CN114206922A - 针对家禽致病因子的抗体及其用途 - Google Patents

针对家禽致病因子的抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114206922A
CN114206922A CN202080041206.2A CN202080041206A CN114206922A CN 114206922 A CN114206922 A CN 114206922A CN 202080041206 A CN202080041206 A CN 202080041206A CN 114206922 A CN114206922 A CN 114206922A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
complex
cell
certain embodiments
eimeria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080041206.2A
Other languages
English (en)
Inventor
哈姆雷特·阿布诺西
斯莱德·洛伊特
菲利普·范佩特赫姆
慈·英·西尔维娅·张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novoband Livestock Treatment Co
Original Assignee
Novoband Livestock Treatment Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novoband Livestock Treatment Co filed Critical Novoband Livestock Treatment Co
Publication of CN114206922A publication Critical patent/CN114206922A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本文描述了可用于减少、消除或预防动物中的寄生虫种群感染的方法和抗体。本文还描述了可用于通过重链抗体和VHH片段靶向以减少动物中的寄生虫种群的抗原。

Description

针对家禽致病因子的抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年5月20日提交的美国临时申请号62/850,386的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。根据35U.S.C.§119要求优先权。以上提到的专利申请以引用的方式并入，如同在本文中完全阐述一般。
技术领域
本发明涉及用于控制与球虫病和坏死性肠炎相关的微生物的方法和组合物及其用途。
发明背景
牲畜被病原体污染后给农业产业造成的损失是全球性负担。随着全球人口不断增长并且可用于农业的耕地数量没有显著增加，需要在不占用更多空间的情况下生产更大量的食物。用抗生素对动物进行传统治疗是多重耐药性生物体出现的主要促成因素，并且被广泛认为是控制牲畜污染的不可持续的解决方案。需要开发病原体特异性分子，所述病原体特异性分子抑制病原体感染宿主或病原体与宿主的缔合，而不会产生抗性。球虫病和坏死性肠炎对家禽产业造成的全球损失估计分别为每年100亿欧元(1)和60亿美元(2)。
发明内容
参考下面列出的定义，本文描述了包含重链可变区片段(VHH)的多肽，所述多肽的预期用途包括但不限于农业或不相关领域中的以下应用：诊断学、体外测定、饲料、治疗学、底物鉴定、营养补充、生物科学和医学研究以及伴随诊断。本文还描述了包含VHH的多肽，所述VHH结合农业中的致病因子并降低农业中的致病因子的毒力。除了这些描述之外，下文阐述包含VHH的多肽在降低宿主动物中疾病的传播和严重程度的方法中的用途，包括它们作为产品中的成分的用途。进一步描述了为此目的产生、表征、改进和修饰VHH的方式。
附图说明
图1：示出具有引起感染的代表性属和种的顶复门(Apicomplexa phylum)的科学分类。
图2A-2B：示出仅骆驼科动物重链抗体及其与VHH结构域和互补决定区(CDR)的关系的示意图。
图3A-3C：示出本公开的VHH抗体的噬菌体ELISA结合数据。
图4：示出本公开的VHH抗体的噬菌体ELISA结合数据。
定义
在描述本发明时，根据以下定义使用以下术语。
在以下描述中，阐述某些具体细节以便提供各种实施方案的全面理解。然而，本领域的技术人员将理解所提供的实施方案可在没有这些细节的情况下实践。除非上下文另外要求，否则贯穿本说明书和以下权利要求书，措词“包含(comprise)”及其变型，如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”以开放的、包括含义来理解，也就是说理解为“包括但不限于”。如在本说明书和所附权利要求中所使用，除非内容另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。还应注意的是，除非内容另外明确指明，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的意义采用。此外，本文提供的标题仅出于方便目的并且不解释要求保护的实施方案的范围或含义。
宿主
如本文所提及，“宿主”、“宿主生物体”、“受体动物”、“宿主动物”及其变型是指产品的预期接受者。在某些实施方案中，宿主来自鸡雁小纲总目。在某些实施方案中，宿主是家禽动物。在某些实施方案中，家禽动物是鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽子、乳鸽、野鸡或鹅。在某些实施方案中，家禽动物是鸡。在某些实施方案中，宿主是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是牛、绵羊、猪、山羊、马、灵长类动物、有袋类动物、狗、驴、驯鹿、北美驯鹿或鹿。在某些实施方案中，哺乳动物是人。在某些实施方案中，宿主是无脊椎动物。
病原体
如在本文中所提及，“病原体”、“病原的”及其变型是指毒性微生物，所述毒性微生物可与宿主生物体相关，在所述生物体中引起在未感染宿主生物体中不存在的症状或一组症状，包括存活、繁衍、繁殖能力的降低。病原体涵盖但不限于寄生虫、细菌、病毒、朊病毒、原生生物、真菌和藻类。在某些实施方案中，病原体是属于顶复门的寄生虫(图1.)。在某些实施方案中，病原体是属于无类锥体纲的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是属于疟原虫属的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是恶性疟原虫。在某些实施方案中，病原体是属于巴倍虫属的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是属于类锥体纲的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是属于簇虫亚纲的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是属于球虫亚纲的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是属于隐孢子虫属的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是属于弓形虫属的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是刚地弓形虫。在某些实施方案中，病原体是属于艾美球虫属的寄生虫。在某些实施方案中，病原体是柔嫩艾美球虫。在某些实施方案中，病原体是巨型艾美球虫。
“毒力(Virulence)”、“毒性的(virulent)”及其变型是指病原体在宿主生物体中引起症状的能力。“毒力因子”是指在感染中具有证明的或推定的作用的核酸、质粒、基因组岛、基因、肽、蛋白质、毒素、脂质、大分子机器或其复合物。
“致病因子”是指在感染中具有证明的或推定的作用的微生物、病原体或毒力因子。
寄生虫
