CN107973857A

CN107973857A - 一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用

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Publication number: CN107973857A
Application number: CN201711219097.5A
Authority: CN
Inventors: 罗砚曦; 阎辉
Original assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2037-11-28
Also published as: CN107973857B

Abstract

本发明公开了一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用，该重组融合蛋白包括冰核蛋白N端结构域、荧光蛋白、抗性蛋白和人存活素蛋白或其突变体。本发明以冰核蛋白N端结构域为细菌表面锚定元件使重组融合蛋白中人存活素蛋白或其突变体通过INP表面展示系统在细菌表面活性表达，解决了现有技术中外源蛋白在大肠杆菌细胞内表达需涉及破菌纯化等繁杂的后续步骤的问题，为制备进一步研制关于人存活素蛋白或其突变体的肿瘤标志物和疫苗奠定了基础。

Description

一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用。

背景技术

当前，恶性肿瘤仍然是极大危害人类生命健康的严重疾病。尽管近年来随着肿瘤生物学和免疫学等基础研究的进步，肿瘤手术、化疗、放疗及生物治疗的疗效在某些类型的肿瘤中已经有显著提高，但肿瘤患者生存率提高的关键仍有赖于肿瘤的早期发现和早期诊断。而未来肿瘤早期预防，则有赖于研制有效的肿瘤疫苗。

肿瘤诊断的关键是发现适当的肿瘤标志物，这其中肿瘤抗原及其相应抗体是重要的肿瘤诊断标志物。目前在临床上，检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)已广泛用于诊断肝癌和消化道肿瘤及其预后监测。然而，迄今为止，具有实用价值的广谱肿瘤标志物仍十分罕见。

存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员之一，它广泛表达于几乎所有的肿瘤细胞，而在大多数正常细胞却未见表达(Andersen MH,et al.The universalcharacter of the tumor-associated antigen survivin.Clin Cancer Res.2007Oct15；13(20):5991-4)；存活素是一高度特异的广谱肿瘤相关抗原。

大量实验证明，检测体液中的存活素抗原或抗体，对肿瘤诊断及预后判断，具有重要价值(Tian P,et al.Diagnostic value of survivin for malignant pleuraleffusion:a clinical study and meta-analysis.Int J Clin Exp Pathol.2014Aug 15；7(9):5880-7)。例如，马丽等采用原核系统表达和纯化人存活素蛋白，建立基于存活素融合蛋白的间接ELISA方法，对89例健康志愿者、215例非小细胞肺癌患者以及20例肺部良性疾病患者的血清样本进行检测。结果表明，间接ELISA方法检测存活素自身抗体在非小细胞肺癌患者血清中的阳性率为19.5％，特异性为88.9％，存活素自身抗体与非小细胞肺癌患者的肿瘤大小、远处转移间存在相关性(P<0.05)(马丽等.非小细胞肺癌患者中Survivin抗体的临床意义及诊断价值.中国肺癌杂志，2010；13:706-712)。

开发基于存活素抗体的检测系统以辅助肿瘤诊断，需采用基因工程方法获取大量纯化的存活素蛋白。如上所述，迄今为止多采用原核(主要是大肠杆菌)表达系统表达纯化存活素蛋白，但这一过程需经繁复的破菌处理和后续纯化步骤，往往还需繁琐的蛋白质变性-复性步骤，耗时费力，事倍功半。

在细菌表面展示系统中，采用冰核蛋白(Ice Nucleation Protein，INP)作为锚定蛋白的系统是一个有效的表面展示系统。INP是存在于丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、欧文氏菌(Erwinia)和荧光假单胞菌(P.flurorescens)等细菌菌种中的一种分泌型表面蛋白，可加速纯水的冰晶形成。大量实验证明，将目标蛋白与INP片段融合后在大肠杆菌和乳酸菌等宿主菌表达，可将这些外源蛋白有效展示/表达于这些宿主菌的表面。例如，申请公布号为CN 106754610A的发明专利申请文献中公开将谷氨酸脱羧酶的编码基因与INP融合并克隆进表达载体，转化感受菌后，可将谷氨酸脱羧酶有效展示于大肠杆菌表面。又如，郭恒等将编码狂犬病毒(Rabies virus，RV)主要免疫保护性抗原糖蛋白G基因片段融合到INP基因的N端，构建表面展示栽体pET28aINP-RVG；转化大肠埃希茵BL21(DE3)后，16℃低温诱导表达，重组蛋白在大肠埃希茵表面成功展示。为进一步研制基于沙门茵的多抗原表位展示性重组疫苗、新型狂犬病疫苗奠定了基础(郭恒，刘娟，李慧萍等.基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白细菌表面展示.动物医学进展，2010，31(S)：51-54)。

