CN114106170B

CN114106170B - 一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体

Info

Publication number: CN114106170B
Application number: CN202111395189.5A
Authority: CN
Inventors: 林旭聪; 田印琪; 袁琳; 谢增鸿
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-11-23
Filing date: 2021-11-23
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2041-11-23
Also published as: CN114106170A

Abstract

本发明具体涉及了一条抗大田软海绵酸的单链抗体的氨基酸序列及其表达载体。所述氨基酸序列包括：一重链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.1所示；一轻链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.2所示。编码该重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码该轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。所述单链抗体的核苷酸序列与带有组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的pET28a‑MBP‑T7‑6×His表达载体形成了可溶性重组质粒。

Description

一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体。

背景技术

大田软海绵酸（Okadaic acid, OA）是一种聚醚类海洋生物毒素，其具有一定的生物毒性，由赤潮藻类产生，是一种海洋腹泻型贝类毒素。OA不具有紫外吸收，稳定性较好，对于一般加热处理方法很难将其毒性破坏。据统计，每年赤潮毒素产生的贝类毒素中毒事件累计高达300多起。2019年在对中国渤海贝类抽样检测报告中显示，23%的贝类均测出了含有OA毒素，其中毛蚶中居多，且OA已经被证实是肿瘤促进剂，严重威胁到了人类的身体健康，因此对OA毒素检测技术的开发及完善十分重要。

免疫学检测方法具有操作简便、快速、检测成本低、通量高、对技术人员的要求低的优点，适合于现场检测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测OA，需要抗OA的抗体。以抗原免疫动物获得多抗血清是制备抗体的经典方法，但制备周期长，得到的抗体量有限。B淋巴细胞杂交瘤技术获得单克隆抗体，其特异性强，性质均一，但不易于大批量生产，特别是抗体制备中进行人为干预改进难以进行。通过基因工程技术，采用抗体分子基因重组可获得多种多样的特异性抗体，使抗体研制有了重要进展。基因工程抗体单链抗体（Singechain variable fragment, ScFv）具有低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点，经由重叠延伸PCR手段拼接成完整的scFv基因，在宿主细胞中表达获得可溶性抗体。重组单链抗体（scFv）能够保留与亲本单克隆抗体（mcAb）结构相一致的高特异性抗原识别位点。与传统的单克隆抗体相比，scFv具有重要的优势，其可操作性强，可根据研究目的进行改造，结合体外表达技术，为筛选获得高灵敏性重组抗体提供了简便而高效的操作系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括：

一重链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.1所示；

一轻链可变区的氨基酸序列，其如SEQ ID No.2 所示。

一种编码上述的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括：

一编码重链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID No.3所示；

一编码轻链可变区的核苷酸序列，其如SEQ ID No.4所示。

一种含有上述核苷酸序列，且以带有可溶性组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的pET28a-MBP-T7-6×His表达载体为初始载体的重组质粒。

本发明通过基因工程技术，提取鼠源抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞的总RNA，反转录得到cDNA后，经由PCR扩增得到重链V_H基因和轻链V_L基因，经过组装获得scFv基因片段，命名为OA-scFv。在此基础上，将上述OA-scFv基因克隆到表达载体中，进而转化至宿主E.coli感受态细胞BL21中，通过体外诱导表达获得所述抗大田软海绵酸单链抗体。其中，所述鼠源抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞的制备方法同参考文献Wang R , Zengl L , Yang H , et al.Detection of okadaic acid (OA) using ELISA and colloidal gold immunoassaybased on monoclonal antibody.[J]. Journal of Hazardous Materials, 2017, 339(oct.5):154-160.。

所述的OA-scFv抗体蛋白功能由抗体基因轻链和重链可变区的抗原决定簇互补区域 CDRs 中氨基酸序列决定，OA-scFv抗体中6个相应的CDRs 区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域（表 1）。

表 1 OA-scFv单链抗体中轻链和重链抗原决定簇互补区域 CDRs序列

将所述的OA-scFv基因克隆到带有组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的pET28a-MBP-T7-6×His表达载体中，可形成高可溶性的重组质粒。

本发明的显著优点在于：

1. 本发明借助于基因工程技术，从抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞提取RNA、转化cDNA和基因PCR，直接获取与目标抗原特异识别的核心基因及其对应的氨基酸组成，结合体外表达系统即可实现抗体表达，避免了常规生物学中需要从脾脏细胞为起点进行抗体基因库构建和抗体多轮陶筛的限制，实现了不依赖动物细胞融合的OA抗体的高效制备。