如本文所提及，“寄生虫”、“寄生的”及其变型是指但不限于艾美球虫属物种或与宿主生物体相关的任何其他寄生物种。在某些实施方案中，细菌可能不在与其相关的所有宿主生物中都具有毒性。
抗体
仅骆驼科动物重链抗体及其与VHH结构域和互补决定区(CDR)的关系的示意图在图2中示出。(图A)。仅骆驼科动物重链抗体由通过二硫桥连接的两条重链组成。每条重链含有两个恒定免疫球蛋白结构域(CH2和CH3)，所述恒定免疫球蛋白结构域通过铰链区连接至可变免疫球蛋白结构域(VHH)。(图B)源自单个VHH结构域。每个VHH结构域含有大约110-130个氨基酸的氨基酸序列。VHH结构域从N末端(N)开始由以下区域组成：框架区1(FR1)、互补决定区1(CDR1)、框架区2(FR2)、互补决定区2(CDR2)、框架区3(FR3)、互补决定区3(CDR3)和框架区4(FR4)。所述结构域结束于C末端(C)。互补决定区是高度可变的，决定抗体的抗原结合，并通过VHH结构域的框架区在支架中保持在一起。框架区由更保守的氨基酸序列组成；然而，这些区域中存在一些可变性。
如本文所提及，“VHH”是指包含可源自天然或合成来源的单个重链可变区的抗体或抗体片段。本文提及的NBX是VHH的一个实例。在某一方面，VHH可缺少重链恒定区(CH2或CH3)的一部分或者整个重链恒定区。
如本文所提及，“重链抗体”是指包含两条重链且缺少通常在常规抗体中发现的两条轻链的抗体。重链抗体可源自骆驼科或软骨鱼纲的物种。在没有任何轻链的情况下，重链抗体保留与抗原的特异性结合。
如本文所提及，“特异性结合”、“特异性地结合”或其变型是指在抗体与其靶分子之间发生的结合，所述结合由所述抗体可变区的至少一个互补决定区(CDR)介导。例如，恒定区与另一种分子(如蛋白A或G)之间的结合不构成特异性结合。
如本文所提及，“抗体片段”是指常规或重链抗体的保留特异性地结合靶抗原的能力的任何部分并且可包括单链抗体、重链抗体的可变区片段、纳米抗体、多肽或免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)。
如本文所提及，当抗体的任何CDR区在物种的动物中产生时，“抗体源自所述物种”。在特定物种中产生、然后通过体外方法(例如噬菌体展示)优化的抗体被认为源自所述物种。
如本文所提及，“常规抗体”是指包含通过二硫键连接在一起的两个重链分子和两个轻链分子的任何全尺寸免疫球蛋白。在某些实施方案中，本文所述的抗体、组合物、饲料、产品和方法不使用常规抗体。
生产系统
如本文所提及，“生产系统”及其变型是指可用于生产本发明的任何物理实施方案或本发明的经修饰形式的任何系统。非限制性地，这包括但不限于由以下中的任一者生物产生：细菌、酵母、藻类、节肢动物、节肢动物细胞、植物、哺乳动物细胞。非限制性地，生物生产可产生可以是细胞内的、周质的、膜相关的、分泌的或噬菌体相关的抗体。非限制性地，“生产系统”及其变型还包括但不限于任何合成生产系统。这包括但不限于从头蛋白质合成、细胞提取物存在下的蛋白质合成、纯化酶存在下的蛋白质合成和任何其他替代蛋白质合成系统。
产品
如本文所提及，“产品”是指本发明的任何物理实施方案或本发明的经修饰形式，其中VHH与任何分子(包括其自身)的结合限定其用途。非限制性地，这包括饲料、饲料添加剂、营养补充剂、预混物、药品、治疗剂、药物、诊断工具、体外测定的组分或全部、诊断测定(包括伴随诊断测定)的组分或全部。
饲料产品
如本文所提及，“饲料产品”是指本发明的任何物理实施方案或本发明的经修饰形式，其中VHH与任何分子(包括其自身)的结合将限定其作为被宿主生物体摄取的产品的预期用途。非限制性地，这包括饲料、粒料、饲料添加剂、营养补充剂、预混物、药品、治疗剂或药物。
具体实施方式
所提供的本发明的描述将结合本文提供的定义和说明来解释。
多年来，农业产业分别利用抗生素和抗球虫药来控制病原菌和寄生虫。这些分子中的一些还充当生长促进剂。这种方法极大地促进了抗生素和抗球虫药耐药性在病原生物体中的传播。欧洲已禁止在动物饲料中使用抗生素作为生长促进剂(自2006年起生效)，以逐步淘汰非医学目的的抗生素并限制抗微生物剂耐药性。由于许多农业上重要的动物的短寿命、工业规模的鸡群的疫苗接种面临的物流挑战以及高成本，通过疫苗接种对养殖动物的广泛保护已失败。动物饲料中预防性抗生素和抗球虫药的停用以及疫苗接种未能提供广泛的保护，使得开发非抗生素产品用于施用至农业动物以预防感染和促进生长成为必要。
影响家禽动物的重要病原体包括寄生虫，如艾美球虫属的成员；以及细菌，如梭菌属和沙门氏菌属的成员。
艾美球虫属寄生虫(特别是柔嫩艾美球虫)是鸡中球虫病的致病物。这种疾病据估计在全球造成100亿欧元的家禽损失(1)。球虫病的特征在于体重增加和饲料转化减少、吸收不良、内衬上皮的细胞的细胞裂解和腹泻(3)。运动性、细胞粘附和紧密连接形成都被认为对于艾美球虫属发病机制而言是重要的(4)。
由艾美球虫属寄生虫，特别是巨型艾美球虫引起的肠损伤是第二种疾病鸡坏死性肠炎的最重要的诱发因素之一(5)。每年因坏死性肠炎造成的损失估计为60亿美元(2)。坏死性肠炎可导致鸡群显著死亡(3)。在亚临床水平上，由产气荚膜梭菌引起的对肠粘膜的损害导致消化和吸收减少、体重增加减少和饲料转化率增加(6)。
与本发明的领域相关的现有技术依赖于宿主生物体来产生针对致病因子的保护。这种方法通常受到受上述病原体影响的宿主生物体的短寿命的限制，这确实允许宿主生物体的免疫系统有足够的时间来产生持久的免疫力。此外，现有技术的有效性受到与大群宿主生物体的广泛疫苗接种相关的技术挑战的限制。这些问题通过引入外源性肽来解决，所述肽通过饲料中和致病因子的毒力和至宿主中的传播，而不会引发宿主免疫应答。此外，本文所述的方法为中和肽的适应和改进提供了范围，这提供了超出宿主自然能够产生的合成功能。
抗体重链可变区片段(VHH)是小(12-15kDa)的蛋白质，所述蛋白质包含与抗原的特异性结合区域。当引入动物体中时，VHH在原位结合致病因子并中和致病因子的作用。由于它们的质量更小，与传统抗体(如先前记录的IgY)相比，它们更不容易被宿主生物体中发现的酶裂解、对温度和pH变化适应性更强、更易溶解、全身吸收低并且更容易大规模重组产生，从而使它们比常规抗体更适合用于动物治疗剂中。
用于预防或降低毒力的抗体(概要)
在一个方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合致病因子以降低物种之间和跨越物种的疾病的严重程度和传播。在某些实施方案中，VHH被提供给宿主动物。在某些实施方案中，VHH是产品的成分。
结合以降低毒力
在另一个方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合致病因子并且在这种情况下降低致病因子发挥病理功能或促成疾病表型的能力。在某些实施方案中，VHH与致病因子的结合降低致病因子的复制速率。在某些实施方案中，VHH与致病因子的结合降低致病因子与其同源受体结合的能力。在某些实施方案中，VHH与致病因子的结合降低致病因子与另一个或多个分子相互作用的能力。在某些实施方案中，VHH与致病因子的结合降低致病因子的移动性或运动性。在某些实施方案中，VHH与致病因子的结合降低致病因子到达感染部位的能力。在某些实施方案中，VHH与致病因子的结合降低致病因子引起细胞死亡的能力。
源自美洲驼的抗体
在另一方面，本发明提供了一种用重组毒力因子接种骆驼科动物或其他物种、从接种过的生物体的淋巴细胞中回收编码VHH结构域的mRNA、对编码VHH结构域的mRNA进行逆转录以产生cDNA、将cDNA克隆到合适的载体中并从所述载体重组表达VHH的方法。
在某些实施方案中，骆驼科动物可以是但不限于单峰骆驼、骆驼、美洲驼、羊驼、小羊驼或原驼。在某些实施方案中，接种过的物种可以是但不限于可产生单结构域抗体的任何生物体，包括软骨鱼，如软骨鱼纲生物体的成员，其包括例如鲨鱼、鳐鱼(ray)、鳐鱼(skate)和锯鳐。在某些实施方案中，重链抗体包含表1中列出的序列。在某些实施方案中，重链抗体包含与表1中公开的任何序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，重链抗体具有表2中列出的CDR1。在某些实施方案中，重链抗体具有表2中列出的CDR2。在某些实施方案中，重链抗体具有表2中列出的CDR3。
Figure BDA0003390599780000091