发明内容

本发明针对现有技术中外源蛋白在大肠杆菌细胞内表达需涉及破菌纯化等繁杂的后续步骤的不足，提供了一种基于细菌表面展示系统的以冰核蛋白N端结构域为细菌表面锚定元件的重组融合蛋白及其应用，该重组融合蛋白能够使广谱肿瘤抗原人存活素蛋白或其突变体通过INP表面展示系统在细菌表面成功表达。

一种重组融合蛋白(以下简称“融合蛋白”)，包括冰核蛋白N端结构域、荧光蛋白、抗性蛋白以及人存活素蛋白或其突变体。

进一步地，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白；抗性蛋白为Zeocin抗性蛋白；人存活素突变体为人存活素T34A突变体、人存活素D52A突变体或人存活素C84A突变体。

其中，冰核蛋白N端结构域提供细菌表面锚定功能，能够使融合蛋白锚定和展示在细胞表面；红色荧光蛋白(mCherry)提供荧光示踪功能；Zeocin抗性蛋白提供药物抗性筛选功能；人存活素蛋白或其突变体作为外源目的融合蛋白的主体，可作为肿瘤标志物和潜在肿瘤治疗性疫苗的组分。

上述各元件之间直接连接或者通过连接肽进行连接。优选的，所述的重组融合蛋白由冰核蛋白N端结构域、红色荧光蛋白、Zeocin抗性蛋白、人存活素突变体依次连接组成。

为了融合蛋白纯化的方便，可以使用亲和纯化标签。作为优选，所述的重组融合蛋白还包括组氨酸标签序列；更优选，所述组氨酸标签序列的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

进一步地，所述的重组融合蛋白，包括冰核蛋白N端结构域、荧光蛋白、抗性蛋白和人存活素突变体；其中，编码所述冰核蛋白N端结构域的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；编码荧光蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；编码抗性蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；编码人存活素突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

更进一步地，所述的重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了一种编码所述重组融合蛋白的基因。

本发明还提供了包含所述基因的重组载体、转化子和细菌表面展示系统。

所述重组载体包括表达载体和重组融合蛋白基因；其中，所述表达载体为pET30A。所述转化子的宿主细菌为大肠杆菌。

编码上述重组融合蛋白的融合基因的构建主要通过重叠PCR完成；以下述内容为例，基因的构建和检测的主要步骤包括：

(1)分别设计特异性引物，从已经有的质粒模板Lego-c/Z中将红色荧光蛋白(mCherry)基因和Zeocin抗性蛋白基因的融合基因CHY-Zeo扩增出来；将人存活素突变体基因(Sur3m)从已有的质粒模板p3.1-Sur3m中扩增出来，酶切后再与CHY-Zeo连接，构成CHY-Zeo-Sur3m三连体融合基因。

(2)设计特异性引物，将INP-N基因从已有的质粒模板PMPL003中扩增出来，酶切后插入pET30a原核表达载体，构建表面展示载体pET30A-INP；

(3)将上述CHY-Zeo-Sur3m三连体融合基因插入表面展示载体pET30A-INP中，构建表达质粒pET30A-INP-CHY-Zeo-Sur3m。

(4)将上述表达质粒转化感受态大肠杆菌，采用IPTG诱导目的蛋白表达，然后分别检测重组菌预期的红色荧光和人存活素表面展示的免疫学特征，进而实现人存活素突变体的检测。