2. 传统单克隆抗体制备中需要采用动物免疫，由于动物免疫的限制，抗OA单克隆抗体难以大批量制备且抗体亲和力成熟难以人工干预。本发明通过重链V_H基因和轻链V_L基因提取，组装设计OA-scFv的基因序列，从而实现了单链抗体的抗原决定簇互补区域 CDRs信息和关键氨基酸识别位点的确定，重组单链抗体（scFv）能够保留与亲本单克隆抗体（mcAb）结构相一致的高特异性抗原识别位点；同时还可以良好地实现对抗OA抗体的基因设计和微生物体外表达，其可操作性强，从而避免了动物免疫中动物依赖和抗体亲和力成熟难的限制。

3. 本发明将所述OA-scFv基因克隆到带有组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的载体pET28a-MBP-T7-6×His载体中，可以提高表达蛋白的可溶性，可有效避免普通载体质粒构建后大部分形成不溶性包涵体蛋白、特异性能降低的不足的问题。

附图说明

图1为V_H基因电泳图。泳道M为分子量标准Marker；泳道1-3为PCR扩增的V_H基因

图2为V_L基因电泳图。泳道M为分子量标准Marker；泳道1-3为PCR扩增的V_L基因

图3为scFv基因电泳图。泳道M为分子量标准Marker；泳道1为PCR扩增的scFv基因。

图4为pET-MBP-His-OA-scFv表达产物的SDS-PAGE分析。泳道M为分子量标准Marker；泳道1为空载体诱导表达的蛋白；泳道2为表达的总蛋白；泳道3和泳道4为pET-MBP-His-OA-scFv表达蛋白。

图5为pET-MBP-His-OA-scFv表达产物的亲和作用曲线。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 OA-scFv基因的制备

1.1 总RNA提取及cDNA合成。

抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞的制备方法同参考文献Wang R , Zengl L , Yang H, et al. Detection of okadaic acid (OA) using ELISA and colloidal goldimmunoassay based on monoclonal antibody.[J]. Journal of Hazardous Materials,2017, 339(oct.5):154-160。采用ER501-01试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）提取抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞的总RNA。以提取的总RNA为模板，使用K1691 cDNA 合成试剂盒（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）合成cDNA。所有操作参照均参照试剂盒说明书进行。

1.2 引物的设计

所设计的引物如表2所示，由金唯智公司合成。

表2 引物序列表

注：M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T

1.3 ScFv的组装

将上述合成的cDNA 作为模板，采用V_H基因和V_L基因的通用引物PCR 扩增V_H基因和V_L基因；V_H基因的通用引物由一对上下游引物（上游引物V_H back和下游引物V_H for）构成，为了增加基因多样性，同时考虑到轻链的可变区基因序列保守性差的特点，V_L基因的通用引物含有一条上游引物和四条不同下游引物（上游引物V_L back、下游引物V_L for1、下游引物V_L for2、下游引物V_L for3和下游引物V_L for4）；利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的V_H基因和V_L基因，V_H基因和V_L基因大小分别为348bp和324bp。用DNA回收试剂盒（购自安诺伦(北京)生物科技有限公司）纯化或回收的基因片段，具体反应体系反应程序如下：

1.3.1 V_H、V_L基因的扩增

将上述合成的cDNA作为模板，以V_H-for、V_H-back和V_L-for、V_H-back作为引物进行PCR扩增，组装产物通过1%琼脂糖凝胶电泳实验进行验证（如图1、2），V_H大小为348bp，V_L大小为324bp，具体方法及反应体系如下：

PCR反应体系：上下游引物 (10μM)各 2.5μL，cDNA 10μL，2×PCR master mix 100μL，加入ddH₂O至反应体系总体积为200μL。

PCR反应条件：94℃预变性 5 min；94℃ 变性45 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 30s，30个循环；72℃ 延伸5 min；16℃保存。最后通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析验证。

1.3.2 Linker 的合成

为使V_H基因和V_L基因进行连接，将二者通过一段柔性片段进行连接，本发明选择SEQ ID No.16:5’-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGATCG-3’作为模板，利用PCR 扩增得到含有酶切位点（EcoR Ι和 Hind Ⅲ）的Linker，最后通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析验证，其大小为80bp左右。具体方法及反应体系如下：

反应体系为：Lin-back (10μM) 2.0μL，Lin-for (10μM) 2.0μL，Linker 40 ng，2×PCR master mix 100μL，加入ddH₂O至反应体系总体积为200μL。