Figure BDA0003390599780000101
Figure BDA0003390599780000111
Figure BDA0003390599780000121
Figure BDA0003390599780000131
Figure BDA0003390599780000141
Figure BDA0003390599780000151
Figure BDA0003390599780000161
Figure BDA0003390599780000171
Figure BDA0003390599780000181
Figure BDA0003390599780000182
Figure BDA0003390599780000191
Figure BDA0003390599780000201
Figure BDA0003390599780000211
Figure BDA0003390599780000221
Figure BDA0003390599780000231
Figure BDA0003390599780000241
Figure BDA0003390599780000251
重组表达的抗体
在另一个方面，本发明提供了一种在合适的生产生物体中产生VHH的方法。合适的生产生物体包括但不限于细菌、酵母和藻类。在某些实施方案中，生产细菌是大肠杆菌。在某些实施方案中，生产细菌是芽孢杆菌属的成员。在某些实施方案中，生产细菌是益生菌。在某些实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在某些实施方案中，酵母是酿酒酵母。在某些实施方案中，藻类是衣藻属或褐指藻属的成员。
添加至饲料的抗体
在又一方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合致病因子并作为饲料产品的一部分通过任何合适的途径施用于宿主动物。在某些实施方案中，动物选自所描述的宿主动物的列表，所述列表是代表性的而非限制性的。在某些实施方案中，施用至受体动物的途径可以是但不限于：经口或经直肠引入消化道中，提供给外表面(例如，作为喷雾或浸没物)，提供给动物所居住的介质(包括基于空气的介质)，通过注射提供，经静脉内提供，通过呼吸系统提供，通过扩散提供，通过内皮或上皮吸收提供，或通过诸如酵母、细菌、藻类、噬菌体、植物和昆虫的次级生物体提供。在某些实施方案中，宿主来自鸡雁小纲总目。在某些实施方案中，宿主是家禽动物。在某些实施方案中，家禽动物是鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽子、乳鸽、野鸡或鹅。在某些实施方案中，家禽动物是鸡。
饲料产品
在另一方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合致病因子并以产品的形式施用于宿主动物。产品的形式不受限制。在某些实施方案中，产品是饲料、粒料、营养补充剂、预混物、治疗剂、药品或饲料添加剂，但不限于这些形式。
饲喂剂量
在另一方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合致病因子并作为产品的一部分以任何合适的剂量方案施用于宿主动物。在实践中，合适的剂量是产品针对致病因子提供任何程度的保护的剂量，并且取决于递送方法、递送时间表、受体动物的环境、受体动物的大小、受体动物的年龄和受体动物的健康状况等因素。在某些实施方案中，VHH以超过1mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以超过5mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以超过10mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以超过50mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以超过100mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以小于1mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以小于500mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以小于100mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以小于50mg/kg体重的浓度施用于受体动物。在某些实施方案中，VHH以小于10mg/kg体重的浓度施用于受体动物。
饲喂频率
在另一方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合致病因子并作为产品的一部分以任何合适的剂量频率施用于宿主动物。在实践中，合适的剂量频率是产品针对致病因子提供任何保护的剂量频率，并且取决于递送方法、递送时间表、受体动物的环境、受体动物的大小、受体动物的年龄和受体动物的健康状况等因素。在某些实施方案中，剂量频率可以是但不限于：持续、以一致的指定频率在一小时以内、每小时、以指定频率在24小时周期内、每天、以指定频率在一周内、每周、以指定频率在一个月内、每月、以指定频率在一年内、每年以及以任何其他指定频率大于1年。
饲料添加剂
在另一方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合致病因子并作为还包含其他添加剂或包衣的产品的一部分施用于宿主动物。在实践中，最合适的包衣或添加剂取决于递送方法、受体动物、受体的环境、受体动物的饮食要求、递送频率、受体动物的年龄、受体动物的大小、受体动物的健康状况。在某些实施方案中，这些添加剂和包衣可包括但不限于以下列表及其混合物：维生素、抗生素、激素、抗微生物肽、类固醇、益生菌、益生菌、噬菌体、几丁质、壳聚糖、B-1,3-葡聚糖、植物提取物、蛋白胨、虾粉、磷虾、藻类、B-环糊精、藻酸盐、树胶、黄蓍胶、果胶、明胶、添加剂喷雾、毒素结合剂、短链脂肪酸、中链脂肪酸、酵母、酵母提取物、糖、消化酶、消化化合物、必需矿物质、必需盐或纤维。
非饲料用途
在另一方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合致病因子并且可以其当前形式和/或作为与另一分子缀合的多肽形式用于非饲料用途，如但不限于：诊断试剂盒、基于ELISA的测定、蛋白质印迹测定、免疫荧光测定或FRET测定。在某些实施方案中，缀合分子可以是但不限于：荧光团、化学发光底物、抗微生物肽、核酸或脂质。
抗原
在另一方面，本发明提供了一种多肽或多种多肽，所述多肽包含一个或多个VHH，所述VHH结合由艾美球虫属物种产生的致病因子。在某些实施方案中，所述物种不属于艾美球虫属，但能够携带由艾美球虫属物种共有的致病因子。在某些实施方案中，艾美球虫属物种是指当前生物体和重新分类的生物体两者。在某些实施方案中，艾美球虫属物种是柔嫩艾美球虫。在某些实施方案中，艾美球虫属物种是巨型艾美球虫。
