KR102044421B1 - 탄저균 특이적 용균능을 갖는 항균 단백질의 안정한 보관을 위한 동결건조 제형 및 이의 제조방법 - Google Patents

탄저균 특이적 용균능을 갖는 항균 단백질의 안정한 보관을 위한 동결건조 제형 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 탄저균(Bacillus anthracis) 특이적 항균 단백질; 및 상기 항균 단백질 특이적 안정화제;를 포함하는, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형이 제공된다.

Description

탄저균 특이적 용균능을 갖는 항균 단백질의 안정한 보관을 위한 동결건조 제형 및 이의 제조방법{FREEZE-DRIED FORMULATION FOR STABLE STORAGE OF ANTIBACTERIAL PROTEIN HAVING LYTIC ACTIVITY SPECIFIC TO BACILLUS ANTHRACIS AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}
본 발명은 탄저균 특이적 용균능을 갖는 항균 단백질의 안정한 보관을 위한 동결건조 제형 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
탄저균(Bacillus anthracis)은 그람 양성의 호기성균으로 아포를 형성하며 편모와 운동성은 없다. 감염동물의 혈액과 조직 내에서 단간균, 쌍간균 또는 연쇄간균으로 관찰되며, 생체 내에서는 아포를 형성하지 않는다. 탄저균은 "탄저" 또는 "탄저병"으로 알려져 있는 감염성 질환의 원인균이다. 탄저병은 주로 초식동물 및 잡식동물에서 발생하는 급성 및 열성전염병으로서 발열, 호흡곤란 등으로 갑자기 폐사를 초래하는 가축의 제2종 법정전염병이다. 탄저균은 사람에게도 감염할 수 있어 인수공통 감염균으로 분류될 수 있으며 생물무기로도 악용될 수 있다. 동물에서 탄저의 주요 감염경로는 탄저균에 오염된 토양이나 목초 등에 의한 경구감염이며, 상처를 통한 피부감염 또는 호흡기 감염도 흔히 일어난다. 또한 흡혈곤충도 감염원으로 작용할 수 있다.
탄저는 소, 양, 산양, 노새, 개 등 대부분의 포유동물에서 발생할 수 있으며, 감염된 동물의 축산물을 섭취할 경우에 사람에게도 발생할 수 있다. 탄저병의 잠복기는 1 내지 5일이며, 임상증상은 증상이 나타난 후 1 내지 2 시간 후 폐사하는 심급성형의 경우와 24시간 내에 폐사하는 급성형이 있고, 일반적으로 갑작스런 발열, 호흡곤란, 침울 등을 볼 수 있다.
우리나라 탄저병 발생은 1907년에 최초 공식보고가 있은 이후에 1930년대까지 동물에서 흔히 발생하였으나, 백신 개발 등으로 동물에서의 발병은 급격히 감소하여 최근에는 산발적으로만 발생할 뿐 그 사례가 거의 없다.
그러나 탄저균은 생물무기로 악용될 가능성이 높다. 생물테러 등에 있어서는 에어로졸 상태의 포자가 주로 사용되는데, 기도를 통해 들어온 탄저균이 상부 기도에 잠복해 있다가 폐 주위의 림프계에 침투하고 탄저균 독소는 폐 조직에 출혈, 괴사, 부종 등을 유발시켜 초기에는 감기와 비슷한 증상을 일으키지만 결국에는 호흡 곤란에 의한 사망에 이르게 된다. 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)는 탄저균을 범주A(Category A) 병원체에 포함시켜 위험성이 가장 높은 세균종으로 취급하고 있다.
이러한 이유로 탄저균에 의한 생물테러나 생물학전을 대비해야 할 필요성이 있으나, 탄저의 매우 빠른 질병 발전 특징으로 인하여 효과적인 감염 처치 방안의 마련이 쉽지 않다. 통상의 페니실린 제제 등 항생제 치료로는 일부 경우에 효과를 기대할 수 있지만 급성 경과를 보이는 경우에는 치료 효과를 기대하기 어렵다.
따라서 신속한 치료 효과를 제공해 줄 수 있는 방안의 마련 및 이에 효과적으로 활용될 수 있는 약학적 제제의 개발이 매우 절실한 실정이다. 신속한 치료 효과를 제공할 수 있는 수단으로 본 발명자들은 탄저균에 대하여 신속한 용균 효과를 제공해 줄 수 있는 항균 단백질 AP50-31의 활용을 제안한 바 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2017-0052946호). 항균 단백질 AP50-31은 탄저균에 대하여 우수한 항균 활성을 가지고 있다.
이러한 항균 단백질 AP50-31의 의료현장 또는 전장에서의 편리하고 안정된 취급, 운반, 보관, 및 사용을 위해서는 액상의 동결 형태의 제형이나 액상의 냉장 보관 형태보다는 상온 취급이 허용되는 동결건조 제형의 확보가 필요하다.
다만, 항균 단백질 AP50-31의 경우에는 항체 단백질이나 호르몬 제제들과 같은 기존의 단백질 제제들과는 달리 효소적 활성이 잘 보존되어야 하는 특성이 있고, 구조적으로도 활성 영역 및 세포벽 결합 영역이 있는 등 다소 복잡하다. 이에 더하여 AP50-31 관련 연구의 수행이 최근에서야 진행되어 아직 관련 정보가 충분히 확보되어 있지 않기 때문에 동결건조 제형 개발에 있어서도 상당한 연구 및 노력이 필요하다. 통상적으로 단백질의 동결건조 제형 개발에 적용되던 알려진 조성과 방법을 그대로 적용해서는 안정적 보관능을 갖는 동결건조 제형이 달성되지 않기 때문에, 항균 단백질 AP50-31을 안정적으로 보관할 수 있는 동결건조 제형의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2017-0052946호
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 병원성 박테리아인 탄저균에 특이적인 항균 단백질의 보관 안정성을 향상시킬 수 있는 동결건조 제형 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 탄저균(Bacillus anthracis) 특이적 항균 단백질; 및 상기 항균 단백질 특이적 안정화제;를 포함하는, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 안정화제는 인산나트륨(sodium phosphate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 및 플루로닉(pluronic) F68을 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 항균 단백질은 Escherichia coli BL21-pBAD-AP50-31(수탁번호 KCTC 12708BP)로부터 유래된 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 동결건조 제형은 항생제, 소독제, 살균제 또는 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 단백질, 및 상기 항균 단백질의 동결건조 제형 특이적 안정화제의 혼합 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 혼합 용액을 동결시키는 단계; (c) 동결된 상기 혼합 용액을 일정 온도에서 건조시키는 단계; 및 (d) 건조된 상기 혼합 용액을 일정 시간 간격에 따라 단계적으로 승온하면서 건조시키는 단계;를 포함하는, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형 제조방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 혼합 용액 내 상기 항균 단백질의 농도가 0.1㎎/㎖ 내지 30㎎/㎖일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 안정화제는 인산나트륨(sodium phosphate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 및 플루로닉(pluronic) F68을 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 혼합 용액 내 상기 인산나트륨의 농도가 1mM 내지 50mM일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 혼합 용액 내 상기 폴리비닐피롤리돈의 농도가 1%(w/v) 내지 10%(w/v)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 혼합 용액 내 상기 플루로닉 F68의 농도가 0.1%(w/v) 내지 2%(w/v)일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 혼합 용액의 pH가 7.2 내지 9일 수 있다.
본 발명의 동결건조 제형은 탄저균 특이적 용균능을 가지는 항균 단백질 AP50-31의 안정성을 향상시킬 수 있는 특정 안정화제 성분을 포함함으로써, 동결보관 또는 냉장보관 해야 하는 액상 제형에 비해 취급, 운반, 보관, 사용 등에 있어 높은 안정성과 편리성을 제공할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항균 단백질 AP50-31의 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 동결건조 제형의 보관 안정성을 확인하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2a 및 2b는 각각 비교예 1의 0주차, 12주차 분석 결과이다. 도 2c 및 2d는 각각 비교예 2의 0주차, 12주차 분석 결과이다. 도 2e 및 2f는 각각 비교예 3의 0주차, 12주차 분석 결과이다. 도 2g 및 2h는 실시예의 0주차, 12주차 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 동결건조 제형의 보관 안정성을 확인하기 위한 생물학적 활성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3a 및 3b는 각각 비교예 1의 0주차, 12주차 분석 결과이다. 도 3c 및 3d는 각각 비교예 2의 0주차, 12주차 분석 결과이다. 도 3e 및 3f는 각각 비교예 3의 0주차, 12주차 분석 결과이다. 도 3g 및 3h는 실시예의 0주차, 12주차 분석 결과이다. (+)는 항균 단백질 용액을 첨가한 경우이고, (-)는 항균 단백질 대신 생리식염수를 첨가한 경우이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 탄저균(Bacillus anthracis) 특이적 항균 단백질; 및 상기 항균 단백질 특이적 안정화제;를 포함하는, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형이 제공된다.
상기 항균 단백질은 탄저균을 특이적으로 용균시킬 수 있는 활성을 갖는 단백질로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항균 단백질 AP50-31일 수 있다. 또한, 상기 탄저균 특이적 항균 단백질 AP50-31은 252개의 아미노산으로 구성되며, 분자량은 약 27.7kDa일 수 있다.
상기 항균 단백질 AP50-31의 아미노산 서열은 당업자에 의해 일부 변형될 수 있다. 이러한 변형에는 아미노산 서열의 일부 치환, 아미노산 서열의 일부 첨가, 및 아미노산 서열의 일부 결실이 포함된다. 그러나 본 발명에서 개시하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 사용하는 것이 가장 바람직할 수 있다.
항균 단백질 AP50-31의 탄저균에 대한 항균력은 본 발명자들의 이전 실험을 통해 확인된 바 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2017-0052946호).
또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 탄저균 특이 항균 단백질 AP50-31은 본 발명자들에 의해 개발 제작되어 2014년 11월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁된 균주 Escherichia coli BL21-pBAD-AP50-31(수탁번호 KCTC 12708BP)로부터 유래된 것일 수 있다.
한편, 상기 동결건조 제형은 상기 항균 단백질의 보관 안정성을 향상시키기 위한 안정화제를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 안정화제는 인산나트륨(sodium phosphate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 및 플루로닉(pluronic) F68을 포함할 수 있다. 상기 플루로닉 F68은 폴록사머(poloxamer) 188로도 불리는 물질을 의미한다.
상기 안정화제는 상기 항균 단백질에 특이적으로 작용하여 보관 안정성을 향상시킬 수 있는 성분으로, 그 외 다른 성분의 조합으로는 상기 항균 단백질 특이적인 보관 안정성 향상을 구현할 수 없다.
상기 동결건조 제형은 통상 약학적으로 허용되는 매질로 재용해(reconstitution)시켜 사용할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는 매질"은 생물체를 자극하지 않고 투여 약물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 통상적으로 의료현장에서 사용되는 주사용수(water for injection)나 식염수(normal saline)를 그 예시로 들 수 있다.
상기 동결건조 제형에 포함되는 탄저균 특이 항균 단백질은 상술한 바와 같이 탄저균을 특이적으로 용균시키므로, 상기 동결건조 제형은 탄저균에 의해 유발되는 질환의 처치에 효과를 나타낸다. 따라서 상기 동결건조 제형은 항생제, 소독제, 살균제, 치료제 등으로 구현되어 탄저균에 의해 유발되는 다양한 질환의 처치에 활용될 수 있다. 또한 생물테러나 생물학전으로 인한 탄저균 감염 처치에도 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "탄저균에 의해 유발되는 질환"은 탄저균 감염에 의한 발열, 호흡 곤란 등을 수반하는 증상을 총칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "처치" 또는 "치료"는 탄저균에 의해 유발된 질환의 억제 및 탄저균에 의해 유발된 질환의 병적 상태를 경감하는 모든 행위를 의미한다.
상기 동결건조 제형을 이용한 탄저균 감염을 처치하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 해당 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식을 따를 수 있다. 예를 들어 상기 동결건조 제형을 약학적으로 허용되는 매질을 사용하여 재용해시켜 용액 형태로 제조한 다음에 이를 경구투여, 비경구투여 또는 비강 분무 등을 통해 투여할 수 있으며, 환경에 분무하는 방식으로도 사용할 수 있다.
또한, 상기 동결건조 제형을 재용해시켜 제조한 용액의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 연령, 체중, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 단백질, 및 상기 항균 단백질의 동결건조 제형 특이적 안정화제의 혼합 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 혼합 용액을 동결시키는 단계; (c) 동결된 상기 혼합 용액을 일정 온도에서 건조시키는 단계; 및 (d) 건조된 상기 혼합 용액을 일정 시간 간격에 따라 단계적으로 승온하면서 건조시키는 단계;를 포함하는, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형 제조방법이 제공된다.
상기 안정화제는 인산나트륨, 폴리비닐피롤리돈 및 플루로닉 F68을 포함할 수 있으며, 상기 항균 단백질 및 안정화제의 성분 및 효능에 관해서는 전술한 것과 같다.
상기 (a) 단계에서는 항균 단백질 용액 및 안정화제 용액을 별도로 준비한 뒤 혼합할 수 있고, 항균 단백질 및 안정화제를 혼합한 뒤 용액으로 제조할 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이 때, 상기 혼합 용액 내 상기 항균 단백질의 농도는 최종 동결건조 제형의 활용 목적에 따라 조정될 수 있으며, 바람직하게는 0.1㎎/㎖ 내지 30㎎/㎖범위에서 조정될 수 있다.
또한, 상기 혼합 용액 내 상기 인산나트륨의 농도가 1mM 내지 50mM일 수 있고, 상기 폴리비닐피롤리돈의 농도가 1%(w/v) 내지 10%(w/v)일 수 있으며, 상기 플루로닉 F68의 농도가 0.1%(w/v) 내지 2%(w/v)일 수 있다.
상기 항균 단백질 및 안정화제가 각각 전술한 범위 내로 포함되는 혼합 용액은 pH가 7.2 내지 9일 수 있고, 바람직하게는 8일 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 혼합 용액을 동결하기 위해 저온 처리할 수 있다. 구체적으로 상기 혼합 용액을 -80℃에서 24시간 동안 저온 처리할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 동결된 혼합 용액을 건조시키는 단계로, 상기 (b) 단계에 비해 높은 온도를 일정하게 유지하면서 건조시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 동결된 혼합 용액을 -20℃에서 16시간 동안 건조시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (d) 단계에서는 상기 (c) 단계에서 건조된 혼합 용액을 재차 건조시킬 수 있다. 이 때, 상기 (c) 단계에서 일정 온도를 유지하면서 건조시키는 것과 달리, 상기 (d) 단계에서는 일정 시간 간격에 따라 단계적으로 승온하면서 건조시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 (d) 단계에서는 1시간 간격으로 10℃씩 승온하면서 4시간 동안 건조시켜 최종 온도가 20℃에서 종료될 수 있도록 조절할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 동결건조 공정의 세부적인 조건은 전술한 내용에 한정되지 않으며, 당업자가 적절히 변경할 수 있는 범위 내에서 그 일부 변경도 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항균 단백질 제조
본 실시예에서는 본 발명자들에 의해 2014년 11월 12일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁된 균주인 Escherichia coli BL21-pBAD-AP50-31(수탁번호 KCTC 12708BP)을 생산균주로 사용하였다.
50㎍/㎖ 카나마이신이 포함된 LB배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, 염화나트륨 10g/L) 20㎖에 Escherichia coli BL21-pBAD-AP50-31을 20㎕ 첨가하여 접종한 다음에 37℃에서 6 내지 7 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액 20㎕를 50 ㎍/㎖ 카나마이신이 포함된 LB배지 200㎖에 접종한 다음에 37℃에서 한밤동안 진탕 배양하였다.
다음날 50㎍/㎖ 카나마이신이 포함된 LB배지 5L가 들어 있는 배양기에 한밤 배양한 배양액을 OD600(600nm에서의 흡광도)이 0.1이 되도록 첨가하였다. 200rpm의 속도로, 분당 5L의 통기(aeration)하고, 37℃ 온도 조건에서 배양을 실시하였다. 세포 농도가 600nm에서의 흡광도 기준으로 0.3 내지 0.35가 되었을 때, 배양 온도를 30℃로 낮추었다. 배양 온도 변경 후에 약 30분 정도 시간이 경과하여 세포 농도가 600nm에서의 흡광도 기준으로 0.5가 되었을 때, 최종 농도가 0.2%가 되도록 L-아라비노즈를 첨가하여 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 탄저균 특이 항균 단백질 AP50-31의 발현을 유도하였다. 발현 유도 후에 30℃에서 4시간 동안 배양을 추가 실시하였다.
배양 종료 후, 세포 배양액을 취하여 6,000rpm에서 10분간 4℃에서 원심분리하여 세포 침전물을 회수하고, 회수한 세포 침전물은 200㎖의 20mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.5) 완충액에 부유시켰다. 준비된 세포 부유액에 대하여 초음파 분쇄법을 적용하여 세포를 파쇄하였는데, 상기 초음파 분쇄법의 적용 조건은 3초간 초음파를 가하여 세포를 깨고 3초간 멈추는 것을 총 15분간 반복하여 실시하였으며, 이때 얼음 조(ice bath) 상태로 실시하였다.
세포 파쇄 후에 세포 파쇄액을 13,000rpm에서 20분간 4℃에서 원심분리하여 상등액을 얻었고, 얻어진 상등액을 통상의 양이온-교환 크로마토그래피(cation-exchange chromatography) 정제 공정을 통하여 정제하였다.
정제 공정을 간단히 설명하면 다음과 같다. 본 실시예에서의 양이온-교환수지(cation-exchange resin)로는 5㎖의 HiTrapTM SP HP(GE Healthcare)를 사용하였다. 크로마토그래피는 칼럼을 Buffer A(20mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH 7.5)로 미리 평형화시킨 다음 실시하였고, 시료를 칼럼에 적하한 다음에는 5㎖/분의 유속(flow rate)으로 buffer A를 5CV 흘려주어 세척을 실시하였다. 세척 후에는 5㎖/분의 유속으로 buffer A에서 buffer B(20mM 트리스-염산(Tris-HCl), 500mM 염화나트륨, pH 7.5)로의 농도 기울기(gradient)가 0%에서 100%가 되게 하는 조건으로 크로마토그래피를 수행하였다.
이 과정에서 목적하는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 탄저균 특이 항균 단백질 AP50-31이 용출되며, 또한 상기 공정을 통하여 탄저균 특이 항균 단백질 AP50-31을 90% 이상의 순도로 확보할 수 있었다. 도 1에서는 크로마토그래피 정제 공정을 이용하여 정제한 항균 단백질 AP50-31을 전기영동으로 분석한 결과를 확인할 수 있다. 도 1에서 레인 M은 단백질 크기 마커이다.
실시예 2: 동결건조 제형 제조 및 안정성 분석
상기 실시예 1에서 제조한 탄저균 특이적 항균 단백질 AP50-31을 유효성분으로 포함하고, 취급 및 보관 안정성이 향상된 약학적 조성물의 동결건조 제형을 제조하였다.
약학적 조성물에 적용 가능한 다양한 완충액 조건들, 여러 종류의 안정화제, 여러 종류의 첨가제를 적용하여 도출되는 여러 조성의 제형 후보들에 탄저균 특이 항균 단백질 AP50-31까지 첨가한 용액 시료를 준비한 다음에 이를 동결건조하였다. 이후, 각각의 동결건조체(동결건조 산물)를 37℃에서 12주 동안 보관하였을 때의 항균 단백질 AP50-31의 안정성 유지 정도를 조사하는 방식으로 항균 단백질 AP50-31에 적합한 동결건조 제형을 제조하였다.
항균 단백질 AP50-31의 안정성 유지에 관련하여서는 구조적 완전성(integrity)이 90% 이상 유지되고 생물학적 활성으로 TOD50(초기 세균 흡광도의 절반으로 감소하는 데까지 걸리는 시간) 값이 초기 값에서 초기 값의 20% 이상 수준으로 증가되지 않는 것을 최소 목표 성능으로 설정하여 제형 개발을 수행하였다.
구체적으로 다양한 조성으로 준비된 항균 단백질 AP50-31을 포함하고 있는 용액에 대하여 다양한 방식(건조 단계, 각 단계의 적용 시간, 온도 등 세부 조건에서 다양한 조건들을 적용)으로 동결건조를 실시한 다음에, 이를 통하여 얻어진 동결건조체를 37℃에서 12주 동안 보관한 다음에 안정성 유지 정도가 우수한 제형과 이에 적용되었던 동결건조 방법을 선정하는 방식으로 수행하였다.
동결건조 제형에서의 항균 단백질 AP50-31의 구조적 안정성 조사는 역상(reverse phase) 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하였다. 동결건조 제형에서의 항균 단백질 AP50-31의 생물학적 활성 측면의 안정성은 혼탁도 감소 분석법(turbidity reduction assay)을 통하여 항균 단백질 AP50-31의 생물학적 활성을 조사하는 방식으로 조사하였다. 이 때, 구조적 안정성은 항균 단백질 AP50-31의 분해(degradation), 항균 단백질 AP50-31의 응집(aggregation), 또는 항균 단백질 AP50-31의 전하(charge) 관련 변화가 일어나지 않는 정도를 의미한다.
역상 고성능 액체 크로마토그래피를 사용한 항균 단백질 AP50-31의 구조적 안정성 조사는 다음과 같이 실시하였다. 칼럼은 RP column(Phenomenex column C18, #00G-4053-E0)을 사용하였고, 이동상으로는 buffer A(0.05% TFA in DW)와 buffer B(0.05% TFA in ACN)를 아래 표 1과 같이 혼합하는 조건으로 적용하였다. HPLC 분석 시에 시료 적하 부피(sample loading volume)는 100㎕로 하였고, 유속은 1㎖/min으로 하였으며, 분석 시간은 총 40분간으로 하였다.
Time (min) % Gradient
(Buffer A)		 % Gradient
(Buffer B)		 Comment
0 100% 0% Initial condition, Sample injection
5 100% 0% 1st elution
5.01 100% 0% Begin 2nd gradient elution
25.00 0% 100% End 2nd gradient elution
30.00 0% 100% Begin wash
35.00 0% 100% End wash
35.01 100% 0% Begin equilibration
40.00 100% 0% End equilibration
혼탁도 감소 분석법을 이용한 항균 단백질 AP50-31의 생물학적 활성 조사는 다음과 같이 실시하였다. 본 실험에서는 탄저균 유사 균종인 바실러스 시리우스(Bacillus cereus)를 사용하였다. 탄저균 유사 균종인 바실러스 시리우스의 대체 사용은 항균 단백질 AP50-31의 탄저균에 대한 항균력이 이미 선행 연구에서 입증되었기에 실험의 편의성 때문에 취해진 것이다(대한민국 공개특허공보 제10-2017-0052946호).
구체적으로, 생리식염수에 탄저균 유사 균종인 바실러스 시리우스 NRS 731 균을 600㎚에서 흡광도가 0.7 정도가 되도록 부유시킨 부유액을 준비하였다. 준비된 부유액 0.9㎖를 담은 튜브에 0.1㎖의 AP50-31 용액(시험군) 또는 생리식염수(대조군)를 첨가해 주었다. 그리고 나서 600㎚에서 흡광도를 20분간 측정하여 TOD50(초기 세균 흡광도의 절반으로 감소하는 데까지 걸리는 시간) 값을 조사하였다. 이 때, 사용한 AP50-31 용액은 다음과 같이 제조하여 사용하였다. 앞서 제조한 동결건조 제형의 약학적 조성물에 주사용수 1㎖를 첨가하여 1㎎/㎖의 AP50-31이 포함된 용액을 1차적으로 제조하였고, 여기에 다시 주사용수를 추가적으로 첨가하여 항균 단백질 AP50-31의 최종농도가 10㎍/㎖이 되게 희석하여 준비하였다.
상기한 바와 같은 항균 단백질 AP50-31의 구조적 특징, 생물학적 특징, 물리적 특징을 고려하여 여러 후보 제형을 고안하고 이의 적합성을 조사하는 실험을 반복 수행하여 표 2에 제시한 것과 같이 항균 단백질 AP50-31의 안정한 동결건조 제형 제조에 적합한 조성과 동결건조 공정을 개발하였다.
항목 내용
조성 1㎎/㎖AP50-31, 10 mM 인산나트륨, 5%(w/v) 폴리비닐피롤리돈, 0.5%(w/v) 플루로닉 F68, pH 8.0
동결건조 공정 단계 1)
동결건조 시킬 용액을 -80에서 하루 동안 보관하여 동결시킴
단계 2)
동결시킨 시료를 동결건조기에 넣은 후에 -20 조건에서 16시간 동안 건조를 실시
단계 3)
“단계 2” 종료 후에 1시간마다 10씩 상승시키면서 건조를 4시간 동안 계속 실시(최종 종결 시의 온도: 20)
최종 선정한 조성 및 동결건조 공정의 우수성은 다음과 같이 확인하였다. 각각의 동결건조 제형의 제조 공정은 상기 표 2의 방법에 따르되, 포함 성분을 달리하여 제조하였다. 구체적으로, 상기 표 2의 조성을 포함하는 제형(실시예), 항균 단백질 정제 분획만을 포함하는 제형(비교예 1), 상용화된 단백질 의약품 중 혈소판 감소증 치료제인 Nplate 성분(1.2㎎/㎖ histidine, 15㎎/㎖ sucrose, 30㎎/㎖ mannitol, 0.03 ㎎/㎖ polysorbate 20, pH 8.0)을 포함하는 제형(비교예 2), 및 상용화된 단백질 의약품 중 항체의약품인 Herceptin 성분(3.36㎎/㎖ histidine HCl, 2.16㎎/㎖ histidine, 136.2㎎/㎖ trehalose, 0.6㎎/㎖ polysorbate 20, pH 8.0)을 포함하는 제형을 각각 제조한 뒤, 동결건조 산물들을 37℃에서 12 주 동안 보관했을 때의 안정성을 조사하는 방식으로 본 발명의 효과를 확인하였다.
안정성 조사는 HPLC 분석과 생물학적 활성을 조사하는 것 모두를 수행하였고, 초기 값을 파악하기 위해 0주차 시점에서도 분석을 실시하였다. HPLC 분석 결과는 표 3 및 도 2에 나타내었으며, 생물학적 활성 분석 결과는 표 4 및 도 3에 나타내었다.
면적값(초기 대비 상대 면적 %)
비교예 1 비교예 2 비교예 3 실시예
0주 시점 12주 시점 0주 시점 12주 시점 0주 시점 12주 시점 0주 시점 12주 시점
2865955
(100%)		 388878
(13.56%)		 2896583
(100%)		 796142
(27.49%)		 2804561
(100%)		 2022412
(72.11%)		 2628321
(100%)		 2623130
(99.80%)
TOD50(분)
비교예 1 비교예 2 비교예 3 실시예
0주 시점 12주 시점 0주 시점 12주 시점 0주 시점 12주 시점 0주 시점 12주 시점
5.5 도출되지 않음 5.4 도출되지 않음 5.6 도출되지 않음 5.6 6.0
상기 결과에서 알 수 있듯이, 상기 실시예 1 및 2에 따라 제조한 항균 단백질 AP50-31을 유효성분으로 포함하고 인산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 및 플루로닉 F68을 주요 안정화 성분으로 포함하는 동결건조 제형은 37℃에서의 12주 동안 보관에서 매우 안정하여 항균 활성이 효과적으로 유지되었다.
이상의 결과로 본 발명의 탄저균 특이 항균 단백질 AP50-31을 포함한 동결건조 제형이 상온 보관능을 포함한 우수한 보관 안정성을 제공해 줄 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
한국생명공학연구원 KCTC12708BP 20141112
<110> Agency for Defense Development <120> FREEZE-DRIED FORMULATION FOR STABLE STORAGE OF ANTIBACTERIAL PROTEIN HAVING LYTIC ACTIVITY SPECIFIC TO BACILLUS ANTHRACIS AND METHOD FOR PREPARING THE SAME <130> APC-2017-0334 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibacterial protein having lytic activity specific to Bacillus anthracis <400> 1 Met Tyr Asp Leu Tyr Thr Phe Gly Ala Gly His Asn Phe Lys Val Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Gly Asn Gly Tyr Lys Glu Glu Val Glu Thr Arg Arg Val 20 25 30 Val Lys Arg Leu Leu Glu Ile Cys Tyr Gln His Gly Ile Lys Ala Val 35 40 45 Asp Thr Thr Asp Asn Asp Gly Arg Thr Gln Arg Glu Asn Leu Asn Asn 50 55 60 Ile Val Arg Asn Cys Asn Ser Tyr Pro Lys Asn Gly Arg Leu Asp Val 65 70 75 80 Ala Ile His Phe Asn Gln Ala Glu Ser Glu Thr Gly Gly Val Glu Val 85 90 95 Trp Tyr Tyr Asp Gln Ala Gly Leu Ala Ala Lys Val Ser Lys Asp Val 100 105 110 Ala Ala Ala Leu Gly Leu Arg Asp Arg Gly Ala Lys Glu Gly Lys Gly 115 120 125 Leu Ala Val Leu Asn Gly Thr Asn Ala Pro Ala Ile Leu Ile Glu Leu 130 135 140 Pro Phe Leu Ser His Val Gly Asn Met Gln Ala Tyr Glu Ser Asn Phe 145 150 155 160 Glu Pro Met Cys Arg Ala Ile Val Gln Ala Val Thr Gly Gln Gln Val 165 170 175 Ala Val Asn Gly Ile Arg Pro Val Ser Lys Asn Val Ile Gln Thr Gly 180 185 190 Ala Phe Ser Pro Tyr Glu Ala Thr Asp Ala Met Thr Ala Leu Thr Ser 195 200 205 Leu Lys Met Thr Gly Val Phe Tyr Leu Gln Ala Asn Gly Leu Pro Tyr 210 215 220 Ile Val Thr Asp Pro Thr Ser Asp Ala Gln Leu Glu Ala Ala Lys Glu 225 230 235 240 Tyr Phe Lys Arg Lys Asp Trp Trp Phe Asp Val Lys 245 250

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 탄저균(Bacillus anthracis) 특이적 항균 단백질; 및
    상기 항균 단백질 특이적 안정화제; 를 포함하고,
    상기 안정화제는 인산나트륨(sodium phosphate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 및 플루로닉(pluronic) F68을 포함하는, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항균 단백질은 Escherichia coli BL21-pBAD-AP50-31(수탁번호 KCTC 12708BP)로부터 유래된 것인, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 동결건조 제형은 항생제, 소독제, 살균제 또는 치료제로 사용되는, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형.
  5. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항균 단백질, 및 상기 항균 단백질의 동결건조 제형 특이적 안정화제의 혼합 용액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 혼합 용액을 동결시키는 단계;
    (c) 동결된 상기 혼합 용액을 일정 온도에서 건조시키는 단계; 및
    (d) 건조된 상기 혼합 용액을 일정 시간 간격에 따라 단계적으로 승온하면서 건조시키는 단계; 를 포함하고,
    상기 안정화제는 인산나트륨(sodium phosphate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 및 플루로닉(pluronic) F68을 포함하는, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 혼합 용액 내 상기 항균 단백질의 농도가 0.1㎎/㎖ 내지 30㎎/㎖인, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형 제조방법.
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    상기 혼합 용액 내 상기 인산나트륨의 농도가 1mM 내지 50mM인, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형 제조방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 혼합 용액 내 상기 폴리비닐피롤리돈의 농도가 1%(w/v) 내지 10%(w/v)인, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형 제조방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 혼합 용액 내 상기 플루로닉 F68의 농도가 0.1%(w/v) 내지 2%(w/v)인, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형 제조방법.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 혼합 용액의 pH가 7.2 내지 9인, 탄저균 감염증 치료용 조성물의 동결건조 제형 제조방법.
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