反应扩增条件：94℃ 预变性5 min；94℃ 变性45 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 30s，30cycles；72℃延伸5 min，16℃保存。

1.3.3 OA-scFv的组装

单链抗体（scFv）由V_H基因、V_L基因及Linker构成，将上述扩增的重链可变区V_H基因和轻链可变区V_L基因以及含有酶切位点（EcoR Ι和 Hind Ⅲ）的Linker用于OA-ScFv的组装，组装产物通过1%琼脂糖凝胶电泳实验进行验证（如图3），其大小为750 bp，具体方法及反应体系如下：

第一轮PCR反应体系：V_H gene 35ng，V_Lgene 35ng，linker 10ng，2×PCR mastermix 10μL，加入ddH₂O至反应体系总体积为20μL。

第一轮PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性45s，63℃退火2min，72℃延伸30s，8个循环；72℃延伸5min。

在第一轮PCR的最后5 min内，向产物中快速加入体系2并进行第二轮PCR组装。

体系2：2×PCR master mix 10μL，OA-scFv-EcoRⅠ-F (10μM) 0.3μL，OA-scFv-Hind Ⅲ-R (10μM) 0.3μL，加入ddH₂O至体系2总体积为20μL。

第二轮PCR反应条件：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸5min；16℃保存10min。

用DNA回收试剂盒（购自安诺伦(北京)生物科技有限公司）纯化回收的基因片段，按照pMD18-T simple载体使用说明，通过T-A克隆系统将OA-scFv基因克隆到pMD18-Tsimple载体中，将重组克隆载体转化至E.coliDH5α感受态细胞，经培养后提取质粒DNA，并进行酶切验证及测序鉴定，所述OA-scFv基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3（重链可变区基因）和SEQ ID NO.4（轻链可变区基因）所示。以测序正确的菌液，采用质粒抽提试剂盒（Omega Inc., USA）抽提质粒作为模板，使用OA-scFv-EcoRⅠ-F和OA-scFv-Hind Ⅲ-R引物对OA-scFv基因进行PCR扩增，具体反应体系反应程序如下：

PCR反应体系：2×PCR master mix 100μL，Pfu polymerase (5U/μL) 0.5μL，模板5μL，OA-scFv-EcoRⅠ-F (10μM) 2.5μL，OA-scFv-Hind Ⅲ-R (10μM) 2.5μL，加入ddH₂O至反应体系总体积为200μL。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min ；16℃保存10min。

实施例2 pET-MBP- His-OA-scFv表达载体构建及表达鉴定

2.1 pET-MBP- His -OA-scFv表达载体的构建

将OA-ScFv基因用 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ 双酶切后，采用琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶回收试剂盒（购自ThermoFisher Scientific公司）回收酶切产物。将含有可溶性标签麦芽糖结合蛋白的pET28a-MBP-T7-6×His载体（购自武汉生物科技有限公司）同样经EcoRⅠ和Hind Ⅲ 双酶切后，采用琼脂糖凝胶电泳回收大片段。将OA-ScFv基因酶切产物片段，与经同样双酶切的pET28a-MBP-T7-6×His载体于16℃连接反应2h（或4℃连接反应过夜），构建重组质粒pET-MBP-His-OA-scFv。

2.2 重组质粒的转化及重组蛋白的表达与纯化

将重组质粒pET-MBP-His-OA-scFv转化于E.coli感受态细胞BL21中，加入900 μL的LB液体培养基，在37℃摇床内震荡培养至菌液OD值达到0.5，以4000 r/min的转速离心3min，沉淀菌体。保留100 μL上清液轻吹重悬沉淀菌体，将转化的菌液均匀涂布于LB-K⁺平板（卡那青霉素终浓度为100μg/mL）或LB-A⁺平板（氨苄青霉素终浓度为100μg/mL）上，37℃恒温孵育箱中过夜，挑取单菌落于含对应浓度抗生素的LB液体培养基中进行扩大培养。PCR及酶切鉴定均为阳性的菌落进行基因序列测定。

将含有重组质粒pET-MBP-His-OA-scFv的E.coli BL21菌液（OD₆₀₀值0.8）按1vol%的接种量分别接种至含K⁺的LB液体培养基（卡那青霉素终浓度为100μg/mL）中或含A⁺抗生素的LB液体培养基（氨苄青霉素终浓度为100μg/mL）中，在37℃摇床中进行扩大培养。当菌液OD₆₀₀值达到0.8时，向其中加入100μL 0.024 g/mL的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），在16℃、180 r/min条件下过夜诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，即得到抗大田软海绵酸单链抗体。SDS-PAGE 分析可溶性抗体蛋白的表达情况（如图4）。

2.3 抗大田软海绵酸单链抗体活性鉴定

采用i-ELISA对上述抗大田软海绵酸单链抗体的活性进行初步验证。

以包被1μg/mL的OA-BSA抗原（OA-BSA抗原制备方法同参考文献Wang R , Zengl L, Yang H , et al. Detection of okadaic acid (OA) using ELISA and colloidalgold immunoassay based on monoclonal antibody.[J]. Journal of HazardousMaterials, 2017, 339(oct.5):154-160）的酶标孔为实验组，设置包被1% PBSB（0.1 MPBS缓冲液(pH 7.40) +1wt%BSA）的酶标孔为阴性对照组，4℃过夜后以1% PBSB为封闭液37℃封闭 2h。甩干后，将抗大田软海绵酸单链抗体用1% PBSB稀释为不同浓度，按100 μL/孔加入至酶标孔中 37℃孵育 1h，PBST洗涤液（1L 1×PBS缓冲液(pH 7.40) + 500ulTween-20）清洗后之后按100 μL/孔加入HRP-His-Tag二抗（购自上海翊圣生物科技有限公司）37 ℃孵育1 h。最后每孔加入 H₂O₂-TMB显色液在37 ℃保温 10~15min，用2M硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定OA-BSA抗原与不同浓度的抗体作用后OD₄₅₀值，对实验数据进行Logistic曲线拟合，按照亲和常数Kaff测定公式计算抗体的亲和力，结果如图5。

其中：[Ab]表示抗原浓度为[Ag]时，在50%最大OD₄₅₀值处的抗体浓度；

[Ab]_t表示抗原浓度为[Ag]_t时，在50%最大OD₄₅₀值处的抗体浓度；

n表示[Ab]与[Ab]_t的比值。

实验结果

（1）抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列

抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列如表3所示。

表3氨基酸序列表

（2）抗大田软海绵酸单链抗体的功能性表达

如图4所示，在70 kDa处观察到 pET-MBP-His-OA-scFv表达的抗体蛋白条带，与理论蛋白大小一致，实现高可溶性表达。

图5为pET-MBP-His-OA-scFv表达产物的亲和作用曲线，亲和常数Kaff数值大小在10⁶水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种抗大田软海绵酸单链抗体的氨基酸序列及其表达载体

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Ile Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Asn Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Arg Asp Ala Gly Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Arg Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 346

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggtcaaac tgcagcagtc aggacctgac ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acttgcactg tctctgtttt tcattaatca gctatgtgtg cactgggttc gccagtctcc 120

aggaaagggt ctggagtggc tgggaataat atgggctggt ggaagcacaa attataattc 180

ggccctcatg tccagactga acatcaacaa agacaactcc aagagccaag ttttcttaaa 240

gatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catgtactac tgtgccagag ggagggacgc 300

cgggctcgtt tactgggggc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca 346

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacattgagc tcacccagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct 60

ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gactacttac actggtatcg acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttctcaat ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca gtatcaatag tgtggaacct 240

gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaaat ggtcacagct ttcctccgac gttcggtggg 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggtsmarct gcagsagtcw gg 22

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaggagacg gtgacggtgg tcccttggcc cc 32

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacattgagc tcacccagtc tcca 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgtttgatt tccagcttgg tgcc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccgttttatt tccagcttgg tccc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgttttatt tccaactttg tccc 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccgtttcagc tccagcttgg tccc 24

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttagaattca tggcccaggt caaactgcag c 31

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

actaagcttc cgtttatttc cagcttggtg cc 32

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gggaccacgg tcaccgtctc ctca 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tggagactgg gtgagctcaa tgtc 24

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggag gatcg 45

Claims

1.一种抗大田软海绵酸单链抗体，其特征在于：包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述的抗大田软海绵酸单链抗体的核酸，其特征在于：包括编码所述抗大田软海绵酸单链抗体重链可变区的核酸和编码所述抗大田软海绵酸单链抗体轻链可变区的核酸；所述编码抗大田软海绵酸单链抗体重链可变区的核酸的序列如SEQ IDNO.3所示，所述编码抗大田软海绵酸单链抗体轻链可变区的核酸的序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种含有如权利要求2所述的核酸，且以带有可溶性组氨酸标签麦芽糖结合蛋白的pET28a-MBP-T7-6×His表达载体为初始载体的重组质粒。