CN113490686A - 病原体结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白、组合物及其用途，其中所述蛋白包含具有第一结合特异性的第一肽、具有第二结合特异性的第二肽和接头，其中所述第一肽和所述第二肽结合至少一种病原体表面组分和/或至少一种由病原体产生的分子。

Description

病原体结合蛋白
技术领域
本发明涉及蛋白、组合物及其用途，尤其是蛋白和组合物。所述蛋白包含具有第一结合特异性的第一肽、具有第二结合特异性的第二肽和接头，其中所述第一肽和所述第二肽结合至少一种病原体表面组分和/或至少一种由病原体产生的分子。因此，所述蛋白和/或组合物可用于预防或治疗由病原体引起的感染。
背景技术
Harmsen et al.2006的文章(Selection and optimization ofproteolyticallystable llama single-domain antibody fragments for oral immunotherapy)涉及重组单域抗体(VHH片段)克隆K609的经口应用。K609针对埃希氏大肠杆菌(Escherichia Coli)F4菌毛，更具体地是尖端粘附素(tip-adhesin)FaeG，并且已证明其可以减少埃希氏大肠杆菌(E.coli)诱导的仔猪腹泻，但由于经口应用的K609单域抗体在胃中通过蛋白水解被降解，其仅在高剂量时有效。通过选择和DNA改组(DNA shuffling)，获得了体外稳定性增加的四个克隆。这些单域抗体彼此之间和与K609之间有至多10个氨基酸残基的不同。最稳定的克隆K922在胃液中孵育后保留41％的活性，在空肠液(jejunal fluid)中为90％，并且此外与原始K609克隆相比对FaeG的亲和力更高。
Virdi et al.2013的文章(Orally fed seeds producing designer IgAsprotect weaned piglets against enterotoxigenic Escherichia coli infection)涉及针对断奶后感染，例如产肠毒素埃希氏大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的仔猪断奶后腹泻的基于经口饲养的被动免疫。针对ETEC的抗F4+ETEC抗体是通过将美洲驼仅重链抗体(llama heavy chain-only antibody)的可变结构域与猪免疫球蛋白(IgG或IgA)的Fc部分融合并在拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子中表达来设计的。该文章还描述了基于VHH-IgA的单体、二聚体和分泌型IgA。
Lo et al.2014的文章(The molecular Mechanism of Shiga Toxin stx2eNeutralization by Single-domain Antibody Targeting the Cell Receptor-bindingDomain)报告了从美洲驼噬菌体展示文库中分离出的单域抗体的发现和表征，该抗体对Stx2e毒素具有强力的中和能力。水肿病(edema disease)是一种以神经性疾病、出血性病变和频繁的致命结果为特征的严重疾病。猪水肿病(swine edema disease)是由生产志贺毒素Stx2e的埃希氏大肠杆菌引起的。该文章表明，中和NbStx2e1将来可用于预防或治疗猪水肿病。
Moonens et al.2014的文章(Nanobody Mediated Inhibition of Attachmentof F18 Fimbriae Expressing Escherichia coli)涉及针对F18菌毛粘附素(fimbrialadhesin)FedF的凝集素结构域的纳米抗体(nanobody)。这些结合FedF的纳米抗体从美洲驼获得。
专利申请WO 2014/033313 A1描述的发明涉及一种能够在被动免疫计划中保护免遭ETEC感染的抗体。抗ETEC单域抗体与IgA Fc结构域融合并在植物种子中生产。此专利申请还涉及抗ETEC，其是抗F4+ETEC单域抗体和抗F18+ETEC单域抗体。
发明内容
本文提供了包含具有第一结合特异性的第一肽、具有第二结合特异性的第二肽和接头的蛋白，其中所述第一肽和所述第二肽结合至少一种病原体表面组分和/或由病原体产生的至少一种分子，例如毒素。本文提供的蛋白可用于预防和/或治疗病原体诱导的感染。
在一个方面，本发明提供了编码上述方面所述的蛋白的分离的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了包含上述方面所述的核酸分子的载体。
在另一个方面，本发明提供了包含上述方面所述的核酸分子或载体的重组宿主细胞。
在一个方面，本发明提供了一种膳食组合物，其包含上述方面所述的蛋白并且任选地进一步包含一种或多种益生元(prebiotics)、益生菌(probiotics)、合生元(synbiotics)、蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、纤维和/或营养素(nutrients)，例如膳食矿物质，用于活体受试者。
在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述方面所述的蛋白、核酸、载体和/或重组宿主细胞以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本发明提供了上述方面所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用作药物。
在一个方面，本发明提供了上述方面所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用于预防或治疗与内表面和/或外表面相关的病原体诱导的感染。
在另一个方面，本发明提供了上述方面所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用于预防或治疗胃肠道感染和/或肺部感染。
在另一个方面，本发明提供一种蛋白，其中所述蛋白包含第一肽和第二肽，各包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。
在一个方面，本发明提供了一种交联病原体的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上述任一方面所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。
在一个方面，本发明提供了一种阻止生物膜(biofilm)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上述任一方面所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。
在一个方面，本发明提供了一种中和病原体和/或由病原体分泌的分子的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上述任一方面所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。
在一个方面，本发明提供了一种治疗或预防有此需要的受试者中由病原体引起的感染例如胃肠道感染和/或肺部感染的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上述任一方面所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了一种生产上述任一方面所述的蛋白的方法，所述方法包括在允许所编码的蛋白表达的条件下培养上述任一方面所述的宿主细胞。
根据一个方面，本发明提供了包含至少两个单域抗体的蛋白，其中所述蛋白至少对第一毒力因子和第二毒力因子特异。
根据另一个方面，本发明提供了包含本发明的蛋白和任选地一种或多种赋形剂、稀释剂和/或粘合剂的组合物。
根据一个方面，本发明提供了包含对第一毒力因子特异的第一单域抗体和对第二毒力因子特异的第二单域抗体的组合物。
根据一个方面，本发明提供了一种治疗或预防动物或人的医学病况的方法，包括施用本发明所述的蛋白或组合物。
根据一个方面，本发明提供了本发明所述的蛋白或组合物的非治疗用途。
附图说明
图1：在与胃肠道条件相似的条件下的稳定性测试结果显示于标准SDS凝胶上。产品条带由方框标示。
图2：在高蛋白酶浓度和低pH条件下的稳定性测试结果显示于标准SDS凝胶上。产品条带由方框标示。
图3：在非常高的蛋白酶浓度和低pH条件下的稳定性测试结果显示于标准SDS凝胶上。产品条带由方框标示。
图4：同二价(homodivalente)和异二价(heterodivalente)蛋白构建体的结合能力测试结果。当产品在ELISA测定中结合时，所测的OD450表示信号，信号越高意味着结合的产品越多。
图5：单体和同二价蛋白构建体在暴露于和不暴露于柠檬酸下的稳定性测试结果。图A)显示了在柠檬酸冲激(citric acid shock)后未分离的单体和同二价蛋白构建体的量，即保留在孔中的产品量。图B)显示了在柠檬酸冲激后被洗脱的单体和同二价蛋白构建体的量。
图6：游离LT-B的流动诱导分散分析(Flow-Induced Dispersion Analysis，FIDA)及其与LT1单体和LT1同二价蛋白构建体的相互作用的结果。
图7：图A)显示了同二价蛋白构建体的热稳定性结果。图B)显示了同二价蛋白构建体的pH稳定性结果。图C)显示了同二价蛋白构建体的胆汁盐(bile salt)稳定性的结果。
图8：图A)显示了暴露于胃液的同二价蛋白构建体的稳定性测试结果。对于一个样品，用HCl将pH调节至约3。将样品在37℃下孵育60分钟或120分钟。图B)显示了暴露于猪胆汁(pig gall)的同二价蛋白构建体随时间的稳定性测试结果。将猪胆汁与细菌和BSA混合至最终胆汁浓度为50％、10％或2％。
图9：图A)是示意图，图B)显示了使用光学显微镜拍摄的图像。图A)和图B)均显示了未添加任何单体或二价蛋白构建体的F4 ETEC细菌、具有F45单体的F4 ETEC细菌和具有将F4 ETEC细菌连接在一起的F45同二价蛋白构建体的F4 ETEC细菌。
图10：图A)的上半部分显示了肠上皮细胞(enterocyte)及其在上表面上的微绒毛(microvillus)。图A)的下半部分显示了来自带有F4 ETEC细菌的仔猪的分离的肠道绒毛状肠上皮细胞(intestinal villous enterocyte)，如左图中的箭头所示。右图显示了当存在F45::(GGGS)3::F45同二价蛋白构建体时，F4 ETEC细菌不能与肠上皮细胞的微绒毛结合。图B)显示了阻断F4 ETEC与猪绒毛状肠上皮细胞结合的功效。通过计数与相关对照相比出现的结合有0、1或2+F4 ETEC细胞的肠上皮细胞，来定量功效。将1包括在内，因为在进行显微镜术时漂浮的细菌可能在盖玻片下捕获。结合1或2+ETEC细胞的肠上皮细胞的百分比显示了细菌感染肠上皮细胞的功效。使用F183::(GGGS)3::F183同二价蛋白构建体作为特异性对照。
图11：同二价蛋白构建体对F4+仔猪(N＝32)断奶后腹泻的体内治疗结果。x轴显示断奶后天数。y轴显示粪便中带有F4细菌的仔猪数量(％)。测试了四组：1)对照：无F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体且无F4，2)对照：有F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体但无F4，3)无F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体但有F4，以及4)有F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体且有F4。
图13：在与胃肠道条件相似的条件下的稳定性测试结果显示于标准SDS凝胶上。产品条带由方框标示。
图12：使用猪胃液以与胃肠道条件相似的条件下的稳定性测试结果显示于标准SDS凝胶上。产品条带由方框标示。
所有引用的参考文献均通过引用并入。
提供附图和实施例以解释而不是限制本发明。本领域技术人员将知晓，本发明的各方面、实施例、权利要求和任意项可以组合。
除非另有说明，否则所有百分比均以重量/重量计。除非另有说明，否则所有测量均在标准条件(环境温度和压力)下进行。除非另有说明，否则测试条件均根据欧洲药典8.0(European Pharmacopoeia 8.0)。
具体实施方式
本说明书中使用的术语在本公开的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有其在本领域中的普通含义。某些术语在下文或说明书的别处讨论，以通过描述本公开的组合物和方法以及如何制备和使用它们来为实施者提供额外的指导。
定义
如本文所用，当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，“a”或“an”一词的使用可意指“一(one)”，但其也与“一或多(one ormore)”、“至少一(at least one)”和“一或多于一(one ormore than one)”的含义一致。另外，术语“具有”、“包括”、“含有”和“包含”是可以互换的，并且本领域技术人员知晓这些术语是开放式术语。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于这个值是如何测量或确定的，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在3或大于3的标准偏差内。或者，“约”可以意指给定值的至多20％，优选至多10％，更优选最多5％，且仍更优选至多1％的范围。或者，尤其是对于生物系统或方法，该术语可意指在值的一个数量级内，优选5倍内，更优选2倍内。
本文所用的术语“受试者”是指任意受试者，例如人类或动物受试者。其非限制性实例可以是哺乳动物受试者和/或家畜。药剂的“有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。
如本文所用，术语“组合”是指使用多于一种治疗剂。术语“组合”的使用不限制向受试者施用治疗剂的顺序。第一治疗剂可以在向受试者施用第二治疗剂之前、同时或之后施用。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，例如“treat”或“treating”)是指以有效改善病况、症状或与疾病相关的参数或有效预防疾病发展至统计学显著程度或本领域技术人员可检测到的程度的量、方式和/或模式，改变正在治疗的个体的自然进程(natural course)的尝试中的一种干预。治疗可以改善、治愈受试者的疾病或病况，或减少其持续时间。
如本文所用，术语“单体(monomer)”或“单体蛋白(monomeric protein)”是指具有单一结合特异性的单个肽。
如本文所用，术语“二价蛋白构建体(divalentprotein construct)”是指包含通过接头连接的具有第一结合特异性的第一肽和具有第二结合特异性的第二肽的蛋白。
如本文所用，术语“同二价蛋白构建体(homodivalentprotein construct)”是指包含通过接头连接的具有第一结合特异性的第一肽和具有第二结合特异性的第二肽的蛋白，其中所述肽是相同的。“同二价蛋白构建体”在本文中也可表示为“二价构建体(bivalent construct)”。因此，这两个术语在本文中可以互换使用。
如本文所用，术语“异二价蛋白构建体(heterodivalentprotein construct)”是指包含通过接头连接的具有第一结合特异性的第一肽和具有第二结合特异性的第二肽的蛋白。所述肽是不同的。“异二价蛋白构建体”在本文中也可表示为“异价(heterovalent)”。因此，这两个术语在本文中可以互换使用。
如本文所用，术语“表面组分”是指存在于病原体表面上的任意表面组分，例如存在于病原体表面上的任意细胞表面组分。因此，细胞表面组分可以是粘附因子，但不限于此。
如本文所用，术语“分子”是指由病原体产生的任意分子。所述分子可以是分泌的分子或附着于细胞或表面的分子。在本发明的一些实施方案中，所述分子是毒素、蛋白酶和/或结合分子。在本发明的一些实施方案中，所述分子是抑制剂，其可以与药物组分结合从而抑制药物组分的功能。
蛋白的性质
本公开涉及一种蛋白，其包含
-具有第一结合特异性的第一肽；
-具有第二结合特异性的第二肽；和
-接头，
其中所述第一肽和所述第二肽结合至少一种病原体表面组分和/或至少一种由病原体产生的分子。
本公开的蛋白通常是分离的蛋白，即其不定位于也不提供在细胞内例如活体受试者中的细胞内。
在本发明的实施方案中，蛋白可包含一种或多种与至少一种病原体表面组分和/或至少一种由病原体产生的分子结合的进一步的肽。
单域抗体(single-domain antibody)，即单体，通常在胃中通过蛋白水解被降解。因此，只有非常大量的单域抗体才可能在胃肠道中产生作用。令人惊讶的是，发明人发现，通过如本发明所述使用接头连接至少两个肽，蛋白构建体在胃肠道中是稳定的。有趣的是，发明人还发现所述蛋白能够与病原体表面组分和/或由病原体分泌的分子结合。因此，本发明人产生了有效预防和/或治疗病原体诱导的感染、交联病原体、阻止生物膜形成和/或中和由病原体分泌的分子的蛋白。
接头的性质
本发明所述的接头是指至少促进二聚化的接头。因此，本发明涉及一种蛋白，其中所述第一肽和所述第二肽通过接头连接。
在本发明的实施方案中，接头是稳定的接头，且赋予本发明的蛋白稳定性。因此，在如下文所述的暴露下，所述接头不被降解并且因此能够连接本发明的所述第一肽和所述第二肽。优选地，蛋白在受试者的胃肠道和/或呼吸系统中是稳定的，即，接头能够至少促进蛋白在受试者的胃肠道和/或呼吸系统中的二聚化。在一个实施方案中，蛋白是酸稳定的和/或蛋白酶稳定的。蛋白可以在任意酸例如胆汁酸(bile acid)和/或柠檬酸存在下是稳定的。蛋白还优选在任意蛋白酶例如胃蛋白酶和/或胰蛋白酶存在下是稳定的。在一个实施方案中，蛋白在胆汁(gall)存在下，例如在50％、10％或2％胆汁下1小时是稳定的。在另一个实施方案中，蛋白在胆汁盐(bile salt)存在下，例如在0.2mM、1mM和10mM脱氧胆酸钠(NaDeox)下1小时是稳定的。
在本发明的一个实施方案中，蛋白是温度稳定的，例如温度稳定直至70℃。这表明蛋白稳定性高。在另一个实施方案中，蛋白是pH稳定的。出乎意料的是，发明人发现，在pH3-4时，约70-90％的蛋白保持稳定，因此所述蛋白能够至少作为二聚体蛋白通过胃肠道并保持其活性。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中第一肽和第二肽通过接头连接在一起。
在本发明的一些实施方案中，所述第一肽和所述第二肽通过GS接头连接。
本文的一个非限制性实例是通过GS接头连接在一起的至少两个单域抗体。GS接头是融合蛋白接头，主要由甘氨酸和丝氨酸残基的区段组成。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述GS接头是具有(GxS)n结构的接头，其中x是指多个连续的G，其中x可以在1-10之间，例如为1，优选为2，更优选为3，优选为4，优选为5，更优选为6，优选为7，优选为8，更优选为9，优选为10。n是指GxS序列的重复次数，其中n可以在1-10之间，例如为1，优选为2，更优选为3，优选为4，优选为5，更优选为6，优选为7，优选为8，更优选为9，优选为10。实例包括但不限于GGGGS接头(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:22)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:23)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ IDNO:24)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:25)。
在一个实施方案中，GS接头是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:22)接头。
发明人已发现，在添加蛋白酶例如胃蛋白酶和胰蛋白酶后，包含通过IgG3接头连接的两个单体的蛋白是不稳定的(参见实施例6)。添加蛋白酶后，IgG3接头被降解，两个单体不再连接。
根据一个实施方案，优选地，本发明的所述第一肽和所述第二肽不通过IgG3接头连接。因此，所述第一肽和所述第二肽可以通过任意稳定的接头连接，条件是所述接头不是IgG3接头，例如SEQ ID NO:26的IgG3铰链接头。
先前的研究已将美洲驼仅重链抗体的可变域与猪免疫球蛋白(IgG或IgA)的Fc部分连接，此类构建体的缺点是它可能导致所治疗的受试者中不想要的免疫应答。
因此，根据本发明的另一个实施方案，优选地，接头不包含抗体的一部分，例如Fc区或Fc区的一部分。因此，所述第一肽和所述第二肽可以通过任意稳定的接头连接，条件是所述接头不包含抗体的一部分，例如Fc区或Fc区的一部分。
病原体表面组分可以是存在于病原体表面上的任意组分。因此，它可以包括但不限于任意毒力因子，例如粘附因子。
肽的性质
第一肽和/或第二肽可以是对病原体表面组分和/或由病原体产生的分子具有结合特异性的任意肽。
病原体表面组分可以是存在于病原体表面上的任意组分。因此，病原体表面组分可以是病原体附属物(appendage)和/或毒力因子，例如粘附因子(adhesion factor)。
本发明所述的分子可以是毒素、抑制剂和/或酶。
一些病原体能够产生酶来保护自己，导致例如抗微生物抗性，例如细菌抗生素抗性。这些分泌的分子可以是蛋白酶或其他针对抗生素或抑制剂的能够结合并中和抗生素的分子。因此，针对此类分子的蛋白能够中和病原体抗生素抗性。
在一个实施方案中，由病原体产生的分子是β内酰胺酶(betalactamase)。
优选地，所述第一肽和所述第二肽以非常低的亲和力与非病原体表面组分和/或由非病原体分泌的分子结合。非限制性实例可以是将蛋白提供给人受试者时，所述蛋白对人表面组分(非病原体表面组分)具有低的结合特异性。
在本发明的一个实施方案中，所述第一肽和/或第二肽是单域抗体。在另一个实施方案中，所述蛋白是DARPin。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述蛋白是同二价的或异二价的。
本发明所述的蛋白包含所述第一肽和所述第二肽，其可以与以下结合：
-相同的表面组分；
-不同的表面组分；
-表面组分和分子；
-相同的分子；或
-不同的分子。
在一个实施方案中，表面组分来自相同的病原体。
在一个实施方案中，表面组分来自不同的病原体。
在一个实施方案中，本发明所述的蛋白能够交联病原体。
在本发明的一个方面，其中所述第一肽和所述第二肽与相同的病原体表面组分结合，所述蛋白能够交联表达相同表面组分的病原体，例如相同的病原体种类。在本发明的另一个方面，其中所述第一肽和所述第二肽与相同的病原体表面组分结合，所述蛋白能够中和病原体的粘附和/或固定病原体。
在本发明的一个方面，其中所述第一肽和所述第二肽与不同的病原体表面组分结合，所述蛋白能够交联表达不同表面组分的病原体，例如交联不同的病原体种类，或交联存在于相同病原体种类上的不同的病原体表面组分。在本发明的另一个方面，其中所述第一肽和所述第二肽与不同的病原体表面组分结合，所述蛋白能够中和病原体的粘附和/或固定病原体。
在一个实施方案中，所述蛋白能够交联F4+ETEC细菌。
在另一个实施方案中，本发明所述的蛋白能够中和病原体和/或由病原体产生的分子。
在本发明的一个方面，其中所述第一肽和所述第二肽与病原体表面组分和由病原体分泌的分子结合，所述蛋白能够使分子与病原体交联，例如中和由病原体分泌的毒素。
在本发明的一个方面，其中所述第一肽和所述第二肽与相同的分子结合，所述蛋白能够中和分子，例如中和分泌的毒素和/或分泌的蛋白酶的作用。
在本发明的一个方面，其中所述第一肽和所述第二肽与不同的分子结合，所述蛋白能够中和至少两种不同的分子，例如中和分泌的毒素和/或分泌的蛋白酶的作用(可能以组合的方式)。
在另一个实施方案中，本发明所述的蛋白能够阻止生物膜形成。
在一个实施方案中，二聚体形式的蛋白与单体蛋白相比结合亲和力增加。例如，包含两个相同单域抗体的同二聚体蛋白构建体的结合亲和力比单独的单体单域抗体高至少1.5倍。
在一个实施方案中，所述第一肽或所述第二肽之一与埃希氏大肠杆菌细菌，例如F4+埃希氏大肠杆菌细菌和/或F18+埃希氏大肠杆菌细菌结合。
在一个实施方案中，所述第一肽或所述第二肽之一与F4+埃希氏大肠杆菌细菌结合，并且其中另一肽结合F18+埃希氏大肠杆菌细菌。
在一个实施方案中，所述表面组分选自由F18+、F4+、Stx2e、LT及其动物和人变体组成的组。
根据一个实施方案，本发明涉及包含至少两个单域抗体的蛋白，其中所述蛋白至少对第一毒力因子和第二毒力因子特异。
毒力因子是由微生物产生和/或作为微生物的一部分并引起疾病的分子。
单域抗体也称为“VHH片段”。单域抗体是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。像完整抗体一样，它能够选择性地与特定抗原结合。单域抗体的分子量仅为12-15kDa，比常见的由两条蛋白重链和两条轻链组成的免疫球蛋白G抗体(150-160kDa)小得多。单域抗体甚至小于Fab片段(～50kDa，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(～25kDa，两个可变域，一个来自轻链，一个来自重链)。首个单域抗体是从在骆驼科中发现的重链抗体工程化得到的，这些称为VHH片段。
VHH可衍生自骆驼科重链抗体并且天然地不含轻链。
术语“单域抗体构建体”是指至少一个单域抗体通过接头与至少一个其他单域抗体或肽连接。
术语“纳米抗体”是指源自天然来源例如骆驼(camel)、美洲驼(llama)或鲨鱼的单域抗体，经选择和优化以供进一步使用。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述第二毒力因子与所述第一毒力因子相同或不同。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述蛋白包含对所述第一毒力因子特异的第一单域抗体和对所述第二毒力因子特异的第二单域抗体。
“对……特异”，通常意指单域抗体与表位结合，并且所述结合需要一些互补性。根据这个定义，当单域抗体与表位结合比与随机的无关表位结合更容易时，将其称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本文中用于定量某单域抗体与某表位结合的相对亲和力。
如本文所用，“对毒力因子特异”的蛋白是指以5x10-7M或更小、1x10-7M或更小、5x10-8M或更小、1x10-8M或更小、5x10-9M或更小、1x10-9M或更小、5x10-10M或更小、1x10-10M或更小、5x10-11M或更小或1x10-11M或更少的Kd与毒力因子结合的蛋白。在某些实施方案中，蛋白以1x10-8M至1x10-10M的Kd结合。在某些其他实施方案中，蛋白以1-5x10-9M的Kd结合。
如本文所用，“同二价”是指存在两个相同的肽，例如VHH片段。
如本文所用，“异二价”是指存在两个不同的肽，例如VHH片段。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述蛋白对1种、优选2种、更优选3种、优选4种病原体表面组分，例如毒力因子和/或由病原体分泌的分子特异。毒力因子可以是来自生物体的不同组毒力因子或同组毒力因子。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述蛋白包含对毒力因子特异的肽，例如单域抗体，其中所述毒力因子形成靶蛋白的一部分或构成靶蛋白，其中所述靶蛋白来自相同的蛋白亚家族。蛋白亚家族可以根据蛋白结构分类(SCOP)数据库分类系统来定义。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述毒力因子的至少一种是粘附因子。
如本文所用，“粘附因子”是指一种毒力因子类型，其是促进粘附或结合至其他细胞或表面的细菌的细胞表面组分或附属物。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述第一和第二单域抗体对来自相同或两种不同微生物的毒力因子特异。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述第一单域抗体对微生物的粘附因子特异，并且所述第二单域抗体对微生物的一种可溶性毒力因子特异。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述一种或多种微生物选自埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)细菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)和志贺氏菌(Shigella)细菌。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述一种或多种病原体选自F4+埃希氏大肠杆菌细菌和F18+埃希氏大肠杆菌细菌。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述第一病原体是F4+埃希氏大肠杆菌细菌且所述第二病原体是F18+埃希氏大肠杆菌细菌。
产肠毒素埃希氏大肠杆菌(ETEC)、产志贺毒素埃希氏大肠杆菌(shigatoxigenicEscherichia coli，STEC)和产维罗毒素埃希氏大肠杆菌(verotoxigenic Escherichiacoli，VTEC)具有两个关键的毒力因子；粘附因素，通常为菌毛(fimbriae)，以及一种或多种引起疾病症状的毒素的产生。
如本文所用，“F4+埃希氏大肠杆菌”是指带有F4菌毛的产肠毒素埃希氏大肠杆菌菌株(F4+ETEC)，其在定殖后分泌一种或多种毒素，例如不耐热毒素(heat-labile toxin，LT)。
如本文所用，“F18+埃希氏大肠杆菌”是指带有F18菌毛的产肠毒素埃希氏大肠杆菌菌株(F18+ETEC)，其在定殖后分泌一种或多种毒素，例如不耐热毒素(LT)和/或热稳定肠毒素(heat-stable enterotoxin，ST)。F18+STEC菌株产生志贺毒素Stx2e，F18+VTEC菌株产生志贺样毒素。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述第一病原体产生不耐热毒素(heat-labile toxin，LT毒素)。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述第二病原体产生志贺毒素，例如选自stx2e和stx2e的猪和人变体。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述第一和/或第二病原体是带有菌毛类型或菌毛粘附的ETEC埃希氏大肠杆菌，例如F5、F6、F41或AIFA，人特异性变体，例如定殖因子抗原(CFA)或大肠杆菌表面抗原(CS)，包括但不限于CFAI、CFAII、CFAIII和CFAIV。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述第一和/或第二病原体产生志贺毒素或志贺样毒素，例如Stx2e和人变体，包括但不限于stx、stx1a、stx1c、stxd、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2f和stx2g。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述毒力因子选自ETEC菌毛粘附素例如F4和F18，不耐热肠毒素(LT)，和志贺毒素或志贺样毒素例如Stx2e，以及其猪和人变体。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白，其中所述毒力因子选自由以下组成的组：F18+、F4+、Stx2e、LT及其猪和人变体。
在本发明的一个实施方案中，所述第一肽和/或所述第二肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
本发明还涵盖与本文定义的氨基酸序列或与具有本文定义的特定性质的肽具有一定程度的序列同一性或序列同源性的肽的用途。本发明尤其涵盖与SEQ ID NO:1-10或其同源物具有一定程度的序列同一性的肽。此处，术语“同源物(homologue)”意指与主题氨基酸序列具有序列同一性的实体。
在本发明的一些实施方案中，所述第一肽和/或所述第二肽基本上由四个“框架区(framework region)”组成，其在本领域和下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；“框架区4”或“FR4”；这些框架区被三个“互补决定区”或“CDR”分隔，其在本领域中和下文中分别称为“互补决定区”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；“互补决定区3”或“CDR3”。因此，所述第一肽和/或所述第二肽的整体结构或序列可以表示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。所述第一肽和/或所述第二肽赋予了所述第一肽和/或所述第二肽的第一和/或第二结合特异性。
在一个实施方案中，所述第一肽和/或所述第二肽包含在SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸序列内的CDR1、CRD2和/或CDR3。
在一个实施方案中，任何序列变异均在CDR之外。
在一个实施方案中，序列变异在所述第一肽和/或所述第二肽的框架区内。
在一个实施方案中，所述第一肽和/或第二肽包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的氨基酸序列，且CDR3具有包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述第一肽和/或第二肽包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列的氨基酸序列，且CDR3具有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述蛋白包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的氨基酸序列，且CDR3具有包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的氨基酸序列，并且其中所述第二肽包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的氨基酸序列，且CDR3具有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的氨基酸序列。在一个方面，同源氨基酸序列应提供保持SEQ ID NO:1-10的肽的功能活性的肽。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1-4和SEQ ID NO:10的所述第一肽和/或第二肽与F4+埃希氏大肠杆菌细菌上的FaeG结合。
在另一个实施方案中，SEQ ID NO:5的所述第一肽和/或第二肽与Stx2e的B亚基结合。
在另一个实施方案中，SEQ ID NO:6-8的所述第一肽和/或第二肽与F18+埃希氏大肠杆菌细菌上的FedF结合。
在另一个实施方案中，SEQ ID NO:9的所述第一肽和/或第二肽与LT的B亚基结合。
在本上下文中，认为同源序列包括可与主题序列至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可以被认为是相似性(即，具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本发明的上下文中，优选同源性表示序列同一性。
在一个实施方案中，本发明所述的蛋白包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和所述第二肽均包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明所述的蛋白包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和所述第二肽均包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明所述的蛋白包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和所述第二肽均包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明所述的蛋白包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和所述第二肽均包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明所述的蛋白包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明所述的蛋白包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二肽包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
核酸
在一个方面，本发明提供了编码本文所述的蛋白的分离的核酸分子。
“核酸分子”包括DNA(例如基因组DNA或互补DNA)和mRNA分子，其可以是单链或双链的。“分离的”意指核酸分子不位于细胞内或不以其他方式在细胞内提供。
载体
在一个方面，本发明提供了包含本文所述的核酸分子的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。
宿主细胞
在一个方面，本发明提供了包含本文所述的核酸分子或载体的重组宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌、真菌，例如酵母和/或哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，本发明所述的细菌可以是芽孢杆菌，例如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或乳酸芽孢杆菌(Bacillus lactobacillus)。
在另一个实施方案中，本发明所述的酵母可以是选自毕赤酵母(pichia)属、汉逊酵母(hansenula)属和酵母(saccharomyces)属的任意物种。
在另一个实施方案中，本发明所述的真菌可以是米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)。
组合物
膳食组合物
本发明所述的膳食组合物可包含如上文所述的蛋白。膳食组合物还可包含以下一种或多种：益生元、益生菌、合生元、蛋白、脂质、碳水化合物、维生素、纤维和/或营养素，例如膳食矿物质，用于活体受试者。
在一个方面，膳食组合物是食品添加剂(food additive)。
在另一个方面，本发明涉及膳食组合物在促进受试者生长中的用途。
在另一个方面，本发明涉及膳食组合物作为婴儿配方产品的添加物的用途。
在另一个方面，本发明涉及膳食组合物作为针对旅行期间受试者中病原体感染的保护助剂(protective aid)的用途。
在另一个方面，本发明涉及膳食组合物作为针对免疫效力(immune efficiency)受损的受试者例如老年人中病原体感染的保护助剂的用途。
在本发明的各个方面，膳食组合物的用途是非治疗性的。
药物组合物
本发明还提供了包含本文所述的蛋白、核酸、载体和/或重组宿主细胞并且进一步包含一种或多种化合物的药物组合物。所述化合物可以是活性化合物和/或赋形剂。
在一个实施方案中，活性化合物和/或赋形剂是一种或多种复合碳水化合物(complex carbohydrate)，例如纤维素和/或藻酸盐(alginate)、酶、活性炭、表面活性剂、抗生素、抗粘剂(antiadherent)、粘合剂、包衣剂、崩解剂、填充剂、溶剂/助溶剂、调味剂、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂、载体、聚合物、缓冲剂、抗氧化剂、润湿剂、消泡剂、增稠剂、保湿剂及其混合物。
根据一个实施方案，本发明涉及包含蛋白和任选一种或多种赋形剂、稀释剂、蛋白和/或粘合剂的组合物。根据一个实施方案，本发明所述的组合物可以进一步或可选地包含以下的一种或多种：adhiron、adnectin、affibody、affitin、anticalin、犰狳重复蛋白(armadillo repeat protein)、avimer、β-发夹模拟物(beta-hairpin mimetics)、双环肽(bicyclic peptide)、DARPin和/或fynomer。
本发明还提供了上文所述的蛋白，以及包含一种或多种所述蛋白的膳食组合物，和/或包含一种或多种所述蛋白的药物组合物。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其包含对第一毒力因子特异的第一单域抗体和对第二毒力因子特异的第二单域抗体。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其中所述第二单域抗体与所述第一单域抗体相同或不同。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其中所述第二毒力因子与所述第一毒力因子相同或不同。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其包含对2种、优选3种、更优选4种、优选5种、更优选6种、优选7种、更优选8种、优选9种、更优选10种、优选11种，更优选12种不同的毒力因子特异的单域抗体。根据一个实施方案，所述单域抗体可以形成一种或多种，例如1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种或12种蛋白的一部分。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其包含本发明的蛋白，以及另外一种或多种单域抗体，优选1-5种、更优选2-3种不同的单域抗体，其中所述不同的单域抗体-域抗体各自对至少一种毒力因子特异。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白或组合物，其中所述蛋白或组合物包含对所述第一毒力因子特异的第一单域抗体和对所述第二毒力因子特异的第二单域抗体。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其中所述毒力因子中的至少一种是粘附因子。
如本文所用，“粘附因子”是指一种毒力因子，其是促进粘附或结合至其他细胞或表面的细菌的细胞表面组分或附属物。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其中所述第一和第二单域抗体对来自相同或两种不同微生物的毒力因子特异。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其中所述第一单域抗体对微生物的粘附因子特异，且所述第二单域抗体对微生物的一种可溶性毒力因子特异。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其中所述一种或多种微生物选自埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)细菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)和志贺氏菌(Shigella)细菌。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其中所述毒力因子选自ETEC菌毛粘附素例如F4和F18，不耐热肠毒素(LT)，和志贺毒素或志贺样毒素例如Stx2e，以及其猪和人变体。
根据一个实施方案，本发明涉及一种组合物，其中所述毒力因子选自由以下组成的组：F18+、F4+、Stx2e、LT及其猪和人变体。
疾病
在一个方面，本发明提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用作药物。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用于预防或治疗与受试者的内表面和/或外表面相关的病原体诱导的感染。在一个实施方案中，感染是胃肠道感染。在另一个实施方案中，感染是肺部感染。
在一个方面，蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物的施用途径是经口、经肺和/或局部(topical)。在一个实施方案中，通过喷雾器(nebulizer)施用。
在一个实施方案中，向受试者施用蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物一次或多次。
在一个方面，本发明提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用于减少受试者中活性感染(active infection)的时间跨度。在一个实施方案中，活性感染的时间跨度减少了至少20％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％。
在一个实施方案中，所述蛋白能够减少受试者例如仔猪中F4 ETEC感染的活性感染的时间跨度。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用于降低受试者中的毒力。
在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是家畜动物，例如选自由猪、牛、绵羊、山羊、马、鸡、驴、骡、鸭、鹅和火鸡组成的组的动物。优选受试者是猪。
在另一个方面，本发明提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用于预防或治疗断奶后腹泻(post-weaning diarrhea，PWD)。
在另一方面，本发明提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物，用于预防或治疗水肿病。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物，用作药物。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物，用于治疗动物或人。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物预防性，用于动物或人中。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物，用于非全身用途，和/或其中所述蛋白不与胃粘膜(stomach lining)相互作用，并且其优选不与上皮细胞相互作用。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白或组合物，其中所述蛋白在胃肠道中是稳定的。
“在胃肠道中是稳定的”意指含有单域抗体的产品在通过胃肠道后保留其10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多的结合活性。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白或组合物，其中所述蛋白或组合物用作婴儿配方产品的添加物，将与婴儿配方产品组合使用，或配制为动物或人用婴儿配方的一部分。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白或组合物，其中所述蛋白或组合物用作人工初乳(artificial colostrum)的组分。
根据一个实施方案，本发明涉及用于经口或经肺施用的蛋白或组合物。
根据一个实施方案，本发明涉及一种治疗或预防动物或人的医学病况的方法，包括施用所述蛋白或组合物。
根据一个实施方案，本发明涉及所述蛋白或组合物在治疗或预防断奶后腹泻(PWD)中的用途。
在养殖业中，产肠毒素埃希氏大肠杆菌(ETEC)和产志贺毒素埃希氏大肠杆菌(STEC)是重要的病原体，造成高死亡率和严重的生产损失。在仔猪中，表达F18+菌毛的ETEC、VTEC和STEC菌株与断奶后腹泻有关。在由F4或F18菌毛促进的初始粘附步骤之后，ETEC菌株产生并分泌LT和/或Stx2e，从而刺激电解质和水的分泌。这导致肠上皮细胞脱水和水样腹泻。F18+STEC菌株产生志贺毒素Stx2e，且F18+VTEC菌株产生志贺样毒素。血管内皮的损伤最终会导致水肿、出血(hemorrhage)和微血栓形成(microthrombosis)，并且这在所有被VTEC感染的动物中90％是致命的。
如前述权利要求中任一项所述的蛋白或组合物在治疗或预防水肿病中的用途。水肿病是一种以神经性疾病、出血性病变和频繁的致命结果为特征的严重疾病。猪水肿病是由产肠毒素和产维罗毒素的产生Stx2e的埃希氏大肠杆菌引起的。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物的非治疗用途。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物促进家畜生长的非治疗用途。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物作为哺乳动物饲料或饲料添加剂的用途。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物的用途，其中所述蛋白或组合物溶解或分散在哺乳动物用水中，例如饮用水或与饲料组合施用的水。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物与至少一种抗微生物剂组合的用途。
根据一个实施方案，本发明涉及一种用途，其中抗微生物剂是氧化锌。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物在稳定人或动物的微生物群系(microbiome)中的用途，优选用于制备用于稳定人或动物的微生物群系的药剂中的用途。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物的用途，用作人或动物的非治疗性补充剂(supplement)。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白或组合物的用途，用作针对旅行期间的细菌性肠道感染的保护助剂。
根据一个实施方案，本发明涉及一种蛋白或组合物的用途，用作针对免疫效力受损的受试者中细菌性肠道感染的保护助剂，所述免疫效力受损的受试者例如老年人、免疫效力下调的人包括HIV患者、器官接受者、接受风湿病治疗的患者、接受癌症治疗的患者和/或接受细菌感染(例如肺炎和败血症)治疗的患者。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物在预防或治疗由霍乱弧菌引起的感染中的用途。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物的医学用途。
根据一个实施方案，本发明涉及一种制备蛋白或组合物的方法，其中至少一种单域抗体由真菌宿主表达。
根据一个实施方案，本发明涉及一种制备蛋白或组合物的方法，其中所述真菌宿主是酵母菌株。
根据一个实施方案，本发明涉及一种制备蛋白或组合物的方法，其中所述真菌宿主选自由曲霉菌(Aspergillus)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)和酵母(Saccharomyces)组成的组。
根据一个实施方案，本发明涉及蛋白或组合物在制备用于动物或人类食物的食物成分中的用途。
蛋白、膳食组合物和/或药物组合物的用途
在一个实施方案中，本发明涉及一种交联病原体的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述权利要求中任一项所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。蛋白、膳食组合物和药物组合物如本文所述。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种阻止生物膜形成的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述权利要求中任一项所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。蛋白、膳食组合物和药物组合物如本文所述。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种中和病原体和/或由病原体分泌的分子的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述权利要求中任一项所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。蛋白、膳食组合物和药物组合物如本文所述。
本发明还涉及如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体或宿主细胞在制备用于预防或治疗与受试者的内表面和/或外表面相关的病原体诱导的感染的药物中的用途。
治疗方法
在一个方面，本发明提供了一种治疗或预防病原体诱导的感染，例如胃肠道感染和/或肺部感染的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的蛋白、核酸、载体、重组宿主细胞或药物组合物。
化合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以向被施用所述化合物的受试者提供有益效果的化合物的量。如本文所用，短语“治疗有效量”可以指足以或有效治疗(延迟或预防发作、预防发展、抑制、减少或逆转)感染的蛋白的量。
病原体
病原体可以是任意病原体，例如细菌、病毒、真菌、原生动物和/或蠕虫。
在一个实施方案中，病原体是埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)细菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)细菌、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)细菌、葡萄球菌(Staphylococcus)细菌、李斯特菌(Listeria)细菌、志贺氏菌(Shigella)细菌、支原体(Mycoplasma)和/或艰难梭菌(Clostridium difficile)。
在另一个实施方案中，病原体是F4+埃希氏大肠杆菌细菌和/或F18+埃希氏大肠杆菌细菌。
在另一个实施方案中，所述第一肽或所述第二肽的其中之一与F4+埃希氏大肠杆菌细菌结合，并且其中另一肽与F18+埃希氏大肠杆菌细菌结合。
在另一个实施方案中，所述病原体产生不耐热毒素(LT毒素)。
在另一个实施方案中，所述病原体产生志贺毒素，例如选自stx2e和stx2e的猪和人变体，或志贺样毒素。
在一个实施方案中，所述病原体是带有菌毛类型或菌毛粘附的ETEC埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)，例如F5、F6、F41或AIFA，人特异性变体例如定殖因子抗原(CFA)或大肠杆菌表面抗原(CS)，包括但不限于CFAI、CFAII、CFAIII和CFAIV。
在一个实施方案中，所述病原体产生志贺毒素或志贺样毒素，例如Stx2e和人变体，包括但不限于stx、stx1a、stx1c、stxd、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2f和stx2g。
生产方法
本发明提供了一种生产上述任一方面所述的蛋白的方法，所述方法包括在允许所编码的蛋白表达的条件下培养本文所定义的宿主细胞。
因此，本发明涉及一种生产本文所述的蛋白的方法，所述方法包括：
a)将上文所述的核酸分子和/或上文所述的载体转染到宿主细胞中以获得上文所述的重组宿主细胞；
b)在合适的条件下培养重组宿主细胞；
c)收集和纯化由所述重组宿主细胞表达的蛋白。
因此，重组宿主细胞可以在允许所编码的蛋白表达的条件下培养。
项
1.包含至少两个单域抗体的蛋白，其中所述蛋白对至少第一毒力因子和第二毒力因子特异。
2.如第1项所述的蛋白，其中所述第二毒力因子与所述第一毒力因子相同或不同。
3.如前述项中任一项所述的蛋白，其中所述至少两个单域抗体通过接头连接在一起。
4.如前述项中任一项所述的蛋白，其中所述至少两个单域抗体通过GS接头连接在一起。
5.如第4项所述的蛋白，其中所述GS接头具有(GxS)n结构，其中x可以是1至10之间的数字，优选2至5，并且n是指GxS序列的重复次数，其中n可以在1至10之间，优选2至5。
6.如第4项或第5项所述的蛋白，其中所述GS接头是GGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ IDNO:22)。
7.如前述项中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包含对所述第一毒力因子特异的第一单域抗体和对所述第二毒力因子特异的第二单域抗体。
8.如前述项中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是同二价的或异二价的。
9.如前述项中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白对1种、优选2种、更优选3种、优选4种毒力因子特异。
10.如前述项中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包含对毒力因子特异的单域抗体，其中所述毒力因子形成靶蛋白的一部分或构成靶蛋白，其中所述靶蛋白来自相同的蛋白亚家族。
11.如第10项所述的蛋白，其中所述蛋白亚家族是根据SCOP系统定义的。
12.包含前述项中任一项所述的蛋白和任选一种或多种赋形剂、稀释剂、蛋白和/或粘合剂的组合物。
13.如第12项所述的组合物，所述组合物包含多种不同的蛋白，所述蛋白中的每一种如前述项中任一项所述，其中所述蛋白数量选自由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12组成的组。
14.如第13项所述的组合物，其中所述蛋白均对一种或两种毒力因子特异。
15.包含对第一毒力因子特异的第一单域抗体和对第二毒力因子特异的第二单域抗体的组合物。
16.如第15项所述的组合物，其中所述第二单域抗体与所述第一单域抗体相同或不同。
17.如第15项或第16项所述的组合物，其中所述第二毒力因子与所述第一毒力因子相同或不同。
18.如第12至17项中任一项所述的组合物，包含对2种、优选3种、更优选4种、优选5种不同毒力因子特异的单域抗体。
19.如第12至18项中任一项所述的组合物，包含第1至11项中任一项所述的蛋白，以及另外的一种或多种单域抗体，优选1至5种、更优选2至3种不同的单域抗体，其中所述不同的单域抗体均对至少一种毒力因子特异。
20.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述蛋白或组合物包含对所述第一毒力因子特异的第一单域抗体和对所述第二毒力因子特异的第二单域抗体。
21.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，包含至少一种中和毒素的单域抗体。
22.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述毒力因子中的至少一种是粘附因子。
23.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述第一和第二单域抗体对来自相同或两种不同微生物的毒力因子特异。
24.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述第一单域抗体对微生物的粘附因子特异，并且所述第二单域抗体对相同或不同微生物的一种可溶性毒力因子特异。
25.如第23至24项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述一种或多种微生物选自埃希氏大肠杆菌细菌、霍乱弧菌细菌和志贺氏菌细菌。
26.如第23至25项中任一项所述的蛋白，其中所述一种或多种微生物选自F4+埃希氏大肠杆菌细菌和F18+埃希氏大肠杆菌细菌。
27.如第23至26项中任一项所述的蛋白，其中所述第一微生物是F4+埃希氏大肠杆菌细菌并且所述第二微生物是F18+埃希氏大肠杆菌细菌。
28.如第23至27项中任一项所述的蛋白，其中所述第一微生物产生不耐热毒素(LT毒素)。
29.如第23至28项中任一项所述的蛋白，其中所述第二微生物产生志贺毒素，例如选自stx2e和stx2e的猪和人变体，或志贺样毒素。
30.如第23至29项中任一项所述的蛋白，其中所述第一和/或第二微生物是带有菌毛类型或菌毛粘附的ETEC埃希氏大肠杆菌：例如F5、F6、F41或AIFA，人特异性变体例如定殖因子抗原(CFA)或大肠杆菌表面抗原(coli surface antigen，CS)，包括但不限于CFAI、CFAII、CFAIII和CFAIV。
31.如第23至30项中任一项所述的蛋白，其中所述第一和/或第二微生物产生志贺毒素或志贺样毒素，例如Stx2e和人变体，包括但不限于stx、stx1a、stx1c、stxd、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2f和stx2g。
32.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述毒力因子选自ETEC菌毛粘附素例如F4和F18、不耐热肠毒素(LT)以及志贺毒素或志贺样毒素例如Stx2e及其猪和人变体。
33.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述毒力因子选自由F18+、F4+、Stx2e、LT及其猪和人变体组成的组。
34.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，用作药物。
35.如第34项所述的蛋白或组合物，用于治疗动物或人。
36.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，用于动物或人的预防用途。
37.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，用于非全身性用途，和/或其中所述蛋白不与胃粘膜相互作用，并且优选不与上皮细胞相互作用。
38.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述蛋白或组合物在胃肠道中是稳定的。
39.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述蛋白或组合物用作婴儿配方产品的添加物、与婴儿配方产品组合使用、或配制为动物或人用婴儿配方的一部分。
40.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，其中所述蛋白或组合物用作人工初乳和/或天然初乳的成分或与之一起使用。
41.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物，用于经口或经肺施用。
42.一种治疗或预防动物或人的医学病况的方法，包括施用前述项中任一项所述的蛋白或组合物。
43.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物在治疗或预防断奶后腹泻(PWD)中的用途。
44.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物在治疗或预防水肿病中的用途。
45.如第1至33、36至41项中任一项所述的蛋白或组合物的非治疗用途。
46.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物促进家畜生长的治疗或非治疗用途。
47.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物作为哺乳动物的饲料或饲料添加剂的用途。
48.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物的用途，其中所述蛋白或组合物溶解或分散在哺乳动物用水中，例如饮用水或与饲料组合施用的水。
49.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物的用途，与至少一种抗微生物剂组合。
50.如第49项所述的用途，其中抗微生物剂是氧化锌。
51.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物在稳定人或动物的微生物群系中的用途，优选用于制备稳定人或动物的微生物群系的药剂中的用途。
52.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物的用途，用作人类或动物的治疗性或非治疗性补充剂。
53.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物的用途，用作针对旅行期间细菌性肠道感染的保护助剂。
54.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物的用途，作为针对免疫效力受损的人中细菌性肠道感染的保护助剂，所述免疫效力受损的人例如老年人、免疫效力下调的人包括HIV患者、器官接受者、接受风湿病治疗的患者、接受癌症治疗的患者和/或接受细菌感染(例如肺炎和败血症)的医学治疗的患者。
55.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物的用途，用于预防或治疗由霍乱弧菌引起的感染。
56.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物的医学用途。
57.一种制备前述项中任一项所述的蛋白或组合物的方法，其中至少一种包含单域抗体的蛋白由真菌宿主表达。
58.如第57项所述的制备蛋白或组合物的方法，其中所述真菌宿主是酵母菌株。
59.一种制备第57至58项所述的蛋白或组合物的方法，其中所述真菌宿主选自由曲霉菌(Aspergillus)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)和酵母(Saccharomyces)组成的组。
60.如前述项中任一项所述的蛋白或组合物在制备用于动物或人类食物的食物成分中的用途，优选其中所述蛋白或组合物与益生菌、益生元和/或合生元一起使用。
实施例
以下实施例旨在说明本发明，且决不应被理解为限制性的。
实施例1：用于在米曲霉(Aspergillus oryzae)中表达的单域抗体构建体的构建
本研究中使用的所有单域抗体均是在已发表的研究中生成并随后选择和优化的；Lo et al.2014(The molecular Mechanism of Shiga Toxin stx2e Neutralization bySingle-domain Antibody Targeting the Cell Receptor-binding Domain)；Moonens etal.2014(Nanobody Mediated Inhibition of Attachment of F18 Fimbriae ExpressingEscherichia coli)；Virdi et al.2013(Orally fed seeds producing designer IgAsprotect weaned piglets against enterotoxigenic Escherichia coli infection)和Harmsen et al.2006(Selection and optimization of proteolytically stable llamasingle-domain antibody fragments for oral immunotherapy)。然而，所有单域抗体的共同点是它们均通过用F4、F18、stx4e或LT抗原免疫健康美洲驼而获得，并且在免疫后的特定时间点，从动物身上收集血液样品。从血液样品中分离出作为单域抗体遗传来源的血液淋巴细胞，并提取总RNA。根据核苷酸PCR、克隆和连接的标准方法，将纳米抗体基因序列克隆至合适的载体中并转化至埃希氏大肠杆菌中以生成克隆文库。为了在米曲霉中表达单域抗体，如Christensen et al.1988(High Level Expression of Recombinant Genes inAspergillus Oryzae)所述地构建具有不同单域抗体的合成基因。对于二价单域抗体构建体，引入接头区域，接头(GGGGS)3或猪IgG3铰链区。
表1中描述了单域抗体构建体和特定靶标。
表1：单域抗体构建体
Figure BDA0003231682040000301
Figure BDA0003231682040000311
实施例2：表达单域抗体构建体的米曲霉的选择和产生
将质粒转化至米曲霉中，其是一种能够在发酵过程中产生和分泌蛋白的丝状真菌。转化是如Christensen et al.1988(High Level Expression of Recombinant Genesin Aspergillus Oryzae)所述进行的。与来自未转化的亲本菌株的上清液相比，通过SDS凝胶上出现的约15kD的额外条带鉴定出产生单域抗体构建体的转化物。过滤培养物，且将所得的含有单域抗体构建体的上清液用于进一步分析。
实施例3：同二价和异二价蛋白构建体的结合能力的体外测试
方法与材料
为了检测蛋白与细菌的结合，设计了ELISA测定。简言之，将Nunc MaxiSorpTM平板F96用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中的约5-25ng/mL未标记的F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体(SEQ ID NO:13)于4℃下包被过夜(O/N)。用奶或牛血清白蛋白(3％)封闭后，将OD600＝0.2的热灭活F4+埃希氏大肠杆菌(0149:F4)添加到奶或BSA中，并于室温下在平板上孵育。在PBS中洗涤并在56℃水浴中1小时后，热灭活细菌。为了检测埃希氏大肠杆菌，在洗涤后添加编码F45::(GGGGS)3::F45(SEQ ID NO:13)或F45::(GGGGS)3::LT1(SEQ IDNO:16)的FLAG标记的蛋白构建体。使用来自SIGMA的抗FLAG-HRP(A8592)检测同二价FLAG或异二价FLAG蛋白构建体。使用底物溶液(H2O2和四甲基联苯胺的1:1混合物)显影，并且加入等量的2M H3PO4停止反应。使用酶标仪在450nm处测量光密度。
结果
当产品在ELISA测定中结合时，测得的OD450表示信号，信号越高意味着结合的产品越多。因此，F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体和F45::(GGGGS)3::LT1异二价蛋白构建体的结合在用于结合F4 ETEC细菌的ELISA实验中得以证实(参见图4)。包含的阴性对照F183(SEQ ID NO:8)对FedF特异而不对FaeG特异。
结论
同二价和异二价蛋白构建体具有活性并与F4 ETEC细菌结合。
实施例4：单域抗体和同二价蛋白构建体的柠檬酸稳定性的体外测试方法与材料
在单体单域抗体和同二价蛋白构建体之间比较柠檬酸稳定性。首先使用未标记的F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体包被平板孔，然后添加细菌以结合，洗掉多余的细菌，然后添加连接FLAG标签的F45单域抗体(SEQ ID NO:10)或F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体(SEQ ID NO:13)之一。洗涤后，向孔中添加0.2M柠檬酸。将柠檬酸洗脱物转移至另一ELISA平板，其也包被了未标记的F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体，并与细菌结合，然后用NaOH中和柠檬酸，并允许单域抗体-FLAG重新与细菌结合。然后将两个平板与抗FLAG一同孵育，并如实施例3中所述进行显影(ELISA)。OD450信号显示结合的产品量。
将标准曲线添加至每个平板以确保来自产品的值在ELISA测定的线性范围内。
结果
在图5A中，高信号对应于更高的结合亲和力，这归因于产品不能用柠檬酸分离。在柠檬酸冲激(shock)后，与F45单域抗体相比，F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体在孔中保留了更高的量。因此，证明了与单域抗体相比，同二价蛋白构建体在柠檬酸冲激后与细菌的结合更好(图5A)。
图5B显示了对在柠檬酸冲激后洗脱下来的F45单域抗体和F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体的定量，因此其是衡量产品从ETEC细菌中洗掉的难易程度的指标。与单域抗体相比，在ELISA测定中检测到同二价蛋白构建体的量较低，证明了与单域抗体相比，被洗脱的同二价蛋白构建体较少。
结论
我们可以得出结论，同二价蛋白构建体以比单域抗体(即单体)更高的亲和力结合，因为在酸冲激后有更多的产品保留，且更少的同二价蛋白构建体被洗脱。
因此，在柠檬酸暴露后，同二价蛋白构建体的结合亲和力比单体高至少1.5倍。
实施例5：同二价蛋白构建体的热稳定性、pH稳定性、胆汁盐稳定性、在猪胃液中随时间的稳定性、在猪胆汁中随时间的稳定性的体外测试
材料与方法
如实施例3中所述进行ELISA。
将标准曲线添加至每个平板以确保来自产品的值在ELISA测定的线性范围内。
相对值显示了检测到多少信号，因此产品在孵育后被结合，这意味着高信号表示信号的高保留和高稳定性。
热稳定性
基于将F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体在不同温度下孵育1小时，然后在ELISA设置中评估相对于对照的产品结合，来评估热稳定性(参见图7A)。
我们可以得出结论，同二价蛋白构建体直至70℃仍是完全稳定的，表明产品稳定性高。
pH稳定性
基于将F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体在37℃下在不同pH下孵育1小时，然后在ELISA实验中评估相对于对照的产品结合，来评估pH稳定性(参见图7B)。
我们可以得出结论，同二价蛋白构建体随着pH值的降低而逐渐丧失稳定性，但在pH 3-4之间有～70-90％的活性得以保留，并且二价蛋白构建体能够通过受试者例如动物的胃并保留生物学相关活性。
胆汁盐稳定性
脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate，NaDeox)是一种胆汁盐，其在细菌与孔中包被的F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体结合的步骤中添加。以0.2mM、1mM和10mM的浓度添加NaDeox，以评估其对细菌-产品结合的影响。孵育后，如上所述洗涤和处理平板。
基于在ELISA实验中将F45::(GGGGS)3::F45构建体在不同浓度的NaDeox下与细菌孵育1小时来评估对胆汁盐中产品-细菌结合的影响，数值表示为相对于对照(参见图7C)。
我们可以得出结论，同二价蛋白构建体在胆汁盐存在下(也在生物学相关范围之外)保持完全稳定且具有活性，因此将在肠道中具有活性。
在猪胃液中随时间的稳定性
从安乐死的猪(重约30kg的约克郡长白猪(Yorkshire Landrace))的胃中提取胃液。在提取后1-2小时内，通过离心使胃液澄清，然后保持在-80℃直至进一步使用。当将预处理的未标记的F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体样品以1:200稀释于胃液中时，测量pH值，并使用HCl将一个样品的pH值调节至约3。随后将样品在37℃下孵育1小时，然后进一步稀释并用于包被ELISA平板。对于所有处理，均如实施例3中所述处理所有后续步骤(ELISA)。
基于将F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体与来自三只不同仔猪的胃内容物在37℃孵育1小时，然后在ELISA实验中评估相对于对照的产品结合，来评估在猪胃液中的产品稳定性。pH＝4/5，并且使用HCl将最后一个样品pH调节至3(参见图8A)。
我们可以得出结论，同二价蛋白构建体在仔猪的胃液中保持稳定，且因此在经口给药时保持活性。
在猪胆汁中随时间的稳定性
胆汁提取自猪(从特定的无病原体畜群中获得的约克郡长白猪，并在约30kg的重量下安乐死)的胆囊。胆汁保存于冰上/冷藏直至进一步使用。使用前，将胆汁在37℃下稍微加热以溶解脂质。高水平的胆汁使奶沉淀，因此对于这些测定，在缓冲液和封闭缓冲液中使用BSA(最终浓度为3％)。将胆汁与细菌和BSA混合至最终胆汁浓度为50％、10％或2％。在胆汁/细菌孵育后，如上所述洗涤和处理平板。
基于将F45::(GGGGS)3::F45与细菌(F4 ETEC)在来自3只单独仔猪的不同胆汁浓度下孵育1小时，然后在ELISA设置中评估相对于对照的产品结合，来评估在猪胆汁中对产品-细菌结合的影响(参见图8B)。
我们可以得出结论，同二价蛋白构建体在胆汁中保持稳定且具有活性，并且因此将在肠中保持功能。
总体结论
我们可以得出结论，在与人类和动物相关的温度范围内，同二价蛋白构建体是完全稳定的。同二价蛋白构建体在pH降低时保持生物相关活性，并且其在胆汁(bile/gall)存在下保持完全稳定且具有活性，因此其将在肠中具有活性。同二价蛋白构建体在仔猪的胃液中也保持稳定，并因此在经口给药时保持活性。
实施例6：单域抗体构建体在特定浓度和pH下的蛋白酶稳定性的体外测试
为了确保经口给药时单域抗体构建体的稳定性，进行了添加蛋白酶的稳定性测试。使用以下单体单域抗体：F41、F45、F183，和以下二价单域抗体构建体：F183::(GGGGS)3::F183、F183::IgG3::F183。后一种接头序列先前已由Virdi et al.2013(Orallyfed seeds producing designer IgAs protect weaned piglets againstenterotoxigenic Escherichia coli infection)使用并被描述为稳定的。单域抗体构建体各自在37℃下与以下一同孵育1小时：
·胃蛋白酶(pepsin)：在消化系统中发现的内肽酶
·胰蛋白酶(trypsin)：在消化系统中发现的丝氨酸蛋白酶
·胰酶(pancreatin)：从猪胰腺中获得的淀粉酶(amylase)、脂肪酶(lipase)和蛋白酶的混合物
·来自猪的胃液
当在后期经口施用单域抗体构建体时，选择蛋白酶和胃液以确定胃肠道中的可能稳定性。
使用蛋白酶在不同浓度和pH下进行稳定性测试。在与蛋白酶孵育之前和之后使用SDS-page分析含有单域抗体构建体的样品，以评估可能的蛋白降解。使用牛血清白蛋白(BSA)作为正常蛋白含量的参考。
所用的具体蛋白酶浓度和pH如下：
正常活性下的稳定性测试(图1)：
·胃蛋白酶250μg/mL(孵育pH 3)
·胰蛋白酶125μg/mL
·胰酶100μg/mL
高活性下的稳定性测试(图2)：
·胃蛋白酶500μg/mL(孵育pH 1-2)
·胰蛋白酶250μg/mL
·胰酶100μg/mL
非常高活性下的稳定性测试(图3)：
·胃蛋白酶50μg/mL(孵育pH 1-2)
·胰蛋白酶500μg/mL
·胰酶150μg/mL
在与胃肠道条件相似的条件下的稳定性测试中，所有单个单域抗体构建体以及同二价单域抗体构建体F183::(GGGGS)3::F183都是稳定的。然而，另一同二价单域抗体构建体F183::IgG3::F183被胰蛋白酶和胰酶降解，并且在SDS凝胶上可见较轻(lighter)的产品。因此，令人惊讶的是，IgG3接头被两种蛋白酶胰蛋白酶和胰酶降解，而(GGGGS)3接头保持完全稳定。在猪的胃液中孵育后观察到同样令人惊讶的图谱，其中具有IgG3接头的同二价构建体被切割，而具有(GGGGS)3接头的同二价构建体保持稳定(图12)。
在高浓度和非常高浓度的蛋白酶以及较低的pH下，通常会有更大量的单域抗体构建体被降解。当比较单个单域抗体构建体时，观察到稳定性的差异：F41被胃蛋白酶降解较少，而被胰蛋白酶和胰酶降解更多，而在高浓度的蛋白酶下对F45观察到相反的情况。此外，在非常高的浓度下，F45比F41更稳定。F45和F183在所有条件下的稳定性相似。
实施例7：细菌聚集(bacterial aggregation)的体外测试
材料与方法
将F4埃希氏大肠杆菌(0149:F4)O/N培养物在LB中在37℃下以180rpm振荡生长O/N。随后将培养物在PBS中洗涤一次，并将OD600调整为1。将1mL细菌沉淀并重悬于40μl约600ng/mL的标记或未标记的F45单域抗体或同二价F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体。使样品沉淀几分钟，然后封固(mount)在载玻片上。图像是在光学显微镜上使用100X油镜拍摄的。
结果
使用和不使用F45单体或F45::(GGGGS)3::F45产品的F4 ETEC细菌培养物的显微镜图片显示了产品如何影响细菌。尽管F45不影响细菌聚集或运动，但同二价蛋白结构F45::(GGGGS)3::F45将F4 ETEC互相连接(interlink)并使其成聚集体，这在显微镜下观察时可见为细菌簇(bacterial clump)(参见图9)。
结论
基于这些图片，我们可以得出结论，同二价蛋白构建体是具有活性的，在两端均结合，并且累积效应大于它们所包含的两个单独的单域抗体，这归因于它们将促进聚集体形成并阻断远多的结合位点。
实施例8：单域抗体构建体与ETEC细菌的结合和与细胞受体的竞争的体外测试
可以建立粘附测定以测试单域抗体单体或构建体的结合以及与天然受体的竞争。这个测定可以证明产品具有隔离ETEC细菌使其不与猪上皮细胞结合的功效。可以将猪肠上皮细胞系-1(Intestinal Porcine Epithelial Cell line-1，IPEC-1)接种、培养并随后用F18+ETEC细菌感染，以模拟肠道中细胞和细菌之间的结合。可以用DAPI将ETEC细菌细胞染色使其可视化，并使用流式细胞术进行测量。为了定量细菌载量，可以将未染色的细菌细胞与猪细胞一同孵育以用于测量菌落形成单位的测定。为了探究单域抗体构建体是否能阻断ETEC细菌细胞与IPEC-1细胞的粘附并因此与细胞受体竞争，可以在添加或不添加单域抗体构建体下进行粘附测定。单域抗体单体、构建体、单体和/或构建体的混合物或以上任一个均可以在用蛋白酶、低pH或胃液处理后进行测试(如实施例3中所述)。单域抗体单体或构建体与F18+ETEC细菌结合，阻止与IPEC-1细胞的结合。也可以进行另一分析，研究在单域抗体单体或构建体存在或不存在下F4+ETEC细菌对表达F4的IPEC-J2细胞系的粘附。
进行测定以确定以下一种或多种效应：
1.与单独单域抗体单体或构建体相比，使用多种单域抗体构建体的混合物对隔离ETEC使其不与猪上皮细胞粘附具有潜在更高的功效。
2.与单域抗体单体相比，二价构建体具有潜在相似或更高的功效。
3.用来自消化道的生物相关蛋白酶、低pH或猪胃液(如实施例3中所述)处理后，与单域抗体单体相比，二价构建体具有潜在相似或更高的稳定性，通过处理后构建体在粘附试验中保留的活性来测量。
实施例9：用于确定LT和stx2e的毒性以及毒素特异性单域抗体构建体隔离毒素结合的效应的细胞毒性测定
可以进行细胞毒性测定以确定ETEC毒素LT和stx2e的毒性，以及单域抗体构建体通过毒素隔离消除这种毒性的能力。暴露于细胞毒性化合物的细胞可以通过多种方式进行应答；如果毒素是致命的，细胞可能会发生坏死、凋亡或自噬，或如果损伤不太严重，细胞可能减少或停止其生长和增殖。在体外细胞毒性测定期间，可以在LT和stx2e存在下测量这些应答的任一种。Vero细胞是一种由从非洲绿猴(African green monkey)中提取的肾上皮细胞建立的细胞系，可用于本研究。可以使细胞暴露于不同/增加浓度的LT和stx2e，然后可以测量细胞应答以确定两种毒素的严重性。在本研究中，单域抗体单体、构建体、以上的混合物或以上任一均可以在用例如蛋白酶、低pH或胃液的产品处理后进行测试(如实施例3中所述)。预期单域抗体构建体将隔离毒素并因此抑制ETEC毒素LT和stx2e的细胞毒性效应。可以使用从ETEC细菌上清液中获得的毒素混合物进行细胞毒性测定。效应可以是剂量依赖性的。
进行测定以确定以下一种或多种效应：
1.与单个单域抗体单体或构建体相比，使用多种单域抗体构建体的混合物在隔离毒素的毒性作用上具有潜在更高的功效。
2.与单域抗体单体相比，二价构建体具有潜在相似或更高的功效。
3.用来自消化道的生物相关蛋白酶、低pH或猪胃液(如实施例3中所述)处理后，与单域抗体单体相比，二价构建体具有潜在相似或更高的稳定性，通过处理后测量构建体在细胞毒性测定中保留的活性确定。
实施例10：单域抗体构建体与ETEC细菌的结合以及与猪肠绒毛上细胞受体的竞争的体外测试
为了显示单域抗体对ETEC绒毛结合的影响，可以从新屠宰的仔猪的肠道粘膜中分离小肠绒毛肠上皮细胞。可以在单域抗体构建体存在和不存在下将绒毛与ETEC细菌一同孵育，且粘附细菌的数量将使用相差显微镜术和免疫组织化学来确定。单域抗体单体、构建体、以上的混合物或以上任一均可以在用例如蛋白酶、低pH或胃液的产品处理后进行测试(如实施例3中所述)。在与ETEC细菌孵育之前添加单域抗体单体或构建体可以隔离ETEC细菌使其不粘附并且将显示产品的功效。
进行测定以确定以下一种或多种效应：
1.与单个单域抗体单体或构建体相比，使用多种单域抗体构建体的混合物在隔离与猪肠绒毛的粘附方面具有潜在更高的功效。
2.与单域抗体单体相比，二价构建体具有潜在相似或更高的功效。
3.与单域抗体单体相比，二价构建体在用来自消化道的生物相关蛋白酶、低pH或来自猪的胃液(参见实施例3)处理后具有潜在相似或更高的稳定性，通过处理后构建体保留的隔离ETEC细菌与猪肠绒毛粘附的能力方面的活性来测量。
实施例11：同二价蛋白构建体对ETEC与猪绒毛肠上皮细胞结合的体外影响
材料与方法
如Van den Broeck et al.(1999)所述从仔猪中分离肠绒毛肠上皮细胞并进行随后的粘附测定。简言之，从猪(从特定的无病原体畜群中获得的约克郡长白猪，并在3-4个月龄时安乐死)的中段空肠切下15-20cm长的肠区段。将区段打开并在Krebs-Henseleit缓冲液(120mM NaCl、14mM KCl、25mM NaHCO3、1mM KH2PO4[pH 7.4])中洗涤，然后保持在含有1％甲醛的Krebs Henseleit缓冲液中约1小时。随后，将缓冲液更换为无菌PBS(pH 7.4)，用载玻片从粘膜上轻柔刮下绒毛，并在无菌PBS(pH 7.4)缓冲液中悬浮和洗涤，直至上清液澄清。将样品储存在PBS中并保持在4℃下直至进一步使用。
从单个菌落接种F4+埃希氏大肠杆菌(0149:F4)，并在37℃下于LB中振荡培养过夜。将细菌在PBS(pH 7.4)中洗涤一次，并用含有以下的溶液预处理：未标记或标记的F45::(GGGS)3::F45同二价蛋白构建体、F183::(GGGS)3::F183同二价蛋白构建体。将细菌/F45::(GGGS)3::F45混合物或细菌/F183::(GGGS)3::F183混合物添加至绒毛物质的浆液中，并在室温下轻柔旋转使粘附发生。一小时后，将样品封固在载玻片上，并在光学显微镜上使用100X油镜拍摄图像，并基于显微镜拍摄的图像手动进行定量。
结果
与相关对照相比，通过计数与相关对照相比出现的结合有0、1或2+F4ETEC细胞的肠上皮细胞，来定量产品阻断F4 ETEC与猪绒毛肠上皮细胞结合的功效。将1包括在内，因为在进行显微镜术时可能在盖玻片下捕获漂浮的细菌。结合1或2+ETEC细胞的肠上皮细胞的百分比显示了细菌感染肠上皮细胞的功效。F4 ETEC+F183::(GGGS)3::F183为对照。参见图10。
结论
得出结论，随着F45::(GGGS)3::F45同二价蛋白构建体的添加，F4 ETEC对肠上皮细胞的粘附几乎完全停止，这归因于同二价蛋白构建体阻断了细菌与肠上皮细胞的结合。
实施例12：进行FIDA以确定单域抗体及其二价构建体的结合
为了确定单域抗体及其二价单域抗体构建体与分析物之间的结合和复合物形成，可以如Poulsen et al.2015(Flow Induced Dispersion Analysis Rapidly QuantifiesProteins in Human Plasma Samples)所述进行流动诱导分散分析(flow induceddispersion analysis，FIDA)。可以分析所有提及的单域抗体及其二价单域抗体构建体，以记录和定量分析物结合，包括Kd和复合物形成。单域抗体单体、构建体、以上的混合物或以上任一者均可以在用蛋白酶、低pH或胃液(如实施例5中所述)处理后进行测试。预期会观察到流体动力学半径的变化，并由此确认分析物的结合。流体动力学范围的多次变化表明多种分析物与单域抗体构建体的结合，这证实了更高阶复合物的形成。类似地，此分析可以表明二价构建体如何通过亲合力(avidity)增加来实现结合增加。
实施例13：流动诱导分散分析(FIDA)
材料与方法
FIDA能够在天然条件下对蛋白进行表征和定量。FIDA基于测量配体大小的变化，因为配体选择性与靶蛋白相互作用。未结合的配体具有相对较小的表观流体动力学半径(大小)，而在分析物存在时由于与分析物结合，其表观流体动力学半径会增加。在FIDA测量之前，使用Atto 488蛋白标记试剂盒(Sigma-Aldrich)使用标准方案对VHH抗原(LT-B或FaeG)进行荧光标记。
FaeG与F45单体以及FaeG与F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体之间的结合的FIDA定量
FIDA定量是使用39nL的Atto标记的FaeG(100nM)和7μL含有单体和同二价蛋白构建体的发酵培养基进行的。通过检测FaeG-atto488的荧光，在488nm处检测流体动力学半径。对于混合的样品，对于单体和二价构建体，均将其与不同浓度的发酵培养基(0和50％v/v)预孵育。
LT-B与LT1单体以及LT-B与LT1::(GGGGS)3::LT1同二价蛋白构建体之间的结合的FIDA定量
FIDA定量是使用39nL的Atto标记的LT-B(100nM)和7μL含有单体和同二价蛋白构建体的发酵培养基进行的。通过检测LT-B-atto488的荧光，在488nm处检测流体动力学半径。对于混合的样品，对于单体和二价构建体，均将其与不同浓度的发酵培养基(0-12.5％v/v)预孵育。LT特异性LT1单体和同二价蛋白构建体在实验之前已经用endoH(NEB，P0702)处理以去除已知的糖基化。
FIDA结果使用FIDA-tech软件进行分析，用于计算结合亲和力和可视化结合曲线。
结果
FaeG
测定游离FaeG的流体动力学半径，并添加单体F45(SEQ ID NO:10)或F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体(SEQ ID NO:13)以评估结合亲和力。流体动力学范围是通过测量当使用FIDA测量样品时产生的峰的宽度来测定的。窄峰是没有产品结合的抗原，当产品结合时峰会变宽(且流体动力学范围增加)。因此，较高的数字表示产品结合，并且值越高，产品的亲和力越高(参见下表1)。
表1
发酵培养基内容物(v/v) 流体动力学半径(nm)
0％ 2.40+/-0.09
50％F45 3.02+/-0.06
50％F45::(GGGGS)<sub>3</sub>::F45 2.97+/-0.20
基于FIDA测量，我们可以得出结论，F45单域抗体和F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体均结合FaeG(参见表1)。有趣的是，当与浓度差异关联时，可以得出结论，同二价蛋白构建体与单域抗体相比以更高的亲和力结合。
LT-B
还测定了游离LT-B的流体动力学半径，并添加LT1单体(SEQ ID NO:9)或LT1::(GGGGS)3::LT1同二价蛋白构建体(SEQ ID NO:15)，以评估结合亲和力(参见图6)。同二价蛋白构建体显示出更高的流体动力学半径，因此同二价蛋白构建体与单域抗体相比显示出更高的结合亲和力。
结论
在这两个实验中，同二价蛋白构建体F45::(GGGGS)3::F45和LT1::(GGGGS)3::LT1与相应的F45和LT1单体相比显示出更高的结合亲和力。
实施例14：F4+仔猪断奶后腹泻的体内治疗
可以进行体内研究以确定单域抗体构建体对治疗仔猪断奶后腹泻(PWD)的作用。F4+仔猪可以用F4+ETEC细菌进行刺激(challenge)以诱导PWD。在研究中，可进行8只仔猪的3次技术上的重复，且每次技术上的重复分为4组，每组2只仔猪；一组为对照(无治疗)，一组将用单域抗体构建体产品处理，一组将用F4+ETEC细菌刺激，最后一组将用单域抗体构建体产品处理并用F4+ETEC细菌刺激。单域抗体单体、构建体、以上混合物或以上任一者可以在用蛋白酶、低pH或胃液处理后进行测试(如实施例3中所述)。治疗可以从断奶前两天至断奶后12天，且刺激将在断奶后的第一天和第二天进行。疾病进展可以通过测量包括腹泻程度、体重、食物摄入、发热、临床表现和对来自血液样品的炎症生物标志物的分析来确定。预期用单域抗体构建体处理可以减少或抑制在所有或部分测量参数上的PWD发展，并可能在仔猪中显示出治愈功效。此研究可以进行多次以比较单域抗体构建体的不同组合的效果。因此，我们可以通过参数例如腹泻程度、体重增加、食物摄入和其他疾病标志物相对于未经处理的经F4+ETEC细菌刺激的仔猪的改善来显示产品的体内功效。
实施例15：用同二价蛋白构建体对F4+仔猪中断奶后腹泻的体内治疗材料与方法
将来自Foulum奥胡斯大学(Aarhus University，Foulum)的遗传表征为对F4+埃希氏大肠杆菌易感的母猪(N＝5)用于本研究，并饲喂标准的丹麦母猪饮食(基于小麦、大麦和豆的饮食(soybean meal))。幼仔在AU-Foulum出生于2019年1月26日(第1窝＝11只仔猪；第2窝＝8只仔猪，第3窝＝5只仔猪)、27日(第4窝＝10只仔猪)和31日。在断奶时(28日龄)，仔猪(总共N＝32)入选一项F4+埃希氏大肠杆菌接种的刺激研究。从3周龄(哺乳期)至实验结束(5周龄)，向所有猪提供相同的饲料。每天喂给猪两次(半自由)饲料(标准商业混合物)，并提供自由引用的水。
实验设计涉及四种处理：
1)对照：无F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体且无F4，
2)对照：有F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体但无F4，
3)无F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体但有F4，和
4)有F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体且有F4。
断奶时，将仔猪圈养在两个带围栏的房间中(气候条件相似)，每个围栏中2只猪，总共16个围栏，或每组4个重复。
16个围栏随机分配在2种治疗中：即由Bactolife提供的F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体和对照(蛋清蛋白/Novo)的溶液。从断奶当天的下午开始直至14天后结束，将这些溶液每天两次地提供给每只猪。将溶液与无醇啤酒(non-alcoholic beer，来自Hancock的
Figure BDA0003231682040000441
)混合。试验持续了21周(直至49日龄)。
在断奶后的第1天和第2天，用埃希氏大肠杆菌(F4，0149)经口刺激仔猪。接种时接种物的CFU在第1天和第2天分别为1.05x 109和1.72x109CFU。将对照猪用缓冲液(碳酸氢钠)接种。在第0、1、2、3、4、5和7天(以及第2周的每两天和第3周的每三天)，从每只猪身上采集粪便样品(直接取自直肠)，分析样品的溶血性和非溶血性细菌，且通过血清学分型来验证埃希氏大肠杆菌。在试验结束时，杀死仔猪(不取样)。
结果
对断奶后腹泻模型系统中的30只仔猪(每组6-8只)进行了体内刺激试验。结果显示，在整个试验过程中，仔猪粪便中均存在F4 ETEC。粪便中F4 ETEC的存在表明活性感染(尤其是数量大)。生成的数据显示，在仔猪受到刺激后(第1+2天)，F4 ETEC细菌存在，但与未经处理的仔猪相比，其在用F45::(GGGGS)3::F45同二价蛋白构建体处理的仔猪中并未形成感染而是被清除(flush out)。参见图11。
结论
因此，可以得出结论，同二价蛋白构建体阻止了F4 ETEC细菌粘附在新断奶仔猪的胃肠道中，并与无处理相比显著减少感染时间。
参考文献
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<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> F41
<220>
<221> 肽
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Glu Gly Gly Ile Leu Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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<223> F42
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Val Arg Glu Ala Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Cys Ser Val Arg
100 105 110
Ser Tyr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 9
<211> 125
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> LT1
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(125)
<223> LT1
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Ser Ile Val Gly Ser Asp Asn Tyr Thr Trp Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Thr Arg Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Tyr Ser Asp Tyr Val Ser Leu Asn Pro Glu Thr Phe
100 105 110
Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 125
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> F45
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(125)
<223> F45
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Gly Ala Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Asp Glu Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
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<221> 肽
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Arg Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Val Arg Glu Ala Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Cys Ser Val Arg
100 105 110
Ser Tyr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn
165 170 175
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Val Arg Glu Ala Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Cys Ser Val Arg
245 250 255
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260 265 270
Ser
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
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Ala Ser Ile Asn Thr Arg Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Val Arg Glu Ala Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Cys Ser Val Arg
100 105 110
Ser Tyr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Val Asp Ile Glu Pro Pro Thr Pro Ile Cys Pro Glu Ile Cys Ser
130 135 140
Cys Pro Ala Ala Glu Val Leu Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
165 170 175
Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val
180 185 190
Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Asn Thr Arg Gly Gly
195 200 205
Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Arg Glu Ala Thr Tyr
245 250 255
Ser Asp Asn Arg Cys Ser Val Arg Ser Tyr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
275 280
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Gly Arg Gly Ala Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Asp Glu Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
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Ser Cys Leu Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Trp Tyr Ala Met Gly Trp
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Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Val Ser
180 185 190
Arg Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Ile Phe Arg Leu Ser
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
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Ala Ser Ile Thr Ser Tyr Gly Asp Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145 150 155 160
Val Ser Gly Ser Ile Phe Arg Leu Ser Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln
165 170 175
Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala Ser Ile Thr Ser Tyr Gly
180 185 190
Asp Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asn Ile Glu Ala Gly Thr
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Tyr Tyr Gly Pro Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
245 250 255
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<221> 肽
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<223> LT1::(GGGGS)3::LT1
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Ser Ile Val Gly Ser Asp Asn Tyr Thr Trp Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Thr Arg Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Tyr Ser Asp Tyr Val Ser Leu Asn Pro Glu Thr Phe
100 105 110
Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Ile Gly Trp
165 170 175
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile Ser Ser Ile Val
180 185 190
Gly Ser Asp Asn Tyr Thr Trp Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Asp Asn Thr Arg Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
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225 230 235 240
Tyr Ser Asp Tyr Val Ser Leu Asn Pro Glu Thr Phe Gly Ser Trp Gly
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<220>
<221> 肽
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<223> F45::(GGGGS)3::LT1
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Gly Ala Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Asp Glu Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Ile Gly Trp
165 170 175
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile Ser Ser Ile Val
180 185 190
Gly Ser Asp Asn Tyr Thr Trp Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Asp Asn Thr Arg Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ser
225 230 235 240
Tyr Ser Asp Tyr Val Ser Leu Asn Pro Glu Thr Phe Gly Ser Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265
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<212> PRT
<213> 未知
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<220>
<221> 肽
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile
35 40 45
Ser Ser Ile Val Gly Ser Asp Asn Tyr Thr Trp Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Thr Arg Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Tyr Ser Asp Tyr Val Ser Leu Asn Pro Glu Thr Phe
100 105 110
Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Ser Cys Leu Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Trp Tyr Ala Met Gly Trp
165 170 175
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Val Ser
180 185 190
Arg Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265
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<212> PRT
<213> 未知
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<220>
<221> 肽
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Arg Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Val Arg Glu Ala Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Cys Ser Val Arg
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Ser Tyr Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Ile Phe Arg Leu Ser
165 170 175
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
180 185 190
Ala Ser Ile Thr Ser Tyr Gly Asp Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
195 200 205
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
210 215 220
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> Stx2e1::(GGGGS)3::F183
<220>
<221> 肽
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<223> Stx2e1::(GGGGS)3::F183
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Ile Phe Arg Leu Ser
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ser Tyr Gly Asp Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
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115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145 150 155 160
Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln
165 170 175
Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Asn Thr Arg Gly
180 185 190
Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
195 200 205
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
210 215 220
Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Arg Glu Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Ser Asp Asn Arg Cys Ser Val Arg Ser Tyr Thr Tyr Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GGGGS接头
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(5)
<223> GGGGS接头
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (GGGGS)2接头
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(10)
<223> (GGGGS)2接头
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (GGGGS)3接头
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(15)
<223> (GGGGS)3接头
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (GGGGS)4接头
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(20)
<223> (GGGGS)4接头
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 24
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (GGGGS)5接头
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(25)
<223> (GGGGS)5接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (GGGGS)6接头
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(30)
<223> (GGGGS)6接头
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3接头
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(23)
<223> IgG3接头
<400> 26
Val Asp Ile Glu Pro Pro Thr Pro Ile Cys Pro Glu Ile Cys Ser Cys
1 5 10 15
Pro Ala Ala Glu Val Leu Gly
20
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> LT1 CDR1
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(7)
<223> LT1 CDR1
<400> 27
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> F45 CDR1
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(9)
<223> F45 CDR1
<400> 28
Gly Thr Phe Ser Trp Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> LT1 CDR2
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(9)
<223> LT1 CDR2
<400> 29
Ser Ile Val Gly Ser Asp Asn Tyr Thr
1 5
<210> 30
<211> 11
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<213> 未知
<220>
<223> F45 CDR2
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(11)
<223> F45 CDR2
<400> 30
Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> LT1 CDR3
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(18)
<223> LT1 CDR3
<400> 31
Ala Ala Asp Ser Tyr Ser Asp Tyr Val Ser Leu Asn Pro Glu Thr Phe
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> F45 CDR3
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(18)
<223> F45 CDR3
<400> 32
Gly Arg Gly Ala Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Asp Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
Trp Gly

Claims (79)

1.一种分离的蛋白，包含
-具有第一结合特异性的第一肽；
-具有第二结合特异性的第二肽；和
-接头，
其中所述第一肽和所述第二肽结合至少一种病原体表面组分和/或至少一种由病原体产生的分子。
2.如权利要求1所述的蛋白，其中所述第一和/或所述第二肽是单域抗体。
3.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白在受试者的胃肠道和/或呼吸系统中是稳定的。
4.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是酸稳定的和/或蛋白酶稳定的。
5.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是pH稳定的和/或温度稳定的。
6.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述接头是GS接头。
7.如权利要求6所述的蛋白，其中所述GS接头具有(GxS)n结构，其中x可以是1至10之间的数字，优选2至5，并且n是指GxS序列的重复次数，其中n可以在1至10之间，优选2至5。
8.如权利要求6至7所述的蛋白，其中所述GS接头是GGGGS接头(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:21)、GGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:22)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:23)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ IDNO:24)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS接头(SEQ ID NO:25)。
9.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，条件是所述接头不包含抗体的一部分，例如Fc区或Fc区的一部分。
10.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，条件是所述接头不是IgG3接头，例如SEQ IDNO:26的IgG3铰链接头。
11.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白的结合亲和力比单体单域抗体的结合亲和力高至少1.5倍。
12.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包含与至少一种病原体表面组分和/或至少一种由病原体产生的分子结合的一个或多个进一步的肽。
13.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述肽以低亲和力结合非病原体表面组分和/或由非病原体分泌的分子。
14.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是同二价或异二价的。
15.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽和所述第二肽结合以下：
a)相同的表面组分；
b)不同的表面组分；
c)表面组分和分子；
d)相同的分子；或
e)不同的分子。
16.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述表面组分来自相同或不同的病原体。
17.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述表面组分是病原体附属物和/或毒力因子，例如粘附因子。
18.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述分子是毒素、抑制剂和/或酶，例如β内酰胺酶。
19.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一和/或第二肽包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的氨基酸序列，且CDR3具有包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的氨基酸序列。
20.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一和/或第二肽包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的氨基酸序列，且CDR3具有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的氨基酸序列。
21.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的氨基酸序列，且CDR3具有包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的氨基酸序列，并且其中所述第二肽包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的氨基酸序列，且CDR3具有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的氨基酸序列。
22.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽和/或所述第二肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
23.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽和所述第二肽均包含如SEQID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
24.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽和所述第二肽均包含如SEQID NO:10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
25.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽和所述第二肽均包含如SEQID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
26.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽和所述第二肽均包含如SEQID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
27.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二肽包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
28.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二肽包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
29.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二肽包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
30.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述第一肽包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述第二肽包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
31.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包含如SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19中任一所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19具有至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
32.编码权利要求1至31中任一项所述的蛋白的分离的核酸分子。
33.包含权利要求32所述的核酸分子的载体。
34.如权利要求33所述的载体，其中所述载体是表达载体。
35.包含权利要求32所述的核酸分子或权利要求33至34中任一项所述的载体的重组宿主细胞。
36.如权利要求35所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌、真菌例如酵母和/或哺乳动物细胞。
37.如权利要求35至36中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细菌是芽孢杆菌(bacillus)，例如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和/或乳酸芽孢杆菌(Bacillus lactobacillus)。
38.如权利要求35至37中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述酵母选自毕赤酵母(pichia)属、汉逊酵母(hansenula)属和酵母(saccharomyces)属。
39.如权利要求35至38中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述真菌选自米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)。
40.包含权利要求1至31中任一项所述的蛋白的膳食组合物。
41.如权利要求40所述的膳食组合物，其中所述组合物进一步包含以下一种或多种：益生元、益生菌、合生元、蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、纤维和/或营养素，例如用于活体受试者的膳食矿物质。
42.如权利要求40至41中任一项所述的膳食组合物，其中所述组合物是食品添加剂。
43.权利要求1至31中任一项所述的蛋白在生产膳食组合物中的用途。
44.权利要求40至42中任一项所述的膳食组合物在促进受试者生长中的用途。
45.权利要求40至42中任一项所述的膳食组合物作为婴儿配方产品的添加物的用途。
46.权利要求40至42中任一项所述的膳食组合物作为针对旅行期间受试者中病原体感染的保护助剂的用途。
47.权利要求40至42中任一项所述的膳食组合物作为针对免疫缺陷受试者例如老年人中病原体感染的保护助剂的用途。
48.如权利要求43至47中任一项所述的用途，其中所述用途是非治疗性的。
49.包含权利要求1至31中任一项所述的蛋白、权利要求29所述的核酸、权利要求33至34中任一项所述的载体和/或权利要求35至39中任一项所述的重组宿主细胞并进一步包含一种或多种赋形剂的药物组合物。
50.如权利要求46所述的药物组合物，其中所述赋形剂选自由以下组成的组：表面活性剂、抗粘附剂、粘合剂、包衣剂、崩解剂、填充剂、溶剂/助溶剂、调味剂、色素、润滑剂、助流剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂、载体、聚合物、缓冲剂、抗氧化剂、润湿剂、消泡剂、增稠剂、湿润剂及其混合物。
51.如权利要求49至50中任一项所述的药物组合物，进一步包含一种或多种碳水化合物，例如纤维素和/或藻酸盐、酶、活性炭、抗生素及其混合物。
52.如权利要求1至31中任一项所述的蛋白、如权利要求32所述的核酸、如权利要求33至34中任一项所述的载体和/或如权利要求35至39中任一项所述的重组宿主细胞或如权利要求49至51中任一项所述的药物组合物，用作药物。
53.如权利要求1至31中任一项所述的蛋白、如权利要求29所述的核酸、如权利要求33至34中任一项所述的载体和/或如权利要求35至39中任一项所述的重组宿主细胞或如权利要求49至51中任一项所述的药物组合物，用于预防或治疗与受试者的内表面和/或外表面相关的病原体诱导的感染。
54.如权利要求53所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述感染是胃肠道感染、肺部感染或皮肤感染。
55.如权利要求53至54中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述感染是胃肠道感染。
56.如权利要求52至55中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述施用途径是经口、经肺和/或局部。
57.如权利要求53所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述经肺施用通过喷雾器进行。
58.如权利要求53至57中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述用途减少了活性感染的时间跨度。
59.如权利要求53至58中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述用途降低了毒力。
60.如权利要求52至59中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述受试者是人类受试者。
61.如权利要求52至60中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述受试者是家畜动物，例如选自以下的组的动物：猪、牛、绵羊、山羊、马、鸡、驴、骡、鸭、鹅和火鸡。
62.如权利要求52至61中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述受试者是猪。
63.如权利要求1至31中任一项所述的蛋白、如权利要求32所述的核酸、如权利要求33至34中任一项所述的载体、如权利要求35至39中任一项所述的重组宿主细胞或如权利要求49至51中任一项所述的药物组合物，用于预防或治疗断奶后腹泻(PWD)。
64.如权利要求1至31中任一项所述的蛋白、如权利要求32所述的核酸、如权利要求33至34中任一项所述的载体、如权利要求35至39中任一项所述的重组宿主细胞，用于预防或治疗水肿病。
65.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病原体是细菌、病毒、真菌、原生动物和/或蠕虫。
66.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病原体是埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)细菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)细菌、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)细菌、葡萄球菌(Staphylococcus)细菌、李斯特菌(Listeria)细菌、志贺氏菌(Shigella)细菌、支原体(Mycoplasma)和/或艰难梭菌(Clostridium difficile)。
67.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病原体是F4+埃希氏大肠杆菌(F4+Escherichiacoli)细菌和/或F18+埃希氏大肠杆菌(F18+Escherichia coli)细菌。
68.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、宿主细胞或药物组合物，其中所述第一肽或所述第二肽之一与F4+埃希氏大肠杆菌细菌结合，且其中另一肽与F18+埃希氏大肠杆菌细菌结合。
69.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病原体产生不耐热毒素(LT毒素)。
70.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病原体产生志贺毒素，例如选自stx2e以及stx2e的猪和人变体或志贺样毒素。
71.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病原体是带有菌毛类型或菌毛粘附的ETEC埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)：例如F5、F6、F41或AIFA，人特异性变体例如定殖因子抗原(CFA)或大肠杆菌表面抗原(CS)，包括但不限于CFAI、CFAII、CFAIII和CFAIV。
72.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述病原体产生志贺毒素或志贺样毒素，例如Stx2e和人变体，包括但不限于stx、stx1a、stx1c、stxd、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2f和stx2g。
73.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，或如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述表面组分选自由以下组成的组：F18+、F4+、Stx2e、LT及其动物和人变体。
74.一种治疗或预防有此需要的受试者中由病原体引起的感染例如胃肠道感染和/或肺部感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的前述权利要求中任一项所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。
75.一种交联病原体的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述权利要求中任一项所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。
76.一种阻止生物膜形成的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述权利要求中任一项所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。
77.一种中和病原体和/或由病原体分泌的分子的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述权利要求中任一项所述的蛋白、膳食组合物和/或药物组合物。
78.一种生产权利要求1至31中任一项所述的蛋白的方法，所述方法包括
a)将权利要求32所述的核酸分子和/或权利要求33至34中任一项所述的载体转染至宿主细胞中，以获得权利要求35至39中任一项所述的重组宿主细胞；
b)在合适的条件下培养重组宿主细胞；
c)收集和纯化从所述重组宿主细胞表达的蛋白。
79.如前述权利要求中任一项所述的蛋白、核酸、载体或宿主细胞在制备用于预防或治疗与受试者的内表面和/或外表面相关的病原体诱导的感染的药物中的用途。
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