JPH01124390A - 異種構造のポリペプチドの分泌を指令するクルイベロミセスα−因子先導配列を有するＤＮＡ構成体 - Google Patents

異種構造のポリペプチドの分泌を指令するクルイベロミセスα−因子先導配列を有するＤＮＡ構成体

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JPH01124390A
JPH01124390A JP63189552A JP18955288A JPH01124390A JP H01124390 A JPH01124390 A JP H01124390A JP 63189552 A JP63189552 A JP 63189552A JP 18955288 A JP18955288 A JP 18955288A JP H01124390 A JPH01124390 A JP H01124390A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換えＤＮＡの技術分野に属する。更に詳細に
は本発明は酵母の細胞の中で異種構造のポリペプチドの
分泌を指令するクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ）α−因子先導配列の使用に関する。
〔従来の技術〕
米国特許第４５６２０８２号明細書はサツカロミセス　
セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）のα−因子前駆体遺伝子について記載する
と共に異種構造の遺伝子の分泌発現に有用なＳ、セレビ
シェの先導配列のＤＮＡ構成体及び異種構造遺伝子を示
すことを企図している。
欧州特許出願０１１６２０１号明細書はヒトの表皮成育
因子の分泌発現を酵母細胞中で達成するためのＳ、セレ
ビシェα−因子先導配列の実際使用について記載してい
る。１９８３年８月１２日出願の係属中の米国特許出廓
第５２２９０９号明細書は異種構造品遺伝子の更に有効
な分泌発現の達成のために“スペーサー（切取部分）不
含有”のＳ、セレビシェα−因子先導配列の使用を記載
している。
サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）　　２２９
　：１２１９−１２２４）はプロキモリンの分泌を指令
するＳ、セレビシェα−因子配列の使用を報告している
。生成されたプロキモリンの大部分は分泌型ではなく。
細胞内での不溶型として存在していたことが報告された
。活性化可能のプロキモリンの分泌を指令するに当りイ
ンベルターゼ先導配列がより一そう有効であるけれども
、プロキモリン分泌をかなりの量で達成するには突然変
異体について法尻にスクリーニングを行なうことが必要
であった。
タルイベロミセス　ラクチス（Ｋ、１ａｃｔｉｓ）の細
胞群又は他のクルイベロミセス種による交配フェロモン
（ｍａｔｉｎｇ　ｐｈｅｒｏｍｏｎｅｓ）（α−因子及
びａ−因子）の産生については従前技術の開示は無い。
Ｋ、ラクチスの該ペプチドの同定の欠如の原因は部分的
にはに、ラクチスにおける交配が誘導不可能という事実
にもとづくかも知れない；これに反しＳ、セレビシェに
おいては交配フェロモンは構成的事由にもとづいて産生
される。
酵母による異種構造のポリペプチド分泌を指令するため
の上記の先導配列の利用可能性にもかかわらず特殊のポ
リペプチドをより効率的又はより実用的に産生ずる他の
配列に対する必要性が継続している。従って本発明者は
に、ラクチスα−因子が存在すること、もし存在するな
らば異種構造のポリペプチド、例えばプロキモリン、の
酵母中での分泌を指令するために有用であることの決定
について追求した。
〔発明の開示〕
本発明は異種構造のポリペプチドの酵母による分泌を指
令するためのクルイベロミセスα−因子先導配列にもと
づ＜　ＤＮＡ構成体を提供する。該ＤＮＡ構成体を有す
るクルイベロミセス形質転換体はポリペプチド、例えば
プロキモリン、を効率良く分泌する。
従って本発明の一態様は、タンパク質を異種構造ポリペ
プチドの中ヘブロセッシング（分子加工）するための酵
母のプロセッシングシグナル（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｓ
ｉｇｎａｌｓ）を介して、異種構造ポリペプチド配列へ
連結している分泌指令性のクルイベロミセスα−因子先
導配列を有するアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ
ードするＤＮＡ構成体を指向する。
本発明の他の態様は、宿主酵母の中に複製可能又は統合
可能な系を有する発現ベクターを指向すると共に、タン
パク質を異種構造ポリペプチドの中ヘブロセソシングす
るための酵母のプロセッシング用のシグナルを介して異
種構造ポリペプチド配列へ連結した分泌指令性クルイベ
ロミセスα−因子先導配列を有するアミノ酸配列を含有
するタンパク質をコードするＤＮＡ構成体を指向する。
本発明のなおその他の態様は、上記の発現ベクターを有
する酵母を、該異種構造ポリペプチドが“プロポリペプ
チド”として該酵母によって発現され分泌される条件、
及び該プロポリペプチドが異種構造ポリペプチドの中へ
少なくとも部分的にプロセッシングされる条件の下で、
培地中で生育させることから成る酵母の中で異種構造ポ
リペプチドを産生ずる方法を指向する。
本発明に従い“成熟した異種構造ポリペプチド”の産生
のために酵母細胞群が使用され、該ポリペプチドは普通
培地から直接収穫される。該ポリペプチドは、クルイベ
ロミセスα−因子先導体をコードするＤＮＡ構成体及び
目的の異種構造ポリペプチドに結合するプロセッシング
用シグナル配列の使用によって産生され、該ポリペプチ
ドはプロセッシング用のシグナル（複数）によって分別
された単数の異種構造ポリペプチドであるか又は複数の
