CN107267519B - 缢蛏C1q基因、编码蛋白及其克隆方法和重组缢蛏C1q基因工程菌构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了缢蛏C1q基因、编码蛋白及其克隆方法和重组缢蛏C1q基因工程菌构建方法，特点是缢蛏C1q基因序列如SEQIDNO.1所示；其克隆方法为根据与C1q基因同源的表达序列标签EST序列设计3’RACE的巢式引物，采用3’RACE技术扩增基因全长；缢蛏C1q基因编码蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，用分别含有BamH I位点和Xho I位点的引物扩增缢蛏C1q蛋白；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化即获得基因工程菌，优点是对脂多糖、肽聚糖、甘露聚糖具有结合能力，对大肠杆菌、鳗弧菌和副溶血弧菌有明显的凝集作用。

Description

缢蛏C1q基因、编码蛋白及其克隆方法和重组缢蛏C1q基因工 程菌构建方法
技术领域
本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种缢蛏C1q基因、编码蛋白及其克隆方法和重组缢蛏C1q基因工程菌构建方法。
背景技术
C1q(Complement 1q)是经典补体途径的靶标识别蛋白，作为一种重要识别分子并且能够启动经典补体途径，是先天和适应免疫系统之间的主要连接环节。除了作为经典补体途径的关键成分之外，C1q还涉及其他几种免疫过程，包括通过清除细胞凋亡来维持免疫耐受，细菌吞噬，逆转录病毒的中和，细胞粘附和树突状细胞，B细胞和成纤维细胞的调节。研究发现有许多非补体蛋白也含有与补体C1q分子类似的C1q球状结构域,统称为含C1q结构域蛋白(C1q domain-containing protein，C1qDC protein)。含有球状C1q结构域(C1qDC)蛋白，在C末端含有通用模式识别球状C1q结构域，可结合各种配体并引发一系列免疫应答。在结构上，C1qDC结构域的特征在于紧密的胶卷β-三明治折叠，其由C末端的
Figure GDA0002390126990000011
个残基组成，具有八个高度保守的残基。到目前为止，已经发现几种无脊椎动物C1qDC蛋白作为模式识别受体(PRR)像凝集素一样有凝集活性，可以直接与PAMPs结合并引发一系列免疫应答。许多C1qDC蛋白被认为是先天免疫中的多功能模式识别受体(PRR)，因为它们识别和结合病原体相关分子模式(PAMP)，然后引发快速增强的吞噬作用，导致有效的遏制病原体。除了PAMP之外，多种配体可以被C1qDC蛋白与其有效和通用的电荷模式识别结构域结合。包括某些逆转录病毒的包膜蛋白，脂多糖(LPS)，β-淀粉样蛋白原纤维，来自革兰氏阴性菌的肽聚糖，磷脂，凋亡细胞甚至一些急性期反应物。
C1qDC蛋白序列广泛存在于哺乳动物、低等脊椎动物及无脊椎动物中。目前，在对无脊椎动物的研究中，主要集中在海湾扇贝(Wang et al.,2012)、文蛤(Sui et al.,2012)、长牡蛎(Jiang et al.,2015)等，针对缢蛏C1q蛋白的研究不是很充分。缢蛏C1q在PAMPs结合上的优越性，为解决缢蛏养殖业病害预防，开展健康养殖和实现养殖业可持续发展具有重要意义。
缢蛏(Sinonovacula constricta)俗名蛏子、蜻子，是属于软体动物门(Mollusca)双壳纲(Bivalvia linnaeus)、帘蛤目(Veneroida)、截蛏科(Solecurtidae)，为广温广盐性海产贝类，广泛分布于我国、日本和朝鲜等国的河口或有少量淡水注入的内湾潮间带中、下区软泥滩。其仅见于西太平洋，是我国、朝鲜和日本的特产，为重要的经济软体动物，与牡蛎、蛤仔、泥蚶一起号称我国“四大养殖贝类”。由于其贝壳自壳顶至腹缘有一条微凹的斜沟，形似绳索的缢痕，因此而得名“缢蛏”。
缢蛏具有生长快、养殖周期短、易管理、产量高、效益好等养殖特点，是我国沿海虾塘和滩涂贝类主要养殖对象。近年来，养殖缢蛏病害经常出现，死亡现象时有发生，而且日趋严重，经济损失十分惨重。据报道，细菌性疾病是缢蛏养殖中近几年病害死亡的主要影响因素之一，特别是由于弧菌引起的疾病比较严重，其易侵染缢蛏个体，导致缢蛏个体的免疫防御能力下降。目前的防治方法主要是使用抗菌素和化学药物，但是抗菌素以及化学药物的长期使用诱导致病菌产生耐药性，导致抗生素失效，也会对养殖环境造成一定影响。因此，筛选特异性好，结合活性强的革兰氏阴性菌结合分子势在必行，同时，通过构建水产动物C1q基因表达工程菌，从而产生工业化、高产量的缢蛏C1q基因，从而提升缢蛏机体的免疫力，可以为缢蛏的发病提供一种解决手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种缢蛏C1q基因、编码蛋白及其克隆方法和重组缢蛏C1q基因工程菌构建方法，表达的重组C1q对脂多糖、肽聚糖以及甘露聚糖有结合活性；对大肠杆菌、副溶血弧菌以及鳗弧菌，具有明显的凝集作用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种缢蛏C1q基因，该基因为SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。该序列全长1225bp，包括744bp的开放阅读框，编码247个氨基酸，5’非编码区长258bp，3’非编码区长223bp，具有多聚腺苷酸信号，序列末端含有典型的polyA尾。
2、一种缢蛏C1q基因的克隆方法，根据与C1q基因同源的表达序列标签EST序列设计基因特异性引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体的步骤如下：
(1)通过对副溶血弧菌诱导缢蛏的cDNA文库的表达序列标签分析，发现了多条编码C1q基因的表达序列标签序列，选取编码缢蛏C1q部分片段的表达序列标签克隆；
