BR112012033121B1

BR112012033121B1 - Métodos e composições farmacêuticas para o tratamento de infecções do trato respiratório.

Info

Publication number: BR112012033121B1
Application number: BR112012033121-3A
Authority: BR
Inventors: Jean-Claude Sirard; Jose A. Chabalgoity
Original assignee: Institut Pasteur De Lille; INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2019-08-20
Also published as: US20140206601A1; KR101768118B1; BR112012033121A2; CN103037887A; WO2011161491A1; CA2800206C; JP2013530982A; KR20140005843A; ES2690760T3; EP2585094B1; CN103037887B; US20130150286A1; US10426816B2; EP2585094A1; CA2800206A1; JP5746761B2

Abstract

métodos e composições farmacêuticas para o tratamento de infecções do trato respiratório. a presente invenção se refere a métodos e composições farmacêuticas para o tratamento de infecções de trato respiratório. mais particularmente, a presente invenção se refere a um agonista tlr5 para uso em um método para o tratamento de infecções do trato respiratório.

Description

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES DO TRATO RESPIRATÓRIO.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a métodos e composições farmacêuticas para o tratamento de infecções do trato respiratório. Mais particularmente, a presente invenção se refere a um agonista de TLR5 para uso em um método para o tratamento de infecções do trato respiratório.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As infecções do trato respiratório são infecções comuns no trato respiratório superior (por exemplo, nariz, ouvidos, seios paranasais e garganta) e trato respiratório inferior (por exemplo, traqueia, brônquios e pulmões). Os sintomas de infecção no trato superior incluem nariz entupido ou escorrendo, irritabilidade, inquietação, falta de apetite, nivel de atividade diminuído, tosse e febre.

As infecções virais do trato respiratório causam e/ou são associadas a dores de garganta, resfriados, laringite e gripe. Exemplos de vírus que causam infecções no trato respiratório superior e inferior incluem rinovírus e vírus influenza A e B.

Infecções bacterianas respiratórias comuns causam e/ou são associadas com, por exemplo, coqueluche e faringite estreptocócica. Um exemplo de uma bactéria que causa infecções do trato respiratório superior e inferior é Streptococcus pneumoniae. Streptococcus pneumoniae (pneumococo) causa infecções do trato respiratório entre crianças e idosos em todo o mundo. O polissacarideo capsular é o principal fator de virulência e sua composição define 91 sorotipos de penumococos. Certos sorotipos colonizam de forma assintomática a nasofaringe humana, representando um reservatório para a transmissão inter-individual da bactéria. Em alguns indivíduos a colonização pode progredir para pneumonia pneumocócica e doença invasiva. Em contrapartida, sorotipos como sorotipo 1 são raramente associados à colonização, mas causam infecções invasivas.

As terapias atuais para infecções do trato respiratório envolvem a administração de agentes antivirais, antibacterianos e antifúngicos para tratamento, prevenção ou melhora das infecções do trato respiratório virais, bacterianas e fúngicas, respectivamente. Infelizmente, com relação a certas infecções, não existem terapias disponíveis, as infecções têm se mostrado refratárias às terapias ou a ocorrência de efeitos colaterais supera os benefícios da administração de uma terapia a um indivíduo. O uso de agentes antibacterianos para tratamento de infecções bacterianas do trato respiratório também pode produzir efeitos colaterais ou resultar em cepas bacterianas resistentes. A administração de agentes antifúngicos pode causar falha renal ou disfunção da medula óssea e pode não ser eficaz contra infecções fúngicas em indivíduos com sistemas imunes debilitados. Adicionalmente, o microrganismo que causa a infecção (por exemplo, vírus, bactéria ou fungo) pode ser resistente ou desenvolver resistência ao agente terapêutico ou combinação de agentes terapêuticos administrados. De fato, os microrganismos que desenvolvem resistência aos agentes terapêuticos administrados frequentemente desenvolvem resistência pleiotrópica a múltiplos fármacos ou fármacos, ou seja, resistência a agentes terapêuticos que agem por mecanismos diferentes dos mecanismos dos agentes administrados. Assim, como um resultado da resistência a fármacos, muitas infecções se mostraram refratárias para uma variada gama de protocolos de tratamento padrão.

Portanto, novas terapias para tratamento, prevenção, gerenciamento e/ou melhora das infecções do trato respiratório e seus sintomas são necessárias.

A ativação das defesas inatas é essencial para o controle de infecção pneumocócica. O receptor Toll-Like 2 (TLR-2), TLR4 e TLR9, bem como o adaptador MyD88 participam da detecção precoce e depuração do pneumococo nos pulmões.

Os receptores citosólicos do domínio de oligomerização e ligação a nucleotídeo (Nod) contendo Nodl e Nod2 também têm estado envolvidos no reconhecimento dos pneumococos. A sinalização de TLR ativa respostas inatas das mucosas, que culminam no recrutamento de fagócitos como os neutrófilos polimorfonucleares (PMN) e macrófagos e a produção de agentes microbicidas. Este processo desencadeia uma rápida erradicação do extracelular.

pneumoniae é patógeno por

Em animais incapaz de fagocitose, deficientes desencadear bem como morte de MyD88, S.

intrinsicamente qualquer recrutamento de PMN nas vias aéreas e os animais aumentaram a suscetibilidade à pneumonia. A contribuição da sinalização de TLR em humanos foi destacada em um estudo recente demonstrando que alguns polimorfismos de MyD88 estão associados à suscetibilidade aumentada à infecção pneumocócica.

A modulação da imunidade pela atividade de receptores inatos é um conceito emergente para conferir respostas protetoras contra infecções. O racional é promover respostas inatas gue excedam bastante em magnitude, qualidade e dinâmica a resposta inata desencadeada pelo próprio patógeno. A eficácia dos agonistas TLR para o tratamento terapêutico de doenças infecciosas foi demonstrada em diversos modelos animais, incluindo modelos de infecções do trato respiratório (Brown, K. L., C. Cosseau, J. L. Gardy e R. E. Hancock 2007. Complexities of targeting innate immunity to treat infection. Trends Immunol 28:260-266.; Lembo, A., M. Pelletier, R. Iyer, M. Timko, J. C. Dudda, Τ. E. West, C. B. Wilson, A. M. Hajjar, e S. J. Skerrett. 2008. Administration of a synthetic TLR4 agonist protects mice from pneumonic tularemia. J Immunol 180:7574-7581; Romagne, F. 2007. Current and future drugs targeting one class of innate immunity receptors: the Tolllike receptors. Drug Discov Today 12:80-87). O TLR5 detecta flagelinas bacterianas, gue são o constituinte principal dos flagelos. Diversas células do trato pulmonar, incluindo células epiteliais, expressam TLR5, mas a modulação da via de sinalização de TLR5 ainda não foi investigada para o tratamento de infecções do trato respiratório.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a métodos e composições farmacêuticas para o tratamento de infecções do trato respiratório. Mais particularmente, a presente invenção se refere a um agonista TLR5 para uso em um método para o tratamento de uma infecção do trato respiratório.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Streptococcus pneumoniae é a causa principal de pneumonia em crianças e idosos. As defesas inatas são essenciais para o controle de infecções pneumocócicas e respostas deficientes podem desencadear a doença em indivíduos suscetíveis.

Aqui, os inventores mostraram que a flagelina pode ativar localmente a imunidade inata e, assim, aumentar a resistência à pneumonia tratamento de mucosas de S. pneumoniae nos aumentada à infecção.

aguda. O com flagelina aprimorou a pulmões e

Além disso, foi completamente restaurada após infectados, o que indica que a depuração promoveu sobrevivência arquitetura pulmonar tratamento de ratos flagelina permite o restabelecimento de condições de estado estável. Usando um mutante de de TLR5, essencial flagelina aéreas e codificam flagelina que não é estabeleceu-se que para a proteção.

induziu regulou

IL-6, capaz de sinalizar através

No a infiltração sinalização de TLR5 é trato respiratório, a de neutrófilos nas vias positivamente a expressão de genes que

TNF-α, CXCL1, CXCL2 e CCL20. Usando anticorpos de esgotamento, demonstrou-se que os neutrófilos são os principais efetores para a proteção. Além disso, verificou-se que camundongos com

SCID deficientes de células T e B liberam o desafio de

S. pneumoniae na mesma extensão que os animais imunocompetentes, sugerindo que estas populações de células não são necessárias para a proteção induzida por flagelina. Em conclusão, os resultados enfatizam que a estimulação da mucosa de imunidade inata por um TLR não naturalmente envolvido por S. pneumoniae pode aumentar a potência para curar pneumonia pneumocócica. Além disso, sem desejar se limitar a qualquer teoria particular, os inventores acreditam que a estimulação da mucosa de imunidade inata por TLR5 também

representa um	caminho	relevante	para	o tratamento	de
infecções do	trato	respiratório.	Por	exemplo, produtos
microbianos,	como	os	lisados	não	tipificáveis	de

Haemophilus influenzae, que são conhecidos por estimular a imunidade inata por via respiratória, são capazes de proteger contra várias infecções respiratórias (Evans SE, Scott BL, Clement CG, Larson DT, Kontoyiannis D, Lewis RE, Lasala PR, Pawlik J, Peterson JW, Chopra AK, Klimpel G, Bowden G, M Gancho, Xu Y, Tuvim MJ, Dickey BF. Stimulated innate resistance of lung epithelium protects mice broadly against bactéria and fungi. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010; 42:40-50), incluindo infecções por S. pneumoniae (Clement CG, Evans SE, Evans CM, Hawke D, R Kobayashi, Reynolds PR, Moghaddam SJ, Scott BL, Melicoff E, Adachi R, Dickey BF, Tuvim MJ. Stimulation of lung innate immunity protects against lethal pneumococcal pneumonia in mice. Am J Respir Crit Care Med. 2008:177:1322-1330). Tais infecções respiratórias incluem doenças que são induzidas por bactérias, vírus e fungos.