本发明所述重组融合蛋白可以用于制备肿瘤标志物和抗肿瘤DNA疫苗，以及应用在影像学中。

本发明将人存活素以融合蛋白方式展示(表达)于细菌表面。蛋白质在细菌表面展示的策略可克服常规蛋白质原核表达中涉及的繁琐问题，该方法系将被表达的目标蛋白质通过与某些特定蛋白载体的融合而“锚定”于细菌表面，从而有利于通过简单的受体菌的培养表达目标蛋白，并通过其与受体菌表面的“锚定”和简单的重组菌低速离心步骤就可将目标蛋白从繁杂的环境中纯化出来。

更重要的是，蛋白质在细菌表面展示直接解决了在免疫检测和蛋白质相互作用(包括酶促反应)实验中靶蛋白的“固相化”步骤。另一方面，在蛋白质细菌表面展示系统中，目标蛋白与受体菌表面复杂的菌体蛋白偶联，其中某些菌体蛋白(如细菌的鞭毛蛋白)具有强效分子佐剂效应，因此，在疫苗开发中，目标蛋白作为免疫原的细菌表面展示可大幅增强疫苗的免疫效应。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以冰核蛋白N端结构域为细菌表面锚定元件使重组融合蛋白中人存活素蛋白或其突变体通过INP表面展示系统在细菌表面活性表达，解决了现有技术中外源蛋白在大肠杆菌细胞内表达需涉及破菌纯化等繁杂的后续步骤的问题，为制备进一步研制关于人存活素蛋白或其突变体的肿瘤标志物和疫苗奠定了基础。

附图说明

图1为实施例1中人存活素突变体融合蛋白(CHY-Zeo-Sur3m)的融合基因的构建流程图。

图2为实施例2中INP表面展示载体(pET-INP)的构建流程图。

图3为实施例3中重组质粒(pET-INP-CHY-Zeo-Sur3m)构建的分子克隆流程图。

图4为重组人存活素融合蛋白(INP-CHY-Zeo-Sur3m)的分子结构及各组分相对位置的示意图。

图5为重组质粒pET-INP-CHY-Zeo-Sur3m的图谱。

图6为实施例4中重组质粒pET-INP-CHY-Zeo-Sur3m转化菌在IPTG诱导下荧光强度随时间的变化情况。

图7为实施例4中胰蛋白酶消化实验的结果。

图8为实施例4中完整细胞ELISA实验的结果。

图9为实施例4中免疫荧光实验的结果；

其中，A1为重组菌经FITC标记的二抗孵育后在荧光显微镜的红荧光波长下观察结果；A2为重组菌经二抗孵育后在荧光显微镜的绿荧光波长下观察结果；B1为重组菌经一抗和二抗分别孵育后在荧光显微镜的红荧光波长下观察结果；B2为重组菌经一抗和二抗分别孵育后在荧光显微镜的绿荧光波长下观察结果。

具体实施方式

实施例1重组人存活素突变体融合蛋白(CHY-Zeo-Sur3m)的融合基因的构建1、扩增红色荧光蛋白(mCherry)基因和Zeocin抗性蛋白基因的融合基因CHY-Zeo

以质粒Lego-c/Zeo(Weber K,Mock U,Petrowitz B,Bartsch U,FehseB.Lentiviral gene ontology(LeGO)vectors equipped with novel drug-selectablefluorescent proteins:new building blocks for cell marking and multi-geneanalysis.Gene Therapy[J].2010,17,511-520)为模板，设计上、下游引物，扩增出CHY-Zeo片段(其中，红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2；Zeocin抗性蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3)；

其中，上、下游引物分别为：

上游引物bg-cherry2：GGAAGATCTGCTAGCTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG，下划线标记BglII酶切位点；

下游引物zeo-speI：CCGGAATTCATTAAAGCTTCTCGAGATGCATCATATGACTAGTGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG，下划线标记SpeI酶切位点。

2、扩增存活素突变体基因Sur3m

以含人存活素基因片段的质粒p3.1-Sur3m(该质粒由本发明人前期实验获得，质粒骨架为pcDNA3.1)，为模板，设计第二对引物，扩增出Sur3m片段(Sur3m片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4)；Sur3m基因片段委托生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成。