在某些实施方案中，所述VHH或其多个能够结合至源自相同或不同物种的一种或多种致病因子。在某些实施方案中，致病因子是与巨型艾美球虫MIC1(EmMIC1，SEQ ID 101)具有80％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在某些实施方案中，致病因子是与柔嫩艾美球虫MIC1(EtMIC1，SEQ ID 102)具有80％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在某些实施方案中，致病因子是与巨型艾美球虫MIC2(EmMIC2，SEQ ID 103)具有80％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在某些实施方案中，致病因子是与柔嫩艾美球虫MIC2(EtMIC2，SEQ ID 104)具有80％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在某些实施方案中，致病因子是与巨型艾美球虫AMA1(EmAMA1，SEQ ID 105)具有80％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在某些实施方案中，致病因子是与柔嫩艾美球虫AMA1(EtAMA1，SEQ ID 106)具有80％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在某些实施方案中，致病因子是与巨型艾美球虫RON2(EmRON2，SEQ ID 107)具有80％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在某些实施方案中，致病因子是与来自结合EmAMA1的EmRON2(SEQ ID 108)的肽具有80％或更高氨基酸序列同一性的肽。在某些实施方案中，致病因子是与柔嫩艾美球虫RON2(EtRON2，SEQ ID 109)具有80％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在某些实施方案中，致病因子是与来自结合EtAMA1的EtRON2(SEQ ID 110)的肽具有80％或更高氨基酸序列同一性的肽。在某些实施方案中，致病因子是与艾美球虫属寄生虫的表面缔合的暴露的肽、蛋白质、蛋白质复合物、核酸、脂质或它们的组合。在某些实施方案中，致病因子是由艾美球虫属寄生虫沉积在宿主细胞表面上的暴露的肽、蛋白质、蛋白质复合物、核酸、脂质或它们的组合。在某些实施方案中，致病因子是艾美球虫属寄生虫。
抗原序列
EmMIC1(SEQ ID 101)
>AAA29076.1 em100基因与编码微线体蛋白Etp100[巨型艾美球虫]的柔嫩艾美球虫基因et100(登录号M73495)同源
MALLPTQRLAPGWALSLLVFLAAGLTFHSSHAAASSEADQVCTRLLDVMLVVDESGSIGTSNYGKVRSFISNFAGTMPLSPDDVRVGLVTFGTSAVTRWDLSDSRAQNADLLAAAAKKLPYAAGSTYTHLGLAKAEEILFSFQKGGRDNAPKMILVMTDGASSRRSQTLSAAEKLRNRGVIIVVLGVGTGVNSAECRSIAGCDTSDTVECPRYLQSNWGGVSSQINGIIKAACKDLAKDAVCSEWSEYGPCEGECGTEGTRTSTRVEIAPPRPGTPPCPTCEAPQGRSCAQQPPGLMRTEQCTMPACKIDAHCGDFGPWSEWSTTCGSATRQRVRQGYEDPPASGGGLSCIDQNPPKYAKEVEVVQKSPCPVQQQPGPWSDWSDCSATCGGGTRYREREGYPQEGELFGGQTLQAQGLDVRETDTCNENPCPVDATCGEWTEFSDCSRVCGGGTKERRREPWLDNAQFGGRSCSQQHPEGPTESVECNEHPCPVDEVVGEWEDWGPCSEQCGRGRQFRYRGPSLQQAMFGGKTIEEQNAGVPEEQKILKVEERPCNDVPCGPCTLPFTEWTACESCSGTRTRDSMVAFDYDDRQCQNPTHEEESCDAVCEESASGGGVGGGAGGAGGGGGGSAGGEGSNGAGPGEDKEEESKGFPTAAVAGGVAGGVLAIAAGAGAFYGLSGGAASAAGGAAAEVMVESGTANPPEVEKESLITAGEQSEMWAS
EtMIC1(SEQ ID 102)
>AIR96017.1微线体蛋白Mic-1[柔嫩艾美球虫]
MAPLPRRRLAPCRALSLLVGLLAASFAFSSLQPGATTSSGQDQVCTSLLDVMLVVDESGSIGTSNFRKVRQFIEDFVNSMPIPPEDVRVGLITFATRSKVRWNLSDPKATNPSLAISAARSLSYSTGVTYTHYGLQDAKKLLYDTNAGARNNVPKLVLVMTDGASNLPSQTRSSAAALRDAGAIVVVLGVGSGVNSSECRSIAGCSTSNCPRYLQSNWSNVTQQVNGIIKAACKDLAKDAVCSEWSEYGPCVGECGKEGVQTSTRVEISPQKPGSPPCPTCEAPRGRSCAEQPPGLTRTQPCTMPVCKTDAHCGEFGAWSEWSTTCGTATRKRQREGYNSPPAAGGGLSCMEQNPPKHEFEVETVQKSPCPVQQQPGPWSEWTECSATCGGGTKHREREGLPQEGELYGGQTLEQQGIAVRETASCSENPCPIGATCGEWTEYSACSRTCGGGTQERKREPWLDNAQHGGRTCMEQYPDGPISVRECNTQPCPVDEVVGDWEDWGQCSEQCGGGKRTRNRGPSKQEAMFGGKTVAQQNVELPEGEKIEVVQEGGCNEVPCGPCTLPFSEWTECESCSGHRTRESAVAFDYTDRMCSGDTHEVHSCEEYCSQNAGGGAGGDGGAGGGTGGSGEEEGKEESSGFPTAAVAGGVAGGVLAIAAGAGAFYGLSGGSAAAATEAGAEVMTEAGTSNAAEVEKESLISAGEQSEMWASEmMIC2(SEQ ID 103)
>CBX60033.1微线体蛋白2[巨型艾美球虫]
MARALSLIALGLLFSLPSTSAVRTKVPGDEPSGPDSALTAGSPTRGNHGVGGFAEAHCNRLTVRGGLQEKEAVKVTANGWGKGDADFFVELVTDNTRGMLQIRESQTEAGPGLAGGGGQEGGSTEGSKTDEGPVKEQPSIPIVGVRIPGSANENGESRKPAVLVYGEGESAPKEFPLDSPAGPTSPFMVVLQQKSPTEMTVRLFTWIPNGSGGDGSWHETFVDVGVGINHRDVMVVVSDCVPHSLRIYGSSSADLVTADEKTCQATEPQLVNLTSPPENRTHPGAETSTTTSVSS
EtMIC2(SEQ ID 104)
>AAD05559.1微线体蛋白Etmic-2[柔嫩艾美球虫]
MARALSLVALGLLFSLPPSSAVRTRVPGEDSFSPESGVLSGTDAPERRPIVPGLVEGNCGRLTVRNGPSVDETIKVTSAGWTKSERDFIVSLVADETRKVVQLRESEGASGASGPGPAPAEKPPSGQGSAEEAPKGEGGQEKPSVPLIAVRIHGSGGDKGESAPQSAVLLYGNDESEPTEVPLETAAGPTTPLMVLITQQNPKEVEVRVLAWISTDATTGKGSWKENSVVVGSSLSGRDLTVNLSDCGPSSLRVYGSASADLVTVKEGMCEADDPELIALTRPHTSAASPLPAEEGDVAQDAQQSAGAQQEAEAQEVGEPQQEAAAAEQGSSAAESDTQQSS
EmAMA1(SEQ ID 105)
>SNT95431.1顶端膜抗原1[巨型艾美球虫]
MCGLRAAFTEAVCLGLLSLGSTVVQGIKDKVHQGHTEAAATAAAGNLSAELHAALHQPNDNPFLVPPLSDFMDRFNIPKVHGSGIYVDLGGDKEVDGRTYREPSGLCPVFGKTIVLYQPQNNPNYKNDFLDDMPTKQQSDAVGHPLPGGFNNSFKMPDKSPYSPMSAQKLNSYKQLKANTPMGKCAEMSFMTTAGKNSSYRYPWVYDTKRDLCYFLYLPVQRLMGERYCSVDGKPDGMTWYCFEPHKALDSRPELVYGSAYVGRDPDYWETHCPNKAVKDAVFGVWVSGRCTEHKHLDGAKKEKVNSKAECWSLAFENPEVASDHPVTEDENFGTYGYFFPSTEPNQPKSGGEGVNFASFYPGSMECWLSGEIPTCLVPLEGAAAFTALGSLEEETAPCTDSFPQTKTPCDRNTCTQIVATCVSGTLVSEEVPCSPEDGTRCEGGFPKGVMIGLAAAGGILLLLLGGGGFLLYRSRMRPAAKGDEATRSDYVQEEAAANRRKQRQSDLVQQAEPSFWEEAEADEAETGESTHVLVDQDY
EtAMA1(SEQ ID 106)
>XP_013229486.1顶端膜抗原-1[柔嫩艾美球虫]
MRRLSPALGLLAAALSCAGPAAGVQHKLQHRQQQQQQHSHASTSHAAAVLAASSDASTDSNPFMQPPYAEFMARFNIPKVHGSGVYVDLGNDKEVKGKMYREPGGRCPVFGKNIEFYQPLDSDLYKNDFLENVPTEEAAAAAKPLPGGFNNNFLMKDKKPFSPMSVAQLNSYPQLKARTGLGKCAEMSYLTTAAGSSYRYPFVFDSKKDLCYLLLVPLQRLMGERYCSTRGSPPGLSHFCFKPLKSVSLRPHLVYGSAYVGERPDDWETKCPNKAVKDAVFGVWEGGRCEEQRLRLGAQTAAAAAKEDCWALAFNNPFAASDQPTSQDEAATSPGYYFPSITPSQPKSGGVGVNFASYYPSGECVLSGEVPTCLLPRQGAAAFTSVGSLEEEELPHCDPTFPASLGSCDPSSCKAILTECRGGRLVEQQTDCVPEDGSKCESKGGGVFIGLAVAGGLLLLLLTGGAFFIYKQRQKALPKESSPQRTDFVQDEAATGRGKKRQSDLVQQAEPSFWEEAEADEPHADENTQVLLDQEY
EmRON2(SEQ ID 107)
>XP_013337434.1假定蛋白，保守的[巨型艾美球虫]
MFRLLYLPGLVTILSVSQRTPEVKITMLGAFSIFALSTLLSLPPYSWRMAAMADSLSVTPEYEVEGPTNFLTPSLVTLDSALEGLDSGGTPGFSGQYADLLDRICPADSPALDLPQQPTREQNIGELELMLSDNDLGEATNKLWLAFYGHEVPKAASSVEELSAQFLELVGQVRVAFQDVHHHMVKQEGHPEFHNSQLPRSIVPIVGARNPLMLGLFWNLLIAYTGFDSYFGEDSITLPFFSWPSLLASLGGQSSSHIDAMCSVQRSRSLTEKFFKWRSPRGIQQNRRHKRVSSLRESSHRTFCELIDRLISSLGEFVAGHVTTLAAAGVPVELGISPLQNMKRLHAETCLPGEDGHILAPCIFEESRLALDSQQLVKMEDDTDQQIRHSAQAELLKQAHTTISGLGALDCKLSSRKWRALPYTPMPRLFKLPELAQLRKDWILERLNLAVATMLTTSSLDNASNYWLAFDRRNFKRAAQDFKKHTIDVLRSVGMEAIGRRLLQSSGSEISDDEVQAAASRLKDLRAVSDGMRVALALYAILNAGRHAQSAHVGSQGHAIHAQCYGTCCSTAEPYAYVGVRVPELSGRDAQEHERNQDPESQKGAWSKIDLNGLPLPDLTDWWSRLNYIVVQALESYLVLEKHLEFLEDTVFTLVSDSLRKLKADAGQTLFFTRIAHQKRQGPLQRLWEGAKKSLMGFLYRSPGRQHGIWFGVTVDFEQLHDLLGQLKLVIEAEPRLTIKINMQEALLREMETRIRVEGSDISRVPPLVERNMGMLGVRRAYGTLSEGLRDTEFQRSMCIDHCRGLWQMALSTMLPSMLSPDIFRKYEKAFGTPWALEHLSDPALVNSRRMVLKSDAALNFFDHSTPKEVREELKGLESGQASMFAYYMLFSSRAHQVLGNHYLGLYLRQQAPFMGNMVVDWISTRRKHAVAAIVSSFVLTFMGIYAVMSFVDILQNLIVSGAPPPFDCLWNPVFGEMACSPVPGGASLGTAWATAIEQVFLIGLFSGTAGGFSLFLTINSAIAVVVNQSKTLMRLQMCLGSAISRLLRRGKRSFSRIREYFIKRSSVKRVMLQRAVAGMKAGSSTATMSNSETLEAADQLLDRLTRTGRANPLKASGGKPAFK
结合EmAMA1的EmRON2肽(SEQ ID 108)
DILQNLIVSGAPPPFDCLWNPVFGEMACSPVPGGASL
EtRON2(SEQ ID 109)
>XP_013231132.1棒状体颈蛋白2，推定，部分[柔嫩艾美球虫]
MGVFSRLLSAALLCAAASPALLSPQAAAAAAAPAEGSTSFTLPSGGSLHVQVLRGPQQQQQQQQQGPWGSTMSFAGPTGATGGYSVTDSATLRSSAGPPAAAAAAAAAEGVYELPTPPTPENPISKTQVLFGWVPEAAAAASLQAVNAEELNNALRSQAFVRKLRTRALVEKSCMIPLASDRRSYLEAFWSAAAAERKFRAEAESQRAAIEEELKQQQMAAPDMSYARSVATRANIESGASPAAAAAAAAGAAAAAAAGEEAAAAALRYQETVDRVLANRIEVLMTCKLAALLGQPGIFLNDKIAAAEVLDLVATALGIGNTKEEAAAAAASPIVPMFGGLEPFLLASNPLIVGHVLTLLIAHIDREAFFGEAARKAFYSFTSLAAAAGGEGAVGMLDEMCDRDRGPRLAAPLLGKYRPKGRGGKPRKRGSSSPWFVRGASRVHRNKLQPELLRAYCDATEMILNALMLKQEDVQQEMLKFSLPVEPLVDPATNASRIQTKTCRGGAPVCEFENSILSPIANPLDPQVLEQNTNTRAAFNLYAGLASAQLGNLLEETGSKYYDVRADQWLEIISKPTAHSDILEKVFFYDNREFLASKRSKLIKSFETNAKKIAALAGKPAVSISEAAAAYEEIQRSVGSQTGKKGAAAAKKNLFPTAATLLLKSTLACDMTSSFAAKLESFTQFMFKAKAASGRRQAPLQRTLMAFIRTGKGSALQSMCSYDPLTFNYLFLYRFVLLGSDPAKTHDKQHAAVSKTPLTTRLLGSTWTPSILKRVLRGVKRKSSILKAKQLLLESLDAGVFPLLLTSFEWIVHTQAALQVNQNSEMFHELEAQQPRALPAEPQKAAEAKLHEGGLVKRTDEQLAEWAEFGVPAALREQLRRGEKLPKAVALERIPTPDLTQWEQQLNRKWLAALEAYLRHPYGAAAAAARDPVALLVQRSRDRLEAELDSTIFLGRIVGAPRGPRRGRRALRAVGGLFRALLRAPRQSEFAVWMGVKVHADRVLRVLHAVHAAAEVAKTAGLFEHVREAFLELVRDAVLGSLQNQLRVPGFDTFAAVEAGLRGGEVSAAAAAAAAAAAAARRSAGFLSVHPELAALGPAAREAEFQNSMCMDHCEALWTLVTSLVFSALQNPRKWRDYEKEVGGAAAAAALADPRRVNSFRLGLSVQTDFFENVLDKKSKRNIQKMKFGGGSWFAYALLLAARLHRGLGHSDLATFFSFQAPYLGHFVLQWQQQRREARRKALLSMLSLGFFFAYTFISVSDITQHLNDSGLGPAVECLENLVVGPVCPAAVVAPAVRSAAAAAAADVFKVGLFGLLTPYLVWPMAAAAAWQLLRSEFKVLLQFEMSLKSLFSRFSSWVRRPFARWWQQRRRLKQLLLQSAAAKFRTEKKRLHGRDPPPRDF
结合EtAMA1的EtRON2肽(SEQ ID 110)
DITQHLNDSGLGPAVECLENLVVGPVCPAAVVAPAVR
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的应用、系统和方法的实施方案并且不意图以任何方式进行限制。
尽管本文示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和取代而不背离本发明。应该理解的是，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。
抗原的产生
重组抗原可从大肠杆菌表达系统中纯化。例如，可在18℃下在自诱导培养基(Formedium)中生长过夜的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达抗原。然后在含
Figure BDA0003390599780000351
DNA酶I和1X蛋白酶抑制剂混合物(Bioshop)的缓冲液A(250mM NaCl、50mM CaCl2、20mM咪唑和10mM HEPES，pH 7.4)中通过超声处理裂解细胞。通过在4℃下以22000x g离心30分钟清除裂解物，然后将其施加至用缓冲液A预平衡的5ml HisTrap HP柱(GE Healthcare)上，用十倍柱体积的缓冲液A洗涤并用0％至60％(vol/vol)缓冲液B(250mM NaCl、50mM CaCl2、500mM咪唑和10mM HEPES，pH 7.4)的梯度洗脱。然后在4℃下在TEV存在下将蛋白质用缓冲液C(250mM NaCl，10mM HEPES，pH7.4和
Figure BDA0003390599780000352
-巯基乙醇)透析过夜。将透析的蛋白质施加至用缓冲液C预平衡的HisTrap HP柱(GE Biosciences)上。6xHis-标记的TEV和6xHis-标签结合至所述柱，并且抗原收集在流过液中。将样品用缓冲液D(5mM NaCl和10mM Tris pH8.8)透析过夜，然后施加至5ml HiTrap Q HP柱(GE Healthcare)。用0％至50％(vol/vol)缓冲液E(1.0M NaCl和10mM Tris pH 8.8)的梯度洗脱蛋白质。最后，使用缓冲液F(400mMNaCl和20mM HEPES pH 7.4)将洗脱液负载到Superdex 75Increase 10/300GL凝胶过滤柱(GE Healthcare)。然后使用具有适当分子量截留的Amicon浓缩器(MWCO；Millipore)将蛋白质样品浓缩至1mg/mL。将纯化的蛋白质储存在-80℃。
可替代地，EmRON2的EmAMA1结合肽(SEQ ID 108)和EtRON2的EtAMA1结合肽(SEQID 110)在大肠杆菌中作为谷胱甘肽S-转移酶(GST)的C-末端的融合物表达。它们如上所述进行纯化而没有TEV裂解。
NBX的产生和淘选
美洲驼免疫
将一只美洲驼用纯化的致病因子(如列出的抗原)进行免疫，所述致病因子可伴有佐剂。对于SEQ ID 108和110，抗原肽作为与GST的融合物提供给美洲驼。美洲驼免疫使用100μg的每种抗原进行，所述抗原合并且注射，总共注射四次。在注射时，将抗原解冻并用PBS将体积增加至1ml。然后将1ml抗原-PBS混合物与1ml完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)混合，获得总计2ml。将总计2ml通过注射进行免疫。然后在第0、28、49、70天从经免疫的动物收集全美洲驼血液和血清。然后将来自第28、49和70天的血清分级分离以从常规抗体分离VHH。ELISA可用于测量针对多克隆和富含VHH的级分中的靶抗原的反应性。从第28、49和70天采集的血清中收集淋巴细胞。
淘选
从纯化的美洲驼淋巴细胞中分离的RNA用于生成cDNA以克隆到噬菌粒中。所产生的噬菌粒用于转化大肠杆菌TG-1细胞以生成所表达的VHH基因的文库。噬菌粒文库的大小可以是约2.5x 107个总转化体，并且含有VHH插入物的噬菌粒的估计数量可估计为约100％。然后通过针对用于美洲驼免疫的抗原进行淘选来选择高亲和力抗体。进行两轮淘选，并使用噬菌体ELISA鉴定从第2轮产生的抗原结合克隆。对抗原结合克隆进行测序，根据它们的CDR区进行分组，并优先考虑在大肠杆菌中的可溶性表达和抗体纯化。
图3示出本公开的抗体的噬菌体ELISA结果。黑色条形显示与用溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的表1和2中指定的抗原包被的孔的结合。灰色条形是显示与仅用PBS包被的孔的结合的阴性对照。在所有情况下，与抗原靶标的结合是与PBS包被孔的结合的至少四倍以上。NBX0707-NBX0718、NBX0726-NBX0728、NBX0731-NBX0734、NBX0740和NBX0748-NBX0752的数据示于图A中。NBX16011-NBX16030的数据示于图B中。NBX017001-NBX017018、NBX17021-NBX17023和NBX17034-NBX17035的数据示于图C中。
图4示出靶向EmRON2的EmAMA1结合肽(SEQ ID 108)或EtRON2的EtAMA1结合肽(SEQID 110)的本公开的抗体的噬菌体ELISA结果。由于用这些肽作为与GST的融合物对美洲驼进行了免疫，因此进行了额外的对照以确认噬菌体与GST-RON2肽融合蛋白的RON2肽部分的特异性结合。黑色条形显示与用溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的表1和2中指定的GST-RON2肽抗原包被的孔的结合。深灰色条形是显示与用溶解在PBS中的GST包被的孔的结合的阴性对照。浅灰色条形是显示与用PBS包被的孔的结合的阴性对照。在所有情况下，与抗原靶标的结合是与PBS包被孔的结合的至少四倍以上，并且是与GST包被的孔的结合的至少三倍以上。
从大肠杆菌纯化VHH
TEV蛋白酶可裂解的6xHis-硫氧还蛋白-NBX融合蛋白在自诱导培养基(Formedium)中在30℃下生长24小时的大肠杆菌的细胞质中表达。通过离心收集细菌，重新悬浮在缓冲液A(10mM HEPES，pH7.5，250mM NaCl，20mM咪唑)中并使用超声处理进行裂解。通过离心除去不溶性物质，并将剩余的可溶性级分施加至用缓冲液A预平衡的HisTrap柱(GE Biosciences)。使用具有缓冲液A与缓冲液B(10mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl，500mM咪唑)之间的线性梯度的FPLC从柱中洗脱蛋白质。将洗脱的蛋白质在TEV蛋白酶存在下用缓冲液C(10mM HEPES，pH 7.5，250mM NaCl)透析过夜。将透析的蛋白质施加至用缓冲液C预平衡的HisTrap柱(GE Biosciences)。6xHis标记的TEV和6xHis标记的硫氧还蛋白结合至所述柱，并且纯化的NBX收集在流过液中。将含有NBX的流过液用缓冲液D(10mM HEPES，pH 7.0)透析并施加至HiTrapSP离子交换柱(GE Biosciences)。使用从缓冲液D至缓冲液E(10mMHEPES，pH 7.0，500mM NaCl)的线性梯度，从柱中洗脱高度纯化的NBX蛋白。将NBX蛋白用缓冲液F(20mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl)透析过夜并浓缩至约10mg/ml。
从巴斯德毕赤酵母纯化VHH
具有用于表达和分泌6xHis标记的VHH的构建体的巴斯德毕赤酵母菌株GS115在30℃下生长5天，伴随每天0.5％(vol/vol)甲醇诱导。通过离心除去酵母细胞，并将含有NBX的上清液中掺杂10mM咪唑。将上清液施加至用缓冲液A(10mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl)预平衡的HisTrap柱(GE Biosciences)。使用具有缓冲液A与缓冲液B(10mM HEPES，pH 7.5，500mM NaCl，500mM咪唑)之间的线性梯度的FPLC从柱中洗脱蛋白质。将NBX蛋白用PBS透析过夜并浓缩至约10mg/ml。
本说明书中提及的所有公布、专利申请、已授权专利和其他文件均以引用的方式并入本文，如同明确并个别地指示每个个别公布、专利申请、已授权专利或其他文件是以引用的方式整体并入一般。以引用的方式并入的文本中包含的定义在与本公开中的定义相矛盾的程度上被排除在外。
以下参考文件以引用的方式整体并入：
(1)Van Meirhaeghe,H.&De Gussem,M.(2014).Coccidiosisa major threat tothe chicken gut.Retrieved on May 25,2018from:https://www.poultryworld.net/Home/General/2014/9/Coccidiosis-a-major-threat-to-the-chicken-gut-1568808W/？dossier＝35765&widgetid＝1.
(2)Wade,B.&Keyburn,A.(2015).The true cost ofnecroticenteritis.Retrieved on May 25,2018from:https://www.poultryworld.net/Meat/Articles/2015/10/The-true-cost-of-necrotic-enteritis-2699819W/.
(3)Chapman,H.D.(2014).Milestones in avian coccidiosis research:areview.Poultry Science,93(3),pp.501-511.
(4)Boucher,L.E.&Bosch,J.(2015).The apicomplexan glideosome andadhesins-structures and function.Journal of Structural Biology,190(2),pp.93-114.
(5)Moore,R.J.(2016).Necrotic enteritis predisposing factors inbroiler chickens.Avian Pathology,45(3),pp.275-281.
(6)Abid,S.A.et al.(2016).Emerging threat of necrotic enteritis inpoultry and its control without use of antibiotics:a review.The Journal ofAnimal and Plant Sciences,26(6),pp.1556-1567.

Claims (37)

1.一种多肽，所述多肽包含重链抗体的至少一个可变区片段(VHH)，其中所述至少一个VHH特异性地结合致病因子。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含多个VHH。
3.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含至少三个VHH。
4.如权利要求2或3所述的多肽，其中所述多个VHH中的任一者与所述多个VHH中的另一个VHH相同。
5.如权利要求2至4中任一项所述的多肽，其中所述多个VHH通过接头彼此共价偶联，所述接头包含一个或多个氨基酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述重链抗体的所述可变区片段包含与SEQ ID No:1至25或111至167中的任一者至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
7.如权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述重链抗体的所述可变区片段包含如SEQ ID No:26至50或168至224中的任一者中所列的互补决定区1(CDR1)、如SEQ ID No:51至75或225至281中的任一者中所列的互补决定区2(CDR2)以及如SEQ ID No:76至100或282至338中的任一者中所列的互补决定区3(CDR3)。
8.一种多肽复合物，其中所述多肽包含第一组分多肽和第二组分多肽，其中所述第一组分多肽和所述第二组分多肽并非共价连接在一起，而是通过蛋白质-蛋白质相互作用、小分子-蛋白质相互作用或小分子-小分子相互作用偶联在一起，其中所述第一组分多肽和所述第二组分多肽中的每一者均包含特异性地结合病原体的VHH。
9.如权利要求1至7中任一项所述的多肽或如权利要求8所述的多肽复合物，其中所述致病因子是寄生虫。
10.如权利要求1至7中任一项所述的多肽或如权利要求8所述的多肽复合物，其中所述寄生虫来自顶复门。
11.如权利要求1至7中任一项所述的多肽或如权利要求8所述的多肽复合物，其中所述顶复门寄生虫来自无类锥体纲。
12.如权利要求1至7中任一项所述的多肽或如权利要求8所述的多肽复合物，其中所述顶复门寄生虫来自簇虫亚纲。
13.如权利要求1至7中任一项所述的多肽或如权利要求8所述的多肽复合物，其中所述顶复门寄生虫来自球虫亚纲。
14.如权利要求1至7中任一项所述的多肽或如权利要求8所述的多肽复合物，其中所述致病因子包括艾美球虫属物种。
15.如权利要求14所述的多肽或多肽复合物，其中所述艾美球虫属物种是柔嫩艾美球虫或巨型艾美球虫。
16.如权利要求14或15所述的多肽或多肽复合物，其中所述VHH特异性地结合艾美球虫属毒力因子。
17.如权利要求15所述的多肽或多肽复合物，其中所述VHH特异性地结合与SEQ ID No:101至110至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％同一的抗原或多肽或其组合。
18.如权利要求17所述的多肽或多肽复合物，其中所述艾美球虫属毒力因子是EmMIC1多肽、EmMIC1样多肽、EtMIC1多肽、Et MIC1样多肽、EmMIC2多肽、EmMIC2样多肽、EtMIC2多肽、Et MIC2样多肽、EmAMA1多肽、EmAMA1样多肽、EtAMA1多肽、EtAMA1样多肽、EmRON2多肽、结合EmAMA1的EmRON2肽、结合EmAMA1的EmRON2样肽、EmRON2样多肽、EtRON2多肽、EtRON2样多肽、结合EtAMA1的EtRON2肽或结合EmAMA1的Em RON2样肽。
19.一种核酸，所述核酸编码权利要求1至7或9至18中任一项所述的多肽或编码权利要求8至18中任一项所述的多肽复合物。
20.多种核酸，所述多种核酸编码权利要求8至18中任一项所述的多肽复合物。
21.一种载体，所述载体包含权利要求19所述的核酸或权利要求20所述的多种核酸，所述载体适合用于在任何生产系统中产生权利要求1至7或9至18中任一项所述的多肽或权利要求8至18中任一项所述的多肽复合物。
22.一种细胞，所述细胞包含权利要求19所述的核酸或权利要求20所述的多种核酸。
23.如权利要求22所述的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
24.如权利要求23所述的细胞，其中所述酵母属于毕赤酵母属。
25.如权利要求23所述的细胞，其中所述酵母属于酵母属。
26.如权利要求22所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
27.如权利要求26所述的细胞，其中所述细菌属于埃希氏菌属。
28.如权利要求26所述的细胞，其中所述细菌是益生菌细菌。
29.如权利要求28所述的细胞，其中所述益生菌细菌选自由以下组成的组：芽孢杆菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属。
30.如权利要求1至7或9至18中任一项所述的多肽或权利要求8至18中任一项所述的多肽复合物，所述多肽或多肽复合物在任何从头蛋白质合成系统中合成。
31.如权利要求1至7或9至18中任一项所述的多肽或权利要求8至18中任一项所述的多肽复合物，所述多肽或多肽复合物还包含维生素、抗生素、激素、抗微生物肽、类固醇、益生菌、益生菌、噬菌体、几丁质、壳聚糖、B-1,3-葡聚糖、植物提取物、蛋白胨、虾粉、磷虾、藻类、B-环糊精、藻酸盐、树胶、黄蓍胶、果胶、明胶、添加剂喷雾、毒素结合剂、短链脂肪酸、中链脂肪酸、酵母、酵母提取物、糖、消化酶、消化化合物、必需矿物质、必需盐或纤维。
32.一种产生权利要求1至7或9至18中任一项所述的多肽或权利要求8至18中任一项所述的多肽复合物的方法，所述方法包括(a)在适合于从权利要求22至29中任一项所述的细胞分泌所述多肽的培养基中孵育所述细胞；以及(b)从所述培养基中纯化所述多肽。
33.如权利要求1至7或9至18中任一项所述的多肽或如权利要求8至18中任一项所述的多肽复合物，所述多肽或多肽复合物用于减少或预防家禽动物或另外的动物物种中的家禽相关的寄生虫感染。
34.权利要求1至7或9至18中任一项所述的多肽或权利要求8至18中任一项所述的多肽复合物用于减少或预防家禽相关的寄生虫从家禽物种传播至另一家禽动物或另外的动物物种的用途。
35.如权利要求34所述的用途，其中所述家禽动物是鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽子、乳鸽、鸵鸟、野鸡或鹅的物种。
36.如权利要求34所述的用途，其中所述非家禽动物物种是牛、绵羊、山羊、鱼、兔、骆驼、美洲驼、原驼、羊驼或小羊驼。
37.如权利要求34所述的用途，其中所述多肽适于经口或经直肠引入消化道中，提供给外表面(例如，作为喷雾或浸没物)，提供给动物所居住的介质(包括基于空气的介质)，通过注射提供，经静脉内提供，通过呼吸系统提供，通过扩散提供，通过内皮或上皮吸收提供，或通过诸如酵母、细菌、藻类、噬菌体、植物和昆虫的次级生物体提供给宿主。
CN202080041206.2A 2019-05-20 2020-05-19 针对家禽致病因子的抗体及其用途 Pending CN114206922A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962850386P 2019-05-20 2019-05-20
US62/850,386 2019-05-20
PCT/IB2020/000380 WO2020234642A1 (en) 2019-05-20 2020-05-19 Antibodies against disease causing agents of poultry and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114206922A true CN114206922A (zh) 2022-03-18

Family

ID=73458905

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080041206.2A Pending CN114206922A (zh) 2019-05-20 2020-05-19 针对家禽致病因子的抗体及其用途

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220242941A1 (zh)
EP (1) EP3972996A1 (zh)
CN (1) CN114206922A (zh)
BR (1) BR112021023296A2 (zh)
CA (1) CA3140739A1 (zh)
IL (1) IL288220A (zh)
MX (1) MX2021014236A (zh)
WO (1) WO2020234642A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017199094A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Novobind Livestock Therapeutics Inc. Antibodies against microorganisms and uses thereof
FR3128713A1 (fr) * 2021-10-29 2023-05-05 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Agent de liaison ayant une affinité améliorée pour la prévention et le traitement des maladies liées aux sarbecovirus
WO2023194388A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Novozymes A/S Fusion proteins and their use against eimeria
WO2023205876A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Novobind Livestock Therapeutics Inc. Antibodies against disease causing agents of plants and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010079149A1 (de) * 2009-01-09 2010-07-15 Ipk Gatersleben Fusionsantikörper
WO2017199094A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 Novobind Livestock Therapeutics Inc. Antibodies against microorganisms and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010079149A1 (de) * 2009-01-09 2010-07-15 Ipk Gatersleben Fusionsantikörper
WO2017199094A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 Novobind Livestock Therapeutics Inc. Antibodies against microorganisms and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MING YAN 等, PARASITE, vol. 25, no. 60, 26 November 2018 (2018-11-26), pages 1 - 10 *
QING LIU 等: "Preparation and initial application of monoclonal antibodies that recognize Eimeria tenella microneme proteins 1 and 2", PARASITOL RES, vol. 113, 28 August 2014 (2014-08-28), pages 4151 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2021014236A (es) 2022-01-18
WO2020234642A1 (en) 2020-11-26
IL288220A (en) 2022-01-01
BR112021023296A2 (pt) 2022-01-04
EP3972996A1 (en) 2022-03-30
CA3140739A1 (en) 2020-11-26
US20220242941A1 (en) 2022-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210269512A1 (en) Antibodies against disease causing agents of poultry and uses thereof
CN114206922A (zh) 针对家禽致病因子的抗体及其用途
JP5038591B2 (ja) 改変トランスフェリン−抗体の融合タンパク質
US20220119506A1 (en) Antibodies against aquaculture disease-causing agents and uses thereof
CN107129524A (zh) 用于抑制微生物细胞的疫苗和疫苗组分
US20220064224A1 (en) Antibodies against disease causing agents of canines and felines and uses thereof
Fawzi et al. Vaccination of lambs with the recombinant protein rHc23 elicits significant protection against Haemonchus contortus challenge
US20220119505A1 (en) Pathogen binding proteins
Nakamura et al. Anti‐PirA‐like toxin immunoglobulin (IgY) in feeds passively immunizes shrimp against acute hepatopancreatic necrosis disease
US20170196971A1 (en) Antibody guided vaccines and methods of use for generation of rapid mature immune responses
WO2017199094A1 (en) Antibodies against microorganisms and uses thereof
CN107267519B (zh) 缢蛏C1q基因、编码蛋白及其克隆方法和重组缢蛏C1q基因工程菌构建方法
US20200040067A1 (en) Anti-salmonella antibodies and uses thereof
KR101890351B1 (ko) 생쥐의 락토바실러스 존스니 및 이를 이용한 면역증진용 조성물
Zhou et al. High throughput screening of scFv antibodies against viral hemorrhagic septicaemia virus by flow cytometry
KR101969132B1 (ko) 생쥐의 락토바실러스 루테리 및 이를 이용한 면역증진용 조성물
WO2024092360A1 (en) Antibodies against aquaculture disease-causing agents and uses thereof
CN109651491B (zh) 一种能提高马抗破伤风免疫球蛋白滴度的免疫方法
RU2021137172A (ru) Антитела против болезнетворных агентов домашней птицы и их применение
CN116948043A (zh) 一种猪丹毒亚单位疫苗及其检测方法和应用
CN118027207A (zh) 靶向非洲猪瘟病毒脱氧尿苷焦磷酸酶的高亲和力纳米抗体及其制备方法与应用
CN101693105B (zh) 鱼类白细胞介素-4样重组蛋白的用途
CN104630150A (zh) 一种以Cfr蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测Cfr蛋白中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination