及び試薬は、Technical Market
ing Associatesを通じて、アプライドバイオシステムズ
社から購入した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
ない、次いでＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーを
行なうことにより、オリゴヌクレオチドを精製した。Ｄ
ＮＡの消化及び修飾用の酵素は、New England Biolabs
より購入し、提供者の勧告に従って使用した。放射性同
位元素〔α−32Ｐ〕ｄＡＴＰ（3000Ｃi ／mmol）及び
〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（3000Ｃi ／mmol）はAmershamより
入手した。チオストレプトンは、ニューヨークのSquibb
Corporation より寄贈された。
【００４５】ＤＮＡの単離 アルカリ性溶解法(alkaline lysis procedure)（Hopwoo
d 等，1985）により、形質転換S. lividansのプラスミ
ドＤＮＡを調製した。50μｇ／mlアンピシリンを含有す
るＹＴ培地（Miller，1972）上でE. coli形質転換株を
育成した。急速煮沸法（HolmesとQuigley ，1981）によ
り、E. coliから得たプラスミドＤＮＡを精製した。全
ての構築に用いたＤＮＡ断片及びベクターを低融点アガ
ロース上で電気泳動により分離し、フェノール抽出及び
エタノール析出（Maniatis等，1982）により溶融アガロ
ースから精製した。
d 等，1985）により、形質転換S. lividansのプラスミ
ドＤＮＡを調製した。50μｇ／mlアンピシリンを含有す
るＹＴ培地（Miller，1972）上でE. coli形質転換株を
育成した。急速煮沸法（HolmesとQuigley ，1981）によ
り、E. coliから得たプラスミドＤＮＡを精製した。全
ての構築に用いたＤＮＡ断片及びベクターを低融点アガ
ロース上で電気泳動により分離し、フェノール抽出及び
エタノール析出（Maniatis等，1982）により溶融アガロ
ースから精製した。
【００４６】ＤＮＡ配列決定 ＨＰＬＣ（Edwardson 等，1986）により精製したプラス
ミドＤＮＡを、ジデオキシ法（Sanger等，1977）の変法
（Hattori 等，1985）を用いて配列決定した。必要な場
合は、Ｍ13バクテリオファージmp18及びmp19（Norrande
r 等，1983）中でサブクローンを調製し、−20ユニバー
サルプライマー(New England Biolabs)を用いてジデオ
キシ配列決定反応を行なった。強固な二次構造のいくつ
かの領域において、圧縮及びポリメラーゼ欠損は、配列
を明確にするためのジデオキシ反応において、デアザグ
アノシン（Mizusana等，1986）(Boehringer Mannheim)
類縁体の使用を必要とした。ＤＮＡＳＴＡＲtmのソフト
ウェア(DoggettとBlattner，1985) を用いて配列をコン
パイルした。
ミドＤＮＡを、ジデオキシ法（Sanger等，1977）の変法
（Hattori 等，1985）を用いて配列決定した。必要な場
合は、Ｍ13バクテリオファージmp18及びmp19（Norrande
r 等，1983）中でサブクローンを調製し、−20ユニバー
サルプライマー(New England Biolabs)を用いてジデオ
キシ配列決定反応を行なった。強固な二次構造のいくつ
かの領域において、圧縮及びポリメラーゼ欠損は、配列
を明確にするためのジデオキシ反応において、デアザグ
アノシン（Mizusana等，1986）(Boehringer Mannheim)
類縁体の使用を必要とした。ＤＮＡＳＴＡＲtmのソフト
ウェア(DoggettとBlattner，1985) を用いて配列をコン
パイルした。
【００４７】
【実施例】実施例１ ｐＵＣ680 Ｔの作製 ストレプトミセスStreptomycesプラスミドｐＩＪ680 (1
〜2 μｇ) を４分間、1.2単位のＰstＩを用いた部分消
化により線状化した。線状化ｐＩＪ680 プラスミドを表
わす5.3-kb ＰstＩＤＮＡ断片をＰstＩ及び仔ウシ腸ア
ルカリホスファターゼを用いて消化されたE. coli（大
腸菌）プラスミドｐＵＣ8 と混合した。次いでその混合
物をＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合して、E. coli中に形質
転換した。その形質転換体を、正しい組換え体に関し、
プラスミドＤＮＡ分析によりスクリーニングした。ある
プラスミド、ｐＵＣ680 は、ｐＩＪ680 の3390位（部位
番号16）でＰstＩ部位に挿入されたｐＵＣ8 プラスミド
を有した。
〜2 μｇ) を４分間、1.2単位のＰstＩを用いた部分消
化により線状化した。線状化ｐＩＪ680 プラスミドを表
わす5.3-kb ＰstＩＤＮＡ断片をＰstＩ及び仔ウシ腸ア
ルカリホスファターゼを用いて消化されたE. coli（大
腸菌）プラスミドｐＵＣ8 と混合した。次いでその混合
物をＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合して、E. coli中に形質
転換した。その形質転換体を、正しい組換え体に関し、
プラスミドＤＮＡ分析によりスクリーニングした。ある
プラスミド、ｐＵＣ680 は、ｐＩＪ680 の3390位（部位
番号16）でＰstＩ部位に挿入されたｐＵＣ8 プラスミド
を有した。
【００４８】ｐＩＪ680 のサブクローンを作製して、 a
phプロモーター及びコード領域の置換を容易にした。こ
のサブクローンｐＣＭ680 Ｂは、ｐＩＪ680 （Hopwood
ら，1985）の4883位から5290位まで（部位番号32から１
の間）の 0.41-kb ＳacII−ＸhoＩＤＮＡ断片を含有す
る。合成リンカーＧＡＧＡＴＣＴＣを、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのKlenow断片を用いて平滑末端化されたＳacII部
位に結合することにより、ＳacII部位をＢglIIに変え
た。新規に生成されたＢglII部位は、ＸbaＩ部位で終わ
る0.92-kb の合成ＤＮＡに隣接している。
phプロモーター及びコード領域の置換を容易にした。こ
のサブクローンｐＣＭ680 Ｂは、ｐＩＪ680 （Hopwood
ら，1985）の4883位から5290位まで（部位番号32から１
の間）の 0.41-kb ＳacII−ＸhoＩＤＮＡ断片を含有す
る。合成リンカーＧＡＧＡＴＣＴＣを、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのKlenow断片を用いて平滑末端化されたＳacII部
位に結合することにより、ＳacII部位をＢglIIに変え
た。新規に生成されたＢglII部位は、ＸbaＩ部位で終わ
る0.92-kb の合成ＤＮＡに隣接している。
【００４９】ｐＩＪ680 サブクローンと連結する合成Ｄ
ＮＡ断片を含有するｐＣＭ680 Ｂの1.33-kb ＸbaＩ−
ＸhoＩ ＤＮＡ断片を、E. coliベクターを含むｐＵＣ
680の6.6-kb ＸbaＩ−ＸhoＩＤＮＡ断片と混合した。
その混合物をＴ4 ＤＮＡリガーゼと結合し、E. coli中
に形質転換した。その結果生じたプラスミドｐＵＣ680
Ｔを、形質転換体のプラスミドＤＮＡを分析することに
より見出した。プラスミドｐＵＣ680 Ｔは、1988年 6月
28日、the American Type Culture Collectionに寄託番
号 40466号で寄託された。
ＮＡ断片を含有するｐＣＭ680 Ｂの1.33-kb ＸbaＩ−
ＸhoＩ ＤＮＡ断片を、E. coliベクターを含むｐＵＣ
680の6.6-kb ＸbaＩ−ＸhoＩＤＮＡ断片と混合した。
その混合物をＴ4 ＤＮＡリガーゼと結合し、E. coli中
に形質転換した。その結果生じたプラスミドｐＵＣ680
Ｔを、形質転換体のプラスミドＤＮＡを分析することに
より見出した。プラスミドｐＵＣ680 Ｔは、1988年 6月
28日、the American Type Culture Collectionに寄託番
号 40466号で寄託された。
【００５０】実施例２ ｐＳＳ2 の作製 ｐＵＣ8 の2.36-kb ＰvuII断片を、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ
を用いて、配列ＣＡＴＣＧＡＴＧのリン酸化ＣlaＩリン
カー（New England Biolabs)に結合した。65℃に加熱し
て結合反応を終結させ、連続的リンカーを結合して生成
した部位を利用するＮsiＩで消化した。2.36-kb ＮsiＩ
断片を単離して、ｐＵＣ680 Ｔの5.3-kbＰstＩ断片と混
合した。その混合物を、ＮsiＩ及びＰstＩの存在下でＴ
4 ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。65℃に加熱して結
合反応を終結させ、E. coli中に形質転換した。形質転
換体のプラスミドＤＮＡを分析することにより見出され
たプラスミドｐＳＳ1 は、前の方のＰstＩ部位に図２に
示す方向で挿入されたE. coliプラスミドセグメントを含
有する。
を用いて、配列ＣＡＴＣＧＡＴＧのリン酸化ＣlaＩリン
カー（New England Biolabs)に結合した。65℃に加熱し
て結合反応を終結させ、連続的リンカーを結合して生成
した部位を利用するＮsiＩで消化した。2.36-kb ＮsiＩ
断片を単離して、ｐＵＣ680 Ｔの5.3-kbＰstＩ断片と混
合した。その混合物を、ＮsiＩ及びＰstＩの存在下でＴ
4 ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。65℃に加熱して結
合反応を終結させ、E. coli中に形質転換した。形質転
換体のプラスミドＤＮＡを分析することにより見出され
たプラスミドｐＳＳ1 は、前の方のＰstＩ部位に図２に
示す方向で挿入されたE. coliプラスミドセグメントを含
有する。
【００５１】ｐＳＳ1 の唯一のＢglII部位をＢamＨＩに
変えて、プロモーター配列の交換を容易にした。プラス
ミドｐＳＳ1 をＢglIIで消化して、線状化プラスミドの
末端をＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片で塞いだ。次
いで、平滑末端化ＤＮＡ断片を、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを
用いて配列ＣＧＧＡＴＣＣＧのリン酸化ＢamＨＩリンカ
ー（New England Biolabs ）に結合した。65℃に加熱し
て結合反応を終結させ、ＢamＨＩで消化した。次いで、
ＢamＨＩ末端を有する精製線状プラスミドを、Ｔ4 ＤＮ
Ａリガーゼを用いて再環化し、E. coli中に形質転換し
た。その結果生じたプラスミド、即ち本来のＢglII部位
を置換する唯一のＢamＨＩ部位を有するｐＳＳ2 は、形
質転換体のプラスミドＤＮＡを分析することにより見出
された。
変えて、プロモーター配列の交換を容易にした。プラス
ミドｐＳＳ1 をＢglIIで消化して、線状化プラスミドの
末端をＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片で塞いだ。次
いで、平滑末端化ＤＮＡ断片を、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを
用いて配列ＣＧＧＡＴＣＣＧのリン酸化ＢamＨＩリンカ
ー（New England Biolabs ）に結合した。65℃に加熱し
て結合反応を終結させ、ＢamＨＩで消化した。次いで、
ＢamＨＩ末端を有する精製線状プラスミドを、Ｔ4 ＤＮ
Ａリガーゼを用いて再環化し、E. coli中に形質転換し
た。その結果生じたプラスミド、即ち本来のＢglII部位
を置換する唯一のＢamＨＩ部位を有するｐＳＳ2 は、形
質転換体のプラスミドＤＮＡを分析することにより見出
された。
【００５２】実施例３ aphプロモーターを含有するＤ
ＮＡ断片のサブクローニング ストレプトミセスStreptomycesプラスミドｐＩＪ61の2.
1-kb ＥcoＲＶ−ＮcoＩ断片をＳau 3ＡＩで消化して、
適当なベクターのＢamＨＩ部位及びＮcoＩ部位に結合し
た。組換え体の中で、 aphプロモーターに対応する配列
を有する0.40-kb Ｓau 3ＡＩ−ＮcoＩ断片を含有するｐ
ＩＪ61のサブクローン、即ちｐＡＰＨ.4が見出された
（図１７）。ＮcoＩ部位は aph遺伝子のイニシエーター
ＡＴＧを含有する。
ＮＡ断片のサブクローニング ストレプトミセスStreptomycesプラスミドｐＩＪ61の2.
1-kb ＥcoＲＶ−ＮcoＩ断片をＳau 3ＡＩで消化して、
適当なベクターのＢamＨＩ部位及びＮcoＩ部位に結合し
た。組換え体の中で、 aphプロモーターに対応する配列
を有する0.40-kb Ｓau 3ＡＩ−ＮcoＩ断片を含有するｐ
ＩＪ61のサブクローン、即ちｐＡＰＨ.4が見出された
（図１７）。ＮcoＩ部位は aph遺伝子のイニシエーター
ＡＴＧを含有する。
【００５３】実施例４ プロテアーゼＢプロモーター及
びシグナルペプチドを含有するＤＮＡ断片のサブクロー
ニング プロテアーゼＢ遺伝子を含有した2.8-kb ＢalII断片を
含むプラスミドの1.4-kb ＢssＨII断片からプロテアー
ゼＢ遺伝子のサブクローンを調製した（1987年7月21日
に Cangene Corpora-tion 社が出願したカナダ国特許出
願第 542,678号）。ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片
を用いてＢssＨII断片の末端を塞ぎ、次いで、実施例２
の教旨に従って、リン酸化ＢamＨＩリンカーに結合し
た。その結果得られたＢamＨＩ末端を有する1.4-kb断片
を、ＢamＨＩで消化された且つアルカリホスファターゼ
で処理されたｐＵＣ8 ベクター中に結合した。その結果
生じたプラスミドｐＳＰＲＢｌ．4 は完全なプロテアー
ゼＢ遺伝子を含有した。
びシグナルペプチドを含有するＤＮＡ断片のサブクロー
ニング プロテアーゼＢ遺伝子を含有した2.8-kb ＢalII断片を
含むプラスミドの1.4-kb ＢssＨII断片からプロテアー
ゼＢ遺伝子のサブクローンを調製した（1987年7月21日
に Cangene Corpora-tion 社が出願したカナダ国特許出
願第 542,678号）。ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片
を用いてＢssＨII断片の末端を塞ぎ、次いで、実施例２
の教旨に従って、リン酸化ＢamＨＩリンカーに結合し
た。その結果得られたＢamＨＩ末端を有する1.4-kb断片
を、ＢamＨＩで消化された且つアルカリホスファターゼ
で処理されたｐＵＣ8 ベクター中に結合した。その結果
生じたプラスミドｐＳＰＲＢｌ．4 は完全なプロテアー
ゼＢ遺伝子を含有した。
【００５４】２つのアニールされたオリゴヌクレオチド
ＧＧＣＣＴＣＧＴＣＴＡＧＡ及びＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧ
ＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡをＰstＩ部位及びＨinｄIII
部位に結合することによって、さらにサブクローニング
用にプラスミドｐＵＣ8 を改造して、プラスミドｐＵ
Ｃ．ＰＸＨとした。プラスミドｐＳＰＲＢｌ．4 をＰvu
IIで消化して、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを用いて配列ＧＣＴ
ＧＣＡＧＣのリン酸化ＰstＩリンカー(New England Bio
labs) に結合した。65℃に加熱して結合反応を終結さ
せ、ＰstＩ及びＢamＨＩで消化した。
ＧＧＣＣＴＣＧＴＣＴＡＧＡ及びＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧ
ＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡをＰstＩ部位及びＨinｄIII
部位に結合することによって、さらにサブクローニング
用にプラスミドｐＵＣ8 を改造して、プラスミドｐＵ
Ｃ．ＰＸＨとした。プラスミドｐＳＰＲＢｌ．4 をＰvu
IIで消化して、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを用いて配列ＧＣＴ
ＧＣＡＧＣのリン酸化ＰstＩリンカー(New England Bio
labs) に結合した。65℃に加熱して結合反応を終結さ
せ、ＰstＩ及びＢamＨＩで消化した。
【００５５】0.49-kb ＢamＨＩ−ＰstＩ断片を精製
し、次いでｐＵＣ．ＰＸＨベクターのＢamＨＩ及びＰst
Ｉ部位に結合した。その結果生じたプラスミドｐＰＰＩ
は、プロモーター、シグナルペプチド及びプロペプチド
の最初の10個のアミノ酸、即ちプロテアーゼＢ遺伝子の
すべてを含有した。
し、次いでｐＵＣ．ＰＸＨベクターのＢamＨＩ及びＰst
Ｉ部位に結合した。その結果生じたプラスミドｐＰＰＩ
は、プロモーター、シグナルペプチド及びプロペプチド
の最初の10個のアミノ酸、即ちプロテアーゼＢ遺伝子の
すべてを含有した。
【００５６】実施例５ プロテアーゼＢシグナルペプチ
ドを用いた発現系の作製 異種蛋白質分泌用にプロテアーゼＢシグナルを改造する
ために、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボキシ
末端の 9個のアミノ酸及びヒト成長ホルモンのアミノ末
端の 8個のアミノ酸をコードする２つの合成オリゴヌク
レオチド 42-マー及び 50-マーを使用した（図１９）。
合成オリゴヌクレオチドを３通りの結合法でプロテアー
ゼＢサブクローンｐＰＰＩの 0.44-kb ＢamＩ−ＨaeII
断片（図１８）、並びにＢamＨＩ及びＸbaＩで消化した
ｐＳＳ2 のベクター断片に連結した。その結果生じたプ
ラスミドｐＰＰＯ．Ｇは、プロテアーゼＢプロモーター
及びシグナルペプチドを含有する 0.46-kbＢamＨＩ−Ｎ
siＩセグメントを有した。ＮsiＩ部位は、プロセッシン
グ部位（−１位）直前にアラニン残基のＧＣＡコドンを
含有した。
ドを用いた発現系の作製 異種蛋白質分泌用にプロテアーゼＢシグナルを改造する
ために、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボキシ
末端の 9個のアミノ酸及びヒト成長ホルモンのアミノ末
端の 8個のアミノ酸をコードする２つの合成オリゴヌク
レオチド 42-マー及び 50-マーを使用した（図１９）。
合成オリゴヌクレオチドを３通りの結合法でプロテアー
ゼＢサブクローンｐＰＰＩの 0.44-kb ＢamＩ−ＨaeII
断片（図１８）、並びにＢamＨＩ及びＸbaＩで消化した
ｐＳＳ2 のベクター断片に連結した。その結果生じたプ
ラスミドｐＰＰＯ．Ｇは、プロテアーゼＢプロモーター
及びシグナルペプチドを含有する 0.46-kbＢamＨＩ−Ｎ
siＩセグメントを有した。ＮsiＩ部位は、プロセッシン
グ部位（−１位）直前にアラニン残基のＧＣＡコドンを
含有した。
【００５７】プロテアーゼシグナルペプチドの最初の15
個のアミノ酸をコードする 43-マーの２つの合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて、プロテアーゼＢのシグナルペプ
チドをaph プロモーターからの発現用に改造した（図２
０）。合成オリゴヌクレオチドを、３通りの結合法で、
本実施例の教旨に従って、 aphプロモーターを含有する
0.40-kb ＢamＨＩ−ＮcoＩ断片（図１７）及びｐＰＰ
Ｏ．ＧのＢamＨＩ−ＭluＩベクター断片に連結した。そ
の結果生じた発現ベクターｐＡＰＯ．Ｇは、プロテアー
ゼＢシグナルペプチドをコードする配列に連結されたap
h プロモーターを含む 0.51-kb ＢamＨＩ−ＮsiＩセグ
メントと、蛋白質をコードする置換可能な配列を含む
0.03-kb ＮsiＩ−ＸbaＩセグメント（図９）とを有し
た。
個のアミノ酸をコードする 43-マーの２つの合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて、プロテアーゼＢのシグナルペプ
チドをaph プロモーターからの発現用に改造した（図２
０）。合成オリゴヌクレオチドを、３通りの結合法で、
本実施例の教旨に従って、 aphプロモーターを含有する
0.40-kb ＢamＨＩ−ＮcoＩ断片（図１７）及びｐＰＰ
Ｏ．ＧのＢamＨＩ−ＭluＩベクター断片に連結した。そ
の結果生じた発現ベクターｐＡＰＯ．Ｇは、プロテアー
ゼＢシグナルペプチドをコードする配列に連結されたap
h プロモーターを含む 0.51-kb ＢamＨＩ−ＮsiＩセグ
メントと、蛋白質をコードする置換可能な配列を含む
0.03-kb ＮsiＩ−ＸbaＩセグメント（図９）とを有し
た。
【００５８】実施例６ プロテアーゼＢシグナルペプチ
ドを用いた代替発現系の作製 蛋白質をコードする1.1-kb ＰstＩ−ＸbaＩ断片を含有
するプラスミドｐＰＣＭをＰstＩ及びＸbaＩで消化し、
その1.1-kb断片をｐＰＰ1 ベクターのＰstＩ部位及びＸ
baＩ部位に結合した。その結果生じたプラスミドｐＰＰ
1.ＰＣＭは、単一ベクター中にｐＰＣＭの1.1-kb Ｐst
Ｉ−ＸbaＩ断片に連結した、ｐＰＰ1 の0.49-kb Ｂam
ＨＩ−ＰstＩ断片を含有した。
ドを用いた代替発現系の作製 蛋白質をコードする1.1-kb ＰstＩ−ＸbaＩ断片を含有
するプラスミドｐＰＣＭをＰstＩ及びＸbaＩで消化し、
その1.1-kb断片をｐＰＰ1 ベクターのＰstＩ部位及びＸ
baＩ部位に結合した。その結果生じたプラスミドｐＰＰ
1.ＰＣＭは、単一ベクター中にｐＰＣＭの1.1-kb Ｐst
Ｉ−ＸbaＩ断片に連結した、ｐＰＰ1 の0.49-kb Ｂam
ＨＩ−ＰstＩ断片を含有した。
【００５９】異種蛋白質分泌用にプロテアーゼＢシグナ
ルをさらに修飾するため、プロテアーゼＢシグナルペプ
チドのカルボキシ末端の 9個のアミノ酸をコードする２
つの合成 26-マーオリゴヌクレオチドを用いる必要があ
った（図２１）。合成オリゴヌクレオチドを３通りの結
合法でｐＰＰ1 の 0.44-kb ＢamＨＩ−ＨaeII断片と、
ＢamＨＩ及びＰstＩで消化されたｐＰＰ1.ＰＣＭのベク
ター断片とに連結した。その結果生じたプラスミドｐＰ
ＰＯ．ＰＣＭは、プロテアーゼＢプロモータ及びシグナ
ルペプチドを含む 0.46-kbＢamＨＩ−ＰstＩセグメント
を有した。ＰstＩ部位はプロセッシング部位（＋１位）
直後にアラニン残基のＧＣＡコドンを含有した。
ルをさらに修飾するため、プロテアーゼＢシグナルペプ
チドのカルボキシ末端の 9個のアミノ酸をコードする２
つの合成 26-マーオリゴヌクレオチドを用いる必要があ
った（図２１）。合成オリゴヌクレオチドを３通りの結
合法でｐＰＰ1 の 0.44-kb ＢamＨＩ−ＨaeII断片と、
ＢamＨＩ及びＰstＩで消化されたｐＰＰ1.ＰＣＭのベク
ター断片とに連結した。その結果生じたプラスミドｐＰ
ＰＯ．ＰＣＭは、プロテアーゼＢプロモータ及びシグナ
ルペプチドを含む 0.46-kbＢamＨＩ−ＰstＩセグメント
を有した。ＰstＩ部位はプロセッシング部位（＋１位）
直後にアラニン残基のＧＣＡコドンを含有した。
【００６０】次いで、ｐＰＰＯ．ＰＣＭの1,6-kb Ｂam
ＨＩ−ＸbaＩ断片を、ｐＳＳ2 のＢamＨＩ−ＸbaＩベク
ター断片に結合した。その結果生じたプラスミドｐＰＰ
Ｏ−ＰＣＭ／Ｓ2 は、蛋白質をコードする合成ＤＮＡセ
グメントに連結されたプロテアーゼＢプロモーター及び
シグナルペプチドを、即ちｐＳＳ2 ベクター内のすべて
を含有した。
ＨＩ−ＸbaＩ断片を、ｐＳＳ2 のＢamＨＩ−ＸbaＩベク
ター断片に結合した。その結果生じたプラスミドｐＰＰ
Ｏ−ＰＣＭ／Ｓ2 は、蛋白質をコードする合成ＤＮＡセ
グメントに連結されたプロテアーゼＢプロモーター及び
シグナルペプチドを、即ちｐＳＳ2 ベクター内のすべて
を含有した。
【００６１】実施例５の教示に従って、 aphプロモータ
ーからの発現用に、ｐＰＰＯ．ＰＣＭ／Ｓ2 作製の際の
プロテアーゼＢシグナルペプチドを改造した。プロテア
ーゼＢシグナルペプチドの最初の15個のアミノ酸をコー
ドする 43-マーのオリゴヌクレオチドを、aph プロモー
ターを含有する 0.40-kb ＢamＨＩ−ＮcoＩ断片及びｐ
ＰＰＯ．ＰＣＭのＢamＨＩ−ＭluＩベクター断片に３通
りの結合方法で連結した。その結果生じた発現ベクター
ｐＡＰＯ．ＰＣＭは、プロテアーゼＢシグナルペプチド
をコードする配列に連結された aphプロモーターを含む
0.51-kb ＢamHI-PstＩセグメントを有した。
ーからの発現用に、ｐＰＰＯ．ＰＣＭ／Ｓ2 作製の際の
プロテアーゼＢシグナルペプチドを改造した。プロテア
ーゼＢシグナルペプチドの最初の15個のアミノ酸をコー
ドする 43-マーのオリゴヌクレオチドを、aph プロモー
ターを含有する 0.40-kb ＢamＨＩ−ＮcoＩ断片及びｐ
ＰＰＯ．ＰＣＭのＢamＨＩ−ＭluＩベクター断片に３通
りの結合方法で連結した。その結果生じた発現ベクター
ｐＡＰＯ．ＰＣＭは、プロテアーゼＢシグナルペプチド
をコードする配列に連結された aphプロモーターを含む
0.51-kb ＢamHI-PstＩセグメントを有した。
【００６２】便宜上、ベクターｐＡＰＯ．ＰＣＭ内にお
いて蛋白質をコードするＤＮＡセグメントを、0.8-kb
ＳacＩ−ＸbaＩ断片を欠失させることにより短縮した。
ベクターｐＡＰＯ．ＰＣＭをＳacＩ及びＸbaＩで消化
し、合成オリゴヌクレオチドＣＴＡＧＡＧＣＴに結合す
ることによりベクター断片を再環化した。その結果生じ
た発現ベクターｐＡＰＯ．ＳＸ（図１４）は、ＳacＩ部
位及びＸbaＩ部位の双方を保持するが、プロテアーゼＢ
シグナルペプチドをコードする配列に連結した aphプロ
モーターを含有する 0.51-kb ＢamＨＩ−ＰstＩセグメ
ントと、蛋白質をコードする置換可能な配列を含有する
0.32-kb ＰstＩ−ＸbaＩ（又はＰstＩ−ＳacＩ）セグ
メントとを有する。
いて蛋白質をコードするＤＮＡセグメントを、0.8-kb
ＳacＩ−ＸbaＩ断片を欠失させることにより短縮した。
ベクターｐＡＰＯ．ＰＣＭをＳacＩ及びＸbaＩで消化
し、合成オリゴヌクレオチドＣＴＡＧＡＧＣＴに結合す
ることによりベクター断片を再環化した。その結果生じ
た発現ベクターｐＡＰＯ．ＳＸ（図１４）は、ＳacＩ部
位及びＸbaＩ部位の双方を保持するが、プロテアーゼＢ
シグナルペプチドをコードする配列に連結した aphプロ
モーターを含有する 0.51-kb ＢamＨＩ−ＰstＩセグメ
ントと、蛋白質をコードする置換可能な配列を含有する
0.32-kb ＰstＩ−ＸbaＩ（又はＰstＩ−ＳacＩ）セグ
メントとを有する。
【００６３】実施例７ プロテアーゼＢ−エンドＨハイ
ブリッドシグナルペプチドを使用した発現系の作製 エンドＨシグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレプ
トミセス用のコドン使用法(Codon usage) を用いて、合
成ＤＮＡ配列を決定した。合成配列及びその相補鎖を６
つのオリゴヌクレオチドに分割した。これらのうち最初
の２つ、即ちＳ1.ＥＮＤ及びＳ2.ＥＮＤを aphプロモー
ターに連結させた（実施例11参照）。これらのうちその
次の４つ、即ちＳ3.ＥＮＤ〜Ｓ6.ＥＮＤは、エンドＨシ
グナルペプチドの残りの27個のアミノ酸をコードした
（図２２）。オリゴヌクレオチドＳ4.ＥＮＤ及びＳ5.Ｅ
ＮＤ（各2 μｇ）を、10ｍＭ Tris 塩酸 (pH7.5)、10ｍ
ＭＭｇＣｌ2 、 5ｍＭ ＤＴＴ、 0.5ｍＭ ＡＴＰ及び
５単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼを含有する20μ
ｌの反応液中で37℃で30分間、別々にリン酸化した。リ
ン酸化オリゴヌクレオチド（各10μｌ）を各々 1μｇの
非リン酸化Ｓ3.ＥＮＤ及びＳ6.ＥＮＤ、並びに 500ｍＭ
Tris 塩酸 (pH7.8)−100 ｍＭ ＭｇＣｌ2 3μｌと混
合して、最終容量を31μｌとした。90℃で10分間、オリ
ゴヌクレオチドのアニーリングを行い、その後12〜16時
間、室温に徐々に冷却した。アニールしたオリゴヌクレ
オチド（15μｌ）を、50ｍＭ Tris 塩酸 (pH7.8)、10ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 ， 1ｍＭ ＡＴＰ及び1600単位のＴ4 Ｄ
ＮＡリガーゼを含有する 200μｌの反応液中で、16℃で
４時間、ともに結合した。次いで、エンドＨシグナルペ
プチドをコードする完全合成遺伝子を、 aphプロモータ
ー、プロテアーゼＢシグナルペプチド、及び置換可能合
成なＤＮＡセグメントを含有する発現ベクターｐＡＰ
Ｏ．ＳＸのＭluＩ部位及びＰstＩ部位に結合した（図１
４）。これは、プロテアーゼＢシグナルのアミノ末端の
15個のアミノ酸をエンドＨシグナルのカルボキシ末端の
26個のアミノ酸に連結し、プロテアーゼＢ−エンドＨハ
イブリッドシグナルペプチドを形成した。ＰstＩ部位
は、シグナルペプチドの−１位にアラニンのＧＣＡコド
ンを含有する。その結果生じた発現ベクターｐＡＥＯ．
ＳＸは、プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナ
ルペプチドをコードする配列に連結した aphプロモータ
を含有する 0.52-kb ＢamＨＩ−ＰstＩ断片と、蛋白質
をコードする置換可能な配列を含有する 0.32-kb Ｐst
Ｉ−ＸbaＩ（又はＰstＩ−ＳacＩ）セグメントとを有し
た（図１１）。
ブリッドシグナルペプチドを使用した発現系の作製 エンドＨシグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレプ
トミセス用のコドン使用法(Codon usage) を用いて、合
成ＤＮＡ配列を決定した。合成配列及びその相補鎖を６
つのオリゴヌクレオチドに分割した。これらのうち最初
の２つ、即ちＳ1.ＥＮＤ及びＳ2.ＥＮＤを aphプロモー
ターに連結させた（実施例11参照）。これらのうちその
次の４つ、即ちＳ3.ＥＮＤ〜Ｓ6.ＥＮＤは、エンドＨシ
グナルペプチドの残りの27個のアミノ酸をコードした
（図２２）。オリゴヌクレオチドＳ4.ＥＮＤ及びＳ5.Ｅ
ＮＤ（各2 μｇ）を、10ｍＭ Tris 塩酸 (pH7.5)、10ｍ
ＭＭｇＣｌ2 、 5ｍＭ ＤＴＴ、 0.5ｍＭ ＡＴＰ及び
５単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼを含有する20μ
ｌの反応液中で37℃で30分間、別々にリン酸化した。リ
ン酸化オリゴヌクレオチド（各10μｌ）を各々 1μｇの
非リン酸化Ｓ3.ＥＮＤ及びＳ6.ＥＮＤ、並びに 500ｍＭ
Tris 塩酸 (pH7.8)−100 ｍＭ ＭｇＣｌ2 3μｌと混
合して、最終容量を31μｌとした。90℃で10分間、オリ
ゴヌクレオチドのアニーリングを行い、その後12〜16時
間、室温に徐々に冷却した。アニールしたオリゴヌクレ
オチド（15μｌ）を、50ｍＭ Tris 塩酸 (pH7.8)、10ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 ， 1ｍＭ ＡＴＰ及び1600単位のＴ4 Ｄ
ＮＡリガーゼを含有する 200μｌの反応液中で、16℃で
４時間、ともに結合した。次いで、エンドＨシグナルペ
プチドをコードする完全合成遺伝子を、 aphプロモータ
ー、プロテアーゼＢシグナルペプチド、及び置換可能合
成なＤＮＡセグメントを含有する発現ベクターｐＡＰ
Ｏ．ＳＸのＭluＩ部位及びＰstＩ部位に結合した（図１
４）。これは、プロテアーゼＢシグナルのアミノ末端の
15個のアミノ酸をエンドＨシグナルのカルボキシ末端の
26個のアミノ酸に連結し、プロテアーゼＢ−エンドＨハ
イブリッドシグナルペプチドを形成した。ＰstＩ部位
は、シグナルペプチドの−１位にアラニンのＧＣＡコド
ンを含有する。その結果生じた発現ベクターｐＡＥＯ．
ＳＸは、プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナ
ルペプチドをコードする配列に連結した aphプロモータ
を含有する 0.52-kb ＢamＨＩ−ＰstＩ断片と、蛋白質
をコードする置換可能な配列を含有する 0.32-kb Ｐst
Ｉ−ＸbaＩ（又はＰstＩ−ＳacＩ）セグメントとを有し
た（図１１）。
【００６４】実施例８ ＧＭ−ＣＳＦをコードする合成
遺伝子の作製 ストレプトミセスStreptomyces用のコドン選択法を用い
たＧＭ−ＣＳＦアミノ酸配列の逆翻訳により合成ＤＮＡ
配列を決定した。実施例７の教旨に従って、ともにアニ
ールされ、結合される16個のオリゴヌクレオチドの合成
に、このＤＮＡ配列及びその逆相補鎖(reverse complem
ent)を用いた。次いで、完全な 0.48-kb合成ＧＭ−ＣＳ
Ｆ遺伝子（図１）をｐＵＣ18の ＰstＩ部位及びＸbaＩ
部位に結合し、E. coliの形質転換に用いた。ＰstＩ部
位は−１位にアラニンのＧＣＡコドンを含有したが、こ
れはプロテアーゼＢ及びエンドＨの発現系と矛盾しな
い。プラスミドＤＮＡの制限分析により形質転換体をス
クリーニングした後、ＤＮＡ配列分析により、合成ＧＭ
−ＣＳＦ遺伝子が本物であることが確定された。
遺伝子の作製 ストレプトミセスStreptomyces用のコドン選択法を用い
たＧＭ−ＣＳＦアミノ酸配列の逆翻訳により合成ＤＮＡ
配列を決定した。実施例７の教旨に従って、ともにアニ
ールされ、結合される16個のオリゴヌクレオチドの合成
に、このＤＮＡ配列及びその逆相補鎖(reverse complem
ent)を用いた。次いで、完全な 0.48-kb合成ＧＭ−ＣＳ
Ｆ遺伝子（図１）をｐＵＣ18の ＰstＩ部位及びＸbaＩ
部位に結合し、E. coliの形質転換に用いた。ＰstＩ部
位は−１位にアラニンのＧＣＡコドンを含有したが、こ
れはプロテアーゼＢ及びエンドＨの発現系と矛盾しな
い。プラスミドＤＮＡの制限分析により形質転換体をス
クリーニングした後、ＤＮＡ配列分析により、合成ＧＭ
−ＣＳＦ遺伝子が本物であることが確定された。
【００６５】実施例９ プロテアーゼＢシグナルペプチ
ドを用いたＧＭ−ＣＳＦ用発現ベクターの作製 ｐＡＰＯ．ＧのＸbaＩ部位をＨinｄIII 部位に変換し
て、合成ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の挿入を容易にした。ベク
ターｐＡＰＯ．ＧをＸbaＩで消化し、その結果生じた線
状ベクター末端をＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片を
用いて塞ぎ、次いでＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて配列Ｃ
ＡＡＧＣＴＴＧのリン酸化ＨinｄIII リンカー(New Eng
land Biolabs) に結合した。65℃に加熱して反応を終結
させ、ＨinｄIII で消化した。次いで、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼを用いて、ＨinｄIII 末端を有する精製線状プラス
ミドを再環化した。その結果生じた発現ベクターｐＡＰ
Ｏ．Ｈは、プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードす
る配列に連結した aphプロモーターを含む 0.51-kb Ｂ
amＨＩ−ＮsiＩセグメントと、蛋白質をコードする置換
可能な配列を含む 0.03-kb ＮsiＩ−ＨinｄIII セグメ
ントとを有する。
ドを用いたＧＭ−ＣＳＦ用発現ベクターの作製 ｐＡＰＯ．ＧのＸbaＩ部位をＨinｄIII 部位に変換し
て、合成ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の挿入を容易にした。ベク
ターｐＡＰＯ．ＧをＸbaＩで消化し、その結果生じた線
状ベクター末端をＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片を
用いて塞ぎ、次いでＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて配列Ｃ
ＡＡＧＣＴＴＧのリン酸化ＨinｄIII リンカー(New Eng
land Biolabs) に結合した。65℃に加熱して反応を終結
させ、ＨinｄIII で消化した。次いで、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼを用いて、ＨinｄIII 末端を有する精製線状プラス
ミドを再環化した。その結果生じた発現ベクターｐＡＰ
Ｏ．Ｈは、プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードす
る配列に連結した aphプロモーターを含む 0.51-kb Ｂ
amＨＩ−ＮsiＩセグメントと、蛋白質をコードする置換
可能な配列を含む 0.03-kb ＮsiＩ−ＨinｄIII セグメ
ントとを有する。
【００６６】ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する、ｐＵＣ．
ＧＭＣＳＦの0.48−kb ＰstＩ−ＸbaＩ断片を、Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて、 aphプロモータを含有し、且つ
プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードするｐＡＰ
Ｏ．ＧのＢamＨＩ−ＰstＩベクター断片に結合した。そ
の結果得られた発現ベクターｐＡＰＯ．ＧＭＣＳＦ内
で、コードされたシグナルペプチドのカルボキシ末端を
コードされたＧＭ−ＣＳＦ蛋白質のアミノ末端に直接融
合する。
ＧＭＣＳＦの0.48−kb ＰstＩ−ＸbaＩ断片を、Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて、 aphプロモータを含有し、且つ
プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードするｐＡＰ
Ｏ．ＧのＢamＨＩ−ＰstＩベクター断片に結合した。そ
の結果得られた発現ベクターｐＡＰＯ．ＧＭＣＳＦ内
で、コードされたシグナルペプチドのカルボキシ末端を
コードされたＧＭ−ＣＳＦ蛋白質のアミノ末端に直接融
合する。
【００６７】実施例10 プロテアーゼＢ−エンドＨハイ
ブリッドシグナルペプチドを用いたＧＭ−ＣＳＦ用発現
ベクターの作製 ｐＡＥＯ．ＳＸのＸbaＩ部位を、実施例９の教旨に従っ
て、ＨinｄIII 部位に変換した。その結果生じた発現ベ
クターｐＡＥＯ．ＳＨは、プロテアーゼＢ−エンドＨハ
イブリッドシグナルペプチドをコードする配列に連結し
た aphプロモータを含む 0.52-kbのＢamＨＩ−ＰstＩセ
グメントと、蛋白質をコードする置換可能な配列を含む
0.32-kb ＰstＩ−ＨinｄIII （又はＰstＩ−ＳacＩ）セ
グメントを有する。
ブリッドシグナルペプチドを用いたＧＭ−ＣＳＦ用発現
ベクターの作製 ｐＡＥＯ．ＳＸのＸbaＩ部位を、実施例９の教旨に従っ
て、ＨinｄIII 部位に変換した。その結果生じた発現ベ
クターｐＡＥＯ．ＳＨは、プロテアーゼＢ−エンドＨハ
イブリッドシグナルペプチドをコードする配列に連結し
た aphプロモータを含む 0.52-kbのＢamＨＩ−ＰstＩセ
グメントと、蛋白質をコードする置換可能な配列を含む
0.32-kb ＰstＩ−ＨinｄIII （又はＰstＩ−ＳacＩ）セ
グメントを有する。
【００６８】ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有するｐＵＣ．Ｇ
ＭＣＳＦの0.48-kb ＰstＩ−ＨinｄIII を、 aphプロモ
ータを含有し、且つプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリ
ッドシグナルペプチドをコードするｐＡＥＯ．ＳＨのＰ
stＩ−ＨinｄIII ベクター断片に結合した。その結果得
られた発現ベクターｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ内で、コード
されたシグナルペプチドのカルボキシ末端をコードされ
たＧＭ−ＣＳＦ蛋白質のアミノ末端に直接融合する。
ＭＣＳＦの0.48-kb ＰstＩ−ＨinｄIII を、 aphプロモ
ータを含有し、且つプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリ
ッドシグナルペプチドをコードするｐＡＥＯ．ＳＨのＰ
stＩ−ＨinｄIII ベクター断片に結合した。その結果得
られた発現ベクターｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ内で、コード
されたシグナルペプチドのカルボキシ末端をコードされ
たＧＭ−ＣＳＦ蛋白質のアミノ末端に直接融合する。
【００６９】実施例11 エンドＨシグナルペプチドを用
いた発現系の作製 ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ中のシグナルペプチドのアミノ末
端を、実施例５の教旨に従って、0.44-kb ＢamＨＩ−Ｍ
luＩ断片を３通りの結合法で、ｐＡＰＨ．4 の0.40-kb
ＢamＨＩ−ＮcoＩ断片、並びにアニールされたオリゴ
ヌクレオチドＳ1.ＥＮＤ（ＣＡＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＣ
ＧＴＴＣＧＧＡＧＡ）及びＳ2.ＥＮＤ（ＣＧＣＧＴＣＴ
ＣＣＧＡＡＣＣＧＧＡＧＴＧＡＡ）で置換することによ
り、プロテアーゼＢからエンドＨに変えた。その結果生
じた発現ベクターｐＡＥＯ−1.ＧＭＣＳＦは、エンドＨ
シグナルペプチドをコードする配列に連結した aphプロ
モーターを含む 0.50-kb ＢamＨＩ−ＰstＩ断片を有し
た。
いた発現系の作製 ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ中のシグナルペプチドのアミノ末
端を、実施例５の教旨に従って、0.44-kb ＢamＨＩ−Ｍ
luＩ断片を３通りの結合法で、ｐＡＰＨ．4 の0.40-kb
ＢamＨＩ−ＮcoＩ断片、並びにアニールされたオリゴ
ヌクレオチドＳ1.ＥＮＤ（ＣＡＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＣ
ＧＴＴＣＧＧＡＧＡ）及びＳ2.ＥＮＤ（ＣＧＣＧＴＣＴ
ＣＣＧＡＡＣＣＧＧＡＧＴＧＡＡ）で置換することによ
り、プロテアーゼＢからエンドＨに変えた。その結果生
じた発現ベクターｐＡＥＯ−1.ＧＭＣＳＦは、エンドＨ
シグナルペプチドをコードする配列に連結した aphプロ
モーターを含む 0.50-kb ＢamＨＩ−ＰstＩ断片を有し
た。
【００７０】実施例12 プロテアーゼＢ−apr ハイブリ
ッドシグナルペプチドを用いたＧＭ−ＣＳＦ用発現ベク
ターの作製 apr シグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレプトミ
セスStreptomyces用のコドン使用法を用いて、合成ＤＮ
Ａ配列を決定した。プロテアーゼＢ−apr ハイブリッド
シグナルペプチド発現ベクターの作製には、プロテアー
ゼＢシグナルペプチドのアミノ酸15及び aprシグナルペ
プチドのカルボキシ末端の25個のアミノ酸をコードする
２つの合成オリゴヌクレオチド、 81-マーと 73-マーの
使用を必要とした（図２３）。合成オリゴヌクレオチド
をアニールし、次いで発現ベクターｐＡＥＯ．ＳＨのＭ
luＩ部位及びＰstＩ部位に結合した（図１１）。その結
果生じたプラスミドｐＡapr.ＳＨは、aph プロモータ、
プロテアーゼＢ−apr ハイブリッドシグナルペプチドを
コード化する配列、及び置換可能な合成ＤＮＡセグメン
トを含有した。プロテアーゼＢ−apr ハイブリッドシグ
ナルペプチドは、apr シグナルペプチドのカルボキシ末
端の25個のアミノ酸に連結したプロテアーゼＢシグナル
ペプチドのアミノ末端の15個のアミノ酸を含有する。
ッドシグナルペプチドを用いたＧＭ−ＣＳＦ用発現ベク
ターの作製 apr シグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレプトミ
セスStreptomyces用のコドン使用法を用いて、合成ＤＮ
Ａ配列を決定した。プロテアーゼＢ−apr ハイブリッド
シグナルペプチド発現ベクターの作製には、プロテアー
ゼＢシグナルペプチドのアミノ酸15及び aprシグナルペ
プチドのカルボキシ末端の25個のアミノ酸をコードする
２つの合成オリゴヌクレオチド、 81-マーと 73-マーの
使用を必要とした（図２３）。合成オリゴヌクレオチド
をアニールし、次いで発現ベクターｐＡＥＯ．ＳＨのＭ
luＩ部位及びＰstＩ部位に結合した（図１１）。その結
果生じたプラスミドｐＡapr.ＳＨは、aph プロモータ、
プロテアーゼＢ−apr ハイブリッドシグナルペプチドを
コード化する配列、及び置換可能な合成ＤＮＡセグメン
トを含有した。プロテアーゼＢ−apr ハイブリッドシグ
ナルペプチドは、apr シグナルペプチドのカルボキシ末
端の25個のアミノ酸に連結したプロテアーゼＢシグナル
ペプチドのアミノ末端の15個のアミノ酸を含有する。
【００７１】ＧＭ−ＣＳＦのアミノ末端の９個のアミノ
酸をコードする２つの合成オリゴヌクレオチド 21-マー
（ＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＧ）及び
２９−マー（ＴＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣ
ＧＧＧＣＧＧＧＴＧＣＡ）を用いることにより、合成Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ遺伝子をｐＡａｐｒ．ＳＨ発現ベクターに適
応させた。合成オリゴヌクレオチドをアニールし、次い
で３通りの結合法で、ｐＵＣ．ＧＭＣＳＦの 0.36-kb
ＳalＩ−ＨinｄIII 断片（図１）、並びにＰstＩ及びＨ
inｄIII で消化されたｐＡapr.ＳＨのベクター断片に結
合した。その結果得られた発現ベクターｐＡapr.ＧＭＣ
ＳＦ内で、コードされたシグナルペプチドのカルボキシ
末端を、コードされたＧＭ−ＣＳＦ蛋白質のアミノ末端
に直接融合する。
酸をコードする２つの合成オリゴヌクレオチド 21-マー
（ＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＧ）及び
２９−マー（ＴＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣ
ＧＧＧＣＧＧＧＴＧＣＡ）を用いることにより、合成Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ遺伝子をｐＡａｐｒ．ＳＨ発現ベクターに適
応させた。合成オリゴヌクレオチドをアニールし、次い
で３通りの結合法で、ｐＵＣ．ＧＭＣＳＦの 0.36-kb
ＳalＩ−ＨinｄIII 断片（図１）、並びにＰstＩ及びＨ
inｄIII で消化されたｐＡapr.ＳＨのベクター断片に結
合した。その結果得られた発現ベクターｐＡapr.ＧＭＣ
ＳＦ内で、コードされたシグナルペプチドのカルボキシ
末端を、コードされたＧＭ−ＣＳＦ蛋白質のアミノ末端
に直接融合する。
【００７２】実施例13 単一の転写開始部位を有する a
phプロモーターを用いたＧＭ−ＣＳＦ用発現ベクターの
作製 発現ベクターｐＡＰＯ．ＧＭＣＳＦをＳacIIで消化し、
その結果生じた断片をＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断
片で処理して平滑末端化した。次いで平滑末端をもつＳ
acII断片を、実施例２の教旨に従ってリン酸化ＢamＨＩ
リンカーに結合した。結合混合物をＢamＨＩ及びＨinｄ
III で消化して、 0.62-kb断片を精製した。次いで0.62
-kb ＢamＨＩ−ＨinｄIII 断片を、ＢamＨＩ及びＨinｄ
III で消化されたｐＡＰＯ．Ｈのベクター断片に結合し
た。その結果生じた発現ベクターｐＡ* ＰＯ．ＧＭＣＳ
Ｆは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列に連結されたプロ
テアーゼＢシグナルペプチドをコードする配列に連結し
た 0.12-kb aphプロモータセグメントを有した。
phプロモーターを用いたＧＭ−ＣＳＦ用発現ベクターの
作製 発現ベクターｐＡＰＯ．ＧＭＣＳＦをＳacIIで消化し、
その結果生じた断片をＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断
片で処理して平滑末端化した。次いで平滑末端をもつＳ
acII断片を、実施例２の教旨に従ってリン酸化ＢamＨＩ
リンカーに結合した。結合混合物をＢamＨＩ及びＨinｄ
III で消化して、 0.62-kb断片を精製した。次いで0.62
-kb ＢamＨＩ−ＨinｄIII 断片を、ＢamＨＩ及びＨinｄ
III で消化されたｐＡＰＯ．Ｈのベクター断片に結合し
た。その結果生じた発現ベクターｐＡ* ＰＯ．ＧＭＣＳ
Ｆは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列に連結されたプロ
テアーゼＢシグナルペプチドをコードする配列に連結し
た 0.12-kb aphプロモータセグメントを有した。
【００７３】実施例14 ＧＭ−ＣＳＦ発現系を有する
S. lividansの形質転換 S. lividans 66 のプロトプラストを形質転換に用い
た。S. lividans 66 の培養物を、 0.5％グリシンを含
むＹＥＭＥ培地（Hopwood ら，1985）中で30℃で40時間
増殖させた。開示の方法（Hopwood ら，1985）と同様に
して、採取した菌糸をリゾチームで処理してプロトプラ
ストを調製し、ミラクロス Miracloth（Calbiochem Hoe
chst）を通して濾過することにより精製した。プロトプ
ラスト(4×109 個) を発現ベクター(1μｇ) のプラスミ
ドＤＮＡで形質転換し、開示の方法（Hopwood ら，198
5）と同様にして、Ｒ2 ＹＥ平板上に接種した。30℃で2
2時間インキュベートした後、平板をチオストレプトン
（30μｇ／ml）を含有するSoftNutrient Agarで被覆
し、胞子形成が起こるまで、30℃でインキュベートし
た。
S. lividansの形質転換 S. lividans 66 のプロトプラストを形質転換に用い
た。S. lividans 66 の培養物を、 0.5％グリシンを含
むＹＥＭＥ培地（Hopwood ら，1985）中で30℃で40時間
増殖させた。開示の方法（Hopwood ら，1985）と同様に
して、採取した菌糸をリゾチームで処理してプロトプラ
ストを調製し、ミラクロス Miracloth（Calbiochem Hoe
chst）を通して濾過することにより精製した。プロトプ
ラスト(4×109 個) を発現ベクター(1μｇ) のプラスミ
ドＤＮＡで形質転換し、開示の方法（Hopwood ら，198
5）と同様にして、Ｒ2 ＹＥ平板上に接種した。30℃で2
2時間インキュベートした後、平板をチオストレプトン
（30μｇ／ml）を含有するSoftNutrient Agarで被覆
し、胞子形成が起こるまで、30℃でインキュベートし
た。
【００７４】実施例15 S. lividans 形質転換体の増殖 ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターで形質転換されたS. livida
ns 66 のコロニーを、チオストレプトン(5μｇ／ml) を
含有するＬＢ培地15ml中に接種し、32℃で65時間増殖さ
せた。15ml組織ホモジナイザー（Tenbroeck-Bellco）を
用いて培養物を分散させて、二次培養用接種材料として
用いた。ＬＢ培地 200ml＋チオストレプトン(5μｇ／m
l）を含有する 2ｌのバッフル付振盪フラスコに吸光度
（Ａ600)-.2 となるように接触し、環境シェーカー(240
rpm)中で２〜４日間、32℃でインキュベートした。増殖
０〜96時間目の間の適当な時点で培養物から10mlのアリ
コートを取り出した。乾燥重量測定に用いる菌糸を、 4
℃の臨床用遠心分離器中で4000rpm で10分間遠心分離し
て取り出した。ＧＭ−ＣＳＦを含有する分泌蛋白質を含
む上清画分を分析前に−20℃で凍結した。
ns 66 のコロニーを、チオストレプトン(5μｇ／ml) を
含有するＬＢ培地15ml中に接種し、32℃で65時間増殖さ
せた。15ml組織ホモジナイザー（Tenbroeck-Bellco）を
用いて培養物を分散させて、二次培養用接種材料として
用いた。ＬＢ培地 200ml＋チオストレプトン(5μｇ／m
l）を含有する 2ｌのバッフル付振盪フラスコに吸光度
（Ａ600)-.2 となるように接触し、環境シェーカー(240
rpm)中で２〜４日間、32℃でインキュベートした。増殖
０〜96時間目の間の適当な時点で培養物から10mlのアリ
コートを取り出した。乾燥重量測定に用いる菌糸を、 4
℃の臨床用遠心分離器中で4000rpm で10分間遠心分離し
て取り出した。ＧＭ−ＣＳＦを含有する分泌蛋白質を含
む上清画分を分析前に−20℃で凍結した。
【００７５】実施例16 ＧＭ−ＣＳＦ分泌のモニタリン
グ ＧＭ−ＣＳＦを含有する分泌蛋白質を含む実施例15に記
載の上清画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分析し、関係のある蛋白質を、蛋白質の特異染色法に
より染色するかあるいはWestern ブロッティングにより
分析して視覚化した。培養上清の 1.5mlのアリコート
を、最終濃度10％(w/v) となるようにトリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）の50％(w/v) 溶液（氷上）を添加し、更にそ
の結果得られた混合液を約 4℃で約15〜30分間インキュ
ベートすることにより凝集させた。ＧＭ−ＣＳＦを含有
する分泌蛋白質を含む生成沈殿物を、室温で５分間、最
大速度でEppendort 遠心器中で遠心分離して収集した。
2Ｎ ＮａＯＨを添加して、再懸濁ＴＣＡ沈殿物のpHを
サンプル緩衝液の pＨに調整するための変法を含めて、
Laemmli(1970）が記載の方法に従って、電気泳動用に沈
殿したサンプルを調製した。Laemmli(1970) が記載した
手順に従って、ポリアクリルアミドゲル（15％アクリル
アミド）に印加した。上記手順により分離した蛋白質の
プロフィルを、Coomassie Brilliant Blueで染色して視
覚化した（図２４）。
グ ＧＭ−ＣＳＦを含有する分泌蛋白質を含む実施例15に記
載の上清画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分析し、関係のある蛋白質を、蛋白質の特異染色法に
より染色するかあるいはWestern ブロッティングにより
分析して視覚化した。培養上清の 1.5mlのアリコート
を、最終濃度10％(w/v) となるようにトリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）の50％(w/v) 溶液（氷上）を添加し、更にそ
の結果得られた混合液を約 4℃で約15〜30分間インキュ
ベートすることにより凝集させた。ＧＭ−ＣＳＦを含有
する分泌蛋白質を含む生成沈殿物を、室温で５分間、最
大速度でEppendort 遠心器中で遠心分離して収集した。
2Ｎ ＮａＯＨを添加して、再懸濁ＴＣＡ沈殿物のpHを
サンプル緩衝液の pＨに調整するための変法を含めて、
Laemmli(1970）が記載の方法に従って、電気泳動用に沈
殿したサンプルを調製した。Laemmli(1970) が記載した
手順に従って、ポリアクリルアミドゲル（15％アクリル
アミド）に印加した。上記手順により分離した蛋白質の
プロフィルを、Coomassie Brilliant Blueで染色して視
覚化した（図２４）。
【００７６】Pharmacia Low Molecular Weight standar
dsと比較した場合、約15,500ダルトンの見掛けの分子量
を有して移動する、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む細胞中に
存在する新規の蛋白質バンドが認められる（第２４図に
矢印で示されている）。ＧＭ−ＣＳＦに対するモノクロ
ーナル抗体との交叉反応により、このバンドはＧＭ−Ｃ
ＳＦと同定された。ゲル電気泳動（第２５図）によって
分離された蛋白質のWestern ブロッティングによりこの
分析を行なったが、この場合、ＧＭ−ＣＳＦ形質転換体
中に見出された新規の蛋白質バンドは、ＧＭ−ＣＳＦす
ると抗体と交叉反応した。Burnette（1981）の改良法で
あるTowbinら（1979）の方法に従って、Western ブロッ
ティングを行った。
dsと比較した場合、約15,500ダルトンの見掛けの分子量
を有して移動する、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む細胞中に
存在する新規の蛋白質バンドが認められる（第２４図に
矢印で示されている）。ＧＭ−ＣＳＦに対するモノクロ
ーナル抗体との交叉反応により、このバンドはＧＭ−Ｃ
ＳＦと同定された。ゲル電気泳動（第２５図）によって
分離された蛋白質のWestern ブロッティングによりこの
分析を行なったが、この場合、ＧＭ−ＣＳＦ形質転換体
中に見出された新規の蛋白質バンドは、ＧＭ−ＣＳＦす
ると抗体と交叉反応した。Burnette（1981）の改良法で
あるTowbinら（1979）の方法に従って、Western ブロッ
ティングを行った。
【００７７】Coomassie Brilliant Blue染色ゲルとWest
ern ブロットの双方をスキャンさせることにより、ＧＭ
−ＣＳＦの分泌レベルの定量を行なった（表１）。Bio-
Rad蛋白質アッセイにより上清中の総蛋白質量を測定し
た。
ern ブロットの双方をスキャンさせることにより、ＧＭ
−ＣＳＦの分泌レベルの定量を行なった（表１）。Bio-
Rad蛋白質アッセイにより上清中の総蛋白質量を測定し
た。
【００７８】ＧＭ−ＣＳＦの分泌されたレベルは、ｐＡ
ＰＯ．ＧＭＣＳＦを含有するS. lividansで最高である
（レーン 9〜10）。単一の開始部位を有する aphプロモ
ーターを含有するｐＡ* ＰＯ．ＧＭＣＳＦに関しては、
わずかに低レベルの分泌ＧＭ−ＣＳＦが観察された。ｐ
ＡＰＯ．ＧＭＣＳＦ中のプロテアーゼＢシグナルペプチ
ドのカルボキシ末端の23個のアミノ酸 (レーン 5〜6)
を、ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ中のエンドＨシグナルペプチ
ドのカルボキシ末端の26個のアミノ酸 (レーン 1〜2)
で、又はｐＡapr.ＧＭＣＳＦの aphシグナルペプチドの
カルボキシ末端の25個のアミノ酸で置き換えると、分泌
されたＧＭ−ＣＳＦのレベルが約1/3 に低下した。しか
しながら、分泌されたＧＭ−ＣＳＦのレベルは、ｐＡＥ
Ｏ．ＧＭＣＳＦのプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッ
ドシグナルペプチドを用いた方が、ｐＡＥＯ−1.ＧＭＣ
ＳＦのエンドＨシグナルペプチドを用いた場合よりも高
かったが (レーン 7〜8)、これはハイブリッドシグナル
ペプチドが天然のシグナルペプチドよりも良いことを示
している。
ＰＯ．ＧＭＣＳＦを含有するS. lividansで最高である
（レーン 9〜10）。単一の開始部位を有する aphプロモ
ーターを含有するｐＡ* ＰＯ．ＧＭＣＳＦに関しては、
わずかに低レベルの分泌ＧＭ−ＣＳＦが観察された。ｐ
ＡＰＯ．ＧＭＣＳＦ中のプロテアーゼＢシグナルペプチ
ドのカルボキシ末端の23個のアミノ酸 (レーン 5〜6)
を、ｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦ中のエンドＨシグナルペプチ
ドのカルボキシ末端の26個のアミノ酸 (レーン 1〜2)
で、又はｐＡapr.ＧＭＣＳＦの aphシグナルペプチドの
カルボキシ末端の25個のアミノ酸で置き換えると、分泌
されたＧＭ−ＣＳＦのレベルが約1/3 に低下した。しか
しながら、分泌されたＧＭ−ＣＳＦのレベルは、ｐＡＥ
Ｏ．ＧＭＣＳＦのプロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッ
ドシグナルペプチドを用いた方が、ｐＡＥＯ−1.ＧＭＣ
ＳＦのエンドＨシグナルペプチドを用いた場合よりも高
かったが (レーン 7〜8)、これはハイブリッドシグナル
ペプチドが天然のシグナルペプチドよりも良いことを示
している。
【００７９】実施例17 ＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性試
験 軟質寒天中のコロニーの増殖を刺激する能力に関して細
胞を採点するメチルセルロースコロニー刺激アッセイに
より、分泌されたＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を測定し
た。要約すると、造血性コロニー刺激活性アッセイ用の
非付着性骨髄細胞を、Gregory とEaves(1977）が記載し
たのと同様にして、健康成人被験者から採取したサンプ
ルより調製した。アッセイ用に、細胞を終濃度約 5×10
4 細胞／mlとなるよう平板培養した。培地には、 Coulo
mbelら（1983）及び Cashmanら（1985）の報告と同様に
して、 0.8％メチルセルロース、30％ウシ胎児血清（Fl
ow）、1 ％脱イオン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Si
gma Chemical Co., セントルイス）、 0.1ｍＭ 2-メル
カプトエタノール、及びアルファ培地を含有させた。十
分な湿度を有する 5％ＣＯ2 含有空気中、37℃で一般に
7〜14日の期間の間、成長因子を含有する培地の存在中
で細胞をインキュベートした。反転顕微鏡下、その場で
コロニーを採点した。
験 軟質寒天中のコロニーの増殖を刺激する能力に関して細
胞を採点するメチルセルロースコロニー刺激アッセイに
より、分泌されたＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を測定し
た。要約すると、造血性コロニー刺激活性アッセイ用の
非付着性骨髄細胞を、Gregory とEaves(1977）が記載し
たのと同様にして、健康成人被験者から採取したサンプ
ルより調製した。アッセイ用に、細胞を終濃度約 5×10
4 細胞／mlとなるよう平板培養した。培地には、 Coulo
mbelら（1983）及び Cashmanら（1985）の報告と同様に
して、 0.8％メチルセルロース、30％ウシ胎児血清（Fl
ow）、1 ％脱イオン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Si
gma Chemical Co., セントルイス）、 0.1ｍＭ 2-メル
カプトエタノール、及びアルファ培地を含有させた。十
分な湿度を有する 5％ＣＯ2 含有空気中、37℃で一般に
7〜14日の期間の間、成長因子を含有する培地の存在中
で細胞をインキュベートした。反転顕微鏡下、その場で
コロニーを採点した。
【００８０】ｐＡＰＯ．ＧＭＣＳＦ及びｐＡＥＯ．ＧＭ
ＣＳＦの両方に関して生物学的活性の分析を行い（表
２）、どちらの場合にも、10％ヒト白血球コンディショ
ニング培地（ヒトＧＭ−ＣＳＦを含有）を用いて見出さ
れたのと同様の比率で、赤血球／混合大型コロニーの低
レベルの刺激とともに、顆粒球／マクロファージ型コロ
ニーの有意の刺激が実証された。
ＣＳＦの両方に関して生物学的活性の分析を行い（表
２）、どちらの場合にも、10％ヒト白血球コンディショ
ニング培地（ヒトＧＭ−ＣＳＦを含有）を用いて見出さ
れたのと同様の比率で、赤血球／混合大型コロニーの低
レベルの刺激とともに、顆粒球／マクロファージ型コロ
ニーの有意の刺激が実証された。
【００８１】
【表１】
【００８２】
【表２】
【００８３】実施例18 ＧＭ−ＣＳＦの精製 ポリアクリルアミドゲルからＧＭ−ＣＳＦを溶出するこ
とにより、ＧＭ−ＣＳＦを少量精製した。増殖の約24時
間目に上清蛋白質10mlを採取し、 4℃で臨床用遠心器
中、4000rpm で10分間遠心分離して菌糸を取り出した。
実施例16の教旨に従ってＧＭ−ＣＳＦを含有する上清蛋
白質を凝集し、Laemmli (1970)の方法に従い、但しサン
プル調製及びゲルの印加に関してはHunkapiller ら(198
3)の改良法に従って、15％ポリアクリルアミドゲル上を
移動させて分離した。Hunkapillerら(1983)が記載のゲ
ル溶出法によりＧＭ−ＣＳＦ蛋白質バンドを分離し、そ
の結果得られた蛋白質溶液を凍結乾燥により濃縮した。
実施例16の教旨に従って、溶出バンドの純度及び性質を
分析した。
とにより、ＧＭ−ＣＳＦを少量精製した。増殖の約24時
間目に上清蛋白質10mlを採取し、 4℃で臨床用遠心器
中、4000rpm で10分間遠心分離して菌糸を取り出した。
実施例16の教旨に従ってＧＭ−ＣＳＦを含有する上清蛋
白質を凝集し、Laemmli (1970)の方法に従い、但しサン
プル調製及びゲルの印加に関してはHunkapiller ら(198
3)の改良法に従って、15％ポリアクリルアミドゲル上を
移動させて分離した。Hunkapillerら(1983)が記載のゲ
ル溶出法によりＧＭ−ＣＳＦ蛋白質バンドを分離し、そ
の結果得られた蛋白質溶液を凍結乾燥により濃縮した。
実施例16の教旨に従って、溶出バンドの純度及び性質を
分析した。
【００８４】実施例19 ＧＭ−ＣＳＦのアミノ末端配列
の分析 実施例18の記載と同様に培養上清のサンプルから精製し
たＧＭ−ＣＳＦサンプルは、カナダのモントリオールの
the Institut de Recherche enBiotechnologieで分析さ
れた。Edman 自動分解循環法(EdmanとBegg，1967) を用
いるアプライドバイオシステムズApplied Biosystems社
製気相スクエネータ上でアミノ末端配列決定を行った。
蛋白質の最初の 9個のアミノ酸に関して得られた配列は
ＡＰＡＲＳＰＳＰＳであったが、これは予期したアミノ
酸配列と一致した。
の分析 実施例18の記載と同様に培養上清のサンプルから精製し
たＧＭ−ＣＳＦサンプルは、カナダのモントリオールの
the Institut de Recherche enBiotechnologieで分析さ
れた。Edman 自動分解循環法(EdmanとBegg，1967) を用
いるアプライドバイオシステムズApplied Biosystems社
製気相スクエネータ上でアミノ末端配列決定を行った。
蛋白質の最初の 9個のアミノ酸に関して得られた配列は
ＡＰＡＲＳＰＳＰＳであったが、これは予期したアミノ
酸配列と一致した。
【００８５】本発明の好ましい実施態様が詳細に記載さ
れているけれども、本発明の思想又は付記のクレームの
範囲を逸脱しない限りにおいての変更は可能であると、
当業者は理解されたい。
れているけれども、本発明の思想又は付記のクレームの
範囲を逸脱しない限りにおいての変更は可能であると、
当業者は理解されたい。
【００８６】図面に関しては、制限部位、デオキシリボ
核酸、ベクター、及び関連した情報を見分けるために種
々の短縮形を用いた。当業者が容易に認知できるよう
に、これらの成分すべてを確認するに際しては標準的用
語を用いた。
核酸、ベクター、及び関連した情報を見分けるために種
々の短縮形を用いた。当業者が容易に認知できるよう
に、これらの成分すべてを確認するに際しては標準的用
語を用いた。
【００８７】本発明の好ましい実施態様を、図面で説明
すると以下の通りである。
すると以下の通りである。
【図１】 ＧＭ−ＣＳＦをコードするＰstＩ−ＨinｄII
I 断片のＤＮＡ配列である。
I 断片のＤＮＡ配列である。
【図２】 ベクターｐＩＪ680 の特異的な入れ替え（al
teration）を示している。
teration）を示している。
【図３】 発現ベクターｐＡＰＯ．ＧＭＣＳＦの制限地
図である。
図である。
【図４】 挿入するＢamＨＩ−ＨinｄIII ＤＮＡ断片の
配列である。
配列である。
【図５】 挿入するＢamＨＩ−ＨinｄIII ＤＮＡ断片の
配列である。
配列である。
【図６】 発現ベクターｐＡＥＯ．ＧＭＣＳＦの制限地
図である。
図である。
【図７】 挿入するＢamＨＩ−ＨinｄIII ＤＮＡ断片の
配列である。
配列である。
【図８】 挿入するＢamＨＩ−ＨinｄIII ＤＮＡ断片の
配列である。
配列である。
【図９】 発現ベクターｐＡＰＯ．Ｇ（又はｐＡＰＯ．
Ｈ）の制限地図である。
Ｈ）の制限地図である。
【図１０】 挿入するＢamＨＩ−ＸbaＩ（又はＢamＨＩ
−ＨinｄIII ）ＤＮＡ断片の配列である。
−ＨinｄIII ）ＤＮＡ断片の配列である。
【図１１】 発現ベクターｐＡＥＯ．ＳＸ（又はｐＡＥ
Ｏ．ＳＨ）の制限地図である。
Ｏ．ＳＨ）の制限地図である。
【図１２】 挿入するＢamＨＩ−ＸbaＩ（又はＢamＨＩ
−ＨinｄIII ）ＤＮＡ断片の配列である。
−ＨinｄIII ）ＤＮＡ断片の配列である。
【図１３】 挿入するＢamＨＩ−ＸbaＩ（又はＢamＨＩ
−ＨinｄIII ）ＤＮＡ断片の配列である。
−ＨinｄIII ）ＤＮＡ断片の配列である。
【図１４】 発現ベクターｐＡＰＯ．ＳＸの制限地図で
ある。
ある。
【図１５】 挿入するＢamＨＩ−ＸbaＩ ＤＮＡ断片の
配列である。
配列である。
【図１６】 挿入するＢamＨＩ−ＸbaＩ ＤＮＡ断片の
配列である。
配列である。
【図１７】 aphプロモータを含むＢamＨＩ−ＮcoＩ
ＤＮＡ断片の配列である。
ＤＮＡ断片の配列である。
【図１８】 プロテアーゼＢプロモータを含有し、且つ
プロテアーゼＢシグナルペプチドとプロテアーゼＢプロ
−ペプチドのアミノ末端の10個のアミノ酸とをコードす
るｐＰＰＩのＢamＨＩ−Ｐst ＤＮＡ断片の配列であ
る。
プロテアーゼＢシグナルペプチドとプロテアーゼＢプロ
−ペプチドのアミノ末端の10個のアミノ酸とをコードす
るｐＰＰＩのＢamＨＩ−Ｐst ＤＮＡ断片の配列であ
る。
【図１９】 プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボ
キシ末端及びヒト成長ホルモンのアミノ末端をコードす
るＨaeII−ＸbaＩ ＤＮＡ断片の配列である。
キシ末端及びヒト成長ホルモンのアミノ末端をコードす
るＨaeII−ＸbaＩ ＤＮＡ断片の配列である。
【図２０】 プロテアーゼＢシグナルペプチドのアミノ
末端をコードするＤＮＡ断片の配列である。
末端をコードするＤＮＡ断片の配列である。
【図２１】 プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボ
キシ末端をコードするＨaeII−ＰstＩ ＤＮＡ断片の配
列である。
キシ末端をコードするＨaeII−ＰstＩ ＤＮＡ断片の配
列である。
【図２２】 エンドＨシグナルペプチドのカルボキシ末
端の27個のアミノ酸をコードするＭluＩ−ＰstＩＤＮＡ
断片の配列である。
端の27個のアミノ酸をコードするＭluＩ−ＰstＩＤＮＡ
断片の配列である。
【図２３】 aprシグナルペプチドのカルボキシ末端の
25個のアミノ酸をコードするＭliＩ−ＰstＩＤＮＡ断片
の配列である。
25個のアミノ酸をコードするＭliＩ−ＰstＩＤＮＡ断片
の配列である。
【図２４】 ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す写
真である。
真である。
【図２５】 Western ブロッティングによるＧＭ−ＣＳ
Ｆ分泌の分析結果を示す電気泳動の写真である。
Ｆ分泌の分析結果を示す電気泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (56)参考文献 特開 昭61−158782（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−502682（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−174396（ＪＰ，Ａ) ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲ ＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．169，ＮＯ８, （1987）Ｐ．3778−3784 ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．294（1981) Ｐ．176−178 ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．77，ＮＯ７ （1980）Ｐ．3988−3992
Claims (20)
- 【請求項１】 （ｉ） プロモーター配列、 （ii） シグナルペプチドをコードし、該プロモーター
配列に結合したＤＮＡシグナル配列であって、前記ＤＮ
Ａシグナル配列が、ストレプトミセスのプロテアーゼＢ
遺伝子由来ＤＮＡ、ストレプトミセスのプロテアーゼＢ
遺伝子由来ＤＮＡとストレプトミセスのエンド−β−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼＨ遺伝子由来ＤＮＡとの
ハイブリッド、又はストレプトミセスのプロテアーゼＢ
遺伝子由来ＤＮＡとバチルスズブチルスのアルカリ性プ
ロテアーゼ遺伝子由来ＤＮＡとのハイブリッドであるも
の、及び （iii） ヒト蛋白質をコードし、該シグナル配列に結
合したＤＮＡ配列を含み、該シグナル配列が、グリコシ
ル化されず、１つ以上のジスルフィド結合を有する形態
の該ヒト蛋白質のストレプトミセス属から選択した宿主
からの分泌を支配することができるものである、組換え
ＤＮＡ。 - 【請求項２】 前記ＤＮＡシグナル配列が、ストレプト
ミセスのプロテアーゼＢ遺伝子由来のＤＮＡとストレプ
トミセスのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼＨ遺伝子由来のＤＮＡとのハイブリッド、又はストレ
プトミセスのプロテアーゼＢ遺伝子由来のＤＮＡ及びバ
チルスズブチルスのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子由来
のＤＮＡとのハイブリッドである、請求項１に記載の組
換えＤＮＡ。 - 【請求項３】 前記ストレプトミセスのエンド−β−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼＨ遺伝子由来のＤＮＡ
が、少なくとも３１個のアミノ酸を含み、アミノ末端の
メチオニンから３０番目から３４番目のアミノ酸の間に
プロセッシング部位を有するシグナルペプチドをコード
する、請求項１又は２に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】 前記ストレプトミセスのプロテアーゼＢ
遺伝子由来のＤＮＡが以下のアミノ酸配列： 【化１】 の少くともアミノ末端部分をコードする、請求項１ない
し３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項５】 前記ストレプトミセスのエンド−β−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼＨ遺伝子由来のＤＮＡが
以下のアミノ酸配列： 【化２】 の少くともアミノ末端部分をコードする、請求項１ない
し４のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項６】 前記ストレプトミセスのエンド−β−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼＨ遺伝子由来のＤＮＡが
以下のアミノ酸配列： 【化３】 の少くともアミノ末端部分をコードする、請求項１ない
し４のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 前記ストレプトミセスのプロテアーゼＢ
遺伝子由来のＤＮＡが以下のアミノ酸配列： 【化４】 の少くともアミノ末端部分をコードする、請求項１、
２、３、５又は６に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項８】 前記シグナル配列が、ストレプトミセス
・グリセウス種由来のＤＮＡ、ストレプトミセス・プリ
カートス種由来のＤＮＡ、又はストレプトミセス・グリ
セウス種由来のＤＮＡ及びストレプトミセス・プリカー
トス種由来のＤＮＡのハイブリッドである、請求項１な
いし７のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項９】 前記シグナル配列が天然又は合成ＤＮＡ
を含む、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の組換
えＤＮＡ。 - 【請求項１０】 前記シグナル配列が野生型又は突然変
異型ＤＮＡを含む、請求項１ないし９のいずれか一項に
記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項１１】 前記シグナル配列にコードされたシグ
ナルペプチドの内の１７個のアミノ末端アミノ酸が、ア
ルギニン、リジン又はその両者を含む少なくとも７個の
アミノ酸を含むものである、請求項１ないし１０のいず
れか一項に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項１２】 前記ヒト蛋白質が顆粒球マクロファー
ジコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項１
ないし１１のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項１３】 前記ヒト蛋白質をコードするＤＮＡ配
列が図１に示されている、請求項１２に記載の組換えＤ
ＮＡ。 - 【請求項１４】 前記ヒト蛋白質が、インターロイキン
−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３，
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は細胞受容体
である、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の組
換えＤＮＡ。 - 【請求項１５】 前記ヒト蛋白質をコードするＤＮＡ配
列が天然又は合成又はそれらの組合せである、請求項１
ないし１４のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項１６】 前記プロモーター配列が多重プロモー
ター配列を含む、請求項１ないし１５のいずれか一項に
記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項１７】 前記プロモーター配列が、ストレプト
ミセスＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及びそ
れによる転写が可能な、ストレプトミセス・フラディア
のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子由
来の配列を含む、請求項１ないし１６のいずれか一項に
記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項１８】 請求項１ないし１７のいずれか一項に
記載の組換えＤＮＡが配置されている、ストレプトミセ
ス内の形質転換及び複写が可能なベクター。 - 【請求項１９】 ベクターがｐＳＳ２である、請求項１
８に記載のベクター。 - 【請求項２０】 請求項１８又は１９に記載のベクター
を有し培地中にヒト蛋白質を生産する能力を有するスト
レプトミセスの宿主。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA572956 | 1988-07-25 | ||
| CA000572956A CA1295567C (en) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte, macrophage-colony stimulating factor (gm-csf) and other heterologous proteins from streptomyces |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1192426A Division JP2711148B2 (ja) | 1988-07-25 | 1989-07-25 | ストレプトミセスからの遺伝子発現方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767663A JPH0767663A (ja) | 1995-03-14 |
| JP2688174B2 true JP2688174B2 (ja) | 1997-12-08 |
Family
ID=4138439
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1192426A Expired - Fee Related JP2711148B2 (ja) | 1988-07-25 | 1989-07-25 | ストレプトミセスからの遺伝子発現方法 |
| JP6054123A Expired - Fee Related JP2688174B2 (ja) | 1988-07-25 | 1994-03-24 | ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの生物活性ヒト顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びその他の異種蛋白質の分泌に関する発現系 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1192426A Expired - Fee Related JP2711148B2 (ja) | 1988-07-25 | 1989-07-25 | ストレプトミセスからの遺伝子発現方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0352707B1 (ja) |
| JP (2) | JP2711148B2 (ja) |