Por conseguinte, a presente invenção se refere a um agonista TLR5 para uso em um método para o tratamento de uma infecção do trato respiratório.

termo infecção do trato respiratório tem o seu significado geral no estado da técnica e destina-se a designar infecções do trato respiratório superior (por exemplo, nariz, ouvidos, seios nasais e garganta) e do trato respiratório inferior (por exemplo, traqueia, brônquios e pulmões) induzidas por um microrganismo vivo.

Exemplos de virus que causam infecções virais incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, os retrovirus (por exemplo, virus linfotrópico de células T humanas (HTLV) tipos I e II e virus da imunodeficiência humana (HIV) ) , virus do herpes (por exemplo, virus do herpes simples (HSV) tipos I e II, virus de Epstein-Barr, HHV6-HHV8, e citomegalovirus), arenavirus (por exemplo, virus da febre de Lassa), paramixovirus (por exemplo, virus morbilivirus, virus sincicial respiratório humano, caxumba, hMPV e pneumovirus), adenovirus, buniavirus (por exemplo, hantavirus), comavirus, filovirus (por exemplo, virus Ebola), flavivirus (por exemplo, virus da hepatite C (HCV), virus da febre amarela e virus da encefalite japonesa), hepadnavírus (por exemplo, vírus da hepatite B (HBV)), ortomiovírus (por exemplo, vírus influenza A, B e C e PIV), papovavírus (por exemplo, papilomavírus), picornavírus (por exemplo, rinovírus, enterovírus e vírus da hepatite A), poxvírus, reovírus (por exemplo, rotavírus), togavírus (por exemplo, vírus da rubéola) e rabdovírus (por exemplo, vírus da raiva).

Exemplos de bactérias que provocam infecções bacterianas do trato respiratório incluem, mas não se limitam, à família Aquaspirillum, família Azospirillum, família Azotobacteraceae, família Bacteroidaceae, espécies Bartonella, família Bdellovibrio, espécies Campylobacter, espécies Chlamydia (por exemplo, Chlamydia pneumoniae), Clostridium, família Enterobacteriaceae (por exemplo, espécies Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter aerogenes, espécies Erwinia, Escherichía coli, espécies Hafnia, espécies Klebsiella, espécies Morganella, Proteus vulgaris, Providencia, espécies Salmonella, Serratia marcescens e Shigella flexneri), família Gardinella, Haemophilus influenzae, família Halobacteriaceae, família Helicobacter, família Legionallaceae, espécies Listeria, família Methylococcaceae, micobactérias (por exemplo, Mycobacterium tuberculosis), família Neisseriaceae, família Oceanospirillum, família Pasteurellaceae, espécies

Pneumococcus, espécies Pseudomonas, família Rhizobiaceae, família Spirillum, família Spirosomaceae, Staphylococcus (por exemplo, Staphylococcus aureus resistente à meticilina e Staphylococcus pyrogenes) , Streptococcus (por exemplo, Streptococcus enteritidis, Streptococcus fasciae e Streptococcus pneumoniae), Vampirovibr, família Helicobacter e família Vampirovibrio.

Exemplos de fungos que causam infecções fúngicas incluem, mas não se limitam a, espécies Absidia (por exemplo, Absidia corymbifera e Absidia ramosa), espécies Aspergillus, (por exemplo, Aspergillus fiavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger e Aspergillus terreus) , Blastomyces dermatitidis, espécies Candida (por exemplo, Candida albicans, Candida glabrala, Candida kerr, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii, Cândida rugosa, Candida stellatoidea e Candida tropicalis) , Coccidioides immitis, espécie Conidiobolus, Cryptococcus neoforms, espécies Cunninghamella, Histoplasma capsulatum, Mucorpusillus, Paracoccidioides brasiliensis, Pseudallescheria boydii, Pneunocystis carinii, espécies Rhizopus (por exemplo, Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae, e Rhizopus micrósporos), espécies Saccharomyces e Sporothrix schenckii.

Em uma modalidade particular, a infecção do trato respiratório de acordo com a presente invenção é uma infecção bacteriana do trato respiratório, mais particularmente uma infecção do trato respiratório que resulta de bactérias que não possuem flagelos. Tipicamente, as bactérias que não possuem flagelos e que causam infecção do trato respiratório incluem Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis ou Mycoplasma pneumoniae. Ainda mais preferivelmente, a infecção do trato respiratório de acordo com a presente invenção é uma infecção por pneumococos.

Tal como utilizado no presente documento, o termo receptor 5 tipo Toll ou TLR5 tem o seu significado geral no estado da técnica e designa um receptor 5 tipo toll de quaisquer espécies mas, de preferência, um receptor 5 tipo toll humano. Após a ativação, um TLR5 induz uma resposta celular por transdução de um sinal intracelular que se propaga através de uma série de moléculas de sinalização a partir da superfície celular para o núcleo. Geralmente, o domínio intracelular de TLR5 recruta a proteína adaptadora, MyD88, que recruta as serina/treonina quinases IRAK (IRAK-1 e IRAK-4). IRAKs formam um complexo com TRAF6, que, em seguida, interage com várias moléculas que participam na transdução do sinal de TLR. Estas moléculas e os outros componentes da via de transdução de sinal de TLR5 estimulam a atividade de fatores de transcrição, tais como fos, jun e NF-kB, e a indução correspondente dos produtos genéticos de gene regulados por fos, jun e NF-kB, tais como, por exemplo, IL-6, TNF-a, CXCL1, CXCL2 e CCL20.

Tal como aqui utilizado, o termo agonista TLR5 refere-se a um composto (natural ou não) que ativa seletivamente ou aumenta a transdução de sinal normal através de TLR5. Um agonista TLR5 pode ativar ou aumentar a transdução do sinal normal através de TLR5 indiretamente, por exemplo, modificando ou alterando a conformação nativa de TLR5 ou de um ligante de TLR5. As atividades das moléculas de sinalização gue medeiam o sinal de TLR5, bem como moléculas produzidas como um resultado de ativação de TLR5 são atividades de TLR5 que podem ser observadas ou medidas. Por conseguinte, uma atividade de TLR5 inclui recrutamento de moléculas de sinalização intracelular, bem como os eventos a jusante, que resultam de ativação de TLR5, tais como a ativação de fator de transcrição e produção de moléculas imunomoduladoras. Uma resposta celular de TLR5 medeia uma resposta do sistema imune inato de um sujeito, uma vez que citocinas liberadas por células que expressam TLR5 regulam outras células do sistema imune para promover uma resposta imune em um sujeito. Assim, tal como aqui utilizado, o termo resposta mediada por TLR5 designa a capacidade do agonista TLR5 de induzir uma resposta celular mediada por TLR5. Exemplos de respostas celulares mediadas por TLR5 incluem a ativação de fatores de transcrição, tais como fos, jun e NF-kB, produção de citocinas e quimiocinas, tais como IL-6, TNF-α, CXCL1, CXCL2 e CCL20, e estimulação de uma resposta imune em um sujeito.

Em uma modalidade, o agonista TLR5 de acordo com a presente invenção é um agonista de baixo peso molecular, por exemplo, uma pequena molécula orgânica. O termo pequena molécula orgânica refere-se a uma molécula de um tamanho comparável às moléculas orgânicas geralmente utilizadas em produtos farmacêuticos. O termo exclui macromoléculas biológicas (por exemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) As moléculas orgânicas pequenas preferidas variam de tamanho em até cerca de 5000 Da, mais preferivelmente até 2000 Da, e mais preferivelmente até cerca de 1000 Da.

Alternativamente, o agonista TLR5 de acordo com a presente invenção pode consistir em um anticorpo (incluindo o termo fragmento de anticorpo). Em particular, o agonista TLR5 pode consistir em um anticorpo direcionado contra TLR5, de tal modo que o referido anticorpo ativa o receptor.

Os anticorpos podem ser criados de acordo com métodos conhecidos pela administração do antigeno ou epitopo apropriado a um animal hospedeiro selecionado, por exemplo, a partir de porcos, vacas, cavalos, coelhos, cabras, ovelhas e ratos, entre outros. Vários adjuvantes conhecidos no estado da técnica podem ser usados para aumentar a produção de anticorpos. Embora os anticorpos úteis na prática da presente invenção possam ser policlonais, os anticorpos monoclonais são preferidos. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados e isolados utilizando qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares contínuas em cultura. As técnicas para a produção e isolamento incluem, mas não se limitam a, técnica de hibridoma, técnica do hibridoma de células B humanas e a técnica de EBV-hibridoma. Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (vide, por exemplo, patente US 4,946,778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos anti-TLR5 de cadeia única.

O agonista TLR5 útil na prática da presente invenção inclui também fragmentos de anticorpos anti-TLR5 incluindo, mas não limitado, a fragmentos de F(ab')2, que podem ser gerados por digestão de pepsina de uma molécula de anticorpo intacta, e fragmentos Fab, que podem ser gerados através da redução das pontes de dissulfeto dos fragmentos

F(ab')2. Alternativamente, Fab e/ou bibliotecas de expressão scFv podem ser construídos de modo a permitir uma rápida identificação de fragmentos com a especificidade desejada para TLR5.

Os anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpo dos mesmos também podem ser preparados de acordo com técnicas conhecidas. Anticorpos humanizados são formas de anticorpos quiméricos não humanos (por exemplo, de roedor) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável (CDRs) do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as voltas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá também pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Métodos para produção de anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, por Winter (Patente US 5,225,539) e Boss (Celltech, Patente US 4,816,397).

Em seguida, após a criação dos anticorpos, como descrito acima, a pessoa versada na técnica pode facilmente selecionar aqueles que são agonistas TLR5.

Em outra modalidade, o agonista TLR5 é um aptâmero. Aptâmeros são uma classe de moléculas que representam uma alternativa aos anticorpos em termos de reconhecimento molecular. Aptâmeros são sequências de oligonucleotídeos ou de oligopeptídeos com a capacidade de reconhecer virtualmente qualquer classe de moléculas alvo com alta afinidade e especificidade. Tais ligantes podem ser isolados através da Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial (SELEX) de uma biblioteca de sequência aleatória, como descrito em Tuerk C. e Gold L., 1990. A biblioteca de sequência aleatória é obtenível por síntese química combinatória de DNA. Nesta biblioteca, cada um dos membros é um oligômero linear, eventualmente modificado quimicamente, de uma sequência única. As possíveis modificações, usos e vantagens desta classe de moléculas foram revisadas em Jayasena SD, 1999. Aptâmeros peptídicos consistem de uma região variável de anticorpos conformacionalmente restritos exibida por uma proteína de plataforma, tal como Tioredoxina A de E. coli, que são selecionadas a partir de bibliotecas combinatórias por dois métodos híbridos.

Em seguida, após a criação dos aptâmeros direcionados contra TLR5 tal como acima descrito, a pessoa versada na técnica pode facilmente selecionar aqueles que são agonistas TLR5.

Em outra modalidade particular, o agonista TLR5 de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo e, mais particularmente, um polipeptídeo de flagelina.

Tal como aqui utilizado, o termo flagelina designa a flagelina contida em uma variedade de espécies de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas. Fontes não limitantes de flagelinas incluem, mas não se limitam a, Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli, tais como B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas, tal como P. aeruginosa e Streptoiayces. Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos. As sequências de aminoácidos e sequências de nucleotideos de flagelinas estão publicamente disponíveis no NCBI Genbank, ver, por exemplo, os Números de Acesso AAL20871, NP_310689, BAB58984, AAO85383, AAA27090, NP_461698, ΆΑΚ58560, YP_001217666, YP_002151351, YP_001250079, AAA99807, CAL35450, AAN74969, e BAC44986. As sequências de flagelina destas e de outras espécies destinam-se a ser englobadas pelo termo flagelina tal como aqui utilizado. Assim, as diferenças de sequência entre as espécies estão incluídas dentro do significado do termo.

O termo polipeptídeo de flagelina destina-se a uma flagelina ou fragmento da mesma que conserva a capacidade de se ligar e ativar TLR5. Tipicamente, o polipeptídeo de flagelina de acordo com a presente invenção compreende os domínios da flagelina envolvidos na sinalização de TLR5. O termo domínio de flagelina inclui o domínio de ocorrência natural de flagelina e variantes conservadoras de função do mesmo. Variantes conservadoras de função são aquelas em que um dado resíduo de aminoácido em uma proteína ou enzima foi alterado sem alterar a conformação geral e a função do polipeptídeo, incluindo, mas não limitado a, a substituição de um aminoácido com um de propriedades similares (tal como, por exemplo, polaridade, potencial de ligação de hidrogênio, acidez, alcalinidade, hidrofobicidade, aromaticidade, e semelhantes). Os aminoácidos que não os indicados como conservados podem diferir em uma proteína, de modo que a similaridade de sequência percentual de proteína ou aminoácido entre duas proteínas quaisquer de função similar pode variar e pode ser, por exemplo, de 70% a 99%, conforme determinado de acordo com um esquema de alinhamento, tal como pelo Método de Cluster, em que a similaridade se baseia no algoritmo MEGALIGN. Uma variante conservadora de função também inclui um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de aminoácidos, tal como determinado pelos algoritmos BLAST ou FASTA, de preferência pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 85%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, e que tem propriedades ou funções idênticas ou substancialmente semelhantes como a proteína nativa ou mãe, a qual é comparada. Os domínios de flagelina que estão envolvidos na sinalização de TLR5 são bem conhecidos no estado da técnica, ver, por exemplo, Smith e col. (2003) Nat. Immunol. 4:1247-1253 (por exemplo, os aminoácidos 78-129, 135-173 e 394-444 de flagelina de S. typhimurium ou homólogos ou formas modificadas da mesma).

Exemplos de polipeptideos de flagelina incluem, mas não estão limitados, aos descritos nas Patentes US 6,585,980; 6,130,082; 5,888,810; 5,618,533 e 4,886,748; Publicação de Patente US 2003/0044429 Al, e nas Publicações de Pedido de Patente Internacionais WO 2008097016 e WO 2009156405, que são incorporados por referência.

Uma flagelina exemplar de E. coli O157:H7 é a SEQ ID NO:1. Uma flagelina exemplar de S. typhimurium é a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO:3. Sequências de aminoácidos com pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idênticas à SEQ ID NO:1, SEQ ID

NO:2 ou

SEQ ID NO:3 podem ser usadas como polipeptideos de flagelina de acordo com a presente invenção.

Em outra modalidade particular, a presente envolve uso de proteínas recombinantes de flagelina descritas no

Pedido de

Patente Internacional

WO 2009156405, que incorporado por referência na sua totalidade. Por conseguinte, um polipeptídeo de flagelina da presente invenção pode compreender: a) um peptídeo N-terminal com pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos iniciando no resíduo de aminoácido localizado na posição 1 da SEQ ID NO: 3 e terminando em um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste de qualquer um dos resíduos de aminoácidos localizados nas posições 99 a 173 da SEQ ID NO: 3, e b) um peptídeo Cterminal com pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos iniciando em um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste de qualquer um dos resíduos de aminoácidos localizados nas posições 401 a 406 da SEQ ID NO:3 e terminando no resíduo de aminoácido localizado na posição 494 da SEQ ID NO:3, em que: o referido peptídeo N-terminal está diretamente ligado ao referido peptídeo C-terminal, ou o referido peptídeo Nterminal e o referido peptídeo C-terminal estão indiretamente ligados, um ao outro, através de uma cadeia espaçadora. Em outra modalidade particular, o referido peptídeo N-terminal é selecionado a partir do grupo que consiste das sequências dos aminoácidos 1-99, 1-137, 1-160 e 1-173 da SEQ ID NO:3. Em outra modalidade, o referido peptídeo C-terminal é selecionado a partir do grupo que consiste das sequências dos aminoácidos 401-494 e 406-494 da SEQ ID NO:3. Em outra modalidade, os referidos peptídeos Nterminal e C-terminal consistem das sequências dos aminoácidos 1-173 e 401-494 da SEQ ID NO:3, respectivamente. Em outra modalidade, os referidos peptídeos N-terminal e Cterminal consistem das sequências dos aminoácidos 1-160 e 406-494 da SEQ ID NO: 3, respectivamente. Numa outra modalidade, os referidos peptídeos N-terminal e C-terminal consistem das sequências dos aminoácidos 1-137 e 406-494 da SEQ ID NO:3, respectivamente. Numa outra modalidade, o referido peptideo N-terminal e o referido peptideo Cterminal estão indiretamente ligados, um ao outro, através de uma cadeia espaçadora intermediária que consiste de uma sequência peptidica NH₂-Gly-Ala-Ala-Gly-COOH (SEQ ID NO:4). Numa outra modalidade, o resíduo de aminoácido asparagina localizado na posição 488 da SEQ ID NO: 3 é substituído por uma serina. Numa outra modalidade, o polipeptídeo de flagelina tal como acima descrito compreende um resíduo de metionina adicional na extremidade N-terminal.

polipeptídeo de flagelina de acordo com a presente invenção pode ser produzido de forma recombinante por células recombinantes que foram transfectadas com um ácido nucleico que codifica a sua sequência de aminoácidos e que permite a sua produção eficaz dentro das células transfectadas.

A sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de flagelina da presente invenção pode ser inserida em um vetor replicável para clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Vários vetores estão publicamente disponíveis. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em sítio (s) apropriado(s) de endonuclease de restrição utilizando técnicas conhecidas no estado da técnica.

Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais de uma sequência de sinal, se a sequência deve ser secretada, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potencializador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. A construção de vetores adequados contendo um ou mais destes componentes utiliza técnicas de ligação padrão que são conhecidas pelo técnico no assunto.

Os polipeptídeos de flagelina da presente invenção podem ser produzidos de forma recombinante, não só diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo com um sítio de divagem específico no N-terminal da proteína madura ou peptídeo. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor ou pode ser uma parte do DNA que codifica o polipeptídeo de interesse que é inserido no vetor. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor. Para a secreção de levedura, a sequência de sinal pode ser, por exemplo, o líder de invertase de levedura, líder do fator alfa (incluindo líderes de fator alfa de Saccharomyces e Kluyveromyces, este último descrito na patente US 5,010,182) ou líder de fosfatase ácida, o líder de glicoamilase de C. albicans ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão em células de mamíferos, as sequências de sinal de mamífero podem ser utilizadas para direcionar a secreção da proteína, tais como sequências de sinal de polipeptídeos secretados da mesma espécie ou relacionadas, bem como líderes de secreção virais.

Ambos os vetores de expressão e de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2.mu. é adequada para levedura, e origens virais diversas (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos.

Os vetores de expressão e clonagem irão conter tipicamente um gene de seleção, também denominado como um marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos, por exemplo, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de flagelina da presente invenção, tais como DHFR ou timidina-quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR de tipo selvagem é utilizada é a linhagem celular CHO deficiente em atividade de DHFR, preparada e propagada tal como descrito por Urlaub e col., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 77:4216 (1980). Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trp 1 presente no plasmideo de levedura YRp7. Stinchcomb e col., Nature, 282:39 (1979); Kingsman e col., Gene, 7:141 (1979); Tschemper e col., Gene, 10:157 (1980). O gene trpl proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N° 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977).

Os vetores de expressão e clonagem normalmente contêm um promotor operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptideo de flagelina à sintese direta de

RNAm. Os promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos.

Os promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores da beta-lactamase e da lactose (Chang e (1978); Goeddel e col., Nature, 281:

col., Nature, 275:615

544 (1979)), fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776) e promotores híbridos, tais como o promotor tac (deBoer e col., Proc Natl Acad Sei. EUA, 80:21-25 (1983)). Os promotores para uso em sistemas bacterianos conterão também uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA que codifica o polipeptideo de flagelina da presente invenção.

Exemplos de sequências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3fosfoglicerato-quínase (Hitzeman e col., J. Biol Chem, 255:2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas (Hess e col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato-isomerase, 3fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.

Outros promotores de levedura que são promotores indutiveis com a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do nitrogênio, metalotioneina, gliceraldeido-3fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores adequados para uso em expressão de levedura são ainda descritos na EP 73,657. A transcrição de ácido nucleico de interesse a partir de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus, tais como o vírus de polioma, vírus da varíola aviária (UK 2,21 1,504, publicado em 5 de julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 2) , vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), por promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, bem como por promotores de choque por calor, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

A transcrição de um DNA que codifica o polipeptídeo de flagelina da presente invenção por eucariotos superiores pode ser aumentada pela inserção de uma sequência potencializadora no vetor. Os potencializadores são elementos de atuação cis do DNA, normalmente cerca de 10300 pb, que atuam sobre um promotor para aumentar a sua transcrição. Muitas sequências potencializadoras são agora conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, alfa-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, usa-se um potencializador de um vírus de célula eucariótica. Os exemplos incluem o potencializador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potencializador de promotor precoce de citomegalovírus, o potencializador de polioma no lado tardio da origem de replicação e potencializadores de adenovírus. O potencializador pode ser unido ao vetor em uma posição 5' ou 3¹ da sequência de codificação para os polipeptídeos de interesse, mas está preferencialmente localizado a um sítio 5' do promotor.

Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (leveduras, fungos, insetos, planta, animal, humano ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para a finalização da transcrição e para a estabilização do RNAm. Tais sequências estão comumente disponíveis a partir de regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou DNAc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do RNAm que codifica o polipeptídeo de flagelina da presente invenção.

Ainda outros métodos, vetores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese do polipeptídeo de flagelina da presente invenção em culturas de células recombinantes de vertebrados são descritos em Gething e col., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei e col., Nature,

281:40-46 (1979); EP 1 17,060 e EP 1 17,058.

Seleção e transformação de células hospedeiras - as células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de expressão ou clonagem descritos aqui para a produção de polipeptídeo de flagelina e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.

As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e similares, podem ser selecionadas pelo técnico no assunto sem experimentação indevida. Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991).

Os métodos de transfecção são conhecidos pelo técnico no assunto, por exemplo, tratamento de CaP04 e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas padrão apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, tal como descrito em Sambrook e col., acima, ou eletroporação é geralmente utilizado para procariotas ou outras células que contenham substanciais barreiras de parede celular. Para células de mamífero sem estas paredes celulares, o método de precipitação com fosfato de cálcio, de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) pode ser empregado. Aspectos gerais de transformações de sistemas hospedeiros de células de mamíferos foram descritos na Patente US 4,399,216. As transformações em leveduras são tipicamente efetuadas de acordo com o método de Van Solingen e col., J. Bact, 130:946 (1977) e Hsiao e col., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA), 76:3829 (1979). No entanto, outros métodos para introduzir DNA nas células, tais como por micro-injecção nuclear, eletroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou policátions, por exemplo, polibreno ou poliornitina, também podem ser usados. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, vide Keown e col., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour e col., Nature, 336:348-352 (1988).

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de DNA nos vetores incluem no presente células de procariotos, leveduras ou células de eucariotos superiores.

Os procariotos adequados incluem, mas não estão limitados a, eubactérias, tais como organismos Gramnegativos ou Gram-positivos, por exemplo,

Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Várias cepas de E.

coli estão disponíveis publicamente, tais como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 31, 446); E. coli X1776 (ATCC 31, 537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27,325) e K5772 (ATCC 53,635). Outras células hospedeiras procarióticas adequadas incluem

Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por exemplo, E.

coli,

Enterobacter,

Erwinia,

Klebsiella,

Proteus,

Salmonella, por exemplo,

SaImonella typhimurium,

Serratia, por exemplo, Serratia marcescans e Shigella, bem como

Bacilli, tais como B.

subtilis e

B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P descrito em DD 266, 710, publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tais como

P. aeruginosa e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos.

A cepa SIN41 de Salmonella typhimurium (fliC fljB), é particularmente interessante para a produção de polipeptideos de flagelina da presente invenção, uma vez que estas células hospedeiras procarióticas não secretam quaisquer flagelinas (Proc Natl Acad Sci, EUA. 2001; 98:13722-7). No entanto, flagelinas são secretadas através do sistema de secreção especializado: o chamado sistema de secreção Tipo III. Curiosamente, a cepa SIN41 produz todos os componentes do sistema de secreção tipo III necessários para a ótima secreção da flagelina. A sequência de clonagem codificando novos peptídeos de flagelina com um promotor fliC permite a secreção de grandes quantidades dos polipeptideos de flagelina de interesse na cepa SIN41.

A cepa W3110 é igualmente interessante, uma vez que é uma cepa hospedeira comum para fermentações de produtos de DNA recombinante. De preferência, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a cepa W3110 pode ser modificada para efetuar uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplos de tais hospedeiros incluindo E. coli W3110 cepa 1A2, que tem o genótipo completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tem o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W31 10 cepa 27C7 (ATCC 55,244), que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan.sup.r; E. coli W31 10 cepa 37D6, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan.sup.r; E. coli W31 10 cepa 40B4, que é a cepa 37D6 com uma mutação de deleção degP não-resistente à canamicina; e uma cepa de E. coli possuindo protease periplasmática mutante descrita na Patente US 4,946,783 concedida em 7 de agosto de 1990. As cepas de E. coli MG1655, MG1655 AfimA-H ou MKS12, uma cepa MG1655 flíD- e -f/m>A-/-/- deletadas também são candidatas interessantes para a produção de flagelinas recombinantes como proteínas secretadas (Nat

Biotechnol

2005.; (4):475-81).

Alternativamente, os métodos in vitro de clonagem, por exemplo,

PCR ou outras reações de polimerase de ácido nucleico, são adequados.

Além dos procariotos, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros adequados de clonagem ou expressão para vetores que codificam polipeptídeos de flagelina de acordo com a presente invenção. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior comumente usado.

Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139,383 publicado em 2 de Maio de 1985); Hospedeiros Kluyveromyces (Patente US 4,943,529; Fleer e col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), tais como, por exemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574;. Louvencourt e col., J. bacterid, 737 [1983]), K.

fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K.

wickeramii (ATCC 24,178), K.

waltii (ATCC 56,500),

K.

drosophilarum (ATCC

36,906;

Van den Berg e col.,

Bio/Technology, 8:135 (1990))

K.

thermotolerans e K.

marxianus; yarrowia (EP 402,226);

Pichia pastoris (EP

183,070; Sreekrishna col., J. Basic

Microbiol,

28:265-278 [1988]); Candida;

Trichoderma reesia (EP

244,234);

Neurospora crassa (Case e col., Proc Natl

Acad

EUA,

76:5259-5263 [1979] ) ;

Schwanniomyces, tais como

Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicado em de outubro de 1990) e fungos filamentosos, tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, publicado em 10 de janeiro de 1991) e hospedeiros Aspergillus, tais como A. nidulans (Ballance e col., Biochem Biophys Res Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn e col, Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton e col., Proc Natl Acad Sei. EUA, 81:1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). As leveduras metilotrópicas são adequadas no presente documento e incluem, mas não estão limitadas a, leveduras capazes de crescer em metanol selecionadas dos gêneros consistindo de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Células hospedeiras adequadas para a expressão do ácido nucleico que codifica o polipeptideo de flagelina da presente invenção são derivadas de organismos muiticelulares.

Exemplos de células de invertebrados incluem células de inseto, tais como

Drosophila S2 e

Spodoptera Sf9, bem como células vegetais. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e células COS

Exemplos mais específicos incluem a linha

CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7,

ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham e col., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)), células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc Natl Acad Sei.

EUA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongos (TM4, Mather, Biol Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75), células de fígado humano (Hep G2, HB 8065) ; e de tumor mamário de camundongos (MMT

060562, ATCC CCL51). A seleção da célula hospedeira apropriada é considerada como estando compreendida no estado da técnica.

O polipeptídeo de flagelina da presente invenção pode ser recuperado a partir do meio de cultura ou de lisados de células hospedeiras. Se ligado à membrana, pode ser liberado da membrana utilizando uma solução de detergente adequada (por exemplo, TRITON-XTM 100) ou por divagem enzimática.

As células empregadas na expressão de ácido nucleico que codifica o polipeptideo de flagelina da presente invenção podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, ruptura mecânica ou agentes de lise celular. Pode ser desejado purificar o polipeptideo de interesse a partir de proteínas ou polipeptídeos celulares recombinantes. Os seguintes procedimentos são exemplos de procedimentos de purificação adequados: por fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, tal como DEAE, cromatofocagem, SDSPAGE, precipitação com sulfato de amônio, filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75, colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tais como IgG, e colunas quelantes de metais para ligar formas epítopo marcadas do polipeptideo de flagelina da presente invenção.

Vários métodos de purificação de proteínas podem ser empregados e estes métodos são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (Springer-Verlag: New York, 1982) . A(s) etapa (s) de purificação selecionada(s) irá(ão) depender, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do polipeptideo de flagelina particular produzido.

Em uma modalidade preferida, o polipeptideo de flagelina é purificado a partir do sobrenadante de S.

Typhimurium	recombinante	SIN41 (fliC	fljB)	, conforme
descrito em	Nempont e	col.	(Nempont, C.	C, D.;	Rumbo, M.;
Bompard, C;	Villeret,	V.;	Sirard, J.C.	2008.	Deletion of

flagellin’s hypervariable region abrogates antibodymediated neutralization and systemic activation of TLR5dependent immunity. J Immunol. 181:2036-2043.). Em particular, Salmonellas foram cultivadas em um caldo LuriaBertani (LB) durante 6-18 horas a 37°C com agitação. O sobrenadante foi filtrado e saturado com sulfato de amônio a 60% (Sigma Aldrich, EUA). Os materiais precipitados foram recuperados por centrifugação, solubilização em Tris/HCI a 20 mM pH 7,5 e depois submetidos a diálise. As proteínas foram ainda purificadas por ciclos sucessivos de hidroxiapatita, troca aniônica, cromatografia por exclusão de tamanho (Bio-Rad Laboratories, EUA, GE Healthcare, Suécia). Finalmente, as proteínas foram depletadas de lipopolissacarídeo (LPS), utilizando uma coluna de polimixina B (Pierce, EUA). Utilizando o ensaio de Limulus (Associates of Cape Cod Inc., EUA), a concentração de LPS residual foi determinada como sendo inferior a 30 pg de LPS por pg de flagelina recombinante.

Em modalidades adicionais, um polipeptideo de flagelina de acordo com a presente invenção pode ser purificado por separação sobre um substrato de cromatografia por imunoafinidade.

Tal substrato de cromatografia por imunoafinidade compreende anticorpos anti-flagelina que foram imobilizados no mesmo. Por anticorpos anti-flagelina, designa-se no presente documento os anticorpos que se ligam tanto à flagelina nativa quanto a uma flagelina de região deletada hipervariável, incluindo aquelas compreendidas pela presente invenção.

De preferência, os anticorpos anti-flagelina consistem de anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos antiflagelina de camundongo.

Em certas modalidades, um polipeptideo da presente invenção pode ser sintetizado por meio de técnicas convencionais de síntese química de peptídeos.

Por exemplo, a sequência de polipeptideo de flagelina da presente invenção pode ser produzida por síntese peptídica direta utilizando técnicas de fase sólida.

A síntese da proteína in vitro pode ser realizada utilizando técnicas manuais ou através de automação. A síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, com um sintetizador Applied Biosystems Peptide (Foster City, CA) , utilizando as instruções do fabricante.

Várias porções do polipeptídeo de interesse podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o 5 peptídeo de comprimento total de interesse.

A presente invenção também se refere a composições farmacêuticas para uso em um método para o tratamento de uma infecção do trato respiratório compreendendo um agonista TLR5 de acordo com a presente invenção.

Tipicamente, os agonistas TLR5 de acordo com a presente invenção podem ser combinados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, com matrizes de libertação sustentada, tais como polímeros biodegradáveis, para formar composições terapêuticas.

Farmaceuticamente ou farmaceuticamente aceitável referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem um efeito adverso, reação alérgica ou outro inconveniente, quando administradas a um mamífero, especialmente um humano. Um veículo ou excipiente 20 farmaceuticamente aceitável refere-se a uma carga, diluente, material de encapsulamento ou auxiliar de formulação atóxico, sólido, semi-sólido ou líquido de qualquer tipo.

A composição farmacêutica da presente invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem, mas não estão limitadas a, administração parenteral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral, intranasal (por exemplo, por inalação), transdérmica (por exemplo, tópica), transmucosa e retal. Em uma modalidade específica, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa, subcutânea ser humano.

intramuscular, oral, intranasal ou tópica ao

Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local para aliviar a dor no local da injeção.

De preferência, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada por via tópica (isto é, no trato respiratório do indivíduo). Portanto, as composições podem ser formuladas sob a forma de uma pomada, creme, emplastro transdérmico, loção, gel, spray, aerossol, solução, emulsão ou qualquer outra forma bem conhecida por um técnico no assunto. Para formas de dosagem tópicas não-pulverizáveis, formas viscosas a semi-sólidas ou sólidas compreendendo um veículo ou um ou mais excipientes compatíveis com a aplicação tópica e com uma viscosidade dinâmica de preferência maior do que a água são tipicamente empregadas. As formulações adequadas incluem, sem limitação, soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomadas, pós, linimentos, unguentos e similares, os quais são, se desejado, esterilizados ou misturados com agentes auxiliares (por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, tampões ou sais) para influenciar várias propriedades, tais como, por exemplo, a pressão osmótica. Outras formas de dosagem tópica adequadas incluem preparações de aerossóis pulverizáveis, em que o ingrediente ativo, de preferência em combinação com um veículo inerte sólido ou líquido, é embalado em uma mistura com um pressurizado volátil (por exemplo, um propulsor gasoso, tal como freon) ou em um frasco compressível. Hidratantes ou umectantes também podem ser adicionados às composições farmacêuticas e formas de dosagem se desejado. Exemplos de tais ingredientes adicionais são bem conhecidos na técnica.

Se o método da presente invenção compreende a administração intranasal de uma composição, a composição pode ser formulada na forma de aerossol, spray, névoa ou sob a forma de gotas. Em particular, os agentes profiláticos ou terapêuticos para o uso de acordo com a presente invenção podem ser convenientemente administrados na forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado (por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono ou outro gás adequado) . No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada pelo fornecimento de uma válvula para liberar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos (compostos de, por exemplo, gelatina) para utilização em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido.

O método de acordo com a presente invenção pode compreender a administração pulmonar, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, de uma composição formulada com um agente aerossol. Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 6,019, 968, 5, 985, 320, 5, 985,309, 5, 934, 272, 5, 874,064, 5,855,913, 5,290,540 e 4,880,078, e publicações PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 e WO 99/66903, cada uma das quais incorporada ao presente por referência em sua totalidade. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada usando a tecnologia de liberação pulmonar de fármaco Alkermes AIR™ (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

Por conseguinte, a invenção fornece um método de

prevenção, tratamento, gestão ou melhora de uma infecção do trato respiratório ou um ou mais sintomas desta, que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agonista TLR5.

De acordo com a presente invenção, o termo sujeito ou indivíduo a ser tratado designa um mamífero humano ou não humano (por exemplo, um roedor (camundongo, rato), um felino, um canino ou um primata) afetado ou suscetível de ser afetado com câncer. De preferência, o sujeito é um humano.

termo guantidade terapeuticamente eficaz designa uma quantidade suficiente de polipeptídeo ou ácido nucleico a fim de tratar câncer, com uma razoável razão benefício/risco, aplicável a qualquer tratamento médico.

Deve ser entendido, contudo, polipeptídeo e composições invenção será decidido pelo que o uso diário total do farmacêuticas da presente médico assistente dentro do âmbito do correto julgamento médico. O nível de dose específico terapeuticamente eficaz para qualquer indivíduo particular dependerá de uma série de fatores, incluindo a desordem a ser tratada e a gravidade da desordem; a atividade do polipeptídeo empregado; a composição específica empregada, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo; o tempo de administração, via de administração, a duração do tratamento; os fármacos utilizados em combinação ou coincidentes com o polipeptídeo específico empregado; e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas.

A presente invenção será ilustrada adicionalmente pelas figuras e exemplos a seguir. No entanto, estes exemplos e figuras não devem ser interpretados de modo algum como limitativos do âmbito da presente invenção. FIGURAS

FIGURA 1: Flagelina protege camundongos BALB/c contra um desafio respiratório letal com S. pneumoniae:

Camundongos BALB/c (n = 8) foram infectados i.n. com 4xl0⁵ UFC de S. pneumoniae (Sp) sorotipo 1 somente em salina (quadrado preto) ou suplementado com 1 pg de flagelina (FÜC, círculo preto) ou suplementado com 1 pg de flagelina digerida com tripsina (FliC/T, círculo aberto) . (A) A sobrevivência dos camundongos foi monitorada diariamente. A sobrevivência para o grupo tratado com FliC foi estatisticamente significativa em relação ao grupo com salina ou ao grupo tratado com FliC/T. Os resultados são representativos de 1 de 3 experimentos. (B) Os camundongos foram sacrificados 24 horas após o desafio e o número de unidades formadoras de colônias (UFC) foi determinado nos pulmões. Diferenças significativas entre os grupos são marcadas com um asterisco; P<0,05 (*) . Os resultados são representativos de 1 de 3 experimentos. As barras de erro representam a média ± erro padrão da média (EPM).

FIGURA 2: A sinalização de TLR5 é necessária para a proteção mediada por flagelina contra infecção por S. pneumoniae:

Camundongos BALB/c (n = 8) foram infectados com 4xl0⁵UFC de S. pneumoniae (Sp) sorotipo 1 em apenas salina (quadrado preto) ou suplementado com 1 pg de FliC Δ174-400 (círculo preto) ou com 1 pg de FliC_Ai7₄-4oo/89-96* sem unidade de sinalização de TLR5 (círculo aberto). A sobrevivência dos camundongos foi registrada diariamente. A sobrevivência do grupo tratado com FliC Δ174-400 foi estatisticamente significativa em relação ao grupo não tratado ou ao grupo tratado com FliCai74-4oo/89-96* (P<0,05). Os resultados são representativos de 1 de 2 experimentos.

EXEMPLO

Material e Métodos

Preparação bacteriana: Streptococcus pneumoniae sorotipo 1 (isolado clínico E1586) foi obtido do Laboratório de Referência Nacional - Ministério da Saúde, Uruguai (39). Estoques de trabalho foram preparados tal como segue. Caldo de levedura Todd Hewitt (THYB) (SigmaAldrich, St. Louis - MO, EUA) foi inoculado com colônias frescas de S. pneumoniae crescidas em placas de ágar sangue e incubadas a 37°C até a cultura atingir OD₆oonm de 0,7-0,9 unidades. As culturas foram conservadas a -80°C em THYB + glicerol a 12% (v/v) até 3 meses. Para a infecção de camundongo, os estoques de trabalho foram descongelados e lavados com solução salina fisiológica estéril (salina) e diluídos à concentração apropriada. O número de bactérias em estoques foi confirmado por plaqueamento de diluições em série em placas de ágar sangue.

Proteínas: Flagelina nativa (FliC) de Salmonella enterica Serovar Typhimurium SIN22 ou flagelinas recombinantes (F1íCai74-4oo θ FüCai74-4oo/89-96*) foram preparadas como descrito anteriormente (27) . A F1íC_A174-400/89-96* carrega substituição de aminoácidos

sinalização de TLR5. Todas as
quantidade de	LPS	(menos	de
determinadas	com	ensaio	de
experimentos, a	FliC	hidrolisada

(89-96) que impede a proteínas continham baixa pg de LPS por pg,

Limulus). Em alguns por tripsina (FliC/T) foi utilizada como controle. A FliC nativa foi aquecida durante minutos a 65°C antes do uso, para assegurar que as proteínas fossem na maior parte monômeros. A menos que especificado, 1 pg de FliC, FliC/T, F1íCai74-4oo ou F1íCai74400/89-96* foi coadministrada i.n. com suspensão de S.

pneumoniae. Para excluir qualquer efeito direto das flagelinas sobre a viabilidade bacteriana, as contagens de viáveis foram determinadas antes e após a incubação de S. pneumoniae com a mesma concentração de flagelina usada para o ensaio in vivo. Não houve diferenças significativas no número de bactérias recuperadas após incubação com flagelina em relação à condição controle.

Infecções em animais: BALB/c fêmeas, C57BL/6J e cepa NMRI não consanguinea (6-8 semanas de idade) foram obtidas a partir da Divisão Nacional de Laboratórios Veterinários (Uruguai) ou Laboratórios Janvier (França). Camundongos fêmea SCID (C.B-17 SCID) foram obtidos a partir das instalações de reprodução do Institut Pasteur de Lille. Estes camundongos são caracterizados pela falta de linfócitos B e T e agamaglobulinemia. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais ventiladas e manipulados em uma cabine de fluxo laminar vertical (classe II A2, ESCO, Pensilvânia, EUA) para a infecção. Todos os experimentos cumpriram com os regulamentos nacionais e institucionais e diretrizes éticas (CHEA - Universidad de la República, Uruguai e #A59107 - Institut Pasteur de Lille). Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal (i.p.) de 2,2 mg de quetamina (Richmond-Vet Pharma, Bs. As. - Argentina) mais 0,11 mg de Xilazina (Portinco, Montevideo

- Uruguai), em um volume total de 200 μΐ ou por inalação de Isoflurano (Belamont, SAS, França) utilizando um sistema sem reinalação de anestesia (DRE-Compact 150, DRE Veterinary, Louisville - EUA) . Bactérias e flagelinas foram administradas nas narinas de camundongos em 20 a 50 pl de salina. A sobrevivência dos camundongos foi registrada diariamente.

Para a depleção de granulócitos, 100 pg de anti-Gr-1 (RB6-8C5) ou controle de isotipo (HB152) foram administrados via i.p. 24h antes do desafio via i.n. com S. pneumoniae (24). Descobriu-se que a injeção de anti-Grl esgota 96,8 ± 1,2% de PMNs em lavagens bronquioalveolares (BAL) após tratamento intranasal com flagelina.

Determinação da carga bacteriana nos pulmões e baço: Os pulmões e o baço foram coletados em intervalos selecionados após o desafio intranasal e homogeneizados com um homogeneizador UltraTurrax (IKA-Werke, Staufen-Alemanha). A contagem de viáveis foi determinada por plaqueamento de diluições em série em placas de ágar sangue.

RT-PCR quantitativo (qRT-PCR): Os pulmões foram homogeneizados em reagente Trizol (Invitrogen, Califórnia, EUA) com o homogeneizador Ultraturrax e armazenados a 80°C. A extração do RNA foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Antes da síntese de cDNA, 1 pg de

RNA total foi tratado com DNAse-I (Invitrogen) e a primeira síntese de cadeia complementar de DNA (DNAc) foi realizada utilizando-se iniciadores aleatórios (Invitrogen) e transcriptase reversa M-MLV (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizada utilizando-se o kit QuantiTect® SYBR® Green PCR (Qiagen, Hilden, Alemanha), em um Rotor-Gene 6000 (Corbett, Sydney, Austrália) de acordo com o seguinte protocolo: 15 min a 95°C seguido de 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos e 60°C durante 1 min. Os iniciadores foram utilizados em uma concentração final de 0,9 μΜ. A expressão do gene de interesse foi normalizada utilizandose β-actina como gene de manutenção. Os resultados são apresentados como aumento de dobra nos níveis de RNAm em relação ao grupo tratado com salina.

Determinação da infiltração de PMN nas vias respiratórias e pulmões: Para amostragem de lavagens bronqueoalveolares (BAL), a traqueia foi canulada e 1 ml de PBS + EDTA a 1 mM foi instilado seis vezes e recuperado por aspiração suave; este processo foi repetido duas vezes. As células foram suspensas em tampão FACS-EDTA (PBS, azida a 0,1%, albumina de soro bovino 1% da Sigma-Aldrich, mais EDTA a 5 mM) . Células de pulmão foram isoladas após tratamento com colagenase/DNAse, como descrito previamente (34) e filtradas através de um filtro celular de 40 pm.

Células imunes foram separadas em um gradiente de Percoll de duas camadas (Sigma-Aldrich). Resumidamente, as células foram suspensas em solução isotônica de Percoll a 35%, cuidadosamente colocadas sobre uma solução isotônica de Percoll a 70% e centrifugadas 30 min a 2600g e temperatura ambiente sem intervalo. 0 anel superior de células correspondendo, em sua maioria, a células epiteliais foi descartado e as células imunes foram recuperadas a partir do anel de células mais próximo da camada de Percoll a 70%. As células foram filtradas utilizando um filtro celular de 100 pm, lavadas e coradas para a análise FACS. Os neutrófilos foram identificados por FSC-SSC e coloração positiva para PE ou anti-Ly-6G conjugado com Alexa Fluor 647 (clone 1A8), anti-Ly-6C conjugado com PerCP-Cy5.5 (Clone HK1.4) ou anti-CDllb conjugado com PE (clone Ml/70) da BD Biosciences ou da BioLegend, Califórnia, EUA. Após fixação com PFA a 4%, a aquisição de dados por citometria de fluxo foi realizada com um citômetro FACS Calibur com programa CellQuest 3.3 (BD Biosciences).

Análise histológica: Os pulmões foram fixados em formalina a 4% (Sigma-Aldrich) durante 24 horas e, em seguida, embebidos em parafina. Os blocos de pulmão foram seccionados a 5 pm usando um micrótomo Leica (Leica Microsystems, Wetzlar-Alemanha) e aderidos à lâminas «

silanizadas. Seções coradas por hematoxilina/eosina foram analisadas usando um microscópio Nikon Eclipse 80i Nikon e uma câmera digital Nikon DS-Ril e processadas usando o programa NIS-Elements BR 3.0 do Laboratório Imaging.

Análise estatística: 0 teste Log-rank (Mantel-Cox) foi realizado para a análise das curvas de sobrevida. Para comparação entre dois grupos, o teste de Mann-Whitney foi realizado. Valores de P<0,05 foram considerados significativos em todos os casos. A análise estatística foi realizada utilizando-se programa GraphPad Prism (programa GraphPad, San Diego, Califórnia, EUA).

Resultados

Liberação intranasal de flagelina protege camundongos contra um desafio letal com S.

pneumoniae:

Primeiro determinamos a dose mínima de S. pneumoniae que provoca

100% de mortalidade em camundongos BALB/c mediante administração intranasal (i.n.). Os animais foram infectados com doses crescentes de um isolado clínico de S.

pneumoniae sorotipo 1 e a sobrevida foi avaliada diariamente. Definiu-se 4xl0⁵ UFC como a dose letal mínima (DLM) que mata todos os animais dentro de 72 a 120 h.

A capacidade de flagelina em controlar a pneumonia pneumocócica foi então avaliada por comparação da sobrevida dos camundongos desafiados por via intranasal com S.

pneumoniae aos camundongos instilados com flagelina (FliC) e S. pneumoniae. Como um controle, os camundongos foram também desafiados com S. pneumoniae e flagelina previamente hidrolisada com tripsina (FliC/T). Como exibido na Figura IA, camundongos tratados com FliC tiveram uma taxa de sobrevida de 75%, enquanto que os animais não tratados ou tratados com FliC/T morreram dentro de 3 a 4 dias após o desafio. A proteção induzida por flagelina variou de 75 a 100% entre os diferentes experimentos independentes. A coadministração de flagelina com S. pneumoniae resultou, em 24h, em uma redução de 80 vezes na contagem de bactérias nos pulmões quando comparado com animais que receberam o S. pneumoniae isoladamente (Figura 1B). Também analisamos se a flagelina podería exercer uma resposta protetora contra a infecção pneumocócica quando administrada antes e após a infecção. Todos os animais que receberam flagelina por via intranasal 12-24h antes do desafio com pneumococos sobreviveram, enquanto que todos os camundongos de controle morreram no dia 4. Além disso, 100% de proteção também foi alcançada quando flagelina foi administrada 24 horas após o desafio. Portanto, a flagelina mostra efeitos profiláticos e terapêuticos em pneumonia pneumocócica.

A capacidade de flagelina em induzir proteção também foi avaliada em C57BL/6 e na cepa NMRI não consanguínea.

Verificou-se que a DLM de S. pneumoniae sorotipo 1 foi de

2xl0⁶ UFC	para ambas as cepas, e a proteção mediada por
flagelina	foi avaliada com 5xDLM. A administração de
flagelina	12h antes do desafio bacteriano induziu 80% de

proteção em camundongos C57BL/6; similarmente, 100% de proteção foi alcançada em animais NMRI quando flagelina foi administrada 32h a 6h antes do desafio. Flagelina também foi protetora quando coadministrada com S. pneumoniae em

C57BL/6 e	cepa NMRI, embora em um menor grau (40%) . Em
conjunto,	estes resultados mostram que o tratamento com
flagelina	é protetor em diferentes linhagens de

camundongos.

A seguir, verificou-se se a sinalização de TLR5 é

necessária	para a proteção provocada pelo tratamento com
flagelina.	Para isso, utilizou-se flagelinas F1íCai74-4oo θ

F1íCm74-4oo/89-96* recombinantes (27) . F1íCai74-4oo tem a mesma capacidade de promover sinalização de TLR5 na mucosa como a flagelina nativa, enquanto que F1íCai74-40o/89-96* carrega mutações que impedem sinalização de TLR5. Considerando que

todos os	camundongos que receberam F1íCai74-400 θ S.
pneumoniae	sobreviveram ao desafio, nenhum dos que
receberam	o mutante F1íCai74-4oo/89-96* θ fizeram (Figura 2) .

Estes resultados sugerem fortemente que a sinalização de

TLR5 é necessária para a proteção.

Tratamento com flagelina promove expressão gênica próinflamatória e exacerba a infiltração celular transitória para os pulmões durante a pneumonia pneumocócica: Analisouse, então, se o tratamento com flagelina modifica a resposta transcricional do pulmão à infecção pneumocócica. Os camundongos foram desafiados com S. pneumoniae ou com S. pneumoniae mais flagelina como antes. Outro grupo recebeu a flagelina sozinha como controle. Vinte e quatro horas após o tratamento e infecção, os pulmões foram retirados para analisar a expressão dos genes selecionados por qRT-PCR. A administração de flagelina sozinha ou em combinação com S. pneumoniae provocou um aumento dramático nos níveis de RNAm de Cxcll, Cxcl2 e Ccl20, em comparação com o desafio pneumocócico. O tratamento de flagelina também aumentou a expressão de Tnf; embora a diferença fosse consistente, não era estatisticamente significativa. A expressão de 116 foi aumentada em animais que foram desafiados e tratados com flagelina, mas não naqueles que receberam flagelina ou S. pneumoniae sozinhas, sugerindo um efeito sinérgico entre a flagelina e a infecção pneumocócica na expressão de 116. Níveis de RNAm dos genes Tgfbl, 1117a, 1117f, 1123 e 114 permaneceram inalterados entre todos os grupos comparados a animais simulados.

Para avaliar se a expressão de genes pró-inflamatórios correlacionava com inflamação e infiltração celular nas vias aéreas, foi realizada a análise histológica do tecido pulmonar obtido 24h após tratamento com flagelina e infecção. S. pneumoniae induziu infiltração celular moderada restrita a certos bronquiolos e a algumas áreas perivasculares próximas a estes bronquiolos. Ao contrário, o tratamento com flagelina, sozinha ou em conjunto com pneumococos, induziu edema e infiltração massiva de células que afetam não apenas as regiões perivasculares e peribronqueal, mas também algumas áreas do parênquima pulmonar circundante. Surpreendentemente, no dia 7, os pulmões de camundongos que receberam a flagelina e pneumococos demonstraram completa resolução da inflamação, sem infiltração celular aparente ou edema. Estes resultados sugerem que a flagelina induz uma resposta inflamatória forte, mas transitória, que promove a depuração das bactérias sem causar alteração permanente da morfologia ou função pulmonar.

Proteção induzida por flagelina requer células que expressam Gr-1, mas é independente de linfócitos B e T; O recrutamento de neutrófilos nas vias aéreas é um marco tanto da infecção pneumocócica quanto do tratamento nasal com flagelina e demonstrou-se aqui que o tratamento com flagelina e a infecção ativaram a expressão de genes envolvidos no recrutamento de neutrófilos. Assim, objetivou-se comparar a cinética de infiltração de neutrófilos em animais desafiados com S. pneumoniae e os tratados ou não com flagelina. BAL e pulmões foram coletados em diferentes intervalos após o desafio e corados com um anticorpo anti-Ly6G. O desafio pneumocócico induziu o recrutamento de PMN em todos os animais. No entanto, os camundongos tratados com flagelina no momento do desafio demonstraram uma infiltração mais rápida e pronunciada de PMN nas vias aéreas em comparação aos camundongos desafiados com S. pneumoniae sozinho. Em 24h, a infiltração de PMN atingiu todos os grupos e a diferença entre os grupos foi máxima. No entanto, por 48 horas, os números de PMN não foram mais significativamente diferentes entre os grupos. Assim, a coadministração de flagelina com pneumococos promoveu um recrutamento rápido e transitório de um grande número de neutrófilos para dentro das vias aéreas.

Subsequentemente, verificou-se se os neutrófilos foram fundamentais para a proteção mediada por flagelina. Para esta finalidade, os animais foram injetados via i.p. com um anticorpo monoclonal específico para o receptor-1 de granulócitos (Gr-1 ou Ly6G/Ly6C) ou anticorpo de controle de isotipo 24h antes do desafio. Os animais que receberam o controle isotipo e que foram tratados com FÜC sobreviveram ao desafio. Em contraste, o tratamento com anti-Gr-1 esgotou >95% de neutrófilos das vias aéreas e revogou a proteção mediada por flagelina contra S. pneumoniae. Estes resultados demonstraram que células que expressam Gr-1, provavelmente PMN, são efetores fundamentais da proteção induzida por flagelina em infecções pneumocócicas.

Como os linfócitos B e T estavam envolvidos na fase inicial da infecção por pneumococos, avaliou-se o seu papel na proteção induzida por flagelina. Camundongos SCID (deficientes para anticorpos, células T e B), bem como camundongos BALB/c imunocompetentes foram desafiados com 2xl0⁷ UFC de S. pneumoniae ou S. pneumoniae com flagelina. Pulmões e baço foram coletados 36h após a infecção para determinar as contagens de bactérias. A coadministração de flagelina promoveu depuração de bactérias nos pulmões dos camundongos SCID em uma extensão semelhante ao dos camundongos BALB/c. Ambos SCID e BALB/c também demonstraram baixa contagem de bactérias no baço mediante tratamento com flagelina, indicando que foram capazes de controlar não só local, mas também a infecção sistêmica. Camundongos SCID recrutaram números similares de PMN dentro dos pulmões e espaços alveolares 16h após a instilação de flagelina, quando comparados com camundongos BALB/c. Em resumo, estes resultados demonstram que as células que expressam Gr-1 não requerem nem linfócitos B, nem linfócitos T para desencadear proteção induzida por flagelina.

Discussão:

A imunidade inata é infecção pneumocócica como essencial

TLR, bem como de MyD88 para do trato respiratório por S. pneumoniae

Sandgren A., Katsuragi H., Meyer-Hoffert U., Wartha F., Hornef M., Normark S. e Normark B Myeloid differentiation factor 88-dependent controls bacterial growth during colonization pneumococcal disease in mice. Cell Microbiol para controlar a por requisição de colonização inicial (Albiger B., Beiter K., H. 2005.

signalling and systemic 7:1603-1615; and C. M.

type 1 humoral by MyD88 on Tollresposta vias aéreas é recrutamento de fagocitica de um importante mecanismo pode escapar das

Khan, A.

Snapper.

immunity

Q., Q. Chen, Z.-Q. Wu,

J. C. Paton,

2005. Both innate immunity and to Streptococcus pneumoniae are mediated but differ in their relative leveis of dependence

Like Receptor 2. Infect. Immun. 73:298-307.). A imune à infecção pneumocócica das caracterizada por um grande e rápido neutrófilos nos pulmões, e a morte pneumococos por PMN é considerada de defesa.

No entanto, S. pneumoniae defesas inatas do hospedeiro, inibindo ou atrasando a deposição do complemento e a explosão respiratória de fagócitos. Assim, o influxo de neutrófilos é muitas vezes ineficaz na limpeza da infecção até que anticorpos sorotipo-especificos sejam produzidos e ignorem a inibição de deposição do complemento, aumentando a opsonofagocitose. Neste estudo avaliou-se se a administração exógena de um agonista de um TLR naturalmente não engajado por S. pneumoniae, denominado flagelina agonista TLR5, poderia fortalecer a imunidade inata para controlar a infecção pneumocócica respiratória aguda. Verificou-se que a administração local de flagelina promoveu a sobrevida de camundongos desafiados com uma dose letal de S. pneumoniae sorotipo 1, aumentando a depuração bacteriana local e sistêmica. 0 tratamento com flagelina foi eficaz quando realizado antes, durante e após o estabelecimento da infecção em camundongos BALB/c, C57BL/6 e NMRI.

Demonstrou-se que a administração in vivo de flagelina regula positivamente a expressão de citocinas próinflamatórias. Demonstrou-se no presente documento que a coadministração de flagelina no momento do desafio de S. pneumoniae também regula positivamente a expressão de genes ativadores/quimiocina específicos para PMN Cxcll e Cxcl2 e também Tnf e Ccl20 nos pulmões, enquanto que S. pneumoniae sozinha estava induzindo fracamente estes genes. De acordo com o perfil de expressão de citocina e quimiocina, uma análise de seções de tecido pulmonar demonstrou uma infiltração maciça de células nas regiões peribronqueal e perivascular, que foi mais pronunciada nos pulmões dos animais tratados com flagelina do que nos animais infectados não tratados. Vale mencionar que, a despeito da resposta inflamatória pronunciada induzida por flagelina, o tecido pulmonar foi totalmente recuperado ao dia 7, enquanto que os animais não tratados morreram de infecção. A análise das amostras de BAL sugeriu que a administração do agonista TLR5 no momento do desafio pneumocócico induziu um recrutamento acelerado e mais pronunciado de PMN. A infiltração de PMN foi transitória, atingiu um pico em 24h e regrediu para os níveis de estado estacionário em 40h. O esgotamento de células que expressam Gr-1, a maioria provavelmente de PMN, aboliu a proteção demonstrando que estas células são necessárias para controlar a infecção pulmonar pneumocócica. A natureza auto-limitante da resposta inflamatória mediada por flagelina é um achado muito relevante, uma vez que a inflamação exacerbada podería ser associada à falha de barreira pulmonar e função. Os mecanismos moleculares que controlam a resposta de TLR5 não só regulam positivamente os genes pró-inflamatórios, mas também desencadeiam a finalização da resposta. Portanto, o tratamento da mucosa com flagelina pode ser considerado como uma terapia contra a pneumonia pneumocócica, reforçando a infiltração de neutrófilos e a limitação concomitante de 5 inflamação que merece avaliação adicional em ensaios clínicos.

Além de PMN, vários estudos também relataram que os linfócitos T e B, bem como anticorpos naturais podem desempenhar um papel importante no controle inicial da 10 pneumonia pneumocócica. Foi demonstrado que os linfócitos T se acumulam nas zonas de inflamação peribronqueal nas fases iniciais da resposta imune e estão envolvidos na defesa contra pneumococos, uma vez que camundongos MHC classe IIdeficientes sem células T CD4⁺ são mais suscetíveis a 15 infecção em comparação às suas contrapartes de tipo selvagem. Foi demonstrado que camundongos CD19 deficientes, que têm deficiência no desenvolvimento de células Bla e produção de anticorpos naturais, têm suscetibilidade aumentada à infecção pneumocócica. No entanto, os 20 resultados apresentados no presente mostram que nem células T, nem células B são necessárias para a depuração de bactérias local e sistêmica induzida por flagelina. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem fortemente que a alteração na dinâmica de PMN resulta em morte eficaz dos pneumococos, mesmo na ausência de linfócitos B e T.

Nossos resultados também demonstraram que a sinalização de TLR5 é necessária para a proteção induzida por flagelina. Nas vias aéreas, TLR5 é expresso por macrófagos alveolares e células epiteliais, o que sugere que estas células residentes podem ser peças chave na indução de defesas inatas de proteção contra S. pneumoniae após tratamento com flagelina. Em conformidade com isso, estudos recentes sugeriram que o epitélio das vias aéreas é o tecido TLR5-ativado envolvido na produção de quimiocinas e recrutamento de PMN em resposta às bactérias flageladas. Por outro lado, os neutrófilos murinos expressam TLR5, assim, a sinalização de TLR5 também pode ativar diretamente PMN e aumentar a sua capacidade de combater S. pneumoniae. De um modo semelhante, foi anteriormente demonstrado que o calor matou Haemophilus influenzae e pode aumentar especificamente a capacidade dos PMN de matar pneumococos de forma Nodl-dependente.

As terapias atuais para a profilaxia e tratamento de infecção por S. pneumoniae possuem limitações na prevenção ou cura de doenças pneumocócicas, assim, novas estratégias de intervenção imune ainda são necessárias. Vários relatórios demonstraram que a administração de lisados bacterianos e de bactérias mortas por calor estimulam respostas protetoras contra a infecção. Contudo, a natureza indefinida destas preparações é geralmente um problema na concepção de fármacos para uso humano. Nossos resultados demonstraram que a estimulação local com uma única e bem caracterizada molécula, especificamente flagelina, é 5 suficiente para aumentar as defesas imunes inatas do pulmão e controlar pneumonia pneumocócica, destacando os benefícios do uso dos Padrões Moleculares Associados a Patógenos como base para o desenvolvimento de terapias antimicrobianas.

REFERÊNCIAS

Ao longo do presente pedido, diversas referências descrevem o estado da técnica ao qual esta invenção pertence. As divulgações destas referências são incorporadas ao presente por referência na presente descrição.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um agonista TLR5 caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento para tratamento de uma infecção do trato respiratório que resulta de Streptococcus pneumoniae, em que o agonista TLR5 é um polipeptídeo de flagelina.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de flagelina é isolado a partir de uma bactéria selecionado do grupo que consiste em Escherichia, tal como, E. coli; Enterobacter; Erwinia; Klebsiella; Proteus; Salmonella, tal como, Salmonella entérica serovar Typhimurium; Serratia, tal como, Serratia marcescens; Shigella; Bacilli, tal como, B. subtilis e B. licheniformis; Pseudomonas, tal como, P. aeruginosa e Streptomyces.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de amino ácidos do referido polipeptídeo de flagelina é selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID

NO: 3.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência do referido polipeptídeo de flagelina compreende:

Petição 870190023164, de 11/03/2019, pág. 50/54

2/4

a) um peptídeo N-terminal que possui uma sequência de aminoácido que começa pelo resíduo de aminoácido localizado na posição 1 da SEQ ID NO: 3 e termina no resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em qualquer um dos resíduos de aminoácidos localizados nas posições 99 a 173 da SEQ ID NO: 3; e

b) um peptídeo C-terminal que possui uma sequência de aminoácidos que começa no resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em qualquer um dos resíduos de aminoácidos localizados nas posições 401 a 406 da SEQ ID NO: 3 e termina no resíduo de aminoácido localizado na posição 494 da SEQ ID NO: 3;

em que o referido peptídeo N-terminal é diretamente ligado ao referido peptídeo C-terminal, ou o referido peptídeo N-terminal e o referido peptídeo C-terminal são indiretamente ligados, um ao outro, por meio de uma cadeia espaçadora.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado

pelo fato de que o referido peptídeo N-terminal é selecionado do grupo que consiste na sequência de aminoácidos 1-99, 1-137, 1-160 e 1 -173 da SEQ ID NO: 3. 6. Uso, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo C-

Petição 870190023164, de 11/03/2019, pág. 51/54

3/4 terminal é selecionado do grupo que consiste na sequência

de aminoácidos 401-494 . e 406-494 da SEQ ID NO : 3. 7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que os referidos peptídeos N-terminal e C-terminal consistem nas sequências de aminoácidos 1-173 e 401-494 da SEQ ID NO: 3, respectivamente. 8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que os referidos peptídeos N-terminal e C-terminal consistem nas sequências de aminoácidos 1-160 e 406-494 da SEQ ID NO: 3, respectivamente. 9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que os referidos peptídeos N-terminal e C-terminal consistem nas sequências de aminoácidos 1-137 e 406-494 da SEQ ID NO: 3, respectivamente. 10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações

4 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo N-terminal e o referido peptídeo C-terminal são indiretamente ligados, um ao outro, por meio de uma cadeia espaçadora que consiste em uma sequência de peptídeo NH₂Gly-Ala-Ala-Gly-COOH (SEQ ID NO: 4).

Petição 870190023164, de 11/03/2019, pág. 52/54

4/4

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido asparagina localizado na posição 488 da SEQ ID NO: 3 é substituído por uma serina.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo de flagelina compreende um resíduo de metionina adicional na extremidade N-terminal.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado para ser compatível com administração intranasal ou administração pulmonar.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o medicamento é formulado na forma de aerossol, spray, para nebulização ou sob a forma de gotas.