(2)RACE引物设计：根据编码缢蛏C1q部分片段的EST克隆设计3’RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：TGTGAACGACAGTAGTGACAGCAAA，3’上游特异性引物2：ATGGGCACAGAATGACCAACTAGAC，扩增3’接头引物Adaptor3：GGCCACGCGTCGACTAGTACTT；
(3)RACE扩增获取C1Q基因全长序列，具体步骤如下：
a.总RNA提取：取缢蛏组织制备得到RNA提取液；
b.3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase试剂盒逆转录合成扩增3’-RACE的模板，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR扩增，取PCR稀释后的产物1ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增得到3’端目的条带；
c.将上述扩增产物的目的条带用胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得缢蛏C1q基因全长序列，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
上述RACE扩增反应体系：模板cDNA 1.0μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2.5μL，浓度10mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的上游特异性引物1.0μL，浓度10μM的接头引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：17.3μL；扩增条件：94℃5min，94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
4、一种缢蛏C1q基因的编码蛋白，该编码蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
利用缢蛏C1q基因编码蛋白构建重组缢蛏C1q基因工程菌的方法，步骤如下：
(1)设计PCR引物，用分别含有BamH I位点和Xho I位点的引物扩增缢蛏C1q蛋白编码序列；
(2)将克隆得到的目的基因插入pET28a(+)载体，获得重组质粒pET28a(+)-C1q；
(3)对重组质粒pET28a(+)-C1q进行诱导表达，再进行纯化即获得重组缢蛏C1q基因工程菌。
具体步骤如下：
(1)缢蛏C1q全长克隆及重组蛋白的构建与表达
a.总RNA提取：取缢蛏组织制备得到RNA提取液；
b.cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamH I位点和Xho I位点的引物扩增缢蛏C1q蛋白的编码基因，其中缢蛏C1q编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
含BamH I位点C1q上游扩增引物的基因序列如下所示：GGATCCGGTCTGCTGCCACCAGAGGAAGTC；
含Xho I位点C1q下游扩增引物的基因序列如下所示：CTCGAGCACGGTTGTGTACAGCAAGAAGC
c.PCR扩增：模板cDNA 1.0μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2.5μL，浓度10mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的上游引物1.0μL，浓度10μM的下游引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：17.3μL；扩增条件：94℃5min，94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；
d.PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后将回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e.重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Xho I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，与经同样酶切的pET28a(+)原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28a(+)-C1q重组质粒；
f.重组蛋白的表达：将阳性重组质粒pET28a(+)-C1q转化到表达宿主BL21(DE3)，再接种到卡那霉素浓度为50ug/mL的LB培养液中，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-7h，收集菌液，经10000g，4℃，离心5min，弃上清液，获得细菌沉淀物；
(2)重组蛋白的纯化
a、菌体裂解：将100mL细菌沉淀物用10mL lysis buffe重悬菌体沉淀，加入1mg/ml的溶菌酶，冰上孵育30min，超声破碎菌体，10000g，4℃，离心20min，收集上清液；
b、蛋白纯化：吸取1mL Ni-NTA SefinoseTM Resin上柱，用无菌水洗两次，再用lysis buffer平衡一次；将收集的上清液与经上柱处理的Ni-NTA SefinoseTM Resin混合，4℃混匀2h，收集流出液；用wash buffer洗脱2次，每次10mL，分别收集流出液；加入elutionbuffer每次1.25mL，洗脱2次，分别收集流出液，取每次收集的elution buffer洗脱的流出液进行SDS-PAGE电泳鉴定，分子量为24.415KDa的目的条带即为重组缢蛏C1q蛋白。
所述的lysis buffer配方如下：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，5mM咪唑，pH＝8.0；