異種構造ポリペプチドであり得る。得られた構成体はプ
レプロポリペプチドをコードし、該プレプロポリペプチ
ドはプレプロポリペプチドを分泌させるため、及びポリ
ペプチドを細胞内又は細胞外でプロセッシングして成熟
ポリペプチドを形成させるためのシグナル（複数）を有
する。
本発明の構成体はプロポリペプチドをコードするための
下式： ％式％） Ｃ但し式中Ｘはリジン又はアルギニンに関するコドンで
あり； Ｙはアルギニンに関するコドンであり；Ｗはアラニン又
はプロリンに関するコドンであり； Ｚはアミノ酸に関するコドンであるが好ましくはＷがプ
ロリンをコードする場合にはセリン、リジン又はアスパ
ラギンに関するコドンであってＷがアラニンをコードす
る場合にはグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン
酸又はセリンに関するコドンであり； ｙはモノマー及びマルチマー（ｗｕｌｔｉｍｅｒ）の生
成のために、少なくとも１、通常は１０以下、更に通常
の場合に４以下の数値であり； Ｇｅｎｅ　”は“宿主酵母に対して外来の先導配列であ
る先導配列”と組合された野生型クルイベロミセスα−
因子以外の遺伝子、通常は植物源又は哺乳動物源の遺伝
子であり； ｎはＯ又は一般に１〜８、通常は３〜７の範囲内で変化
する数値であり、好ましくは０である〕を有するＤＮＡ
配列を含有する。
上式においてＸ、Ｙ、Ｚ及びＷによってコードされるア
ミノ酸はα−因子プロセッシング用のシグナルを決定し
、この場合にＸ及びＹによってコードされるアミノ酸は
ペプチド開裂部位を決定し、Ｚ及びＷによってコードさ
れるアミノ酸はオリゴペプチド　スペーサーを決定する
。ｎはＺであり得るという事実で示される通り、スペー
サーの存在は任意である。もしスペーサーが存在するな
らば構成体は“スペーサーにより決定されるＮ−末端残
基の除去を許し、その結果Ｇｅｎｅ　”によってコード
される成熟タンパク質を生成させる追加の配列”を有す
ることが典型的である。
大部分については、本発明の構成体はプレプロポリペプ
チドをコードするための少なくとも下式；％式％） 〔但し式中りはプレプロポリペプチドの分泌を達成させ
るクルイベロミセス先導配列であり、その他の記号は前
定義の通りである〕を有する構成体である。プレプロポ
リペプチド分泌を達成するいかなるクルイベロミセス先
導配列も使用可能であり、該先導体配列は約２０〜１２
０個のアミノ酸、通常は約３０〜１００個のアミノ酸を
有し、疎水域を有すると共にそのＮ−末端にメチオニン
を有する。
先導配列しはタルイベロミセス属のいがなる菌種、例え
ばに、ラクチス及びに、フラジリス（Ｋ、ｆｒａｇｉｌ
ｉｓ）、の完全な長さのα−因子先導配列であってもよ
く、又は機能性（即ち分泌指令可能）の断片（フラグメ
ント）、突然変異体、伝統的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖ
ｅ）又は非伝統的のもの、通常は５以下、更に通常の場
合に３以下の数値をもつ異なるアミノ酸、或はそれらの
同族体であってよい。機能性断片は、野生型の種々の長
さの完全長の配列を有する構成体を調製して分泌指令能
についてそれらをスクリーニングすることによって同定
され得る。野生型のＫ。
ラクチスのα−因子に関する遺伝子配列は、第２図に示
されており、その先導配列はＤＮＡをコードするアミノ
酸１〜８３を有する。第２図のＤＮＡ配列は本来的（ｅ
ｓｓｅｎｔｉａｌ）ではない。機能性のクルイベロミセ
ス先導オリゴペプチドをコードするいかなる配列も充分
に使用され得る。種々の配列が多かれ少なかれ効率的に
翻訳され得る。酵母の好適なコドンの少な（とも大部分
が配列の中で使用されることが望ましい。
発現のためのカセット（定位直間移動ＤＮＡ配列）とし
て有用なりＮＡ配列を提供する場合に下式： ％式％） 〔但し式中Ｔｒは転写調節シグナルをコードするＤＮＡ
配列、特にプロモーター（促進シグナル）及びその他の
調節用シグナル例えばオペレーター（作動シグナル）、
アクチベーター（活性化シグナル）、キャップシグナル
（ｃａｐ　ｓｉｇｎａｌ）又は転写又は翻訳制御用のシ
グナルと共に含まれる他の配列であり； ｄはＯ又は１であってｙが１より大である場合に１であ
り； Ｔｒ配列は一般に少なくとも約１ｏｏｂｐであって約２
０００ｂｐ以下であり；その他の記号は前定義の通りで
ある〕 を有する配列を便利に使用し得る。特に有用なものは先
導配列りと連合するＴｒ配列であり、かようにしてＤＮ
Ａ断片は、宿主に対して内因性のシグナル配列と連合し
た転写用及び翻訳用シグナル配列として使用され得る。
或は別法として発現産生物の製造の増大のために他の転
写シグナル及び翻訳シグナルを使用し得る。
Ｇ　ｅｎｅ“の３′−末端は、構成体の独自の制御部位
の中へのＧｅｎｅ　”の挿入を許す該構成体の形状にお
いて、更に容易に操作され得る。かような好ましい構成
体は、Ｇ　ｅｎｅ”が挿入される制限部位を提供し、開
始コドンを有するフレーム（解読枠）をなしている。こ
の構成体は下式：（Ｔｒ）　−Ｌ　　ＸＹ　　（ＺＷ）
　、ｌ−（ＳＣ）　ｂ　−Ｔｅ〔但し式中既述と同じ記
号は前定義の通りであり； ａは０又は１であってこの構成体が転写シグナル及び翻
訳シグナルを有するか又は有しないことを表し； ＳＣは終止コドンを表し； Ｔｅは転写終止指定配列であって他のシグナル例えば多
連アデニル形式（ｐｏｌｙ　ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）
のシグナルであり；及び ｂは一般に約Ｏ〜４、更に通常の場合に０〜３の範囲内
で変化する数値であり、Ｇｅｎｅ　’″が独自の終止コ
ドンを有することを理解させるものである〕 によって記号化され得る。
Ｇｅｎｅ　”から上流に在る配列は、与えられた種（ス
ペシイス）のＧｅｎｅ　”が他の種のＧｅｎｅ　”によ
って代替されることを許すのに便利な制限部位を提供す
