WO2021079536A1 - バクテリオファージ組成物 - Google Patents

Abstract

受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質であるエンドライシンとを、有効成分として含有する、スタフィロコッカス・アウレウスを溶菌するための組成物、又はスタフィロコッカス・アウレウスに起因する疾患を予防若しくは治療するための組成物。

Description

バクテリオファージ組成物

　本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスを溶菌させる性質を有するバクテリオファージとエンドライシンとを有効成分として含む、該菌を溶菌するための組成物、及びスタフィロコッカス・アウレウスに起因する疾患を予防又は治療するための組成物に関する。

　スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、以下、「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」と略記する場合がある）は、ブドウ球菌属（スタフィロコッカス属）に属するグラム陽性球菌で、ヒトや動物の鼻腔、咽頭、皮膚、腸管等に常在し自然界にも広く分布し、ヒトや動物において様々な疾病を引き起こす。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは細胞壁にＩｇＧに対する結合能を持つプロティンＡを持ち、また、コアグラーゼを産生する。プロティンＡとコアグラーゼは、マクロファージ等の食作用を阻止することにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの宿主に対する感染を長引かせる。

　また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、創傷部から体内に侵入することにより化膿性疾患や敗血症、肺炎、急性心内膜炎等を引き起こし、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの産生する外毒素（エンテロトキシン）はヒトに対して食中毒を引き起こすことが知られている。さらに、抗生物質に対する耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，ＭＲＳＡ）は、院内感染等の日和見感染を引き起すが、ＭＲＳＡは殆どの抗生物質が奏功せず、深刻な問題となっている。

　また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ウシ等に対しては、乳牛の乳量や乳質の低下をもたらす疾患である乳房炎（乳腺炎）の起因菌の一つである。乳房炎の原因菌は１５０種ほどが知られているが、中でも最も重要な病原菌がＳ．ａｕｒｅｕｓである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓが原因菌である乳房炎（黄色ブドウ球菌性乳房炎）に対しては、抗生物質等で治療するのが一般的である。しかし、現在知られている抗生物質はＳ．ａｕｒｅｕｓに特異的ではなく、しかも抗生物質による治療は、費用がかかるという問題点もある。上記のとおり薬剤耐性を獲得したＳ．ａｕｒｅｕｓが発見されていることもあり、抗生物質等に代わる新規な治療技術の開発が求められている。

　この点に関し、バクテリオファージの利用が試みられている。バクテリオファージは、細菌に感染するウイルスの総称であり、宿主である細菌に感染すると細菌内で増殖する。増殖した娘ファージは、細菌の細胞壁から菌体外に放出され、細菌は溶菌により死滅する。また、バクテリオファージには、宿主となる病原菌以外の細菌叢に影響を与えない、増殖が簡単で大量のバクテリオファージを安価に調製できる等の利点がある。

　そこで、バクテリオファージを利用したＳ．ａｕｒｅｕｓの殺菌に関する研究結果もいくつか報告されている。例えば、特許文献１において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌させる性質を有するバクテリオファージとして、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３にて特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージが、本発明者らによって見出され報告されている。

　また、エンドライシンは、バクテリオファージによって生成されるペプチドグリカン加水分解酵素であり、細菌の細胞壁ペプチドグリカンを切断することが知られている。このように、エンドライシンは、抗生物質とは異なるメカニズムによって細菌に対し溶菌作用を示し、抗生物質等に対して高い耐性を示す細菌に対しても有効性を示す。これまでにＬｙｓ－ｐｈｉＫ、Ｌｙｓ－ＧＨ１５、Ｌｙｓ－ｐｈｉＴｗｏｒｔ等の黄色ブドウ球菌バクテリオファージエンドライシンが分離され、報告されている。これらのエンドライシンは、Ｎ末端のシステイン－ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメイン、アミダーゼ（ＡＭＩＤ）ドメイン、及びＣ末端のＳＨ３ｂ細胞壁結合ドメインで構成されるマルチドメイン酵素であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する溶菌作用等が報告されている（非特許文献１）。特に、Ｌｙｓ－ｐｈｉＫは、ウシおよびヒトから臨床的に分離されたブドウ球菌に対する抗菌効果が報告されている（非特許文献２）。

特開２０１１－５０３７３号公報

Ｊ．Ｇｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１　Ｄｅｃ；６３（６）：５３８－４２ Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　２００５　Ｏｃｔ；１８７（２０）：７１６１－４． Ｊ．Ｆｕｊｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０１８　Ｆｅｂ　２４；１１（１）．ｐｉｉ：Ｅ２５．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｈ１１０１００２５

　本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌するための組成物、及びＳ．ａｕｒｅｕｓに起因する疾患を予防又は治療するための組成物を提供することを課題とする。

　本発明者らは、従前、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌させる性質を有するバクテリオファージとして、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３にて特定されるバクテリオファージを見出し（特許文献１）、さらにそれが産生するエンドライシン（Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２）の単離及び同定に成功している（非特許文献３）。

　今回、前記バクテリオファージ及びエンドライシンを組み合わせて用いた場合における、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する溶菌活性を検出し、これらの併用効果を評価した。その結果驚くべきことに、各々を単独に用いた場合に比べ、併用することによって相乗的に高い溶菌活性が奏されることが、明らかとなった。

　本発明は、かかる知見に基づき完成されたものであり、以下の構成よりなる。
＜１＞　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、エンドライシンとを有効成分として含有し、かつ前記エンドライシンが、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、スタフィロコッカス・アウレウスを溶菌するための組成物
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
＜２＞　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、エンドライシンとを有効成分として含有し、かつ前記エンドライシンが、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、スタフィロコッカス・アウレウスに起因する疾患を予防又は治療するための組成物
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
＜３＞　前記疾患が、スタフィロコッカス・アウレウスによる、皮膚感染症、尿路感染症、血液感染症、骨・関節感染症、生殖器感染症、乳房感染症、軟部組織感染症、耳鼻感染症、創傷感染症、呼吸器感染症、眼感染症、中枢神経感染症又は食中毒である、＜２＞に記載の組成物。
＜４＞　注射用組成物、経口用組成物又は外用組成物である＜２＞又は＜３＞に記載の組成物。
＜５＞　外用組成物であり、散布、浸漬、展着又は滴下によって対象に投与される、＜２＞又は＜３＞に記載の組成物。

　本発明によれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌し、ひいては当該菌に起因する疾患を予防又は治療することが可能となる。特に、本発明において有効成分とするバクテリオファージ及びエンドライシンは併用することによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して高い溶菌活性を示し、当該菌を効率よく殺菌等することができる。そのため、例えば、哺乳動物や鳥がＳ．ａｕｒｅｕｓに感染することで引き起こされる各種感染症（表皮感染症、食中毒、肺炎、心内膜炎、髄膜炎、関節炎、敗血症、乳腺炎等）に対して、有効な予防剤、治療剤等を、本発明は提供することが出来る。

　バクテリオファージは、対応する宿主が存在すれば、その宿主に感染し、爆発的に増殖する。しかし、バクテリオファージは宿主が存在しなければ、単独では増殖できない。そのため、その特定の宿主がバクテリオファージによってすべて溶菌されて死滅してしまえば、そのバクテリオファージも増殖することはできない。また、他の細菌等に感染等して影響を及ぼすこともない。エンドライシンにおいても特定の細菌が存在しなければ、他の細菌等に影響を及ぼすこともない。したがって、本発明の組成物を用い、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの溶菌処理を行った後、更にバクテリオファージを除く何らかの処理を行う必要はない。以上の点で、本発明は、環境及び他の細菌等に悪影響を及ぼすことがなく、安全で、使用し易いという利点も有する。

スタフィロコッカス・アウレウスに対するバクテリオファージ　ΦＳＡ０１２の溶菌活性を解析した結果を示す、グラフである。図中縦軸は、スタフィロコッカス・アウレウス培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は、バクテリオファージを前記培養液に接種してからの経過時間を示す（単位：時）。バクテリオファージの接種量は、図中「Φ０．００００１」～「Φ１０」に示すとおり、ＭＯＩ＝菌量に対するバクテリオファージの相対量：０．００００１～１０である。また図中「ＮＣ」は、バクテリオファージ非接種の場合を示す。 スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性において、バクテリオファージ　ΦＳＡ０１２とエンドライシン　Ｌｙａｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を解析した結果を示す、グラフである。図中縦軸は、スタフィロコッカス・アウレウス培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は、バクテリオファージ及びエンドライシン（５０μｇ／ｍＬ）を前記培養液に添加してからの経過時間を示す（単位：時）。バクテリオファージ及びエンドライシンの添加量は、図中「Φ０．００００１＋Ｌｙｓ５０」～「Φ１０＋Ｌｙｓ５０」に示すとおり、バクテリオファージについては、ＭＯＩ：０．００００１～１０であり、エンドライシンについては一律５０μｇ／ｍＬである。また図中「Ｌｙｓ５０」は、５０μｇ／ｍＬのエンドライシンのみを添加した場合を示す。 スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性において、バクテリオファージ　ΦＳＡ０１２とエンドライシン　Ｌｙａｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を解析した結果を示す、グラフである。図中縦軸は、スタフィロコッカス・アウレウス培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は、バクテリオファージ及びエンドライシン（１．５６２５μｇ／ｍＬ）を前記培養液に添加してからの経過時間を示す（単位：時）。バクテリオファージ及びエンドライシンの添加量は、図中「Φ０．００００１＋Ｌｙｓ１．５６２５」～「Φ１０＋Ｌｙｓ１．５６２５」に示すとおり、バクテリオファージについては、ＭＯＩ：０．００００１～１０であり、エンドライシンについては一律１．５６２５μｇ／ｍＬである。また図中「Ｌｙｓ１．５６２５」は、１．５６２５μｇ／ｍＬのエンドライシンのみを添加した場合を示す。 スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性における、バクテリオファージ　ΦＳＡ０１２とエンドライシン　Ｌｙａｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を示す図である。図中、横軸は、エンドライシンの添加濃度を示し、縦軸は、バクテリオファージの接種濃度を示す。図中、濃いグレーにて示されている組み合わせは、バクテリオファージ及び／又はエンドライシンを添加してから２４時間後のスタフィロコッカス・アウレウス培養液の６６０ｎｍにおける吸光度が０．２未満であることを示し、薄いグレーにて示されている組み合わせは、バクテリオファージ及び／又はエンドライシンを添加してから２４時間後のスタフィロコッカス・アウレウス培養液の６６０ｎｍにおける吸光度が０．２以上であることを示す。 スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性における、バクテリオファージ　φＳＡ０１２とエンドライシン　Ｌｙａｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を示す図である。図中、縦軸は、バクテリオファージ及び／又はエンドライシンを添加してから１２時間後のスタフィロコッカス・アウレウス培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を示す。バクテリオファージ及びエンドライシンの添加量は、図中「φＭＯＩ」及び「Ｌｙｓ」に示すとおりである。「Ｍｏｃｋ」は、バクテリオファージ及びエンドライシンが添加していない条件での結果を示す。 スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性における、バクテリオファージ　φＳＡ０３９とエンドライシン　Ｌｙａｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を示す図である。図中の表記については図３Ａ同様である。 スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性における、バクテリオファージ　φＳＡ０３９とエンドライシン　Ｌｙａｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を示す図である。図中の表記については、縦軸が、バクテリオファージ及び／又はエンドライシンを添加してから１５時間後のスタフィロコッカス・アウレウス培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を示していること以外、図３Ａ同様である。 スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性における、バクテリオファージ　φＩ４αとエンドライシン　Ｌｙａｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を示す図である。図中の表記については図３Ａ同様である。 スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性における、バクテリオファージ　φＣ５２－３βとエンドライシン　Ｌｙａｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を示す図である。図中の表記については図３Ａ同様である。

　後述の実施例において示すとおり、スタフィロコッカス・アウレウスに対して溶菌活性を有する、バクテリオファージ及びエンドライシンの併用は、スタフィロコッカス・アウレウスに対する溶菌活性において、各々単独に用いた場合と比べ相乗的に高い活性を示すことが明らかとなった。したがって、本発明は、後述のバクテリオファージとエンドライシンとを併用し、スタフィロコッカス・アウレウスを溶菌する、ひいては当該細菌に起因する疾患の予防又は治療に関するものである。

　本発明において対象となるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、ブドウ球菌属（スタフィロコッカス属）に属するグラム陽性球菌である、真正細菌の１種である。また、「溶菌」とは、バクテリオファージ、エンドライシンにより、細菌の細胞膜及び細胞壁が破壊され、細胞質が細胞外に放出（溶出）し、当該細菌が死滅することを意味する。

　（バクテリオファージ）
　本発明において用いられるバクテリオファージの一つは、２００８年１２月２５日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　特許微生物寄託センター（郵便番号　２９２－０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３として寄託してあるバクテリオファージである。なお、本発明者等は、このバクテリオファージを「φＳＡ０１２」と命名した。

　本発明に係るバクテリオファージのもう一つは、２００８年１２月２５日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　特許微生物寄託センター（郵便番号　２９２－０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４として寄託してあるバクテリオファージである。本発明者等は、このバクテリオファージを「φＳＡ０３９」と命名した。

　透過型電子顕微鏡を用いた観察で、φＳＡ０１２とφＳＡ０３９は、ともにＴ４ファージと同程度の大きさで、かつ若干長いことが知られた。また、φＳＡ０１２及びφＳＡ０３９は、収縮性のシース（ｓｈｅａｔｈ）を持つことから、ミオビリデ科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｔｅ　ｆａｍｉｌｙ）に属するものと推察される。なお、このミオビリデ科は古典的な分類に基づくものであり、当該科は、昨今では遺伝学的分類に基づき、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ａｃｋｅｒｍａｎｖｉｒｉｄａｅ科、及びＨｅｒｅｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ科に再編されている。かかる再編化された分類では、φＳＡ０１２及びφＳＡ０３９は共に、Ｈｅｒｅｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ科に属する。本発明に係るバクテリオファージのその他の構造及び性質については、特許文献１の記載を参照のほど。

　本発明に係るバクテリオファージは、これらが寄託されている上記寄託機関に分譲請求を行なうことにより、入手することができる。また、一般家庭の下水流水や下水処理施設から採取した排水等、あるいはＳ．ａｕｒｅｕｓに感染した動物由来の血液，鼻腔，咽頭，皮膚，腸管等の生体試料から、例えば、特許文献１に記載されているプラークアッセイ・分離方法等の常法により分離・精製することにより入手することもできる。より具体的には、排水等の試料を、１００００～１５０００ｒｐｍで１０～１５分程度遠心分離して夾雑物を除いた後、例えばＰＥＧ６０００及びＮａＣｌを加えてファージ粒子を沈殿させた後、更に１００００～１５０００ｒｐｍで１０～１５分程度遠心分離する常法により、バクテリオファージを回収する。回収したバクテリオファージと、十分培養したＳ．ａｕｒｅｕｓとを軟寒天に混合し、寒天培地上に広げる。２７～３７℃で６時間～一昼夜培養後、検出された軟寒天培地上の単一プラークを回収し、例えば、通常のプラーク形成法、ろ過、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配遠心等の密度勾配遠心分離の常法で、バクテリオファージを単離することができる。さらに、超遠心分離、限外ろ過等の公知の方法で、バクテリオファージの精製処理を行ってもよい。また、本発明に係るバクテリオファージは、例えば、特許文献１に記載されているプレートライセート法等の一般的なバクテリオファージの増殖法で増殖させることができる。

　本発明の組成物において含まれるバクテリファージの態様としては特に制限はなく、例えば、単離及び/又は精製されたバクテリオファージが挙げられる。

　（エンドライシン）
　本発明に係るエンドライシンは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細胞壁ペプチドグリカンを切断する活性を有し、当該細菌に対して溶菌活性を示す、ペプチドグリカン加水分解酵素である。Ｎ末端のシステイン－ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメイン、アミダーゼ（ＡＭＩＤ）ドメイン、及びＣ末端のＳＨ３ｂ細胞壁結合ドメインで構成されるマルチドメイン酵素であり、より具体的には、「配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質」が挙げられる。

　当該タンパク質は、受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３として寄託してあるバクテリオファージ（φＳＡ０１２）によって生成されるエンドライシンであり、本発明者らによって「Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２」と命名されている（非特許文献３参照のほど）。また、Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２（配列番号：１に記載のアミノ酸配列、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＡＯ４７０９８．１に記載のアミノ酸配列）は、ｐｈｉＳＡ０１２のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ９０３９６７．１に記載のＤＮＡ配列）の２７３３９～２８８２６（ＯＲＦ５１）にコードされている。

　また、現在の技術水準においては、当業者であれば、Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２をコードするＤＮＡの配列情報が得られた場合、そのＤＮＡ配列に対して種々の改変を行い、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する溶菌活性を有するタンパク質をコードする変異遺伝子の製造を行うことが可能である。さらに、自然界においても、ＤＮＡ配列が変異することは起こり得ることである。

　したがって、本発明に係るエンドライシンには、前記溶菌活性を有する限り、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。

　ここで「複数」とは、本発明に係るエンドライシンのアミノ酸配列全体においては、通常、１００アミノ酸以内（例えば、９０アミノ酸以内、８０アミノ酸以内、７０アミノ酸以内）、好ましくは６０アミノ酸以内（例えば、５０アミノ酸以内、４０アミノ酸以内）、より好ましくは３０アミノ酸以内（例えば、２０アミノ酸以内、１０アミノ酸以内）、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内）である。

　なお、アミノ酸配列への変異導入は、例えば、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列への変異導入を介して行なうことができる。かかるＤＮＡ配列への変異導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法、又はこれに準ずる方法により、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ－Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ－Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）等）を用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。

　さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定のＤＮＡが得られた場合、そのＤＮＡの配列情報を利用して、同種若しくは他のファージから、各活性を有するタンパク質をコードする相同遺伝子を単離することが可能である。このような相同遺伝子を取得するためのファージとしては、例えば、ミオビリデ科に属するファージ（古典的分類に基づく。再編化された分類では、Ｈｅｒｅｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ科に属するファージ）が挙げられる。

　相同遺伝子を取得するための方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）等が挙げられる。相同遺伝子を単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど高い同一性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。但し、上記のＳＳＣ、ＳＤＳ及び温度の条件の組み合わせは例示であり、ＤＮＡの濃度、ＤＮＡの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間等を適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。

　取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号：１に記載のアミノ酸配列と高い同一性を有する。高い同一性とは、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上）、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列の同一性である。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を利用して（例えば、デフォルト、すなわち初期設定のパラメータを用いて）決定することができる。

　したがって、本発明に係るエンドライシンには、前記溶菌活性を有する限り、配列番号：１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。

　配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体、相同体等が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して溶菌活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に示すような溶菌活性試験を行なうことにより判定することができる。具体的には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの培養液に、前記変異体等を添加し、当該培養液における吸光度の変化を検出し、前記添加後に吸光度の減少が認められた場合には、前記変異体等は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して溶菌活性を有すると判断することができる。なお、かかる試験における諸条件については、当業者であれば、適宜設定することが可能である。

　また、本発明に係るエンドライシンは、当業者であれば、当該エンドライシンをコードするＤＮＡを、適当なベクターに載せ、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の宿主細胞、又は無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入することにより、組換えタンパク質として発現させることができる。さらに、宿主細胞等において発現させた組換えタンパク質は、公知のペプチド精製方法により精製することができる。例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、本発明に係るエンドライシンを特異的に認識する抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー）、遠心分離等によって精製することができる。

　また、宿主細胞等において発現させた組換えタンパク質を精製する公知の方法としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質、Ｈｉｓ－タグタンパク質等の機能性タンパク質を融合させた形態で前記エンドライシンを合成し、ＧＳＴ親和性レジン、金属キレート樹脂に結合させることにより精製する方法等が挙げられる（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，７２１１－７２１５（１９８８））。さらに、例えば、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ等で機能性タンパク質と前記エンドライシンとの間を切断することにより、前記エンドライシンのみを分離して精製することもできる。

　また、本発明に係るエンドライシンは、そのアミノ酸配列に基づき、市販のポリペプチド合成機によって化学的に合成して調製することもできる。さらに、本発明に係るエンドライシンは、φＳＡ０１２を感染させたＳ．ａｕｒｅｕｓの培養物等からも、上述の公知のペプチド精製方法により調製することもできる。

　（溶菌用組成物）
　本発明は、上述のバクテリオファージとエンドライシンとを有効成分とする、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌するための組成物（以下、「溶菌用組成物」とも称する）を提供する。より具体的には、
　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、エンドライシンとを有効成分として含有し、かつ前記エンドライシンが、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、スタフィロコッカス・アウレウスを溶菌するための組成物
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
を、本発明は提供する。

　また、本発明の組成物を複合して用いることができ、結果として併用してＳ．ａｕｒｅｕｓが溶菌される場合、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシンは２種以上の組成物の中に分けて存在することもできる。

　本発明の組成物に有効成分として含まれる、本発明に係るバクテリオファージについては上述のとおりであるが、その濃度は、特に制限はなく、当業者であればその使用形態により適宜調整することができる。例えば、後述の液状の剤形（液状の抗菌剤等）にて使用する場合は、１×１０^３～１×１０^１３ＰＦＵ／ｍｌ（ＰＦＵ：ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ　プラーク形成単位）とするのが好ましく、１×１０^５～１×１０^１１ＰＦＵ／ｍｌとするのがより好ましく、１×１０^８～１×１０^１０ＰＦＵ／ｍｌとするのが更に好ましい。

　また、本発明の組成物に含有されるバクテリオファージは、一種類（株、ｓｔｒａｉｎ）であってもよく、本発明に係るバクテリオファージ以外の他のバクテリオファージを更に含んでいてもよい。他のバクテリオファージとしては、特に制限はなく、本発明に係るブドウ球菌とは異なる細菌（例えば、Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ、Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）に対するバクテリオファージ等が挙げられる。また。溶菌性のみならず、溶原性バクテリオファージであってもよい。

　本発明の組成物に有効成分として含まれる、本発明に係るエンドライシンについては上述のとおりであるが、その濃度は、特に制限はなく、当業者であればその使用形態により適宜調整することができる。例えば、後述の液状の剤形（液状の抗菌剤等）にて使用する場合は、０．１６～５００μｇ／ｍｌとするのが好ましく、０．１６～５０μｇ／ｍｌとするのがより好ましく、１．６～５０μｇ／ｍｌとするのが更に好ましい。

　また、本発明の組成物に含有されるエンドライシンは、一種類でも、本発明に係るエンドライシン以外の他のエンドライシンを更に含んでいてもよい。他のエンドライシンとしては、特に制限はなく、例えば、Ｌｙｓ－ｐｈｉＫ、Ｌｙｓ－ＧＨ１５、Ｌｙｓ－ｐｈｉＴｗｏｒｔが挙げられる（非特許文献１及び２参照）。

　本発明の溶菌用組成物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌することができるため、医薬組成物の態様をとり得る。医薬組成物としては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに起因する疾患を予防又は治療するための医薬組成物（治療薬、予防薬、症状改善薬等の医薬品）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを殺す又は死滅させるための医薬組成物（殺菌剤等、例えば、消毒薬等の医薬品、薬用石鹸等の医薬部外品）が挙げられる。

　本発明の溶菌用組成物は、医薬組成物に限らず、食品の態様にて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに起因する疾患の予防又は改善に用いることも可能である。このような飲食用組成物としては、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品及び機能性表示食品等の保健機能食品の他、動物飼料、栄養補助食品、健康補助食品、栄養調製食品、病者用食品、あるいは食品添加物であり得る。

　また、本発明の溶菌用組成物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの数を減少させるための組成物（除菌剤等）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖を抑制するための組成物（抗菌剤等）の態様をとり得る。さらに、本発明の溶菌用組成物は、研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）でＳ．ａｕｒｅｕｓを溶菌するための組成物（試薬等）の態様もとり得る。

　本発明の溶菌用組成物の形態は、その対象（投与対象等）に応じて適宜変更可能であり、例えば、固形状、半固形状、液状が採用される。

　例えば、本発明の溶菌用組成物を、医薬組成物、除菌剤、抗菌剤等として使用する場合、その対象に適した形態（製剤形態、剤形）に調製される。剤形としては、例えば、経口用組成物（内用組成物）、外用組成物、注射用組成物（乳房注入用組成物等を含む）が挙げられ、より具体的に、経口用組成物としては、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、トローチ剤、ドロップ剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤）、大丸薬、顆粒剤、散剤、丸剤、粒剤、粉剤、ドライシロップ剤、浸剤・煎剤、リポソーム製剤等の固形剤、舐剤、ゼリー剤、チューインガム剤等の半固形剤、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、油剤、乳剤、酒精剤等の液剤が挙げられる。また、外用組成物としては、坐剤、パップ剤、プラスター剤等の固形剤、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、シート製剤、樹脂製剤、ゲル剤（ナザールジェル剤等）、インへラー剤等の半固形剤、点鼻剤、点眼剤、リニメント剤、ローション剤、スプレー剤、エアゾール剤、スポットオン製剤、ポアオン製剤、経皮パッチ、噴霧剤、懸濁剤、油剤、乳剤等の液剤が挙げられる。また、液剤は、浸漬等の方法で含有させた織布、編布、不織布等のような形態もとり得る。また、除菌剤、抗菌剤等としては、さらに、水和剤、フロアブル剤、加熱蒸散剤、煙霧剤、燻煙剤、ＵＬＶ剤、ペレット剤等の形態もとり得る。

　これら剤形は、薬理学上許容される補助成分（媒体や担体（固体担体、液体担体、ガス状担体等）を用い、当業者であれば適宜調製することができる。補助成分としては、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）、生理食塩水、蒸留水等の水性媒体、ポリエチレングリコール，プロピレングリコール，オレイン酸エチル等の非水性媒体、界面活性剤、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、マトリックス形成剤、賦形剤、ベヒクル、増粘剤、粘着剤、展着剤、結合剤、希釈剤、滑沢剤、保護剤、粘性促進剤、ウィッキング剤、安定化剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、溶解補助剤、湿潤剤、着色料、染料、顔料、香味剤、芳香剤、矯味剤、甘味料、矯味矯臭剤、防腐剤、粘稠剤、保存剤、抗酸化剤等の一般的に利用されるものが挙げられる。なお、これら補助成分は、有効成分である上述のバクテリオファージ及びエンドライシンと適合するものでなければならない。

　本発明の溶菌用組成物は、他の薬剤を更に含んでいてもよく、また併用してもよい。併用する場合、同時に投与してもよく、前後して投与してもよい。また、上述のバクテリオファージ及び／又はエンドライシンに薬剤を付加することもできる。

　「他の薬剤」としては、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシンのＳ．ａｕｒｅｕｓに対する溶菌活性を失わせないようなものであれば特に限定されるものではないが、抗菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、感染症の予防剤、感染症の治療剤、殺虫剤、駆虫剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤等、それぞれの用途に慣用の薬剤を、それぞれ使用する態様に応じて適宜選択して用いることができる。

　「抗菌剤」としては、例えば、β－ラクタム系、アミノグリコシド系、リンコマイシン系、ホスホマイシン系、テトラサイクリン系、クロラムフェニコール系、マクロライド系、ケトライド系、ポリペプチド系、グリコペプチド系、ストレプトグラミン系、キノロン系、オキサゾリジノンが挙げられるが、これらに限定されない。

　「抗炎症剤」としては、例えば、ステロイド剤、非ステロイド剤が挙げられる。「ステロイド剤」としては、例えば、コルチコステロイドが挙げられ、より具体的に、プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、プレドニカルバート、モメタゾン及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。「非ステロイド剤」としては、例えば、サリチル酸系、プロピオン酸系、酢酸系、オキシム系、ピリン系、非ピリン系の化合物、ＣＯＸ－２阻害薬が挙げられるが、これらに限定されない。

　「免疫抑制剤」としては、例えば、代謝拮抗剤、アルキル化剤、微小管合成阻害剤、リンパ球シグナル伝達阻害薬、サイトカイン阻害薬、抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

　（溶菌方法）
　本発明において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの溶菌（殺菌、除菌、増殖の抑制等）は、特に制限はなく、溶菌処理を施す対象に、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシン、又はそれらを有効成分として含有する溶菌用組成物を接触等させることによって行なうことができる。

　すなわち、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシン、又は本発明の溶菌用組成物を、対象と接触させることにより、当該対象における、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを溶菌する方法を提供する。

　「対象」としては特に制限はなく、後述の（治療方法等）にて例示される動物の他、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが存在し得る物、環境（例えば、食品、食品の加工・調理・保存に使用する器具や機器、食品加工工場、食品が晒される環境、哺乳動物（豚等）の飼育施設等、鳥（ニワトリ等）の飼育施設等が挙げられる。

　「接触」方法については特に制限はなく、例えば、後述の散布、浸漬、展着、滴下等により、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシンを対象に接触させることができる。また、対象との接触時間としては、特に制限はなく、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシン、又は本発明の溶菌用組成物が、該対象におけるスタフィロコッカス・アウレウスを溶菌し、該ブドウ球菌の増殖等を防止することができるだけの十分な時間であればよい。

　また、本発明の溶菌方法は、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシンを併用するものであり、本発明に係るバクテリオファージと本発明に係るエンドライシンとをそれぞれ単独に接触させてもよい。すなわち、本発明に係るバクテリオファージと本発明に係るエンドライシンとを同時に又は別々に接触させてもよく、それぞれの接触順、接触回数は異なっていてもよい。

　（治療方法等）
　本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシンの併用は、後述の実施例に示すとおり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して高い溶菌活性を示し、当該細菌を高効率にて死滅させることができる。そのため、本発明に係るバクテリオファージとエンドライシンを併用することでＳ．ａｕｒｅｕｓに起因する疾患の予防、治療又は改善が可能となる。

　したがって、本発明は、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシン、又はそれらを有効成分として含有する医薬組成物を、対象に投与することにより、当該対象のＳ．ａｕｒｅｕｓに起因する疾患を予防又は治療する方法をも提供する。

　治療等の「対象」としては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが感染し得るものであれば特に制限はなく、ヒトであってもよく、非ヒト動物であってもよい。非ヒト動物としては、家畜、ペット、実験用動物が挙げられ、より具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ウサギ、ネコ、イヌ、ミンク、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類が挙げられる。

　「Ｓ．ａｕｒｅｕｓに起因する疾患」としては、特に制限はないが、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス感染症が挙げられ、より具体的には、スタフィロコッカス・アウレウスによる、皮膚感染症（皮膚炎（例えば、浮腫性皮膚炎、バタリー病、趾瘤症、趾底炎）、表皮炎、毛嚢炎、膿皮症）、尿路感染症（膀胱炎、尿路感染等）、血液感染症（カテーテル関連菌血症、菌血症、人工関節感染、敗血症、敗血症性多発性関節炎等）、心内膜炎、骨・関節感染症（骨髄・脊椎炎（例えば、化膿性骨髄炎、化膿性脊椎炎、骨脆弱症、へたり病）、関節炎、骨・関節炎等）、生殖器感染症（膣炎、子宮蓄膿症等）、乳房感染症（乳房炎、乳腺炎等）、軟部組織感染症（軟部組織感染等）、耳鼻感染症（耳炎、副鼻腔炎等）、創傷感染症（創傷感染、手術創感染等）、呼吸器感染症（気道感染、肺炎等）、眼感染症（眼内炎、結膜炎、眼瞼及び結膜を含む眼感染症等）、中枢神経感染症（髄膜炎等）、食中毒が挙げられる。

　本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシン、又はそれらを有効成分として含有する本発明の医薬組成物の「投与」方法としては、特に制限はなく、例えば、経皮投与、皮内投与、皮下投与、血管内注射（静脈内投与、動脈内投与）、局所投与（例えば、乳房注入等の局所注射）、経口投与、経粘膜（経鼻等）投与、腹腔内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。かかる投与は、上述の剤形を適宜採用することによって行なうことができる。また投与量は、対象（動物）の種類、年齢（週齢）、体重、症状、健康状態等に応じて、適宜調整される。

　例えば、本発明の医薬組成物を外用組成物として使用する場合には、前述のとおり、対象の種類等によって異なるが、外用組成物中に１×１０^６～１×１０^１２ＰＦＵ／ｍｌ程度の本発明に係るバクテリオファージと０．１６～５００μｇ／ｍｌ程度の本件に係るエンドライシンを含有させ、投与することができる。

　外用組成物の投与方法としては、例えば、散布、浸漬、展着、滴下が挙げられる。浸漬としては、より具体的に、外用組成物又はそれを含有する水等への対象の入浴が挙げられる。散布としては、例えば、外用組成物を対象に、スプレー、噴霧、霧吹き、シャワー、散粉（ダスティング）することが挙げられる。展着としては、外用組成物を対象に、塗布、拭き取りすること、または外用組成物を、細片、プレート、バンド、カラー、耳標（ｅａｒ　ｍａｒｋ）、リム（ｌｉｍｂ）・バンド、標識装置等の成形製品に含有させ、当該成型製品を装着した対象（動物）どうしが接触することにより、該動物に外用組成物を付着、分散させることも挙げられる。滴下としては、例えば、外用組成物を対象に、ポアオン、スポットオンすることが挙げられる。

　より具体的に、外用組成物を対象に塗布又は噴霧する場合には、上述のとおり、対象の種類、状態等によって異なるが、例えば、患部５ｃｍ^２あたりに、１×１０^４～１×１０^１２ＰＦＵ程度（好ましくは１×１０^５～１×１０^１２ＰＦＵ程度）の本発明に係るバクテリオファージと、０．１６～５００μｇ／ｍｌ程度（好ましくは０．１６～５０μｇ／ｍｌ程度）の本発明に係るエンドライシンを含む併用剤を塗布又は噴霧すればよいが、これに限定されない。

　また、本発明のバクテリオファージを含有する注射剤を局所注射する場合には、対象の種類、患部の状態等によって異なるが、例えば、１×１０^４～１×１０^１２ＰＦＵ程度（好ましくは１×１０^５～１×１０^１２ＰＦＵ程度）の本発明に係るバクテリオファージと、０．１６～５００μｇ／ｍｌ程度（好ましくは０．１６～５０μｇ／ｍｌ程度）の本発明に係るエンドライシンを含む併用剤を注射すればよいが、これに限定されない。

　本発明のバクテリオファージとエンドライシンを含有する注射液を、例えば頸動脈等の血管から血液中に投与する場合には、対象の種類、患部の状態等によって異なるが、例えば、本発明のバクテリオファージを１×１０^４～１×１０^１２ＰＦＵ／Ｋｇ程度になるように、本発明に係るエンドライシンを０．１６～５００μｇ／ｍｌ程度（好ましくは０．１６～５０μｇ／ｍｌ程度）となるように、血管内に注射すればよいが、これに限定されない。

　また、本発明の治療方法は、本発明に係るバクテリオファージ及びエンドライシンを併用するものであり、本発明に係るバクテリオファージと本発明に係るエンドライシンとをそれぞれ単独に投与してもよい。すなわち、本発明に係るバクテリオファージと本発明に係るエンドライシンとを同時に又は別々に投与してもよく、それぞれの投与順、投与回数は異なっていてもよい。

　なお、ファージ及びエンドライシンは、宿主特異性が高く、宿主の細菌にしか溶菌活性を示さないさめ、動物に投与した場合の毒性は殆どない。そのため、対象の種類、患部の状態等によっては、より多量のバクテリオファージを投与することが可能である。例えば投与する動物が大型動物の場合には、より多量のバクテリオファージ及びエンドライシンを投与することもできる。

　以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって、何ら限定されるものではない。

　本発明者らは、従前、スタフィロコッカス・アウレウスを溶菌させる性質を有するバクテリオファージとして、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ（φＳＡ０１２）及び受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージ（φＳＡ０３９）を単離することに成功している。本実施例においては、これらバクテリオファージに関し、以下に示す試験にて、ウシ乳腺炎（乳房炎）感染原乳より単離されたスタフィロコッカス・アウレウス（ＳＡ００３株）に対する、溶菌活性を評価した。

　＜スタフィロコッカス・アウレウスに対するバクテリオファージφＳＡ０１２及びエンドライシンＬｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２の併用効果についての評価＞
　（１）スタフィロコッカス・アウレウス
　特許文献１に記載の方法によりスタフィロコッカス・アウレウス（ＳＡ００３）を分離した。より具体的には、乳腺炎（Ｍａｓｔｉｔｉｓ）を発症した乳牛（北海道）の原乳を採取し、１００μＬをｂｒａｉｎ－ｈｅａｒｔ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ａｇａｒ（日本製薬株式会社製）に広げ、３７℃で１５時間培養した。生じた各コロニーから細菌を採取し、それぞれマンニット食塩寒天培地を用いた通常のコアグラーゼ試験とヒツジ血液寒天培地を用いた通常の溶血試験を行った。以上の試験の結果、コアグラーゼ試験と溶血試験の両方で陽性と判断されたコロニー　１株を選択・分離し、ＳＡ００３として－８０℃で保管した。使用時マンニット寒天培地を用いた常法により培養後、釣菌しＬＢ培地に懸濁、インキュベーター（３７℃）に入れ９時間培養し、増菌させ試験菌とした。

　なお、ＬＢ培地の組成は以下のとおりである。ＬＢ液体培地の場合、ＮａＣｌ　０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス（Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）　０．５ｗ／ｗ％、ポリペプトン　１ｗ／ｖ％を含有する。ＬＢ寒天培地の場合、上記組成に更に１．５％　寒天（ａｇａｒ）を含有する。

　（２）バクテリオファージ
　バクテリオファージ　φＳＡ０１２（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３）を、ＳＭ　ｂｕｆｆｅｒ溶液（０．１ｍＭ　ＮａＣｌ，８ｍＭ　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．１％　ゼラチン）に加えて攪拌し、バクテリオファージの懸濁液を得た。

　（３）エンドライシン
　エンドライシン（Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、非特許文献３に記載の方法により調製した。より具体的には先ず、Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２をコードするＤＮＡを増幅し、当該エンドライシンを大腸菌にて発現させるためのプラスミドを構築した。すなわち、バクテリオファージ　φＳＡ０１２から通常の方法により抽出したＤＮＡを鋳型として、プライマー　Ｌｙｓ０１２－１Ｆｗ（５’－ＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡ－３’、配列番号：２）及びＬｙｓ０１２－４９５Ｒｖ（５’－ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧ－３’ 、配列番号：３）を用いたＰＣＲにより、Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２をコードするＤＮＡを増幅した。増幅した断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、ｐＧＥＸ－６Ｐ－２（ＧＥ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ））にサブクローニングした。サブクローニングは、大腸菌ＤＨ５αで実施した。プラスミド構築物については、Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｖ３．１サイクル配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを使用したＤＮＡ配列分析によって、Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２をコードするＤＮＡが含まれていることを確認した。

　次に、得られたプラスミドを使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、０．１ｍＭ　イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（最終濃度）（ナカライテスク、京都、日本）の添加により、Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２の発現を誘導した。なお、ｐＧＥＸ－６Ｐ－２に挿入したことにより、Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２は、そのＣ末端側にＧＳＴタグを融合させた形態にて発現することになる。そして、前記大腸菌をバイオシェーカーＢＲ－４０ＬＦ（Ｔａｉｔｅｃ、埼玉、日本）で２５℃で一晩振盪しながらインキュベートし、２３００ｘｇで４℃で５分間の遠心分離後、上清を除去し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ　ＭｇＣｌ_２及び１０％　ＮＰ－４０（和光、大阪、日本）をペレットに加え、混合物をＢｉｏｒｕｐｔｏｒ　ＵＣＤ－２００（Ｃｏｓｍｏ　Ｂｉｏ、東京、日本）を使用して超音波処理した。混合物を１６，０００ｘｇで４℃で３０分間遠心分離した後、可溶性タンパク質を含む上清を、グルタチオンを充填したＥｃｏｎｏ－Ｐａｃ（登録商標）クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して精製した。なお、該精製の際には、ＧＳＴタグ融合Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２を結合させた前記カラムを、ＧＳＴ融合タンパク質切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）にて処理することにより、前記カラムから、ＧＳＴタグを除外した、Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２を溶出した。このようにして精製されたタンパク質がＬｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２であることは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって確認した。また、そのタンパク質濃度もＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定した。得られたＬｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２は、使用するまで－３０℃で保存した。

　ＬＢ培地４ｍｌをＬ字型試験管に採り、分離したスタフィロコッカス・アウレウス　ＳＡ－００３株昼夜（１６時間）培養液４０μｌを接種し、それぞれ３７℃で、対数増殖期になる（ＯＤ６６０＝０．１）まで、４０ｒｐｍで振盪培養した。

　次いで、バクテリオファージ　φＳＡ０１２をＭＯＩ＝０．００００１～１０（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：菌量に対するバクテリオファージの相対量）及び／又はエンドライシンを１．５６２５～５０μｇ／ｍｌの濃度になるよう、スタフィロコッカス・アウレウスに加え、当該菌に対する溶菌効果を６６０ｎｍにおける吸光度を指標に測定した、なお、測定は、ＴＶＳ０６２ＣＡ　Ｂｉｏｐｈｏｔｏｒｅｃｏｒｄｅｒ（Ａｄｖａｎｔｅｃ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて行ない、スタフィロコッカス・アウレウスの培養液にファージ　φＳＡ０１２を添加直後から２３時間４５分後まで実施した。得られた結果を図１Ａ～Ｃ及び図２に示す。

　図１Ａでは、ＭＯＩを０．００００１～１０にした時のバクテリオファージの単独効果を示し、図１Ｂでは、バクテリオファージ（ＭＯＩ　０．００００１～１０）とエンドライシン５０μｇ／ｍｌの併用効果を示し、図１Ｃでは、バクテリオファージ（ＭＯＩ　０．００００１～１０）とエンドライシン１．２６５２μｇ／ｍｌの併用効果を示す。図２ではバクテリオファージの接種量とエンドライシン各濃度のそれぞれの組み合わせによる併用効果を示す。

　図１Ａ～Ｃ及び図２に示した結果から明らかなように、バクテリオファージ　φＳＡ０１２とエンドライシン　Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２の併用は、各単独に比べスタフィロコッカス・アウレウスに対し優れた溶菌活性を示した。

　＜スタフィロコッカス・アウレウスに対する、バクテリオファージφＳＡ０３９等とエンドライシンＬｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果についての評価＞
　上記φＳＡ０１２同様に、φＳＡ０３９等についてもエンドライシンＬｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用効果を評価した。また陰性対照として、バクテリオファージ　φＩ４α及びφＣ５２－３βについても実験を行なった。なお、バクテリオファージ　φＩ４αは、スタフィロコッカス・シミュランスから分離されたものであり、当該ブドウ球菌に対して溶菌活性を示す。バクテリオファージ　φＣ５２－３βは、スタフィロコッカス・クロモジナスから分離されたものであり、当該ブドウ球菌に対して溶菌活性を示す。また、これらのバクテリオファージは、酪農学園大学にて前記各菌から単離されたものであり、いずれのファージも、ＳＡ００３株に対する溶菌活性を有さない。

　得られた結果を図３Ａ～３Ｅに示す。具体的には、エンドライシン　Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２（添加濃度；１．５６又は３．１２５μｇ／ｍｌ）とのスタフィロコッカス・アウレウスに対する併用効果を評価した結果（バクテリオファージ及び／又はエンドライシンを添加してから１２時間後のスタフィロコッカス・アウレウス培養液の６６０ｎｍにおける吸光度）を、バクテリオファージ　φＳＡ０１２（添加濃度；ＭＯＩ　１０^－４又は１０^－３）、φＳＡ０３９（添加濃度；ＭＯＩ　１０^－４又は１０^－３）、φＩ４α（添加濃度；ＭＯＩ　１０^－４又は１０^－３）及びφＣ５２－３β（ＭＯＩ　１０^－４又は１０^－３）に関し、各々図３Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥに示す。また、φＳＡ０３９については、添加してから１５時間後にスタフィロコッカス・アウレウスに対する併用効果を評価した結果を図３Ｃに示す。

　図３Ａに示すとおり、上述の図１Ａ～１Ｃ及び図２同様に、バクテリオファージ　φＳＡ０１２とエンドライシン　Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２の併用は、各々を単独に用いた場合と比べスタフィロコッカス・アウレウスに対し優れた溶菌活性を示した。また図３Ｂ及び３Ｃに示すとおり、バクテリオファージ　φＳＡ０３９についても、エンドライシン　Ｌｙｓ－ｐｈｉＳＡ０１２との併用は、各々を単独に用いた場合と比べスタフィロコッカス・アウレウスに対し優れた溶菌活性を示した。

　以上説明したように、本発明によれば、スタフィロコッカス・アウレウスに対して溶菌活性を示す、バクテリオファージ　φＳＡ０１２又はφＳＡ０３９は、エンドライシンと併用することで各単独に比べ相乗的に高い溶菌活性を発揮し、スタフィロコッカス・アウレウスを効率よく殺菌等することができる。

　したがって、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスの除菌、前記細菌に起因する疾患の予防又は治療等において有用である。

（１）識別の表示：００３＋φＳＡ０１２
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３
（３）受託日：２００８年１２月２５日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（１）識別の表示：００３１＋φＳＡ０３９
（２）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４
（３）受託日：２００８年１２月２５日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構

Claims (5)

1. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、エンドライシンとを有効成分として含有し、かつ前記エンドライシンが、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、スタフィロコッカス・アウレウスを溶菌するための組成物
   （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
2. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９３で特定されるバクテリオファージ及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－６９４で特定されるバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも１のバクテリオファージと、エンドライシンとを有効成分として含有し、かつ前記エンドライシンが、下記（ａ）～（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、スタフィロコッカス・アウレウスに起因する疾患を予防又は治療するための組成物
   （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
3. 　前記疾患が、スタフィロコッカス・アウレウスによる、皮膚感染症、尿路感染症、血液感染症、骨・関節感染症、生殖器感染症、乳房感染症、軟部組織感染症、耳鼻感染症、創傷感染症、呼吸器感染症、眼感染症、中枢神経感染症又は食中毒である、請求項２に記載の組成物。
4. 　注射用組成物、経口用組成物又は外用組成物である、請求項２又は３に記載の組成物。
5. 　外用組成物であり、散布、浸漬、展着又は滴下によって対象に投与される、請求項２又は３に記載の組成物。

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