其中，上、下游引物分别为：

上游引物Suv-Eco：TATCAGAATTCTTAGTGATGGTGGTGGTGATGATCCATGGCAGCCAGCTGC，下划线标记EcoRI酶切位点；

下游引物Suv-lap：AAGATACTAGTGGTGCCCCGACGTTGC，下划线标记SpeI酶切位点。

上述两步扩增的具体流程相同，步骤如下：

(1)PCR的反应体系：

注：引物1和引物2指上、下游引物。

(2)PCR的反应程序：

①94℃预变性2min；②94℃变性50S；③55℃退火30S；④72℃延伸2min30s；⑤再进入②步骤；重复30个循环，72℃延伸10min。

(3)取2μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪观察记录结果。

(4)PCR产物纯化的过程：

①取50μL PCR产物，加入5倍体积的结合液，混匀后加入吸附柱中静置2min，10000×g离心1min，弃去流出液；

②加入650μL洗涤液，10000×g离心1min，弃去流出液；

③8000×g离心1min，去除残留的洗涤液；

④将吸附柱置于一干净的1.5mL离心管中，在柱的中央加入30μL预热至65℃的洗脱液，室温静置2min，10000×g离心2min；

(5)利用限制性内切酶SpeI酶切PCR纯化产物：

其中，酶切CHY-Zeo片段的PCR纯化产物的反应体系，如下：

酶切Sur3m片段的PCR纯化产物的反应体系，如下：

各组分混合均匀，低速离心，37℃酶切1小时。

酶切产物跑1％的琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯(300-360nm)下切胶，参照生工公司切胶回收试剂盒说明书回收，步骤如下：

①将带有目的片段的凝胶块转移至1.5mL离心管(离心管已称重)中，称重得出凝胶块的重量，按100mg/400μL加入Binding Buffer，于50℃温浴至凝胶完全融化。

②将溶胶液全部转移至吸附柱中，8000×g离心30s，弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内。

③用500μLWash buffer(已用无水乙醇稀释的)至吸附柱中，9000×g离心30s。

④重复步骤3一次。

⑤空吸附柱9000×g离心1min以甩干柱子基质残余的液体.

⑥把吸附柱装在一个干净的1.5mL离心管上，加入30μL的预热至65℃的ElutionBuffer到吸附膜上，静置1min，9000×g离心1min，洗脱DNA。

将切胶纯化产物取2μL跑1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察记录结果。

3、制备CHY-Zeo-Sur3m三连体融合基因

通过T4连接酶将CHY-Zeo片段与Sur3m片段连接起来，具体反应体系如下：

上述反应体系下，22℃反应1h，65℃灭活20分钟。

再以上述步骤获得的连接产物作为模板，以bg-cherry2为上游引物，Suv-Eco为下游引物，经Taq酶催化，进行PCR扩增反应，具体反应体系如下：

反应程序：

①94℃预变性2min，②94℃变性50S，③55℃退火30S，④72℃延伸2min，⑤再进入②步骤，重复30个循环，72℃延伸10min。

取所有的反应产物，跑1％琼脂糖凝胶电泳，长波下观察条带，并将目的条带(大小约1600bp)切下，得到CHY-Zeo-Sur3m三连体融合基因。

切胶纯化过程如下：

③用500μL Wash buffer(已用无水乙醇稀释的)至吸附柱中，9000×g离心30s。

④重复步骤3一次。

⑤空吸附柱9000×g离心1min以甩干柱子基质残余的液体.

实施例2INP表面展示载体(pET-INP)的构建

以质粒PMPL003(Jianlin Dou,Janet Daly,Zhiming Yuan,et al.BacterialCell surface display:a method for studying Japanese Encephalitis VirusPathogenicity.Jpn.J.Infect.Dis[J].2009,62(5):402-408)为模板，设计上、下游引物，扩增出INP片段(INP片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1)。

其中，上、下游引物分别为：

上游引物Nde-inp：GGAATTCCATATGGATATCGGATCCATGGCTCTCGACAAGGCGT，下划线标记为NdeI酶切位点；

下游引物XhoI-Nd2：CCGCTCGAGATTAGAATTCACTAGTAGATCTCGGGCCTTTGCTGCCGTGATTGTCGCCACTCAACG，下划线标记XhoI酶切位点。

上述PCR反应体系如下：

PCR反应程序：

①94℃预变性2min，②94℃变性50S，③55℃退火30S，④72℃延伸1min20s，⑤再进入②步骤，重复30个循环，72℃延伸10min。

取2μLPCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪观察记录结果。

PCR产物纯化的过程：

①取50μL PCR产物，加入5倍体积的结合液，混匀后加入吸附柱中静置2min，10000×g离心1min，弃去流出液。

②加入650μL洗涤液，10000×g离心1min，弃去流出液。

③8000×g离心1min，去除残留的洗涤液。

④将吸附柱置于一干净的1.5mL离心管中，在柱的中央加入30μL预热至65℃的洗脱液，室温静置2min，10000×g离心2min。

利用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切PCR纯化产物和pET30a载体；其中，酶切INP片段的PCR纯化产物的反应体系如下：

酶切pET30a载体的反应如下：

各组分混合均匀，低速离心，37℃酶切1小时。

④重复步骤3一次。

⑤空吸附柱9000×g离心1min以甩干柱子基质残余的液体.

通过T4连接酶将上述经过酶切得到的INP片段与pET30a连接起来，具体反应体系如下：

在上述反应体系下，22℃反应1h，65℃灭活20分钟。

转化反应：

①将感受态细胞E coli DH5α从-70℃冰箱取出置冰中融化。

②超净台中取4μL连接产物加入100μL感受态细胞中，冰浴30min。

③于42℃热激90s，然后冰浴3min。

④加入900μL预热至37℃的LB培养基，放37℃摇床，200rpm，1h。

⑤从摇床中取出转化物，3000rpm，离心5min，弃去900μL培养液，用剩余的100μL培养液重悬菌体，将之涂布在预热含卡那霉素50μg/mL的LB agar平板上，待干。

⑥将LB平板倒置放入37℃恒温箱过夜，次日早晨观察结果。

菌落PCR验证：第二天从长满菌落的LB平板上，挑取菌落进行菌落PCR验证，挑取过的菌落做好标记，反应体系如下：

反应程序：

①94℃预变性2min，②94℃变性50S，③55℃退火30S，④72℃延伸1min，⑤再进入②步骤，重复30个循环，72℃延伸10min。

取5μL PCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪观察记录结果。

重组质粒的提取：将菌液PCR验证为阳性的菌落，接种至3mL含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃摇床，220rpm培养过夜。次日，取菌液，按照生工质粒小提试剂盒说明书提取质粒，步骤如下：

1)取3mL菌液，分两次8000×g离心2min，弃上清。

2)加入250μL Buffer P1，振荡器充分重悬。

3)加入250μL Buffer P2，立即温和颠倒5-10次混匀，室温静置2-4min。

4)加入350μL Buffer P3，立即温和颠倒5-10次混匀。

5)12000×g离心5-l0min，将上清液移入吸附柱，8000g×g离心30s，倒掉收集管中液体。

6)加入500μL Wash Solution，9000×g离心30s，倒掉收集管中液体。

7)重复步骤6一次。

8)空吸附柱9000×g离心1min。

9)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管，加入50μL预热至65℃的ElutionBuffer到吸附膜中央，静置1min，离心1min，保存管中DNA溶液。

将离心后溶液保存至-20℃冰箱，取2μL质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察记录结果。

实施例3重组质粒pET-INP-CHY-Zeo-Sur3m的构建

利用限制性内切酶BglII、EcoRI酶切融合片段CHY-Zeo-Sur3m的纯化产物和质粒pET-INP。

酶切融合片段CHY-Zeo-Sur3m的纯化产物的反应如下：

质粒pET-INP的酶切反应体系如下：

各组分混合均匀，低速离心，37℃酶切1小时。

④重复步骤3一次。

⑤空吸附柱9000×g离心1min以甩干柱子基质残余的液体.

通过T4连接酶将融合片段与质粒载体连接起来，反应体系如下：

22℃反应1h，65℃灭活20分钟。

转化反应：

①将感受态细胞E coli DH5α从-70℃冰箱取出置冰中融化。

③于42℃热激90s，然后冰浴3min。

④加入900μL预热至37℃的LB培养基，放37℃摇床，200rpm，1h。

⑥将LB平板倒置放入37℃恒温箱过夜，次日早晨观察结果。

反应过程：

重组质粒的提取：将菌液PCR验证为阳性的菌落，接种至3mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃摇床，220rpm培养过夜。次日，取菌液，按照生工质粒小提试剂盒说明书提取质粒，步骤如下：

1)取3mL菌液，分两次8000×g离心2min，弃上清。

2)加入250μL Buffer P1，振荡器充分重悬。

4)加入350μL Buffer P3，立即温和颠倒5-10次混匀。

6)加入500μL Wash Solution，9000×g离心30s，倒掉收集管中液体。

7)重复步骤6一次。

8)空吸附柱9000×g离心1min。

重组质粒经菌落PCR验证后，送上海生工公司测序验证。

实施例4融合蛋白INP-CHY-Zeo-Sur3m的表达及展示

1、融合蛋白INP-CHY-Zeo-Sur3m的诱导表达

①挑取转化重组质粒pET-INP-CHY-Zeo-Sur3m平板上的1个单菌落，接种于3mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃摇床，200rpm振荡培养过夜；

②按1:100将过夜培养的细菌菌液接种到新鲜的含50mg/L卡那霉素和50mg/L博来霉素的LB液体培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.2mmol/L，摇床25℃，200r/min，诱导24h，分别在第0h、2h、4h、6h、8h、24h取1ml菌液离心弃上清后用PBS洗涤2次，最后用200μl PBS重悬菌体，测荧光强度(RFU/OD)，结果如图6所示。

由图6可知，由于融合基因中的Cherry基因片段可表达红荧光蛋白，因此通过融合蛋白的荧光检测可证明与其融合的目的蛋白的表达，且荧光强度随着诱导时间的增加而增强。

2、胰蛋白酶消化实验

①将重组菌接种于3mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃摇床，200rpm振荡培养过夜；

②按1:100将过夜培养的细菌菌液接种到新鲜的含50mg/L卡那霉素和50mg/L博来霉素的LB液体培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6时加入IPTG使其终浓度为0.2mmol/L，摇床25℃，200r/min，诱导8h；

③取菌液500μl，5000g离心5min弃上清，用1mLPBS洗涤两次，得到的菌体沉淀用500uL含0.2％EDTA的胰蛋白酶重悬，37℃反应0-5min，反应后立即插入冰中，并加入500uL含10％新生牛血清(FCS)的DMEM培养液终止消化；

④用PBS将上述反应之后收集的菌体洗涤两遍，6000g离心3min，沉淀用100uL的PBS重悬，放入酶标板测荧光强度，无荧光表达的pET30a和表达红色荧光蛋白的pCBMCZ作为对照，结果如图7所示。

由图7可知，展示在菌体表面的融合蛋白(INP-CHY-Zeo-Sur3m)经胰蛋白酶消化后结构被破坏，导致荧光表型受损，随消化时间延长荧光强度随之降低，而未展示到菌体表面的荧光蛋白(PCBMCZ)以及无报告基因Cherry的菌体(pET30a)不会受到细胞外胰蛋白酶的影响，从而证明存活素融合蛋白在菌体内表达并且在细菌表面展示成功。

3、完整细胞ELISA实验

②按1:100将过夜培养的细菌菌液接种到新鲜的含50mg/L卡那霉素和50mg/L博来霉素的LB液体培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6时加入IPTG使其终浓度为0.2mmol/L，摇床25℃，200r/min，诱导过夜；

③调整菌液OD600＝1，取200ul菌液离心收集菌体，并用PBS洗涤两遍，得到的菌体沉淀用1mL 4％多聚甲醛重悬，室温下反应30min，反应完成后用PBS洗两遍，6000g离心3min弃上清。加入1:200稀释的一抗(存活蛋白抗体)，混匀后室温下反应1h，反应完成后用PBS洗两遍，6000g离心3min弃上清。加入1:200稀释的二抗(羊抗小鼠IgG-FITC)，混匀后室温下反应1h，反应完成后用PBS洗5遍，最后用100uL PBS重悬菌体，525nm处测荧光强度，另取一份菌液除了不加一抗外，其余做相同处理。此外用pET30a作为阴性对照，结果如图8所示。

由图8可知，由于使用的是未经破碎的诱导后的完整的重组菌进行包被，只有表面展示人存活素蛋白抗原的重组菌才可被存活素蛋白抗体识别，进而与二抗羊抗小鼠IgG-FITC结合，说明我们构建的重组融合蛋白成功展示在细胞表面；不加一抗检测的阴性对照和空载体检测的阴性对照均为阴性证明本检测系统的特异性好。

4、免疫荧光实验

③离心收集菌体，并将菌体重悬于含10g/L牛血清白蛋白的PBS中，调整OD600为1.0，于室温放置30min，加入1:200稀释的一抗(存活蛋白抗体)，室温放置1.5h，阴性对照不加一抗(存活蛋白抗体)。PBS洗涤菌体后，加入1:200稀释的二抗(羊抗小鼠IgG-FITC)，室温下放置1.5h，最后将菌体用PBS洗涤5次，在荧光倒置显微镜下观察，结果如图9所示。

由图9可知，导入pET30A-INP-CHY-Zeo-Sur3m的重组菌经过一抗和二抗孵育后，展示在细菌表面的存活素融合蛋白与FITC标记的二抗结合，可观察到绿荧光(B2)，而阴性对照仅能观察到细菌本身所发出的红荧光(A1)，说明重组蛋白在细菌表面展示成功。

序列表

<110> 浙江省医学科学院

<120> 一种基于细菌表面展示系统的重组融合蛋白及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctctcg acaaggcgtt ggtgctgcgt acctgtgcaa ataacatggc cgatcactgc 60

ggccttatat ggcccgcgtc cggcacggtg gaatccagat actggcagtc aaccaggcgg 120

catgagaatg gtctggtcgg tttactgtgg ggcgctggaa ccagcgcttt tctaagcgtg 180

catgccgatg ctcgatggat tgtctgtgaa gttgccgttg cagacatcat cagtctggaa 240

gagccgggaa tggtcaagtt tccgcgggcc gaggtggttc atgtcggcga caggatcagc 300

gcgtcacact tcatttcggc acgtcaggcc gaccctgcgt caacgtcaac gtcaacgtca 360

acgtcaacgt taacgccaat gcctacggcc atacccacgc ccatgcctgc ggtagcaagt 420

gtcacgttac cggtggccga acaggcccgt catgaagtgt tcgatgtcgc gtcggtcagc 480

gcggctgccg ccccagtaaa caccctgccg gtgacgacgc cgcagaattt gcagaccgcc 540

acttacggca gcacgttgag tggcgacaat cac 573

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 60

cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 120

ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc 180

gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 240

gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 300

atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc 360

gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 420

cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 480

ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag 540

gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 600

atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 660

gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaag 705

<210> 3

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccaagttga ccagtgccgt tccggtgctc accgcgcgcg acgtcgccgg agcggtcgag 60

ttctggaccg accggctcgg gttctcccgg gacttcgtgg aggacgactt cgccggtgtg 120

gtccgggacg acgtgaccct gttcatcagc gcggtccagg accaggtggt gccggacaac 180

accctggcct gggtgtgggt gcgcggcctg gacgagctgt acgccgagtg gtcggaggtc 240

gtgtccacga acttccggga cgcctccggg ccggccatga ccgagatcgg cgagcagccg 300

tgggggcggg agttcgccct gcgcgacccg gccggcaact gcgtgcactt cgtggccgag 360

gagcaggac 369

<210> 4

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgccccga cgttgccccc tgcctggcag ccctttctca aggaccaccg catctctaca 60

ttcaagaact ggcccttctt ggagggctgc gcctgcgccc cggagcggat ggccgaggct 120

ggcttcatcc actgccccac tgagaacgag ccagccttgg cccagtgttt cttctgcttc 180

aaggagctgg aaggctggga gccagatgac gaccccatag aggaacataa aaagcattcg 240

tccggtgccg ctttcctttc tgtcaagaag cagtttgaag aattaaccct tggtgaattt 300

ttgaaactgg acagagaaag agccaagaac aaaattgcaa aggaaaccaa caataagaag 360

aaagaatttg aggaaactgc gaagaaagtg cgccgtgcca tcgagcagct ggctgccatg 420

gatcatcacc accaccatca c 441

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccaccacc accaccac 18

<210> 6

<211> 716

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Leu Asp Lys Ala Leu Val Leu Arg Thr Cys Ala Asn Asn Met

1 5 10 15

Ala Asp His Cys Gly Leu Ile Trp Pro Ala Ser Gly Thr Val Glu Ser

20 25 30

Arg Tyr Trp Gln Ser Thr Arg Arg His Glu Asn Gly Leu Val Gly Leu

35 40 45

Leu Trp Gly Ala Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ser Val His Ala Asp Ala

50 55 60

Arg Trp Ile Val Cys Glu Val Ala Val Ala Asp Ile Ile Ser Leu Glu

65 70 75 80

Glu Pro Gly Met Val Lys Phe Pro Arg Ala Glu Val Val His Val Gly

85 90 95

Asp Arg Ile Ser Ala Ser His Phe Ile Ser Ala Arg Gln Ala Asp Pro

100 105 110

Ala Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Pro Met Pro

115 120 125

Thr Ala Ile Pro Thr Pro Met Pro Ala Val Ala Ser Val Thr Leu Pro

130 135 140

Val Ala Glu Gln Ala Arg His Glu Val Phe Asp Val Ala Ser Val Ser

145 150 155 160

Ala Ala Ala Ala Pro Val Asn Thr Leu Pro Val Thr Thr Pro Gln Asn

165 170 175

Leu Gln Thr Ala Thr Tyr Gly Ser Thr Leu Ser Gly Asp Asn His Gly

180 185 190

Ser Lys Gly Pro Arg Ser Ala Ser Ser Arg Met Val Ser Lys Gly Glu

195 200 205

Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His

210 215 220

Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly

225 230 235 240

Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr

245 250 255

Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe

260 265 270

Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp

275 280 285

Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met

290 295 300

Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu

305 310 315 320

Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe

325 330 335

Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala

340 345 350

Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile

355 360 365

Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val

370 375 380

Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr

385 390 395 400

Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr

405 410 415

Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly

420 425 430

Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu

435 440 445

Thr Ala Arg Asp Val Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu

450 455 460

Gly Phe Ser Arg Asp Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg

465 470 475 480

Asp Asp Val Thr Leu Phe Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln Val Val Pro

485 490 495

Asp Asn Thr Leu Ala Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr

500 505 510

Ala Glu Trp Ser Glu Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly

515 520 525

Pro Ala Met Thr Glu Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala

530 535 540

Leu Arg Asp Pro Ala Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln

545 550 555 560

Asp His Met Thr Ser Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro

565 570 575

Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu

580 585 590

Glu Gly Cys Ala Cys Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile

595 600 605

His Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Ala Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys

610 615 620

Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu

625 630 635 640

His Lys Lys His Ser Ser Gly Ala Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln

645 650 655

Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg

660 665 670

Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe

675 680 685

Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala

690 695 700

Met Asp His His His His His His Glu Phe Lys Leu

705 710 715

Claims

1.一种重组融合蛋白，其特征在于，包括冰核蛋白N端结构域、荧光蛋白、抗性蛋白以及人存活素蛋白或其突变体。

2.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白；抗性蛋白为Zeocin抗性蛋白；人存活素突变体为人存活素T34A突变体、人存活素D52A突变体或人存活素C84A突变体。

3.如权利要求2所述的重组融合蛋白，其特征在于，由冰核蛋白N端结构域、红色荧光蛋白、Zeocin抗性蛋白、人存活素突变体依次连接组成。

4.如权利要求3所述的重组融合蛋白，其特征在于，还包括组氨酸标签序列。

5.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，包括冰核蛋白N端结构域、荧光蛋白、抗性蛋白和人存活素突变体；编码所述冰核蛋白N端结构域的基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示；编码荧光蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；编码抗性蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；编码人存活素突变体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

6.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

7.编码如权利要求1～6任一项所述的重组融合蛋白的基因。

8.包含如权利要求7所述基因的重组载体、转化子和细菌表面展示系统。

9.如权利要求1～6任一项所述重组融合蛋白在制备肿瘤标志物和抗肿瘤DNA疫苗中的应用。