所述的wash buffer配方如下：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，40mM咪唑，pH＝8.0；
所述的elution buffer配方如下：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH＝8.0；所述的超声破碎菌体具体破碎过程为：超声处理5s，停10s，重复6次，超声功率为30w。
5、上述重组缢蛏C1q基因工程菌的应用，其表达的重组缢蛏C1q在制备内毒素脂多糖、肽聚糖和甘露聚糖结合剂方面的作用。
6、上述重组缢蛏C1q基因工程菌的应用，其表达的重组缢蛏C1q在制备大肠杆菌、鳗弧菌和副溶血弧菌抑制剂方面的作用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明利用基因工程技术，通过3’端cDNA快速扩增(3’-RACE)的方法，首次从缢蛏中克隆得到了C1q基因cDNA序列，同时对缢蛏C1q蛋白质进行重组质粒的构建和表达，获得了一株具有对脂多糖、肽聚糖以及甘露聚糖有结合活性；对大肠杆菌、鳗弧菌、副溶血弧菌有凝集作用的重组C1q的基因工程菌，本发明优点在于：
a、利用基因工程技术获得的重组蛋白与化学合成法相比具有成本低的优点；
b、该重组蛋白具有高效的结合活性和凝集活性，通过本研究的方法将工程菌产生的C1q蛋白投放于缢蛏养殖环境中，在缢蛏自身产生C1q的基础上增加了C1q对阴性致病菌的结合能力，从而提升缢蛏机体的免疫力，可以为缢蛏感染弧菌提供一种解决手段。
附图说明
图1为缢蛏重组C1q蛋白的SDS-PAGE分析，M泳道为蛋白质分子量标准，1为PET-28a空载体，2为诱导3h的重组蛋白，3为诱导5h的重组蛋白，4为诱导7h的重组蛋白，5为纯化后的重组蛋白；
图2为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌对内毒素脂多糖的结合活性分析图；
图3为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌对内毒素肽聚糖的结合活性分析图；
图4为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌对内毒素甘露聚糖的结合活性分析图；
图5为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌对大肠杆菌的凝集效果。其中A为TBS-Ca和大肠杆菌，B为TBS-Ca、大肠杆菌和BSA，C为TBS-Ca-EDTA、大肠杆菌和重组C1q蛋白，D为TBS-Ca、大肠杆菌和重组C1q蛋白；
图6为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌对鳗弧菌的凝集效果。其中A为TBS-Ca和鳗弧菌，B为TBS-Ca、鳗弧菌和BSA，C为TBS-Ca-EDTA、鳗弧菌和重组C1q蛋白，D为TBS-Ca、鳗弧菌和重组C1q蛋白；
图7为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌对副溶血弧菌的凝集效果。其中A为TBS-Ca和副溶血弧菌，B为TBS-Ca、副溶血弧菌和BSA，C为TBS-Ca-EDTA、副溶血弧菌和重组C1q蛋白，D为TBS-Ca、副溶血弧菌和重组C1q蛋白；
图8为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌对藤黄微球菌的凝集效果。其中A为TBS-Ca和藤黄微球菌，B为TBS-Ca、藤黄微球菌和BSA，C为TBS-Ca-EDTA、藤黄微球菌和重组C1q蛋白，D为TBS-Ca、藤黄微球菌和重组C1q蛋白；
图9为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌在大肠杆菌存在下对内毒素脂多糖、内毒素肽聚糖和内毒素甘露聚糖的凝集效果。其中A为TBS-Ca和大肠杆菌，B为TBS-Ca、大肠杆菌和BSA，C为TBS-Ca-EDTA、大肠杆菌、内毒素脂多糖和重组C1q蛋白，D为TBS-Ca、大肠杆菌、内毒素脂多糖和重组C1q蛋白，E为TBS-Ca-EDTA、大肠杆菌、内毒素肽聚糖和重组C1q蛋白，F为TBS-Ca、大肠杆菌、内毒素肽聚糖和重组C1q蛋白，G为TBS-Ca-EDTA、大肠杆菌、内毒素甘露聚糖和重组C1q蛋白，H为TBS-Ca、大肠杆菌、内毒素甘露聚糖和重组C1q蛋白；
图10为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌在鳗弧菌存在下对内毒素脂多糖、内毒素肽聚糖和内毒素甘露聚糖的凝集效果。其中A为TBS-Ca和鳗弧菌，B为TBS-Ca、鳗弧菌和BSA，C为TBS-Ca-EDTA、鳗弧菌、内毒素脂多糖和重组C1q蛋白，D为TBS-Ca、鳗弧菌、内毒素脂多糖和重组C1q蛋白，E为TBS-Ca-EDTA、鳗弧菌、内毒素肽聚糖和重组C1q蛋白，F为TBS-Ca、鳗弧菌、内毒素肽聚糖和重组C1q蛋白，G为TBS-Ca-EDTA、鳗弧菌、内毒素甘露聚糖和重组C1q蛋白，H为TBS-Ca、鳗弧菌、内毒素甘露聚糖和重组C1q蛋白；
图11为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌在副溶血弧菌存在下对内毒素脂多糖、内毒素肽聚糖和内毒素甘露聚糖的凝集效果。其中A为TBS-Ca和副溶血弧菌，B为TBS-Ca、副溶血弧菌和BSA，C为TBS-Ca-EDTA、副溶血弧菌、内毒素脂多糖和重组C1q蛋白，D为TBS-Ca、副溶血弧菌、内毒素脂多糖和重组C1q蛋白，E为TBS-Ca-EDTA、副溶血弧菌、内毒素肽聚糖和重组C1q蛋白，F为TBS-Ca、副溶血弧菌、内毒素肽聚糖和重组C1q蛋白，G为TBS-Ca-EDTA、副溶血弧菌、内毒素甘露聚糖和重组C1q蛋白，H为TBS-Ca、副溶血弧菌、内毒素甘露聚糖和重组C1q蛋白；