| AT (1) | ATE291629T1 (ja) |
| CA (1) | CA1295567C (ja) |
| DE (1) | DE68929531D1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR930701464A (ko) * | 1990-07-11 | 1993-06-11 | 스튜어트 알.슈터 | 이질성 단백질의 생성용 스트렙토마이세스 벡터 |
| FR2666588B1 (fr) * | 1990-09-10 | 1994-02-11 | Pasteur Institut | Sequence nucleotidique regulatrice de l'initiation de transcription. |
| JP2818146B2 (ja) * | 1996-06-20 | 1998-10-30 | 株式会社精工技研 | 光ファイバ端面研磨装置 |
| JP2787293B2 (ja) * | 1996-06-20 | 1998-08-13 | 株式会社精工技研 | 光ファイバ端面研磨装置 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| GB8315579D0 (en) * | 1983-06-07 | 1983-07-13 | Biogen Nv | Streptomyces expression systems |
| ATE67244T1 (de) * | 1984-07-06 | 1991-09-15 | Sandoz Ag | Herstellung und reinigung von lymphokinen. |
| US4745056A (en) * | 1984-10-23 | 1988-05-17 | Biotechnica International, Inc. | Streptomyces secretion vector |
| CA1295563C (en) * | 1985-11-01 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Production of active proteins containing cystine residues |
| CA1295566C (en) * | 1987-07-21 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Characterization and structure of genes for protease a and protease b from streptomyces griseus |
| AU1299988A (en) * | 1987-03-09 | 1988-10-10 | Cetus Corporation | Expression of heterologous genes in streptomyces species |
-
1988
- 1988-07-25 CA CA000572956A patent/CA1295567C/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-07-24 AT AT89113607T patent/ATE291629T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-24 DE DE68929531T patent/DE68929531D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-24 EP EP89113607A patent/EP0352707B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-25 JP JP1192426A patent/JP2711148B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-03-24 JP JP6054123A patent/JP2688174B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１６９，ＮＯ８，（１９８７）Ｐ．３７７８−３７８４ |
| ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．２９４（１９８１）Ｐ．１７６−１７８ |
| ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．７７，ＮＯ７（１９８０）Ｐ．３９８８−３９９２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0352707B1 (en) | 2005-03-23 |
| DE68929531D1 (de) | 2005-04-28 |
| JPH0286782A (ja) | 1990-03-27 |
| JPH0767663A (ja) | 1995-03-14 |
| JP2711148B2 (ja) | 1998-02-10 |
| ATE291629T1 (de) | 2005-04-15 |
| CA1295567C (en) | 1992-02-11 |
| EP0352707A2 (en) | 1990-01-31 |
| EP0352707A3 (en) | 1991-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5641663A (en) | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces | |
| US4977247A (en) | Immobilized protein G variants and the use thereof | |
| US5200327A (en) | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from streptomyces | |
| JP3730256B2 (ja) | 分泌シグナル遺伝子およびそれを有する発現ベクター | |
| EP0143836A1 (en) | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors | |
| EP0196864A2 (en) | Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, DNA sequences for use therein and cells transformed using such sequences | |
| NO311142B1 (no) | Fusjonerte proteiner og fremgangsmåte for enzymatisk spalting av rekombinante proteiner ved anvendelse av IgA-proteaser ogfremgangsmåte for fremstilling av rekombinant G-CSF | |
| NZ283214A (en) | Rh signal peptide used for improving secretion of ngf polypeptides and preparing met-less ngf polypeptides | |
| RU2232772C2 (ru) | Модифицированный колониестимулирующий фактор гранулоцитов человека и способ его получения, днк, экспрессирующий вектор | |
| US4956296A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| JP2023517162A (ja) | 枯草菌及びエンドヌクレアーゼを使用したヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の生成 | |
| JPH04211384A (ja) | 細菌ベクター | |
| US4954618A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| CA1295566C (en) | Characterization and structure of genes for protease a and protease b from streptomyces griseus | |
| Breitling et al. | Secretory expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis of human interferon α genes directed by staphylokinase signals | |
| US5082773A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| US5272254A (en) | Production of streptavidin-like polypeptides | |
| JP2688174B2 (ja) | ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの生物活性ヒト顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びその他の異種蛋白質の分泌に関する発現系 | |
| US5312901A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| Koller et al. | Recombinant Streptomyces lividans secretes a fusion protein of tendamistat and proinsulin | |
| EP0293391A1 (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein g and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein g | |
| DK175020B1 (da) | Fremgangsåde til udtrykkelse og ekstracellulær udskillelse af proteiner i G(-)bakterie, rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektor kodende herfor, samt G(-)bakterie indeholdende disse | |
| JP3689920B2 (ja) | マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産 | |
| EP1678308B1 (en) | Expression vector for secreting antibody fragment using e. coli signal sequence and method for mass-producing antibody fragment | |
| US5514590A (en) | Expression system comprising DNA encoding the signal peptide of protease B from Streptomyces griseus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |