JP2006514636A - 抗ブドウ球菌療法およびワクチンの標的としての壁テイコイン酸 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2002年12月2日付で出願された米国仮出願第60/430,225号を基礎にしており、その利益を主張する。この仮出願の全体の開示は参照により本発明の開示に含まれる。
本発明は、免疫学および感染症の分野において、グラム陽性細菌に特異的な抗体、特に表面に壁テイコイン酸(Wall Teichoic Acid: WTA)を有する細菌に関する。本発明は、ポリクローナル抗体を含む。本発明はまた、モノクローナル、キメラおよびヒト化抗体、同様に、それらのフラグメント、領域および誘導体も含む。本発明はさらに、WTA欠失グラム陽性細菌に関する。本発明はまた、WTAで構成されるワクチン、および、WTAに特異的な抗体で構成されるワクチンに関する。本発明の抗体はまた、治療用途だけでなく、診断および予防用途に用いることもできる。
細菌感染と戦う物質の検索は、時間がかかり骨の折れるものであった。切断術に伴う敗血症が死亡率の50パーセントに関連していた時代から、我々は抗生物質の開発を行ってきた。しかしながら、今日の問題は、スタフィロコッカス属の仲間などの抗生物質耐性細菌の発生が増加していることである。
PS/Aではなくテイコイン酸に対する抗体を惹起するように設計された免疫化プロトコールは、菌血症または心内膜炎に対する防御を生じなかった(86)。
発明の概要
本発明の特徴は、ワクチン候補としてのWTAを提供することである。このようなワクチンによって生産された抗体は、鼻およびその他の上皮へのS.アウレウスの結合をブロックし、それによって感染プロセスにおける第一工程を予防するという二重の役割を果たす。
上記の本発明の形態は、単にS.アウレウスと患者とのWTAを介した相互作用の妨害に関する可能性を説明することを意図したものであり、本願の範囲を限定するものとみなすべきではない。これらの理念は、ヒトと獣医学的な環境の両方において用途を有する。
図1は、S.アウレウスのWTAの構造と、WTA生産の崩壊を示す。A.S.アウレウスのWTAの構造である。リン酸N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)とD−アラニン部分は、灰色の囲みで強調されている。MurNAcは、N−アセチルムラミン酸である。B.S.アウレウスのtagO遺伝子の位置、および、それをermBカセットで置換する戦略である。C.アルシアンブルー染色手順と銀染色手順の組合わせで染色した、WTA製剤を含むポリアクリルアミドゲルである。D.ΔtagO突然変異体は、WTAが欠失している。S.アウレウスSa113野生型(WT)、ΔtagO突然変異体(M)、および、プラスミドpRBtagOで補足されたΔtagO(MC)由来のWTA製剤における、ホスフェート、GlcNAcおよびリビトールの含量の解析である。少なくとも5つの独立した実験の平均およびSD(ホスフェート,GlcNAc)、または、1回の実験で4回カウントした値の平均(リビトール)を示す。リビトール含量は、WTとMサンプルのみで決定された。
定義
本発明において用いられる用語「壁テイコイン酸」(WTA)は、ブドウ球菌の細胞壁においてペプチドグリカンに共有結合した、複合表面が露出したポリマーを意味する。WTAはまた、可溶性WTA全体またはそれらのフラグメントも意味する。一実施形態において、WTAは、合成で生産されてもよい。他の実施形態において、WTAは、ブドウ球菌から単離してもよく、このようなブドウ球菌としては、これらに限定されないが、S.アウレウスが挙げられる。他の実施形態において、WTAは、ブドウ球菌生物以外から単離してもよく、このような生物としては、これらに限定されないが、L.モノサイトゲネス(L.monocytogenes)が挙げられる。WTA製剤は、可溶性WTA全体またはそれらのフラグメントで構成される。
本発明は、グラム陽性ブドウ球菌のWTAに結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体、ならびに、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体など)、それらのフラグメント、誘導体および領域を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、ブドウ球菌のWTAが結合する患者のリガンドに結合する。これらの抗リガンド抗体は、例えば、WTAとそのリガンドとの相互作用を阻害することによって、ブドウ球菌の患者の表面への結合を阻害することができる。グラム陽性細菌は、グラム陰性細菌とは異なり、細胞壁の構造における差の結果としてグラム染色を吸収する。グラム陰性細菌の細胞壁は、2つの対向するリン脂質−タンパク質リーフレット(phospholipid-protein leaflets)からなる独特な外部膜で構成されており、内部リーフレット中には通常のリン脂質が含まれるが、外部リーフレット中には極めて毒性のリポ多糖類が含まれる。グラム陽性細菌の細胞壁は、2つの主要な成分、ペプチドグリカンおよびテイコイン酸を含み、加えて、種に応じてさらなる炭水化物およびタンパク質を含み、比較の点ではるかに簡単のように思われる。様々なブドウ球菌の種間でWTAの構造は異なるが、S.アウレウスのWTAに対して生じた抗体は、多少の共通したWTAの改変(例えばD−アラニンエステルまたはGlcNAcの改変)を認識することができ、その他のブドウ球菌種由来のWTAと交差反応することができる。その上、抗WTA抗体はまた、非ブドウ球菌種と特異的に結合することができる。例えば、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)は、S.アウレウスと同じWTA構造を有する。従って、S.アウレウスのWTAに特異的に結合する抗体は、L.モノサイトゲネスにも特異的に結合することができる。
一実施形態において、本発明は、グラム陽性細菌のWTAに結合する抗体に関する。他の実施形態において、これらの抗体は、このような細菌の食細胞活動を高める。これらの抗WTA抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル抗体、MAb、および、その他のMAb抗体、例えばキメラ、ヒト化、完全ヒト抗体、抗体フラグメント、および、改変された抗体が挙げられる。キメラまたはその他のモノクローナル抗体は、マウス抗体の発達を回避できる点で有利である。少なくとも1つの研究において、マウス抗TNF(腫瘍壊死因子)モノクローナル抗体を投与され、抗マウス抗体を発生させた患者は、投与された抗体に応答する(28)。このタイプの治療計画に対する免疫応答は、一般的には、ヒト抗マウス抗体応答、または、HAMA応答と呼ばれており、治療の有効性を減少させ、治療を完全に無効にすることもある。ヒト化またはキメラヒト/非ヒトモノクローナル抗体は、HAMA応答を顕著に減少させ、治療の有効性を増加させることが示されている(49)。
本発明は、全長の抗体およびそれらの部分に関するペプチド配列、および、全長の抗体およびそれらの部分をコードするDNA配列、同様に、これらのMAbに関するCDRおよびFRを含む。本発明はさらに、これらの配列に相同なDNAおよびペプチド配列を含む。一実施形態において、これらの相同DNAおよびペプチド配列は、約70%同一であるが、他の実施形態は、約75%、80%、85%、88%、90%および95%またはそれ以上同一な配列を含む。上述したように、DNAおよびペプチド配列の両方に関する同一性のレベルを決定することは、十分に当業者の習慣的な技術の範囲内である。
細菌株および成長条件:
S.アウレウスSA113および8325−4は、実験的な感染研究で頻繁に用いられている実験用株である(61)。近年、SA113dltA突然変異体と、その突然変異体の補足のために用いられたプラスミドpRBdlt1は、詳細に説明されている(68)。8325−4で誘導された突然変異体(2種のS.アウレウスのFn結合タンパク質をコードするfbpAおよびfbpBが欠失している)は、Tim J.Foster氏(ダブリン,アイルランド)のご好意によって提供された(37)。全ての細菌株を、LBブロス(1%トリプトン,0.5%酵母抽出物,0.5%NaCl)、または、BMブロス(LBに、0.1%K2HPO4および0.1%グルコースを添加)中で、特に他の規定がない限り37℃で、成長させた。野生型細菌と突然変異型細菌との世代時間を比較するために、複合培地(BM)または合成最小培地(フェノールレッド非含有のIMDM,ギブコ(Gibco)−BRL,カールスバッド,カリフォルニア州)に、一晩の培養液を体積比1/100で植え付け、サンプル(200μl)を、96−ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、30℃または37℃で強く撹拌した。数々のタイムポイントで細菌の密度をマイクロプレートリーダーで測定し、対数期の成長のために世代時間を計算した。
S.アウレウスのゲノム由来の遺伝子SA0702(27)は、B.ズブチリスtagOと62%類似性を示す。それに相当する遺伝子を不活性化するために、SA0702の1001bp上流、および、1002bp下流からなるDNAフラグメントを、S.アウレウスSA113(ATCC35556)のDNAからPCRによって増幅し、KpnI/SalI(上流)とEcoRI/XbaI(下流)制限部位を用いて、KpnI/Xbalで消化した温度感受性シャトルプラスミドpBT2へ、SalI/EcoRIで消化したTn551由来のermB遺伝子と共にクローニングした。E.coliのDH5aへクローニングした後、PCR産物の配列を確認した。得られたプラスミドpBTΔtagOをS.アウレウスSA113に形質転換し、相同組換えによってゲノムへのermB遺伝子の統合を達成した。突然変異体を2.5μg/mlエリスロマイシン存在下で42℃で培養することによって濃度を高めた。tagOよりかなり大きいermBの適切な統合は、PCR解析によって確認した。1055bpのTagO全体をコードするフラグメントは欠失された。E.coliおよびスタフィロコッカスに特異的なプラスミドベクターならびに分子学的方法は、以前に説明されている(4,5,10,61,67)。近年、実質的に説明されているようにして、突然変異体のクローニング、相同組換え、および確認の手順を行った(10,68,69)。
TO−PCR1(Asp7181)
5’CGATAAGGGATAGGGTACCCAGATATAAATAATGATACG 3’(配列番号1)
TO−PCR2(HindIII)
5’GAAGAAACTCCAAAGCTTTTATTCGATATACCAAACT 3’(配列番号2)
これらのPCRプライマーにより、上記フラグメントが、同じ制限部位で消化されたシャトルベクターpRB473へライゲーションされた(67)。E.coliのDH5a中でpRBtagOを構築し、エレクトロポレーションによってS.アウレウスSA113へ形質転換した(4)。プラスミドpBRtagOの安定性を解析するために、細菌を24時間ごとに1:100で植え付けることによる連続培養(抗生物質を含まない)で細菌を培養した。希釈した細菌懸濁液を、寒天(クロラムフェニコール含有または非含有)上にプレーティングすることによって、生存可能な細菌をカウントした。
近年説明されている通りに、ブドウ球菌のテイコイン酸を単離し、解析した(68)。簡単に言えば、細菌を、0.3%グルコースを含むBMブロスで一晩成長させ、酢酸ナトリウム緩衝液(20mM,pH4.6)に再懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕した。2%SDSを用いて粗細胞溶解産物を抽出し、続いて酢酸ナトリウム緩衝液で全般的に洗浄することによって、細胞壁を調製した。5%トリクロロ酢酸で細胞壁を処理することによって細胞壁テイコイン酸 を放出させた。以前に説明されている通りに、比色分析によってテイコイン酸サンプル中のリンおよびヘキソサミンの量を決定した(18,68,80)。ガスクロマトグラフィーによって、リビトール含量を決定した。WTA製剤(100μl)を6NのHCl(100μl)と共に110℃で23時間加熱した;これらの条件下で、リビトールは完全に無水リビトールに変換される。メタノール(100μl)と、tert−ブタノール(10μl)を加え、サンプルを真空遠心分離機で乾燥させた。次に、リビトールを、ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド/アセトニトリル(1:1)を(50μl)用いて、110℃で2時間誘導体化した。サンプルを、n−テトラコサン(内部標準)(20μg)を含む塩化メチレン(100μl)で希釈し、DB5石英ガラスキャピラリー(30m×0.25mm;df=0.1μm;J+Wサイエンティフィック(J+W Scientific),フォルサム,カリフォルニア州)で、キャリアーガスとしてH2を用いた水素炎イオン化検出器を備えたHP5890ガスクロマトグラフ(ヒューレット・パッカード(Hewlett Packard),パロアルト,カリフォルニア州)で、解析した。同一のサンプル製剤の条件下で、n−テトラデカンに対するリビトールの応答要素を測定した。
近年、鼻での定着のコトンラットモデルが詳細に説明されている(45)。簡単に言えば、2%NaCl(シグマ(Sigma),セントルイス,ミズーリ州)を添加したコロンビア寒天(BD,スパークス,メリーランド州)でS.アウレウスを一晩成長させ、莢膜形成を誘導した。プレートで成長した細菌を、リン酸緩衝塩類溶液(PBS,バイオウィッタカー(BioWhitakker))で、懸濁液の透過性(%)が10%未満になるように懸濁することによって洗浄した。点滴注入する予定の動物1匹あたり1mlに相当する量の懸濁された細菌を、遠心分離によってペレット化し、次にこれを、点滴注入する予定の動物1匹あたり10μlの、抗生物質を含まないPBS、または、別の実験において、2.5μg/mlエリスロマイシン、300μg/mlスペクチノマイシン、または、10μg/mlクロラムフェニコールを含むPBS、または、ΔtagO、ΔdltA、または、補足されたΔtagOそれぞれを含むPBSに再懸濁した。6週齢の雌コトンラット(Sigmadon hispidis) を、ロンプン(Rompun)、マレイン酸アセプロマジンおよびケタミン(それぞれ2.5mg/kg,2.5mg/kgおよび25mg/kg)を併用して麻酔した。再懸濁されたS.アウレウス(109CFU)のアリコート(10μl)を、鼻腔内に滴状で点滴注入し、麻酔した動物の鼻孔それぞれに等しく分布させた。
感受性の実験用の細菌を調製するために、ミューラーヒントンブロスに、一晩の細菌培養物を体積比1/100で植え付け、中期対数期になるまで37℃で強く撹拌した。細菌を、0.05%HSAを含むリン酸カリウム緩衝液(10mM,pH7.5)で3回洗浄した。濃度1×106CFU/mlの細菌を、同じ緩衝液中の100μgのhNP1−3/ml、10μlのLL−37/ml、または、500μgのラクトフェリン/mlと共に、全ての化合物を37℃で予備加熱した後にインキュベートした。それぞれ10μlのサンプルを37℃で撹拌し、様々なタイムポイントで氷冷リン酸カリウム緩衝液で25倍希釈することによって死滅を止めた。適切な希釈物をLB寒天にプレーティングして24時間後に、生存可能な細菌をカウントした。ヒトラクトフェリンをシグマ(セントルイス,ミズーリ州)から購入した。近年説明されている通りに、hNP1−3を、ヒト顆粒球から精製した(63)。Fmoc/Bu1法、および、Rinkアミド樹脂を含むポリスチレン樹脂を用いた固相ペプチド合成によってLL−37を合成した(2)。脱保護した後に、ヌクレオシル(Nucleosil)C4カラム(150×10mm)での逆相分離用HPLCによってペプチドを精製した。分析用逆相HPLCによってペプチドの純度を調べ、その製剤が97%純粋であることがわかった。ペプチドの同一性を、エレクトロスプレーマススペクトロメトリーとMALDI−MSによって確認した。同数のS.アウレウスSA113野生型、ΔtagO、および、ΔdltA細菌を、100μg/mlのヒトデフェンシンhNP1−3、xμg/mlカテリシジンLL−37、または、500μg/mlのラクトフェリンと共にインキュベートした、生存可能な細菌を、様々なインキュベート時間後にカウントした。
樹立されたヒト肺胞の上皮細胞系A549(45)を、10%熱で不活性化されたウシ胎仔血清(バイオクロム(Biochrome),ベルリン,ドイツ)、および、2mMグルタミンが添加されたダルベッコ改変イーグル培地NutミックスF−12(DMEM−F12)(ギブコ−BRL,カールスバッド,カリフォルニア州)中で培養した。初期のヒト気管支の上皮細胞(NHBE)と、必要な培地成分を、クロンティクス(Clonetics,ウォーカーズビル,メリーランド州)から購入した。それらを、製造元の説明書に従って、BulletKitが添加された気管支の上皮細胞の増殖培地(BEGM)中で培養し、継代数4までを用いた。初期のヒトの鼻の上皮細胞(HNEC)と、必要な培地成分を、オリジーン(Oligene,ベルリン,ドイツ)から購入した。製造元の説明書に従ってHNECを培養し、継代数4までを用いた。全てのタイプの上皮細胞を、5×104/ウェル(A549)、2×104/ウェル(NHBE)、または、1×104/ウェル(HNEC)の細胞数で24−ウェル培養プレートに蒔き、37℃で、5%CO2下でインキュベートした。密集してきたら、単層を、RPMI1640培地(シグマ)で3回洗浄し、付着の分析に用いた。
IL−8誘導を、付着の研究に関して上記で説明されている条件下で研究した(ただし、細菌を標識せず、HNECをS.アウレウス株と共にインキュベートし、1時間後にゲンタマイシン(100μg/ml)を添加し、続いてさらに8時間インキュベートすることによって不活性化したことを除く)。IL−8 をELISAによって定量した(R&Dシステムズ(R&D Systems),ミネアポリス,ミネソタ州)。
アミンで修飾された蛍光マイクロスフェア(フルオスフェアズ(FluoSpheres),直径1.0μm,黄〜緑色の蛍光,モレキュラープローブス(Molecular Probes),ユージーン,オレゴン州)をWTAでコーティングするために、ビーズを、リン酸カリウム緩衝液(PPB)(10mM,pH7.5)で洗浄し、室温で30分間、WTA(500μg/ml)(200μl)と共に、ゆっくり撹拌しながらインキュベートした。WTAはエタノール沈殿し、PPBに溶解した。WTAでコーティングしたビーズを2回洗浄し、1%BSA(シグマ)を含むPPBに再懸濁し、疎水性エリアをブロックした。BSAなしでWTAでコーティングしたビーズ(100μl)を100℃で10分間沸騰させることによって放出されたGlcNAcの量を測定することによって、吸着したWTAの量を決定した。WTAでコーティングしたビーズを、RPMIで希釈し、ノイバウエル計算板を用いて決められた濃度に調節し、様々なサンプルを同じ蛍光に関して試験した。このサンプルを、FITCで標識された細菌について説明されたのと同様にして、密集して成長したA549細胞(MOI=50,25および12.5)、または、HNEC(MOI=60,30および15)への付着の分析に用いた。505/515nm/ウェルでの相対的な蛍光を、フルオロリーダー(FL600,バイオ−TEKインスツルメンツ(Bio−TEK Instruments),ウィノースキ(Winooski),バーモント州)を用いて定量した。結果を評価するために、数回の実験で、上述したようにFITCで標識された細菌をカウントすることによって(すなわち顕微鏡でカウントすることによって)ビーズ数/mm2上皮細胞を決定した。
細菌の固相Fnへの付着を、Wolz等によって説明されている通りに研究した(93)。簡単に言えば、96−ウェルマイクロタイタープレート(コースター(Costar),アクトン,マサチューセッツ州)を、50mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中の20μgのFn/ウェルで、4℃で15時間コーティングした。それに続いて、ウェルを、3%BSAのTBS(25mMトリス−HCl,100mMのNaCl、pH7,5)溶液で2時間ブロックし、TBSで2回洗浄した。細菌を、IMDM中で中期対数期になるまで成長させ、TBSで2回洗浄し、ノイバウエル計算板を用いて1×109細胞/mlに調節した。細菌懸濁液(200μl)を各ウェルに加えた。37℃でのインキュベートの1時間後に、ウェルをTBSで3回洗浄し、サフラニンで1分間染色し、マイクロプレートリーダー(スペクトラマックス(SpectraMAX)360pc,モレキュラーデバイス(Molecular Devices),サニーベール,カリフォルニア州)でA492を決定した。
死滅の実験用の細菌を調製するために、ミューラーヒントンブロスに、体積比1/100の一晩の細菌培養物を植え付け、中期対数期になるまで37℃で強く撹拌した。細菌を、0.05%HSAを含むリン酸カリウム緩衝液(10mM,pH7.5)で3回洗浄した。濃度1×108CFU/mlの細菌を、同じ緩衝液中の、100μgのhNP1−3/ml、500μgのラクトフェリン/ml、または、100μlのLL−37/mlと共に、全ての化合物を37℃で予備加熱した後にインキュベートした。それぞれ10μlのサンプルを37℃で撹拌し、様々なタイムポイントで氷冷リン酸カリウム緩衝液で25倍希釈することによって死滅を止めた。適切な希釈物をLB寒天にプレーティングして24時間後に、生存可能な細菌をカウントした。ヒトラクトフェリンをシグマから購入した。近年説明されている通りに、hNP1−3を、ヒト顆粒球から精製した(18,68)。LL−37を固相ペプチド合成によって合成し、逆相HPLCによって精製した。LL−37のアミノ酸配列は以下の通りである:
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(配列番号3)
ペプチドの純度および同一性を、HPLCとマススペクトロメトリーによって確認した。ラクトフェリンをシグマから購入した。
S.アウレウス野生型およびΔtagOに対するリソスタフィンの活性を比較するために、B培地(B−media)に、体積比1/100で一晩の培養物を植え付け、中期対数期になるまで37℃で撹拌した。細菌をPBS中で3回洗浄した。全ての工程を4℃で行った。A600=1の細菌を、1μg/mlリソスタフィン(メルク(Merck))含有または非含有のPBS中で、30℃で1時間インキュベートした。A600の減少を、10分間ごとに、マイクロプレートリーダー(スペクトラマックス360pc,モレキュラーデバイス,サニーベール,カリフォルニア州)で測定した。
人口の30〜40%における前鼻孔の定着は、重度のスタフィロコッカス・アウレウス感染の発症に関する主要な危険因子である。しかしながら、鼻孔における付着および生存に介在するメカニズムは未だにわかっていない。
病原性におけるテイコイン酸の役割を徹底的に研究するために、我々は、WTA生合成遺伝子tagOを同定し、第一の定義されたWTA欠失突然変異体を生成した。それに続く以下の実施例で述べられるように、この定義された突然変異体(ΔtagO)は、コトンラットモデルにおける、S.アウレウスの鼻での定着におけるWTAの役割を実証している。
野生型およびΔtagOにおける細胞壁に固定されたタンパク質のパターンにおいては、主要な差は示されなかった(データ示さず)。S.アウレウスSA113野生型と、ΔtagO突然変異体の成長の特徴を、複合培地(基礎培地,BM)と、最小培地(イスコフ改変ダルベッコ培地,IMDM)とで比較した。前鼻孔に適切な条件下で(30℃,通気良好)、世代時間は両方の株で極めて類似しており(図2A)、これは、WTAは、S.アウレウス細胞複製においてわずかな役割しか果たさないことを示す。37℃で、リッチな培地で、ΔtagO突然変異体のラグフェーズはほんのわずか増加し、世代時間は減少した(突然変異体においては61±3分間であるのに対し、野生型にいおては50±4分間;平均±SD)。定常期における野生型とΔtagOの生存率は、少なくとも6日間にわたって極めて類似していた(図2B)。
S.アウレウスSA113のその他の突然変異体、ΔdltAが説明されている(68)。この突然変異体は、WTA、および、膜に固定されたリポテイコイン酸においてD−アラニン修飾が欠失している(図1A)。それらが、ヒトの気道の上皮細胞(正常なヒト気管支の上皮細胞、NHBE)(図3A)、および、ヒトの鼻の上皮細胞(HNEC)(図3B)へ付着する能力に関して、ΔtagOとΔdltA突然変異体を解析した。HNECにおいては、両方の突然変異体の付着効率は、野生型に比べてかなり低かった(ΔtagO,80%の付着の減少;ΔdltA,55%の付着の減少;図3B)。失われた遺伝子が補足された突然変異体株は、野生型レベルの付着を示す。初期のヒト気管支細胞への付着を解析したら、類似しているが著しくはない差が見出された(図3A)。
ヒトおよび齧歯類動物からの鼻の分泌物は、多数の陽イオン性抗菌ペプチドおよびタンパク質を含む(16,89)。ヒトおよび齧歯類動物からの気道上皮は、デフェンシン、カテリシジン、ラクトフェリンなどの多数の抗菌性物質を生産する。テイコイン酸D−アラニンエステルは、S.アウレウスのこのクラスの宿主防御要素に対する耐性において主要な役割を果たす(68,18)。加えて、インテグリンとのFnが介在する相互作用は、S.アウレウスの上皮細胞への結合において役割を果たすことが示されている(25)。以下の実施例4で実証されているように、ΔtagOおよびΔdltAのコトンラットの鼻に定着する能力は、野生型と比較すると減少している。これは、突然変異体の先天的な宿主防御要素に対する感受性が増加したためによる可能性がある。従って、S.アウレウス野生型、ΔdltA、および、ΔtagOの、ヒトデフェンシンhNP1−3、カテリシジンLL−37およびラクトフェリンに対する感受性を比較した(図5A)。LL−37が最も効力のある化合物であったが、それぞれhNP1−3およびラクトフェリンと類似した抗菌活性を達成するのに10または50倍多い量が必要であった。ΔdltA突然変異体は、全ての3種の物質に比べてかなり感染しやすかった。それに対して、ΔtagOにおけるWTAの欠失は、野生型株と比較して、3種のペプチドの活性には影響がなかった(図5A)。この結果により、鼻の患者の防御に対して、S.アウレウスのΔtagOの感受性が増加したことは恐らく、この突然変異体が、コトンラットの鼻に定着できないこととは関与していないことが示される。
1980年代の間接的なデータが、ヒトの気道の上皮細胞への結合におけるテイコイン酸に関与しており(2)鼻での定着におけるWTAの可能性のある役割を示している。近年開発された、S.アウレウスの鼻での定着のコトンラット(Sigmadon hispidis)モデルにより、一貫して持続性のハイレベルな鼻での定着が可能である(45)。コトンラットの鼻孔は、扁平上皮,円柱上皮に対する立方骨,円柱上皮、および、多列円柱上皮エリアにおいてヒトと類似した組織学的な特性を有するため、コトンラットモデルは、ヒトのS.アウレウスのキャリアーにおける状況をよく反映している(73)。コトンラットは、多くの細菌性およびウイルス性の呼吸器のヒト病原体に感染しやすく、ヒトで観察される病気の経過と類似した経過をたどることが示されている(60)。
WTAに特異的に結合する抗体
WTAに特異的に結合する抗体は、当業者周知の方法によって生成される。米国特許第6,610,293号を参照(この参照により開示に含まれる)。例えば、WTAを特異的に認識するポリクローナル抗体は、マウスの皮下にWTA製剤を植え付けることによって生成される。WTA製剤は、WTAまたはWTAフラグメント、および、完全フロインドアジュバントで構成される。例えば、10μg、50μg、または、100μgの範囲の量の抗原が投与される。この最初の植菌に続いて、約1〜2ヶ月のインターバルで、1回またはそれ以上のブースター植菌が行われる。ブーストされる抗原製剤は、不完全フロインドアジュバント中に、WTAまたはWTAフラグメントを含む。様々な抗原の量の組合わせと、ブーストスケジュールを実行することによって、最適なWTAへの免疫応答が生じる投与およびブーストスケジュールを決定することができる。ポリクローナル抗体は、ワクチン注射されたマウスの血液を回収し、血液サンプルを遠心分離して、細胞成分から血清を分離することによって血清を調製することによって製造される。ポリクローナル抗体はまた、類似の方法によってウサギで生産してもよい。
行われた実験の結果により、鼻での定着において、WTAおよびWTAのd−アラニンエステル、および/または、LTAが顕著な役割を有することが実証される。我々の知見にとって、WTAは、鼻での定着に重要であると同定された第一の要素である。ΔdltA突然変異体による鼻での定着の欠失を、この突然変異体の陽イオン性の抗菌成分に対する感受性の増加によるものと結論付けることもできるが、ΔtagO突然変異体の、鼻の上皮で見出される抗菌成分に対する感受性は、S.アウレウス野生型より低かった。この観察は、耐性の減少以外の理由は、壁テイコイン酸の突然変異体は、コトンラットの鼻孔へ定着できないことに関連していることを示す。
Claims (38)
- 患者のブドウ球菌感染を治療する方法であって、患者の鼻孔に、WTAに特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを含む組成物の治療有効量を点滴注入することを含み、その治療により定着が緩和またはブロックされる、前記方法。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合する複数種のMAbを含み、前記MAbのアミノ酸配列は同一ではない、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するキメラ抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するヒト化抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するヒト抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1種の抗ブドウ球菌薬の点滴注入をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗ブドウ球菌薬は、リソスタフィンおよびナイシンから選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌感染は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体フラグメントは、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、SFv、および、scFvから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌感染は、S.アウレウス(Staphylococcus aureus)感染である、請求項1に記載の方法。
- 患者の鼻孔に、可溶性型のWTA全体またはWTAのフラグメントを含む組成物の治療有効量を点滴注入することを含み、その治療により定着が緩和またはブロックされる、患者のブドウ球菌感染を治療する方法。
- 少なくとも1種の抗ブドウ球菌薬の点滴注入をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記抗ブドウ球菌薬は、リソスタフィンおよびナイシンから選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌感染は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌感染は、S.アウレウス感染である、請求項13に記載の方法。
- WTAに特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントの治療有効量を含む組成物であって、前記抗体またはそれらのフラグメントは、患者へ投与されるとブドウ球菌の定着を緩和またはブロックする、前記組成物。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む、請求項18に記載の組成物。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、請求項18に記載の組成物。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合する複数種のMAbを含み、前記MAbのアミノ酸配列は同一ではない、請求項18に記載の組成物。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するキメラ抗体を含む、請求項18に記載の組成物。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するヒト化抗体を含む、請求項18に記載の組成物。
- 前記組成物は、WTAに特異的に結合するヒト抗体を含む、請求項18に記載の組成物。
- 前記フラグメントは、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、SFv、および、scFvから選択される、請求項18に記載の組成物。
- 前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項18に記載の組成物。
- 前記ブドウ球菌の定着は、S.アウレウス感染を引き起こす、請求項18に記載の組成物。
- (a)請求項18に記載の組成物;および、
(b)製薬上許容できるキャリアー、
を含むワクチン。 - 前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項28に記載のワクチン。
- 前記ブドウ球菌の定着は、S.アウレウス感染を引き起こす、請求項28に記載のワクチン。
- 可溶性型のWTA全体またはそれらのフラグメントの治療有効量を含む組成物であって、前記WTAまたはそれらのフラグメントは、患者へ投与されるとブドウ球菌の定着を緩和またはブロックする、前記組成物。
- 前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項31に記載の組成物。
- 前記ブドウ球菌の定着は、S.アウレウス感染を引き起こす、請求項31に記載の組成物。
- (a)請求項31に記載の組成物;および、
(b)製薬上許容できるキャリアー、
を含むワクチン。 - 前記定着は、局所的感染、全身感染および異物の汚染から選択されるブドウ球菌感染を引き起こす、請求項34に記載のワクチン。
- 前記ブドウ球菌の定着は、S.アウレウス感染を引き起こす、請求項34に記載のワクチン。
- 構築の際にtagO遺伝子が不活性化された、単離された構築されたWTA欠失S.アウレウス生物。
- ΔtagOである、請求項37に記載の単離されたS.アウレウス生物。
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