图12为缢蛏重组C1q蛋白基因工程菌在藤黄微球菌存在下对内毒素脂多糖、内毒素肽聚糖和内毒素甘露聚糖的凝集效果。其中A为TBS-Ca和藤黄微球菌，B为TBS-Ca、藤黄微球菌和BSA，C为TBS-Ca-EDTA、藤黄微球菌、内毒素脂多糖和重组C1q蛋白，D为TBS-Ca、藤黄微球菌、内毒素脂多糖和重组C1q蛋白，E为TBS-Ca-EDTA、藤黄微球菌、内毒素肽聚糖和重组C1q蛋白，F为TBS-Ca、藤黄微球菌、内毒素肽聚糖和重组C1q蛋白，G为TBS-Ca-EDTA、藤黄微球菌、内毒素甘露聚糖和重组C1q蛋白，H为TBS-Ca、藤黄微球菌、内毒素甘露聚糖和重组C1q蛋白。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
C1q基因克隆与序列分析
(1)通过前期对副溶血弧菌诱导缢蛏cDNA文库的EST(表达序列标签)分析，发现了多条编码C1q基因的EST序列，对其中一个EST克隆进行测序分析，表明该克隆编码缢蛏C1q的部分片段；
(2)RACE引物设计：根据编码缢蛏C1q部分片段的EST克隆设计3’RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：TGTGAACGACAGTAGTGACAGCAAA，3’上游特异性引物2：ATGGGCACAGAATGACCAACTAGAC，扩增3’接头引物Adaptor3：GGCCACGCGTCGACTAGTACTT；
(3)缢蛏C1q(3)RACE扩增获取C1q基因全长序列，具体步骤如下：
a.总RNA提取：取刺缢蛏的腮和肝胰脏组织(0.2g-1g)于1.5mlRNA free离心管中，加入Trizol试剂(购于Takara公司)1.0mL，用匀浆器进行充分匀浆。4℃，12000g，离心5min，取上清，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置5min，4℃，12000g，离心15min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心5min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75％的乙醇1mL，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清后在沉淀中加入质量百分浓度为75％的乙醇1mL重悬沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b.3’-RACE扩增：将上述RNA提取液用3’-Full RACE Core Set withPrimeScriptTM RTase试剂盒(Takara公司)逆转录合成扩增3’-RACE的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR扩增，取PCR产物1ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增，得到3’端目的条带；其中RACE扩增反应体系及反应条件如下：模板1.0μL，10×PCR缓冲液(含Mg2 +)2.5μL，浓度2.5mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的3’上游特异性引物1.0μL，浓度10μM的扩增3’接头引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：17.3μL；扩增条件：94℃5min，94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；
c.将扩增产物3’端目的条带使用凝胶回收试剂盒(百泰克)回收，回收产物与载体pMD19-T(Takara公司)连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α(Takara公司)后，在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB平板培养基(LB平板培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L)中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到缢蛏C1q基因全长序列，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
最终得到的缢蛏C1q基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，该序列全长1225bp，包括744bp的开放阅读框，编码248个氨基酸，5’非编码区长258bp，3’非编码区长223bp，序列末端含有典型的polyA尾；缢蛏C1q蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该蛋白分子量为24.415KDa，等电点为5.97，其中编码序列的1-24为信号肽序列，该蛋白定位于缢蛏的细胞膜外。
具体实施例二
C1q基因全长克隆及重组蛋白的构建与表达
a.总RNA提取：取缢蛏各部分组织(0.2g-1g)于1.5mlRNA free离心管中，加入Trizol试剂(购于Takara公司)1.0mL，用匀浆器进行充分匀浆。4℃，12000g，离心5min，取上清，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置5min，4℃，12000g，离心15min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心5min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75％的乙醇1mL，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清后在沉淀中加入质量百分浓度为75％的乙醇1mL重悬沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒(Takara)转录cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，然后用带酶切位点的引物对合成的cDNA进行PCR扩增，即如下所示：
含BamH I位点C1q上游扩增引物：GGATCCGGTCTGCTGCCACCAGAGGAAGTC；
含Xho I位点C1q下游扩增引物：CTCGAGCACGGTTGTGTACAGCAAGAAGC；
c、PCR扩增：cDNA 1.0μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL，浓度10mM的dNTP2.0μL，浓度10μM的上游引物1.0μL，浓度10μM的下游引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：17.3μL；扩增条件：94℃5min，94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；
d、PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒(BioTeke)回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T(Takara公司)连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α(Takara公司)后，在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L)平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的阳性克隆质粒；
e、重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmH I和Xho I(New England Biolabs，NEB)限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，与经同样酶切的pET28(a)原核表达载体连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28(a)-C1q，将阳性重组质粒pET28(a)-C1q转化到表达宿主BL21(DE3)(Novagen公司)，再接种到卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养液(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)中，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-7h，收集菌液，经10000g，4℃，离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物。
具体实施例三
重组蛋白的纯化
a、菌体裂解：将100mL细菌沉淀物用10mL lysis buffer(咪唑浓度5mM)重悬菌体沉淀，加入1mg/ml的溶菌酶，冰上孵育30min，超声破碎菌体(超声破碎5s，停10s，共6次，功率30w，10000g，4℃，离心20min，收集上清；
b、蛋白纯化：吸取1mL Ni-NTA SefinoseTM Resin上柱，用无菌水洗两次，再用裂解缓冲液(含咪唑浓度5mM)平衡一次；将步骤(a)得到的上清液与之前经上柱处理的Ni-NTASefinoseTM Resin混合，4℃混匀2h，收集流出液，用wash buffer(咪唑浓度40mM)，每次10mL，洗脱2次，分别收集流出液，加入1.25mL elution buffer(咪唑浓度250mM)，洗脱2次，分别收集流出液。取每次收集的elution buffer洗脱的流出液进行SDS-PAGE电泳鉴定(结果如图1所示)，回收分子量为24.415KDa的目的条带(图1，箭头所示即为目的蛋白)，获得重组缢蛏C1q蛋白。
上述步骤中，
所述的lysis buffer(咪唑浓度5mM)配方：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，5mM咪唑，pH＝8.0；
所述的wash buffer(咪唑浓度40mM)配方：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，40mM咪唑，pH＝8.0；
所述的elution buffer(咪唑浓度250mM)配方：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH＝8.0。
具体实施例四
缢蛏重组蛋白的内毒素结合活性分析
a、将3种内毒素脂多糖(Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111：B4，LPS,Sigma)，肽聚糖(PGN，源叶)，甘露聚糖(Mannan from Saccharomyces cerevisiae，Sigma)分别溶于50mmol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液，终浓度为2mg/mL。取3种内毒素各20μL加入96孔板，每组设置3个重复，4℃孵育过夜；
b、将孵育过夜的3种内毒素分别用PBST缓冲液洗3次后，用200μL，5％BSA缓冲液封闭，37℃，静置1h；
c、倒掉上一步的BSA缓冲液，用PBST缓冲液洗3次，3种内毒素中分别加入具体实施例三获得的重组缢蛏C1q基因工程菌、加His标签的对照蛋白(BSA)、空白对照(0.05M，pH7.4Tris-HCl缓冲盐溶液TBS)各100μL，根据C1q蛋白浓度(1.375μg/μL)，设置5个不同的浓度组，分别为20％，40％，60％，80％，100％蛋白浓度，37℃孵育1h；
d、用PBST缓冲液洗3次，每孔加入100μLMouse Anti-His Tag单抗(1：1000)，37℃孵育1h；
e、将上一步溶液轻轻倒出，PBST洗3次，加入100μL的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:3000)，37℃孵育1h；
f、将上一步溶液轻轻倒出，PBST洗4次，加入100μL PNPP显色液(北京赛驰生物科技公司)，室温黑暗条件下孵育30min；
g、向上一步的96孔板中加入50μL，3mol/L NaOH终止液，孵育15min终止反应，405nm波长测定溶液的吸光度。
结果显示，如图2、图3和图4所示，缢蛏重组蛋白C1q对脂多糖、肽聚糖以及甘露聚糖有显著地结合活性。
具体实施例五
缢蛏重组蛋白的凝集活性分析
a、细菌FITC标记：将待标记细菌培养到指数生长中后期，4℃5000g离心10min，弃上清液，用PBS(0.01mol/L、pH 7.4)洗涤2次，4℃5000g离心10min，之后用碳酸盐缓冲液(0.5mol/L、pH 9.5)配成浓度为0.5×109cfu/mL的悬菌液，加入FITC溶液(参照说明书)，使FITC在悬菌液中的终浓度为50～100μg/mL，常温搅拌1～2h，5000g离心10min，弃上清液，用PBS洗涤2次，5000g离心10min，取沉淀的细菌用PBS配成浓度为0.5×109cfu/mL的菌悬液。标记完成后经荧光显微镜检查确认，4℃避光保存。
b、使用TBS-Ca缓冲液(50mmol L-1，Tris-HCl，50mmol L-1NaCl，10mmol L-1CaCl2，pH7.5)和TBS-Ca-EDTA(50mmol L-1，Tris-HCl，50mmol L-1NaCl，10mmol L-1CaCl2，10mmol L-1EDTA，pH7.5)分别将FITC标记的大肠杆菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、藤黄微球菌重悬，使其浓度达到1×109cell*ml-1。在酶标板中，取10μl菌悬液与25μl重组蛋白混匀。在对照组中，取10μl与25μBSA混匀。室温下孵育1h后，取10μl在荧光显微镜下观察。
c、使用TBS-Ca缓冲液(50mmol L-1，Tris-HCl，50mmol L-1NaCl，10mmol L-1CaCl2，pH7.5)和TBS-Ca-EDTA(50mmol L-1，Tris-HCl，50mmol L-1NaCl，10mmol L-1CaCl2，10mmol L-1EDTA，pH7.5)分别悬浮菌体使其浓度达到1×109cell*ml-1。在酶标板中，取10μl糖溶液(本实验所用糖及其浓度：2mg*ml-1脂多糖、2mg*ml-1肽聚糖、200mmol*L-1甘露聚糖)与25μl重组蛋白混合。室温下孵育30min后，加入10μl菌液。孵育1h后，取10μl制片于荧光显微镜下观察。
结果显示，如图5、图6、图7和图8所示，缢蛏重组蛋白C1q对大肠杆菌、鳗弧菌以及副溶血弧菌有显著地凝集活性；如图9、图10、图11和图12所示，缢蛏重组蛋白C1q对内毒素脂多糖、内毒素肽聚糖以及内毒素甘露聚糖有显著地凝集活性。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 缢蛏C1q基因、编码蛋白及其克隆方法和重组缢蛏C1q基因工程菌构建方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1225
<212> DNA
<213> 缢蛏C1q基因全长
<400> 1
TGTAAGGAGT GTTGGACCGA GTAGTTCGAA CAAGCGCTGC TTCTAAGATA GTTGAATTTC 60
CGTGCGTGTT TGTGTAAAAT TGTAGACATT TTCTGGCAAC CAGTTCTAAG TGTGGTGTAG 120
ATCACTAAAA CGTGGTCAGA GTCTGACACT CTAACAAAGC GATTTCGGAA TTGAACACTC 180
GAAAATTGGT GACATTTGGG TTATTCTGAA TCAATAGTAA CTGTCTTTTA CTGAAGACTT 240
TTTCTTGGCA GAAGATCCAT GATGCGCCAC AATTACAAAC TGCATATAGT TGCCATGGTA 300
ACGTGTATTA TATCGCAGCT GGTTCAGGGA GGTCTGCTGC CACCAGAGGA AGTCCAGACC 360
GAGGCTTCAA GTGACCGGAA ATTGATACAG CAGTTGATAG ATCGTCTGGG TGCCATGGAA 420
ACGCGAGAGG CAAGACTAGA GTCCCGTGTC AACCAACTGG AACGTACCAA CCGACAACTA 480
GAATCTGAGT TGTTCCGTCT TGACCAGTTG GCTAATCAAC AGAAAGGGCA CCTGGAGTCC 540
ATAACCAACG CGACCATCCA CGGTCATGGT CGCTCAGAGA GGGCAGTTGG ACCCAGCAAG 600
CCAATCGCGT TTACAGCATG GGCACAGAAT GACCAACTAG ACATGGGAAT CAACCAAAAC 660
ATTCAGTTCG AGCACGTCGT CAACAATGTT GGCAATGCTT ACAACTCCCA CGCCGGGATA 720
TTTGTAGCTC CAGTGACTGG GATATATGTT TTCTCTGTGA CCACGTTGGC TTATCCAGGA 780
ATACAGGCTT ACTACAGAGT TTCTGTGAAC GACAGTAGTG ACAGCAAAGC GTGGATATTT 840
GTCCGCAACT CTCCCAGCCA GGGGGAGCAA GGGGCGACAA CTGTGACCCT GATCTTGATG 900
TCGGGTGACA TCGTGTCTGT AAAGAATCTA GGACAGCATG GCGCCGTCCA CGGAGGAGGG 960
TTTACGTCAT TCTCTGGCTT CTTGCTGTAC ACAACCGTGT AAATTCCGCA GTAAAGTGAA 1020
GTTCCCTGTA CTTGGCGTAG TAAAAGATAA AAATGAACGG AGTTACACGA TTCTCTGTAA 1080
TTCGGATAGT AAACTGAACA GATGAAGAGA TAACGTTGTT CTCTGTACAG ACAACACTTA 1140
CACACGAAGG GCTGCTAACA TCATCCCCAG TAATTGTTCA GCTGAACTTA TAAATGAAAT 1200
GCATTCCAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1225
<210> 2
<211> 247
<212> PRT
<213> 缢蛏C1q基因编码蛋白
<400> 2
Met Met Arg His Asn Tyr Lys Leu His Ile Val Ala Met 13
Val Thr Cys Ile Ile Ser Gln Leu Val Gln Gly Gly Leu 26
Leu Pro Pro Glu Glu Val Gln Thr Glu Ala Ser Ser Asp 39
Arg Lys Leu Ile Gln Gln Leu Ile Asp Arg Leu Gly Ala 52
Met Glu Thr Arg Glu Ala Arg Leu Glu Ser Arg Val Asn 65
Gln Leu Glu Arg Thr Asn Arg Gln Leu Glu Ser Glu Leu 78
Phe Arg Leu Asp Gln Leu Ala Asn Gln Gln Lys Gly His 91
Leu Glu Ser Ile Thr Asn Ala Thr Ile His Gly His Gly 104
Arg Ser Glu Arg Ala Val Gly Pro Ser Lys Pro Ile Ala 117
Phe Thr Ala Trp Ala Gln Asn Asp Gln Leu Asp Met Gly 130
Ile Asn Gln Asn Ile Gln Phe Glu His Val Val Asn Asn 143
Val Gly Asn Ala Tyr Asn Ser His Ala Gly Ile Phe Val 156
Ala Pro Val Thr Gly Ile Tyr Val Phe Ser Val Thr Thr 169
Leu Ala Tyr Pro Gly Ile Gln Ala Tyr Tyr Arg Val Ser 182
Val Asn Asp Ser Ser Asp Ser Lys Ala Trp Ile Phe Val 195
Arg Asn Ser Pro Ser Gln Gly Glu Gln Gly Ala Thr Thr 208
Val Thr Leu Ile Leu Met Ser Gly Asp Ile Val Ser Val 221
Lys Asn Leu Gly Gln His Gly Ala Val His Gly Gly Gly 234
Phe Thr Ser Phe Ser Gly Phe Leu Leu Tyr Thr Thr Val 247
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 3’上游特异性引物1
<400> 3
TGTGAACGACAGTAGTGACAGCAAA 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 3’上游特异性引物2
<400> 4
ATGGGCACAGAATGACCAACTAGAC 25
<210> 5
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 扩增3’接头引物
<400> 5
GGCCACGCGTCGACTAGTACTT 22
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 含有BamH I位点C1q上游扩增引物
<400> 6
GGATCCGGTCTGCTGCCACCAGAGGAAGTC 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 含有Not I位点C1q下游扩增引物
<400> 7
CTCGAGCACGGTTGTGTACAGCAAGAAGC 29

Claims (7)

1.一种缢蛏C1q基因，其特征在于：该基因为SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。
2.一种权利要求1所述的缢蛏C1q基因的克隆方法，其特征在于：根据与C1q基因同源的表达序列标签EST序列设计基因特异性引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体的步骤如下：
(1)通过对副溶血弧菌诱导缢蛏的cDNA文库的表达序列标签分析，发现了多条编码C1q基因的表达序列标签序列，选取编码缢蛏C1q部分片段的表达序列标签克隆；
(2)RACE引物设计：根据编码缢蛏C1q部分片段的EST克隆设计3’RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：TGTGAACGACAGTAGTGACAGCAAA，3’上游特异性引物2：ATGGGCACAGAATGACCAACTAGAC，扩增3’接头引物Adaptor3：GGCCACGCGTCGACTAGTACTT；
(3)RACE扩增获取C1q基因全长序列，具体步骤如下：
a.总RNA提取：取缢蛏组织制备得到RNA提取液；
b.3’-RACE扩增：将RNA提取液用3’-Full RACE Core Set with PrimeScript TMRTase试剂盒逆转录合成扩增3’-RACE的模板，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR扩增，取PCR稀释后的产物1ul作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增得到3’端目的条带；
c.将上述扩增产物的目的条带用胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得缢蛏C1q基因全长序列，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种权利要求1所述的缢蛏C1q基因的编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白为SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
4.一种利用权利要求3所述的缢蛏C1q基因编码蛋白构建重组缢蛏C1q基因工程菌的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)缢蛏C1q全长克隆及重组蛋白的构建与表达
a.总RNA提取：取缢蛏组织制备得到RNA提取液；
b.cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamH I位点和Xho I位点的引物扩增缢蛏C1q蛋白的编码基因，其中缢蛏C1q编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
含BamH I位点C1q上游扩增引物的基因序列如下所
示：GGATCCGGTCTGCTGCCACCAGAGGAAGTC；
含Xho I位点C1q下游扩增引物的基因序列如下所
示：CTCGAGCACGGTTGTGTACAGCAAGAAGC；
c.PCR扩增：模板cDNA 1.0μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2.5μL，浓度10mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的上游引物1.0μL，浓度10μM的下游引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水：17.3μL；扩增条件：94℃5min，94℃30s、55℃45s、72℃1min、共35个循环，最后72℃延伸10min；
d.PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后将回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50ug/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e.重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Xho I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，与经同样酶切的pET28a(+)原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28a(+)-C1q重组质粒；
f.重组蛋白的表达：将阳性重组质粒pET28a(+)-C1q转化到表达宿主BL21(DE3)，再接种到卡那霉素浓度为50ug/mL的LB培养液中，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-7h，收集菌液，经10000g，4℃，离心5min，弃上清液，获得细菌沉淀物；
(2)重组蛋白的纯化
a、菌体裂解：将100mL细菌沉淀物用10mL lysis buffe重悬菌体沉淀，加入1mg/ml的溶菌酶，冰上孵育30min，超声破碎菌体，10000g，4℃，离心20min，收集上清液；
b、蛋白纯化：吸取1mL Ni-NTA SefinoseTMResin上柱，用无菌水洗两次，再用lysisbuffer平衡一次；将收集的上清液与经上柱处理的Ni-NTA SefinoseTMResin混合，4℃混匀2h，收集流出液；用wash buffer洗脱2次，每次10mL，分别收集流出液；加入elution buffer每次1.25mL，洗脱2次，分别收集流出液，取每次收集的elution buffer洗脱的流出液进行SDS-PAGE电泳鉴定，分子量为24.415KDa的目的条带即为重组缢蛏C1q蛋白。
5.根据权利要求4所述的一种重组缢蛏C1q基因工程菌的构建方法，其特征在于：
所述的lysis buffer配方如下：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，5mM咪唑，pH＝8.0；
所述的wash buffer配方如下：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，40mM咪唑，pH＝8.0；
所述的elution buffer配方如下：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH＝8.0；
所述的超声破碎菌体具体破碎过程为：超声处理5s，停10s，重复6次，超声功率为30w。
6.一种权利要求4-5中任一项所述的重组缢蛏C1q基因工程菌的应用，其特征在于：其表达的重组缢蛏C1q在制备内毒素脂多糖、肽聚糖和甘露聚糖结合剂方面的应用。
7.一种权利要求4-5中任一项所述的重组缢蛏C1q基因工程菌的应用，其特征在于：其表达的重组缢蛏C1q在制备大肠杆菌、鳗弧菌和副溶血弧菌抑制剂方面的应用。
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