るために設計されたものである。必要に応じ該代替の達
成のためにリンカ−（結合手段）及びアダプター（受容
手段）を使用し得る。
本発明の構成体はベクターの中へ挿入されるための移動
可能な配列を提供するがこれは所望の複製系を提供する
。既述の通り或場合にはシグナル配列に連合した野生型
プロモーターを別異のプロモーターで代替させることが
望まれる。酵母の場合において解糖経路の中の酵素群を
有するプロモーターは高搏度の転写を達成し得る。これ
らのブ０％−ターは酵素群例えばホスフォグルコインメ
ラーゼ、ホスフォフラクトキナーゼ、ホスフォトリオー
スイソメラーゼ、ホスフォグルコミュターゼ、エノラー
ゼ、ピルピックキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲ
ナーゼと連合している。
これらのプロモーターはシグナル配列から上流の所で挿
入される。先導配列の５′側に存在する領域は維持され
るか又は他の代りのプロモーターの３′配列によって代
替され得る。ベクター（複数）が調製され得るがこれは
既述の構成体挿入のためのプロモーターから下流側にあ
る便利な制限部位を有するプロモーター（複数）を具え
ていることが報告されている。
最終の発現ベクターは発現カセット及び複製可能系又は
統合可能系を有するが液系は機能性であって宿主酵母中
に安定に保持される。該ベクターは、原核の中でクロー
ニングさせる複製系を任意に存する。更に選択のための
単数又は複数のマーカー（目印）を含有し、該マーカー
は宿主の中で保持されるための選択的加圧（ｓｅｌｅｃ
ｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を許す。更に該ベクター
は高度又は低度のコピイ数を有し、該コピイ数は一般に
約１〜２００の範囲内にある。高度コビイ数のベクター
は一般に少なくとも１０．好ましくは少なくとも２０、
通常は約１５０以下、更に通常の場合に約１００以下の
コピイ数を存する。Ｇｅｎｅ　”に依存するが高度コピ
イ数又は低度コビイ数が望ましく、これは宿主に対する
ベクターの効果に影響する。宿主の生育能に対して有害
な影響を及ぼすベクターの発現生成物が存在する場合に
は低度コピイ数が示されることがあり得る。
各種の宿主を使用し得るが特に所望の性質を具える突然
変異株を使用し得る。本発明の構成体の発現生成物の産
生速度に依存して、産生程度（レベル）におけるプロセ
ッシングのためにプロセッシング用酵母の使用が適当で
あるか又は適当でないかもしれないことを認識すべきで
ある。従ってプロセッシング用酵素（ジペプチジル　ア
ミノベブチターゼＡ及び／又はｌｙｓ−ａｒｇ−エンド
ペプチダーゼ）の産生増大をもたらす変異株を提供し得
るし、或はベクターの使用により酵素の産生増大を達成
し得る。一般に酵素産生は所望の発現産生物の産生より
も低いオーダーに止まるべきである。
別の場合として、細胞内のプロセッシングを望まない場
合があり得る。この場合には“分泌を生起させるけれど
も産生物をプロセッシングしない突然変異株”が有用で
ある。かようにして産生物をインビトロで順次工程でプ
ロセッシングし得る。
制御された調節による発現を提供する突然変異株の宿主
を有利に使用し得る。例えば融合によるタンパク質を発
現する本発明の構成体を用いる場合には形質転換体は融
合タンパク質の毒性の結果とみなされる遅い（緩徐な）
生育を示す。従って生育の過程において発現を阻止する
ことにより、発現のための自由置火な諸条件へ諸条件を
変更する以前に、宿主を高密度に生育させ得る。
更に既述の通りＧｅｎｅ　’″は複数の配列を重複しく
隣り合せ）て有してよく、配列は同−又は異なる配列で
あってよく、介在するプロセッシング用シグナルを有し
てもよい。かようにして産生物は全体的に又は部分的に
プロセッシングされ得るし、その結果、単独の又は重複
しく隣り合せ）でいる各種の配列を次工程のプロセッシ
ング用として得るであろう。多くの場合においては異な
る各種の配列を得ることが望ましく、該配列の夫々は成
る特別なタンパク質製品のサブユニットとなるわけであ
る。
Ｇｅｎｅ　′″は目的のいかなる型のポリペプチドをも
コードし得る。該ポリペプチドは８個のアミノ酸から成
る可及的に小さいオリゴペプチドであるか又はｉｏｏ、
ｏｏｏダルトン或はそれ以上を有するポリペプチドであ
り得る。通常は単一の連鎖が約３００．０００ダルトン
以下、更に通常の場合に約１５０．０００ダルトン以下
である。特別に有利な場合のポリペプチドは約５．００
０〜１５０．０００ダルトン、更に特別な場合に約５，
０００〜１００，０００ダルトンを有する。有利なポリ
ペプチドの例はホルモン及びファクター例えば生長ホル
モン、ソマトメジン及び表皮生育ファクター；内分泌性
分泌物例えば黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、
オキシトシン、インスリン、パップレシン、レニン、カ
ルシトニン、卵胞刺激ホルモン、プロラクチン及びその
他；血液産生因子例えばエリスロボイエチン、コロニイ
刺激因子及びその他：リンホカイン；グロビン；グロブ
リン例えば免疫グロブリン：アルブミン例えば血清アル
ブミン例えばヒト血清アルブミン；インターフェロン例
えばα、β及びδ型のもの；リプレッサー（抑制物質）
；酵素例えばキモシン又はそのチモゲン、α−及びβ−
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、キシラ
ナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、リパー
ゼ、ホスフォリパーゼ及びその他；エンドルフィン例え
ばβ−エンドルフィン、エンセファリン、グイノルフィ
ン及びその他を包含する。
本発明の構成体を有するベクターを調製した後に該ベク
ターを宿主酵母の中へ導入する。酵母の属及び種は臨界
的でない。酵母宿主の例はタルイベロミセス属及びサツ
カロミセス属である。導入方法は慣用方法である。酵母
宿主中へのＤＮＡ導入のためには各種の方法がある。文
献〔例えば旧ｎｎｅｎ　　ｅｔ　　ａｌｌ　Ｐｒｏｃ、
　　Ａｃａｄ、　Ｎａｔｌ、　　Ｓｃｉ、　　　ＵＳＡ
（１９７８）７５：１９１９−１９３３又はＤａｓｅｔ
　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　（１９８
４）１５８　：１１６５−１１６７又はＳｔｉｎｃｈｃ
ｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ、。
ＥＰＡ　　ＯＯ４５５７３）参照のこと。得られた形質
転換体は次にこれを適宜の普通培地に生育させ、この場
合に適宜の選択的加圧を形質転換体上に維持させる。発
現を誘導するに当り酵母を高密度に生育させることが可
能であり、次いで発現を誘導する。かような場合におい
て実質的比率の産生物を周辺質領域に保持させてよく。
酵素例えばチモラーゼ又はリチカーゼを用いて酵母細胞
群を処理することにより産生物を放出させ得る。
産生物を便宜の手段、例えばクロマトグラフィによるタ
ンパク質精製、電気泳動、透析、溶媒−溶媒抽出等によ
って収穫し得る。
下文においてはに、ラクチスも例示されるが、ここでは
タルイベロミセス属の種からのα−因子をコードする遺
伝子を得るために遂行し得る操作を述べると下記の通り
である。第１図の構造を有する放射性物質の標識をもつ
オリゴヌクレオチドのプローブ（探索子）を調製してこ
れを他の菌株からの染色体のＤＮＡの切断物を探索する
ために使用した。別法としてはＳ、セレビシェのα−因
子遺伝子のニックトランスレーションによって生成され
た断片（ｎｉｃｋ　ｔａｎｓｌａｔｅｄ　ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ）をプローブとして使用し得る。有用な一技法とし
ては染色体のＤＮＡの制限されたエンドヌクレアーゼに
よる切断物からのセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）をプラ
スミドの中へ挿入してこれらのプラスミドを大腸菌（Ｅ
。
ｃｏｌｉ）又はその他の細菌株の形質転換のために使用
して、プラスミドのライブラリィ　（保存庫）を得るの
である。次いでコロニイからのＤＮＡとプローブとをニ
トロセルロース濾紙上で便宜にハイブリダイゼーション
（雑種分子形成）させ得る。
上記のようにプローブとのハイブリダイゼーションによ
って同定されたセグメントを各種の制限酵素により切断
し、得られた断片について、サザンプロット（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）法又は類似の分析法に従い、ＤＮ
Ａ配列分析に適する寸法の制限断片を同定するための同
種の雑種分子形成プローブを用いて分析する。次に、同
定された断片を精製し、ＤＮＡ配列分析用として充分量
のＤＮＡを調製するために適宜なベクターを用いてクロ
ーニングを行なう。
上記の諸技法の使用下に、本発明で特異的に同定された
菌株以外の菌株からクルイベロミセスα−因子遺伝子を
得ることが可能である。
〔発明の効果〕
本発明に従い、産生物収量の著大な増加、精製操作の単
純化、所望製品の劣化の最少化、及びプロセッシング、
装置及び機械等の要請に関する単純化の達成のために法
尻な種類のポリペプチド分泌物を提供し得る。更に生産
性にもとづく栄養素の利用性を増加させるので、より経
済的でより効率的なポリペプチド製造を達成し得る。し
かも酵母の使用は原核と共に存在するかもしれない内毒
素を回避し、長い年代にわたって発達した既知の酵母発
酵技術（この技術は酵母産物の単離技術を含む）を使用
することによる多（の利益をもたらす。
〔実施例〕
下記の諸例は本発明の例示する。該諸例はいかなる方式
においても本発明の範囲を限定するものではないことを
当業者は理解すべきである。
炎上　Ｋ、−クチスα−の−　　び゛ 供試菌株としてＳ、セレビシェＭａｔ　ａ　５ｓｔ２−
３菌株ＲＣ６８７を使用するユリウス等の記載（Ｊｕｌ
ｉｕｓｅｔａｌ、、Ｃｅ１ｌ（１９８３）３２　：　８
３９）のようにして、培養物の上澄液について生物学的
試験を行なった。０．５％グルコース、０．１７％酵母
用含チッ素塩基（硫酸アンモニウム不含有）（Ｄｉｆｃ
ｏ）　、０．００２％硫酸アンモニウムから成る培地上
にに、ラクチス菌株ＣＢ５１４１（α）を生育させた。
遠心分離によって細胞群を取出した後に培養物上澄液に
対して酢酸を濃度０．１Ｍになるまで加えてこの培養物
上澄液をビオレクス（Ｂｉ。
−Ｒｅｙ、　７０　（Ｂｉｏｒａｄ）　Ｅのコラムへ通
過サセタ。コラムを０，１Ｍ酢酸で洗ってからα−因子
を８０％Ｅｔ０１（／　１０　ｍＭ　　ＨＣｊ２を用い
て溶出した。溶出液を蒸発乾燥してから０．１％　ＴＦ
Ａ／２０％アセトニトリルに溶かし逆相ＨＰＬＣコラム
（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ　ＨＰＬＣｇｕａｒｄ　
ｃｏｌｕｍｎ）にかけた。このコラムを０．１％ＴＦＡ
及び２０％、４０％、６０％並びに８０％アセトニトリ
ルを含む各溶液を用いて順次に洗浄した。次にα−因子
活性を呈する６０％アセトニトリルのフラクションを分
析用ｃ−１８ＨＰＬＣコラムで処理し、０．１％ＴＦＡ
中の２０％〜８０％アセトニルの勾配溶液を用いて溶出
した。各フラクションを集めてα−因子活性を検した。
α−因子含有フラクションを乾燥し、分析装置（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　ｇａｓ　　ｐｈ
ａｓｅ　　ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　　Ｍｏ
ｄｅｌ　　４７ＱＡ　　ｃｏｕｐｌｅｄ　　ｔｏ　　Ｍ
ｏｄｅ１１２０　　Ａ　　ＰＴＨａｎａｌｙｚｅｒ）を
用いてアミノ酸配列について分析した。
玉　プラスミド　ライブラリィの交雑スクリーニング（
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）γ
（”Ｐ）−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを
用いてオリゴヌクレオチドのプール（ｐｏｏｌｓ）を標
識した。これらのオリゴヌクレオチドプローブをサザン
プロット法について、又は下記構成： ４ＸＳＳＣ，５０ｍＭ　　ＫＨｚＰＯｔ　　ｐＨ７，１
％サルコシル、１０％デキストラン硫酸塩、２００μｇ
／ｍｌｌの音波処理され、変性されたサケ精子のＤＮＡ
をもつ交雑用溶液中の４２℃における細菌コロニイにつ
いて探索するために使用した。フィルターを２ＸＳＳＣ
，０，１％ＳＤＳ中で４２℃において洗浄した。
＞５ｏｏｏｂｐの断片を精製するために大きさによって
分別されたに、ラクチス菌株Ｓ　Ｄ　１１　（ｔｒｐＨ
ａｃ４）からの染色体ＤＮＡの制限された５ａｕ３Ａ＋
切断物から得られた挿入物を含有するクローニング用ベ
クターｐＪｓ１０９（このｐＪｓ１０９の代りに例えば
ｐＵｃ１８及びｐＢＲ３２２のような他の標準的クロー
ニング用ベクターを使用してもよい）の中でプラスミド
ライブラリィを、１００μｇ／ｍ　（ｌのアムピシリン
を含むＬ−’ＪＪ天の８鶴の平板１個当り５００〜２０
００個のコロニイの密度において大腸菌（Ｅ、コリ）菌
株　ＨＢｌｏｌの平板培養形質転換体によるプローブを
用いてスクリーニングした。これらのコロニイからＤＮ
Ａをニトロセルロースフィルターへ移しこれらのフィル
ターについて既述のようにして交雑を行なった。フィル
ター上の交雑シグナルの領域に対応する元の平板培養上
の領域を採取して再度平板培養を行なってから交雑によ
る再度のテストを行ない、かようにして交雑配列を含む
プラスミドを存する単一のコロニイ　（複数）を単離し
た。陽性を示すコロニイについて更に、小規模培養物か
ら精製されたＤＮＡに関するサザンプロット分析法によ
ってテストを行なった。
交雑陽性コロニイから精製されたプラスミドを各種の制
限酵素を用いて切断し、得られた断片を、同じ交雑用プ
ローブを用いるサザンプロット分析法によって分析した
。これはＤＮＡ配列の分析に適切な大きさをもつ制限断
片を同定するためである。かようにして同定された断片
をアガロースゲル電気泳動法によって精製し、適宜のＭ
Ｐ１８ベクター及びＭＰ１９ベクターへクローニングし
てＤＮＡ配列分析を行なった。
■主　ａ　立　　の　ゞゝのキモシン 遠心分離によって細胞群を培養物から分離し、得られた
上澄液をＬＭ　　ＨｇＳＯ４の添加によってｐＨ２とな
るまで酸性化し、室温下に２時間恒温を保持させた。次
に２Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）塩基添加により、この溶液
をｐＨ６にまで中和した。１０ｍＭＣａα２中の乾燥脱
脂乳（１２％）の懸濁物（２００μｍ）に対して、上記
中和液の適宜の希釈物（容積５０μｌ）を添加し、凝塊
が形成されるまで３７℃に恒温保持させた。１単位のキ
モシン活性は上記条件下に１０分間放置した際の凝塊生
成に要する活性キモシン量として定義される。
孤り跋験猪来 に、ラクチスα−因子の最初の１０個のアミノ酸はＳ、
セレビシェからのα−因子（６個の残基を有する）と決
定的な相同を示した。この配列は下記の通りである： Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ上記のタンパク質アミノ
酸配列を、第１図に示す構造遺伝子に相補的であること
が推論される１セツトのオリゴヌクレオチドの製造計画
のために使用した。α−因子ペプチドのセグメント（区
域）に対応する可能なすべてのコドンを有するオリゴヌ
クレオチド（複数）を２個のプール（ｐｏｏｌｓ）の９
６及び４８個の異なる分子として合成した。
γ　（”Ｐ）−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いて上記の２個のプールを放射性標識し、これら
の夫々をに、ラクチスＤＮＡの制限切断に関するサザン
プロット分析の探索に使用した。
プール２は数個の異なる切断物における単一断片に対し
て強い交雑を与えたことが見出された。よってプール２
かに、ラクチス染色体ＤＮＡのプラスミドライブラリィ
のスクリーニングのために選択された。
プラスミドライブラリィのストリーニング用の上記のプ
ローブの使用によって数多の交雑されたクローンが単離
された。これらのクローンの中のひとつについてのＤＮ
Ａ配列分析の結果、Ｓ、セレビシェα−因子ペプチドの
前駆体と著しく類似するα−因子−関連ペプチドをコー
ドすることが証明された。交雑セグメントは約１０００
ｂｐのＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ断片上にあることが見出さ
れた。この断片の該配列を第２図に示す。
この断片の推論されたα−因子前駆体に関する比較を第
３及び４図に示す。図から判る通り、両者はかなりの相
同性をもつ同じ長さの先導配列（第３図のアミノ酸１−
８３）を有する。けれどもに、ラクチス前駆体はＮ一連
結炭水化物鎖の添加のための部位を２個だけ有するに過
ぎない（第４図）。Ｋ、ラクチスの反復鎖のスペーサー
はＳ、セレビシェの反復鎖のスペーサーよりも長く、Ｓ
、セレビシェに見出されるＧｌｕ／Ａｓｐ−Ａｌａを有
するのではなく、パターンＸ−Ａｌａ／Ｐｒｏを有する
異なる配列を示す。ＤＮＡ配列（第５図）と比較すると
コードする領域の全体を通じて強度の相同性をも示して
いる。
第６図に示される一連のプラスミドは、強いプロモータ
ーの転写制御の下で発現されたプロキモリンに対するに
、ラクチスα−因子先導体の融合を行なわせるために構
成されたものである。先ず第一に、αｆｋ１８ｂからの
６７３ｂｐの５ｓｐｌ−ＥｃｏＲＩ断片を、フレナラ酵
素（Ｋｌｅｎｏｗ　　ｅｎｚｙｍｅ）によるＥＣ０ＲＩ
の懸垂物の充満によって、及び付着末端に対するＢｇｌ
　Ｉ　Ｉのリンカ−（結合鎖）の添加によって修飾した
。次にこの断片をＢｇｌ　Ｉ　Ｉの部位に挿入してＳ、
セレビシェのグリセルアルデヒド−３−ホスフェート　
デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ）のプロモーター領域
とターミネータ−領域とを結合させた。このカセットを
ｐｕｃ　１８中のＢａｍＨＩ断片としてクローニングし
てｐＡＢ３０７を得た。
次にα−先導体をコードする配列とウシのプロキモリン
をコードする配列とを融合させた。先ずｐＡＢ３０７を
Ｎｃｏ　Ｉを用いて切断し、粘性末端をマング豆（ｍｕ
ｎｇ　ｂｅａｎ）のヌクレアーゼによって処理すること
で鈍化させた。次に、得られた産生物を５ａｌｌを用い
て切断した。これに対して２０００ｂｐ　　ＥｃｏＲＶ
　−Ｓａｌ　Ｉ断片（第７及び８図に示された配列）を
連結させた。該ＥｃｏＲＶ−３ａｌ　Ｉ断片はプロキモ
リンをコードする配列とＳ、セレビシェＧＡＰ転写用の
終了領域をコードする配列とを有する断片である。この
断片をプラスミドｐＪＳ１１１から誘導したがその場合
にＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩアダプターを、Ｓ、セレビ
シェＧＡＰ転写終止領域に融合したプロキモリン　ｃＤ
ＮＡを有する断片の５′末端に対して添加した。この連
結混合物を使用して大腸菌（Ｅ、コリ）菌株ＨＢ　Ｌ　
０１を形質転換させ、プラスミドｐＡＢ３０９を有する
形質転換体を単離した。この融合体の結合周辺の配列を
第７図に示し、ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉの挿入された
ｐＡＢ３０９の全体の配列を第８図に示す。
Ｋ、ラクチス株の形質転換の達成のために、Ｋ、ラクチ
スＬＡＣ４の３′領域の中に挿入されたＳ。
セレビシェＡＤＨ１プロモーターの転写制御の下でＥ、
コリのカナマイシン抵抗性遺伝子を有する３５６０ｂｐ
　　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片をｐＡＢ３０９の中へ挿入し
てプラスミドｐＡＢ３１２を得た。挿入のためのスクリ
ーニングを制御切断分析によって遂行し、正確なオリエ
ンテーションのためのチエツクを行なった。
該３５６０ｂｐ　　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片はプラスミド
ｐＧＢ９０１から誘導され、それを第９図に示す。
プラスミドｐＧＢ９０１は、（１１ｐＵｃ１ａ５６　（
下文参照）から単離されたラクターゼＡＴＣ出発コドン
から約−９０の位置にあるラクターゼ　プロモーターを
有する３　・６ｋｂ　　ＸｂａＩ　−ＨａｅＩ　Ｉ断片
、（２）下記のヌクレオチド配列を有するＨａｅｌＩ−
３ａｉｌ断片： 、　　　← Ｑ 、　　　υ ｒ５２１５ ０つ （３）プロキモリンとｐＧＢ９００（下文参照）からの
抗生物質Ｇ４１８に対する抵抗性を付与する遺伝子とを
コードする５　−１ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断
片、及び（４）ＸｂａＩを用いる開裂されたｐＵＣ１９
、を、連結することによって構成された。
上記のプラスミドの構成に際し、ＨａｅＩＩ部位からの
ＣＧ配列は不注意に除去されたので、この位置にＨｉｎ
ｄ　　ｒ　Ｉ　Ｉ部位が生成された。
プラスミドｐＵｃ１ａ５６は下記のようにして構成され
た。クロモソームのＤＮＡをに、ラクチス菌株ＣＢ、５
２３６０から単離し、ＸｈｏＩを用いて開裂させ、ショ
糖勾配上で大きさに従って分別した。
ラクトース遺伝子を有するフラクションを、ニトロセル
ロースフィルター上にＤＮＡをスポットシた後にＬＡＣ
４プローブを用いて検出した。ＬＡＣ４遺伝子を有する
ＤＮＡをプラスミドｐＰＡ　１５３−２１５　ＣＰ、　
Ｍ、　Ａｎｄｒｅｏｌｉ、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ。
（１９８５）１９９：３７２−３８０３のＸｈｏＩ部位
の中へクローニングさせてプラスミドｐＰＡ３１を得た
。ラクトース遺伝子を有するｐＰＡ３１のＸｂａ　Ｉ断
片をｐＵＣ１９〔Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎｅｔａ
ｌ、、　　　Ｇｅｎｅ（１９８５）　　　３３　　：１
０３−１１９）のＸｂａＩ部位の中へ二次的にクローニ
ングさせ、かようにしてプラスミドｐＵｃｌａ５５を産
生させた。
プラスミドｐＧＢ９００は、（１）Ｇ４１８抵抗性遺伝
子を有するプラスミドｐＧＢ　Ｔｅ　０４１８（第１Ｏ
図及び下文参照）からの３・６　ｂｐ　　Ｈ１ｎｄＩＩ
Ｉ−ＸｂａＩ断片及び（２）ＳａｌＩ及びＸｂａＩによ
って開裂されたｐＵｃｌ−９の中゛にプロキモリン遺伝
子を有するプラスミドｐＧＢ”１２３からのＳａｌ　Ｉ
　−Ｈｌｎｄ　　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片、を連結することによ
って構成された。
プラスミドｐＧＢ　Ｔｅ　０４１８　（第１０図）はプ
ラスミドｐＰ　Ａ　２１５　（Ａｎｄｒｅｏｌｉ、　Ｍ
ｏｌ。
Ｇｅｎｅ、　　Ｇｅｎｅｔ、　　（１９８５）１９９：
３７２−３８０参照〕及び３　・７ｋｂ　　ＢａｍＨＩ
　　Ｋ、ラクチスラクターゼターミネータ−断片（Ｂｒ
ｅｕｎｉｎｇ　ｅｔａｔ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）　　１２　：２３２７−２
３４１〕とＴｎ　　５遺伝子ＣＲｅ１ｓｓ　ｅｔａｌｌ
、ＥＭＢＯＪ、（１９８４）３：３３１７−３３２２］
とから成る５・５ｋｂ断片から構成され、酵母からのプ
ロモーター　アルコール　デヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ
Ｉ）の指令の下に０４１８に対する抵抗性を与えられて
いるがこれは文献の記載〔ＢｅｎｎｅｔＺｅｎａｎｄ　
Ｈａｌｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　（１９
８２）　２５７　：３０１８−３０２５）と同様である
。プラスミドｐＧＢＴｅ　Ｇ４１８はＣＢＳ　１８４　
・８７の受託番号の下に１９８７年２月２６日付でＣＢ
Ｓに寄託された。
プラスミドｐＡＢ３１２はＥｃｏＲＶを用いて（Ｋ、ラ
クチス染色体のＬＡＣ４領域への統合を目的として）切
断されてからＧ４１８に対して抵抗性を有するようにす
るに、ラクチス菌株２ＵＶ２１（ｕｒａ３　ｔｒｐｌ　
ｌａｃ　４　ＣＫ１１’　））の形質転換のために使用
され、この際にＬｉＣｊ７技法［：Ｄａｓ　ｅｔ　ａｌ
、。
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８４）　　１５８：
１１６５−１ｌ６７）が使用された。
多数の形質転換体並び１こ形質転換されなかった対照菌
株を、１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース
、０．１７％酵母含チッ素塩基、５０μｇ／ｍｌトリプ
トファン及び５０％μｇ／−ウラシルから成る１ｍｌの
培地中で３６時間生育させた。次に培養物の上澄液につ
いて酸活性化の後に、キモシン活性に関して試験した。
すべての形質転換体が１００〜１２０単位／−の活性化
可能キモシンを分泌することが見出された。
担インヒドロでの突然変異生成によるスペーサーコドン
の分離 ｐ’ＡＢ３０９から１９００ｂｐのＳａｃ　Ｉ　−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片を単離してこれをＭＰ　１９　〔Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　
Ｇｅｎｅ　　　（１９８５）　　　３　３　　：１０３
〕の中へクローニングした。−末鎖のファージＤＮＡを
調製し、第１１図に示されたオリゴヌクレオチドブライ
マーを用いるインビトロでの突然変異生成のための鋳型
として使用した。ブライマー＃１及びブライマー＃２を
夫々使用してＭ１３ファージ　ＭＰ１９．／αｋｌｌ・
５及びＭＰ１９／αｋ１２・２を調製した。
上記の２種のファージから二重鎖ＲＦ　　ＤＮＡを調製
し、これらの夫々から１１００ｂｐ　　５ａｃｌ−Ｓ　
ｔｕ　Ｉ断片（複数）を調製した。これらの断片をｐＡ
Ｂ３１２からの７１００ｂｐ　　５ａｃｌ−３ｔｕＩ断
片へ連結させた。得られたプラスミドｐＡＢ３１３及び
ｐＡＢ３１４を、第１２図に例示された配列交替によっ
て単離した。
上記プラスミドｐＡＢ３１３及びｐＡＢ３１４を使用し
て菌株２ＵＶ２１をＧ４１８に対する抵抗性付与のため
に形質転換させた。転換体２ＵＶ２１：ｐＡＢ３１２．
２ＵＶ２１　：　　ｐＡＢ３１３及び２ＵＶ２１　：　
　ｐＡＢ３１４の培養物を生育させてから培養物の上澄
液について既述のようにキモシン活性に関して試験した
。その結果を第１表に示す。
第１表 夫々の転換体は、トリクロロ酢酸−沈澱化一培養物上澄
液のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により判
定される通りの単一のプロキモリン−関連種を分泌する
ことが見出された。ｐＡ８３１２転換体によって分泌さ
れたプロキモリン−関連タンパク質は、電気泳動におけ
る泳動状況によって決定される通り、ｐＡＢ３１３転換
体及びｐＡＢ３１４転換体により分泌されたプロキモリ
ン−関連タンパク質よりもその分子量においてやや高値
を示すようである。
上記の菌株（複数）のセルベレット（ｃｅｌｌ　ｐｅｌ
ｌｅｔｓ）についてキモシン活性を分析した結果は上澄
液中の測定された活性値の２％以下の活性値を含むこと
が見出された。従ってクルイベロミセスα−因子はクル
イベロミセスラクチスからのプロキモリンの分泌に関す
る指令において約９８％のを効率を有する。
ＫＲＮ３０３−１及びＫＲＮ３０４−４によって分泌さ
れる主な種（スベシイス）を電気泳動（ｐｒｅｐａｒａ
ｔｉｖｅ　ＳＯＳ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇ
ｅｌ　ｅｌｅｃｔｒ。
ｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって精製し、これらについて気
相アミノ酸配列分析を行なった。これらの種のＮ−末端
配列は下記の通りである： 上記の結果は、ＫＲＮ３０３−１によって分泌されたプ
ロキモリン−関連種はアミノ−末端スペーサー配列のプ
ロセッシングを受けないこと、他′方においてＫＲＮ３
０４−４から分泌された種は真正の成熟したキモシンア
ミノ末端を有することを示すものである。
下記の有機体は１９８７年６月３０日付でアメリカンタ
イプ力ルチュアコレクションへ寄託された：ＨＢ１０１
　　ｐＡＢ３０７、Ａ　Ｔ’ＣＣ受託番号６７４５４；
ＨＢＩＯＩ　　ｐＡＢ３１２、ＡＴＣＣ受託番号６７４
５５゜ 本発明は路側についてかなり詳記されたけれどもそれは
理解を充分にするための例示に過ぎず本発明の範囲内で
変更及び修正が可能であることが自明であろう。
【図面の簡単な説明】
添付図面の第１図はに、ラクチスα−因子ＤＮＡの同定
のために使用されるオリゴヌクレオチドプローブの設計
用の手段を示し； 第２図はに、ラクチスα−因子をコードするＤＮＡ断片
の完全な配列を示し；− 第３図はに、ラクチスα−因子と、Ｓ、セレビシェα−
因子のタンパク質配列の比較を示し；第４図はに、ラク
チスα−因子及びＳ、セレビシェα−因子の模式図であ
り； 第５図はに、ラクチスα−因子及びＳ、セレビシェα−
因子のＤＮＡ配列の比較を示し； 第６図は３種のプラスミド（これらの構成体についての
説明は路側において詳記されている）の模式図であり； 第７図は、Ｋ、ラクチスα−因子先導体に関するＤＮＡ
と、プロキモリンに関するＤＮＡとの連結を示す反応模
式図であり； 第８図はｐＵｃ１８中へのｐＡＢ３０９　　Ｂａｒｒｌ
Ｈ１／５ａｉｌ挿入物の配列を示し； 第９図はプラスミドｐＧＢ９０１を示し；第１０図はプ
ラスミドｐＧＢＴｅＧ４１８を示い 第１１図はに、ラクチスα−因子先導体ＤＮＡの突然変
異形成のために使用されるプライマー配列を示し； 第１２図はに、ラクチスα−因子先導体／プロキモリン
ＤＮＡ融合における連結点の周辺のＤＮＡ配列を示す。 第３図 Ｌ’／Ｓ　Ａｒ（Ｊ　−↓ｕ　ＡＪｋａ　ＩＪｏｕ　ｊ
％Ｊ−ａ　　　　　　−−−一５（ ６一 第７図 に、ラクチスα−因子先導体　（ｐＡＢ３０７）ＣＴＴ
ＣＧＧＣＴＡＣＧＡＡＧＧＧ プロキモリン　　（ｐＪｓｌｌｌ） ＭｅｔＡｌａＧｌｕ ｔｎｒ＋ｒｎ 特開平１−１２４３９０　（２Ｂ）

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）異種構造のポリペプチド配列に連結する分泌指令
    性クルイベロミセスα−因子先導配列をアミノ酸配列の
    中に有するタンパク質をコードするＤＮＡ構成体。
  2. （２）異種構造のポリペプチドの中へタンパク質をプロ
    セッシングするために、酵母のプロセッシングシグナル
    を介して該異種構造ポリペプチド配列へクルイベロミセ
    スα−因子先導配列を連結している請求項１記載のＤＮ
    Ａ構成体。
  3. （３）５′末端に酵母のプロモーターを更に有する請求
    項１記載のＤＮＡ構成体。
  4. （４）先導配列が野生型クルイベロミセスのα−因子の
    完全な長さの先導配列である請求項１記載のＤＮＡ配列
    。
  5. （５）先導配列が第２図に示された先導配列である請求
    項４記載のＤＮＡ配列。
  6. （６）先導配列が野生型クルイベロミセスα−因子の完
    全な長さの先導配列の機能性断片である請求項１記載の
    ＤＮＡ配列。
  7. （７）完全な長さの先導配列が第２図に示された先導配
    列である請求項６記載のＤＮＡ配列。
  8. （８）クルイベロミセスα−因子先導配列がクルイベロ
    ミセスラクチスのα−因子先導配列である請求項１記載
    のＤＮＡ配列。
  9. （９）酵母のプロセッシングシグナルが基礎的なジペプ
    チド開裂部位及びスペーサーを有する請求項２記載のＤ
    ＮＡ配列。
  10. （１０）酵母のプロセッシングシグナルが、異種構造ポ
    リペプチドのＮ−末端へ直接に融合した基礎的ジペプチ
    ド開裂部位を有し、スペーサーを有しない請求項２記載
    のＤＮＡ配列。
  11. （１１）基礎的ジペプチド開裂部位がリジン−アルギニ
    ン又はアルギニン−アルギニンである請求項９又は１０
    記載のＤＮＡ配列。
  12. （１２）酵母のプロモーターがα−因子プロモーター又
    はＧＡＰプロモーターであり、クルイベロミセスα−因
    子先導配列がクルイベロミセスラクチスα−因子先導配
    列であり、該クルイベロミセスラクチスα−因子先導配
    列が酵母のプロセッシングシグナルを介して異種構造ポ
    リペプチド配列へ連結し、該酵母のプロセッシングシグ
    ナルがリジン−アルギニン開裂部位及びスペーサーを有
    する請求項３記載のＤＮＡ構成体。
  13. （１３）異種構造ポリペプチドがプロキモリンである請
    求項１２記載のＤＮＡ構成体。
  14. （１４）酵母のプロモーターがα−因子プロモーター又
    はＧＡＰプロモーターであり、クルイベロミセスα−因
    子先導配列がクルイベロミセスラクチスα−因子先導配
    列であり、該クルイベロミセスラクチスα−因子先導配
    列が酵母のプロセッシングシグナルを介して異種構造ポ
    リペプチド配列へ連結し、該酵母のプロセッシングシグ
    ナルが異種構造ポリペプチドに直接融合したリジン−ア
    ルギニン開裂部位を有していてスペーサーを有しない請
    求項３記載のＤＮＡ構成体。
  15. （１５）異種構造ポリペプチドがプロキモリンである請
    求項１４記載のＤＮＡ構成体。
  16. （１６）酵母の中で安定に保持されるための複製可能系
    又は統合可能系を有する発現ベクター及び請求項１〜１
    ５のいずれか１項記載のＤＮＡ構成体。
  17. （１７）酵母の中で異種構造ポリペプチドを産生する方
    法において、請求項１６記載の発現ベクターを有する酵
    母を、該異種構造ポリペプチドがプロポリペプチドとし
    て該酵母によって発現され分泌される条件、及び該プロ
    ポリペプチドが異種構造ポリペプチドの中へ少なくとも
    部分的にプロセッシングされる条件の下で、培地中で生
    育させることを特徴とする上記の方法。
  18. （１８）酵母のα−因子先導配列の指令によって異種構
    造ポリペプチドを分泌させる異種構造ポリペプチドの製
    造方法において、酵母のα−因子先導配列がクルイベロ
    ミセスα−因子先導配列であることを特徴とする改良さ
    れた上記の方法。
  19. （１９）クルイベロミセスα−因子先導配列がクルイベ
    ロミセスラクチスのα−因子先導配列である請求項１８
    記載の方法。
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