CN104593401B - 一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫galectin‑1蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)galectin‑1蛋白的方法，步骤如下：(1)引物合成；(2)galectin‑1基因的扩增；(3)galectin‑1重组质粒的构建；(4)重组融合蛋白Galectin‑1的诱导表达和纯化，即得可溶性广州管圆线虫galectin‑1蛋白。本方法方法简单、操作方便，所使用的物料来源广泛，成本低廉，建立了一种在低温下诱导表达可溶性广州管圆线虫galectin‑1蛋白的表达纯化方法，减少了大肠杆菌本身蛋白的表达，提高了目的蛋白的纯化效率，同时也保证了galectin‑1蛋白的生物学活性。该方法制备得到的galectin‑1蛋白的可溶性高，为galectin‑1蛋白的广泛应用提供了基础。
Description
技术领域
本发明属于分子克隆技术领域，尤其是一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白的方法。
背景技术
广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)可导致严重的公共卫生问题，如何控制广州管圆线虫的感染所带来的中枢神经系统的损伤、如何减少广州管圆线虫感染影响确保对患者作出充分的医疗反应，这些问题尚待解决。另外，广州管圆线虫病往往呈爆发流行，其治疗阶段降低免疫应答是减轻免疫病理反应、改善临床症状的关键，故目前在临床调节免疫应答主要依赖激素，而激素的滥用存在诸多弊端。
目前GenBank中已有广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)galectin-1基因序列和蛋白序列的记录，但是广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)gelatin-1蛋白目前尚无人表达，而且尚无该蛋白较为完整、具体的表达纯化方法，而已有的其他物种的galectin-1蛋白的原核表达方法通常是利用大肠杆菌在37℃下诱导表达，这时大肠杆菌本身蛋白的表达较多，一定程度上影响了目的蛋白的表达纯化，而且该方法表达的蛋白往往可溶性不高，也影响了表达蛋白的原有生物学活性，影响了对其继续的使用。
通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献及相关文章：
一、pCold载体蛋白表达技术
宝生公司的《cold shock expression system pcold DNA》：当培养温度切换到低温时，大肠杆菌暂时停止生长，大部分的大肠杆菌蛋白质表达减少，但是一类称为冷休克蛋白的蛋白质被特异性诱导表达。pCold DNA I～IV是应用冷休克基因之一的cspA基因启动子而设计并可以有效表达蛋白质的冷休克表达载体。在cspA启动子下游插入了lacperator，可以严紧调控蛋白质表达。另外，在cspA启动子下游还有5’非编码区(5’UTR)、TEE序列、His tag序列、Factor Xa切断序列和多克隆位点。因为本制品应用了大肠杆菌来源的启动子，所以大部分的大肠杆菌菌株都可以作为表达宿主使用。pCold系列载体根据TEE序列、His tag序列和Factor Xa切断序列的有无，分成四种pCold载体，可根据使用目的选择最适的载体。
二、相关物种galectin-1蛋白表达技术
详见相关文献1-9，其中最接近的是李晶等人的《重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测》：构建重组原核表达质粒pET-galectin,目的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化后,得到的蛋白纯度可达80％以上。红细胞凝集试验结果表明获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,可进一步用于半乳糖凝集素-1功能研究。这些文献与本发明表达的galectin-1的来源物种不同、研究功能不同、表达载体和表达条件不同。
[1]王婧.捻转血矛线虫Galectin C端CRD差异氨基酸突变对其生物学活性的影响[D].南京农业大学,2007.
[2]任声权.Galectin-1的表达纯化及其抑瘤功能的初步研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,2008.
[3]李晶,贺丽清,舒震,侯建伟,陈霖,徐玉金,张伟,张英起.重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测[J].生物技术通讯,2010,03:315-318.
[4]李晶.重组人Galectin-1蛋白的表达、纯化及生物活性的检测[D].第四军医大学,2010.
[5]姚雅楠.猪肠三叶肽TFF3基因的克隆与原核表达[D].河南农业大学,2013.
[6]于珊珊.松江鲈(Trachidermus fasciatus)几种凝集素的基因克隆与功能研究[D].山东大学,2013.
[7]易绍琼,任声权,于婷,张晓艳,刘树玲,陈薇.半乳糖凝集素-1的表达纯化与生物活性分析[J].军事医学科学院院刊,2009,03:231-233.
[8]徐跃.中华蟾蜍与日本蟾蜍皮肤galectin-3cDNA的克隆、序列分析及原核表达[D].浙江农林大学,2012.
[9]王鹏,王维,吕志强.家蚕半乳糖凝集素BmGalectin-4的表达、纯化及性质分析[J].昆虫学报,2014,07:806-814.
三、相关galectin-1专利公开文献
详见下方的相关专利1-9，这些专利与本发明表达的galectin-1的来源物种不同，或是表达载体和表达条件不同，以及功能研究方向不同。
[1]杨国庆,姚雅楠.一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体、构建方法、重组工程菌及其表达方法[P].河南：CN103725706A,2014-04-16.
[2]安德鲁·H·塞加尔,埃尔胡·扬.凝集素组合物和调节对抗原免疫应答的方法[P].美国：CN101119745,2008-02-06.
[3]伊莎贝尔·康比,帕特里克·昂列,弗洛朗斯·勒弗朗,皮埃尔·库尔图瓦,罗伯特·基什.靶向半乳凝素-1的基于RNAi的方法用于治疗癌症的用途[P].比利时：CN101228274,2008-07-23.
[4]MAYO KEVIN H..ANTI-TUMOR AGENT OTX-008TARGETS HUMAN GALECTIN-1[P].：US2014121278,2014-05-01.
[5]Raymond Eric,Astorgues-Xerri Lucile,Faivre Sandrine,CvitkovicEsteban.COMPOUNDS INHIBITING GALECTIN-1EXPRESSION,CANCER CELL PROLIFERATION,INVASION,AND TUMORIGENESIS[P].：US2014243415,2014-08-28.
[6]MAYO,KEVIN,H..ANTI-TUMOR AGENT OTX-008TARGETS HUMAN GALECTIN-1[P].：WO2014070214,2014-05-08.
[7]RAYMOND ERICASTORGUES-XERRI LUCILEFAIVRE SANDRINECVITKOVICESTEBA.COMPOUNDS INHIBITING GALECTIN-1EXPRESSION,CANCER CELL PROLIFERATION,INVASION,AND TUMORIGENESIS[P].：WO2012131079,2012-10-04.
[8]GOMEZ-BROUCHET ANNE,SCHIFF CLAUDINE.GALECTIN-1(GAL1)AS A BIOMARKERFOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF OSTEOSARCOMA AND CHONDROSARCOMA[P].：EP2396424,2011-12-21.
[9]GOMEZ-BROUCHET ANNE,SCHIFF CLAUDINE.GALECTIN-1(GAL1)AS A BIOMARKERFOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF OSTEOSARCOMA AND CHONDROSARCOMA[P].：US2012028825,2012-02-02.
通过对比，本发明专利申请与上述相关的专利公开文献及文章存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服原有技术的不足之处，提供一种方法简单、操作方便，所使用的物料来源广泛、成本低廉，减少了大肠杆菌本身蛋白的表达，提高了目的蛋白的纯化效率，同时也保证了galectin-1蛋白的生物学活性，制备得到的galectin-1蛋白的可溶性高的应用pCold载体在低温下诱导表达可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)galectin-1蛋白的方法，步骤如下：
⑴引物合成
根据galectin-1基因cDNA序列设计引物，为了将目的基因克隆至pCold III载体，上游引物的5'端设计加入BamH I酶切位点和6个组氨酸密码子标签；下游引物的5'端设计加入Xba I酶切位点；
引物序列如下：
上游引物：pcold3-G-F:5'-CGGGATCC ATGTCGTCTCCTCCA-3'(序列1)；
下游引物：pcold3-G-R:5'-CTTCTAGACTACTGAATTTGAATGCCGGT-3'(序列2)；
所述6个组氨酸密码子标签和galectin-1基因插入到原pcoldIII质粒的BamHI和XbaI之间；
⑵galectin-1基因的扩增
利用试剂盒提取广州管圆线虫5期总RNA；
利用逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA；
利用Ex Taq酶扩增galectin-1基因，50ul反应体系：上、下游引物各0.25-0.5ul，cDNA模板0.5-1ul，Taq酶0.2-1.0ul，10×Taq Buffer 5ul，dNTP Mixture 4ul，所述dNTPMixture各2.5mM，补充ddH2O到50ul；PCR反应条件：94-95℃1-4min，94-95℃30s，55-60℃30-45s，72℃45s-1.5min，循环数25-35次；72℃5-10min，得PCR产物；
PCR产物以1-1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离产物，在850bp附近处可见目的片段，DNA凝胶回收试剂盒回收该目的片段，经测序确认该基因序列完成且无突变后，得目的基因片段；
⑶galectin-1重组质粒的构建
用限制性内切酶BamH I、Xba I对目的基因片段和Pcold III载体分别进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳回收，经T4连接酶连接后进行琼脂糖凝胶电泳回收，获得重组构建质粒pColdIII-galectin-1；最终将重组质粒转化到大肠埃希菌E.coilBL 21感受态细胞中，由引物对pcold3-G-F/pcold3-G-R和BamH I/Xba I双酶切进行阳性克隆鉴定，筛选合格后，得pColdIII-galectin-1BL21阳性克隆菌株；
所述双酶切的条件为：双酶切体系20-50ul：限制性内切酶BamH I和Xba I各1-5ul，目的基因片段或Pcold III载体5-10ug，酶切10×buffer加至1×，补充ddH2O至反应体系20-50ul；反应条件：22-25℃酶切2h，或者16℃酶切过夜，80℃灭活5-10min；
⑷重组融合蛋白Galectin-1的诱导表达和纯化
活化菌种：筛选到的pColdIII-galectin-1BL21阳性克隆菌株经含100-150ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃，过夜培养活化后，挑取单克隆菌斑加到含100-150ug/ml氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃摇床，220-250r/min培养至OD值到0.4-0.5范围内；
诱导表达：将OD值在0.4-0.5范围内的菌液置于15℃静置半小时，加入终浓度为1.0mM的入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，于15℃摇床，220-250r/min诱导表达12-24h，得诱导后的表达细胞；
收集诱导后的表达细胞：4℃，8000×g离心5min，倒掉上清，沉淀用1×PBS清洗2次，最后加入1×PBS重新悬浮细胞，浓缩10-20倍，得浓缩后细胞；
超声破碎细胞：将浓缩后细胞进行冰浴超声裂解，功率200W，持续15s，间隔30s，持续30-60min，然后4℃，12000×g离心10min得表达上清；
镍柱纯化：表达上清利用融合表达的组氨酸标记经镍柱进行纯化，用不同浓度的咪唑过柱洗脱，得到不同纯化的可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白，SDS-PAGE鉴定表达和纯化效果，酶标仪检测蛋白浓度，即得可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白。
而且，所述步骤⑵中galectin-1基因的扩增的具体步骤如下：
利用life technologie公司的TRIzol试剂盒提取广州管圆线虫5期总RNA，虫子数量20条，具体操作参考试剂盒说明书；
利用大连宝生生物有限公司的逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA，具体操作参考试剂盒说明书；
利用大连宝生生物有限公司的Ex Taq酶扩增galectin-1基因，50ul反应体系：上下游引物个0.5ul，cDNA模板1ul，其他组分参照试剂盒说明书。
而且，所述步骤⑶中转化感受态细胞方法为热激转化法。
而且，所述热激转化法的步骤如下：
5-10ul连接反应液加入到50-100ul的BL21感受态细胞中，冰浴30-40min，42℃热激90s，冰浴1-3min，加入0.7-1ul LB培养液37℃200-250rpm摇床培养1-2h，取100-200ul培养液涂加有100-150ug/ml氨苄青霉素的LB平板培养过夜，挑取单克隆PCR鉴定阳性克隆。
而且，所述步骤⑶中的连接反应条件：5U/ul T4DNA连接酶0.5ul，galectin-1基因片段和pCold III载体按物质的量比为1:1～1:10的配比混合，T4DNA连接酶10×buffer2ul，加水至20ul，22-25℃放置1-2h。
而且，所述galectin-1基因片段和pCold III载体为3pmol galectin-1基因片段和0.3pmol pCold III载体。
而且，所述步骤⑷中最后加入的1×PBS体积为5-10ml。
而且，所述步骤⑷中获得的可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白通过如下步骤进行鉴定与分析：
重组融合蛋白Galectin-1的免疫印迹鉴定
表达纯化的广州管圆线虫galectin-1蛋白融合有6个组基酸标记，利用组基酸单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清分别进行WB免疫鉴定；
重组融合蛋白Galectin-1的生物活性分析
利用新鲜的小鼠血细胞与不同稀释浓度的重组融合蛋白Galectin-1的凝集反应，检测目的蛋白的生物学活性。
而且，所述用不同浓度的咪唑过柱洗脱的具体步骤如下：
⑴配制不同浓度的咪唑
平衡Buffer配置：500mM的NaCI，20mM Tris HCI，PH7.9；
不同浓度咪唑的Buffer：在平衡buffer中加入咪唑，配成10mM，40mM,10mM，200mM，500mM；
⑵平衡镍柱
A.取3ml镍柱胶加入到10ml的蛋白层析柱中，取5ml 1X BPS缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶；
B.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流平衡3-5次镍柱胶；
⑶蛋白上清过柱
将蛋白表达上清缓慢加入层析柱中利用重力自然下流结合镍柱胶，将穿透液重复过柱一次，或是蛋白上清先与镍柱胶在16℃摇床中缓慢混合1-4h再利用重力自然下流，接收穿透液；
⑷不同浓度的咪唑洗脱
A.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶，洗脱为结合的杂蛋白，接收穿透液；
B.再分别取2ml 40mM,10mM，200mM和500mM的咪唑Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗2-3次镍柱胶，洗脱目的蛋白，接收穿透液。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本方法方法简单、操作方便，所使用的物料来源广泛，成本低廉，建立了一种在低温下诱导表达可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白的表达纯化方法，巧妙地重组构建了pColdIII-galectin-1质粒，6xHis标签和galectin-1基因插入到原pcoldIII质粒的BamHI和XbaI之间，使表达的融合蛋白带有质粒本身的氨基酸量最少.，减少了大肠杆菌本身蛋白的表达，提高了目的蛋白的纯化效率，同时也保证了galectin-1蛋白的生物学活性。该方法制备得到的galectin-1蛋白的可溶性高，为galectin-1蛋白的广泛应用提供了基础。
2、本方法可为临床用药提供参考，也能够为广州管圆线虫的个性化治疗提供靶标，拒绝广谱用药、杜绝医疗浪费，其社会效益重大，其经济效益可观；本方法制得的Galectin-1的潜在应用价值极大，可为临床用药提供参考，具相当的市场前景和实用性。
3、本发明方法巧妙地重组构建了pColdIII-galectin-1质粒，使表达的融合蛋白带有质粒本身的氨基酸量最少；本发明使用的表达体系在1.0mM IPTG诱导剂量下目的蛋白表达量高，可溶性好，经镍柱纯化精制蛋白的效率约为2mg/L；本发明最终纯化的galectin-1蛋白具有良好的生物学活性，能与His单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清发生免疫反应，10-5稀释的galectin-1蛋白仍能使小鼠血细胞发生凝集反应。因此，本发明具有设计巧妙、操作简便、成本低廉等优点，制备的广州管圆线虫表达量高、可溶性好、具有天然的生物活性，为进一步研究广州管圆线虫galectin-1蛋白的生物学功能和相关药物的开发奠定了基础。
附图说明
图1为本发明的重组pColdIII-galectin-1质粒图；其中，6xHis标签和galectingalectin-1基因插入到原pcoldIII质粒的BamHI和XbaI之间；
图2为本发明的galectin-1基因的扩增图；以cDNA为模板经PCR扩增，得到850bp左右的扩增片段与gelectin-1目的片段一致；
图3为本发明的重组质粒pColdIII-galectin-1双酶切鉴定图；将重组质粒用BamHI、Xba I双酶切之后进行琼脂糖凝胶电泳，得到850bp左右的片段与gelectin-1目的片段一致；
图4为本发明纯化galectin-1的表达纯化(SDS-PAGE图)的结果图；诱导表达的蛋白通过HIS镍柱，用不同浓度的咪唑洗脱；在浓度为500mM的咪唑下，得到无杂带的目的蛋白；
图5为本发明的重组融合蛋白Galectin-1的免疫印迹鉴定图(Western blot图)；
图6为本发明的重组融合表达纯化蛋白galectin-1的生物活性分析(凝集反应)图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域的常规试剂；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域的常规方法。
本发明是把pColdIII(原核表达载体)载体具体应用在广州管圆线虫galectin-1的原核表达，并进行纯化及生物活性检测；涉及广州管圆线虫(AngiostrongylusCantonensis)半乳糖凝集素galectin-1基因的克隆，pcoldIII-6his-galectin-1重组表达质粒的构建，重组融合蛋白6his-galectin-1的诱导表达、纯化。
本发明中不同浓度的咪唑过柱洗脱的具体操作可以为现有技术中的方法，具体可以如下：
1、配制不同浓度的咪唑
平衡Buffer配置：500mM的NaCI，20mMTris HCI，PH7.9；
不同浓度咪唑的Buffer：在平衡buffer中加入咪唑，配成10mM，40mM,10mM，200mM，500mM。
2、平衡镍柱
A、取3ml镍柱胶加入到10ml的蛋白层析柱中，取5ml 1X BPS缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶；
B、再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流平衡3-5次镍柱胶。
3、蛋白上清过柱
将蛋白表达上清缓慢加入层析柱中利用重力自然下流结合镍柱胶，可将穿透液重复过柱一次，或是蛋白上清先与镍柱胶在16℃摇床中缓慢混合1-4h再利用重力自然下流，接收穿透液。
4、不同浓度的咪唑洗脱
A、再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶，洗脱为结合的杂蛋白，接收穿透液。
B、再分别取2ml 40mM,10mM，200mM和500mM的咪唑Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗2-3次镍柱胶，洗脱目的蛋白，接收穿透液。
实施例1
一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白的方法，步骤如下：
⑴引物合成
根据galectin-1基因cDNA序列设计引物，为了将目的基因克隆至pCold III载体，上游引物的5'端设计加入BamH I酶切位点和6个组氨酸密码子；下游引物的5'端设计加入Xba I酶切位点；
引物序列如下：
上游引物：pcold3-G-F:5'-CGGGATCCCATCATCATCATCATCATATGTCGTCTCCTCCA-3'(序列1)；
下游引物：pcold3-G-R:5'-CTTCTAGACTACTGAATTTGAATGCCGGT-3'(序列2)，由上海生工有限公司合成；
⑵galectin-1基因片段鉴定
广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)半乳糖凝集素galectin-1基因的克隆：
利用试剂盒提取广州管圆线虫5期总RNA；
利用逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA；
以cDNA为模板，50ul反应体系：上、下游引物各0.25-0.5ul，cDNA模板0.5-1ul，Taq酶0.2-1.0ul，10×Taq Buffer 5ul，dNTP Mixture 4ul，所述dNTP Mixture各2.5mM，补充ddH2O到50ul；
PCR反应条件：94℃1min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，循环数35个；72℃5min，得PCR产物。
PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定分离产物，在850bp左右处可见目的片段，DNA凝胶回收试剂盒回收该目的片段，并进行纯化，得目的基因片段。如图1和图2所示。
⑶galectin-1重组质粒(pcoldIII-6his-galectin-1重组表达质粒)的构建
步骤(1)所述的6xHis标签和galectin-1基因插入到原pcoldIII质粒的BamHI和XbaI之间，如图1和图3，具体方法如下：
用限制性内切酶BamH I、Xba I对目的基因片段和Pcold III载体分别进行双酶切(双酶切体系20ul：限制性内切酶BamH I和Xba I各1ul，目的基因片段(或Pcold III载体)5ug，酶切10×buffer加至1×，补充ddH2O至反应体系20ul。反应条件：22-25℃酶切2h，或者16℃酶切过夜。80℃灭活5min。)后，产物进行琼脂糖凝胶电泳。DNA凝胶回收试剂盒回收带有黏性末端的目的基因galectin-1和Pcold III载体。galectin-1基因酶切产物和PcoldIII载体酶切产物用T4连接酶进行连接，得连接产物；
连接反应条件：5U/ul T4DNA连接酶0.5ul，galectin-1基因片段和pCold III载体按物质的量比为1:1～1:10的配比混合，推荐实例为3pmol galectin-1基因片段和0.3pmolpCold III载体，T4DNA连接酶10×buffer 2ul，加水至20ul，22℃放置1h。
取连接产物转入大肠埃希菌E.coilDH5α，冰浴30min，42℃热击90s，迅速冰浴3min，之后加入1ml无抗性的液态LB培养基，于37℃以250r/min振摇培养1h，然后涂于含氨苄霉素的LB培养板上培养12-16h。挑取独立的菌落加到含1ml有氨苄霉素的LB液体培养基中，于37℃，250r/min，摇床上振荡4h后，做菌液PCR鉴定，合格后，获得构建成功的galectin-1重组质粒的菌液。
⑷重组的Galectin-1(重组融合蛋白6his-galectin-1)的诱导表达和纯化
活化菌液，将10ul菌液加到10ml有氨苄霉素的LB液体培养基中37℃，摇床振荡12-16h，用质粒回收试剂盒回收质粒，将重组质粒用BamH I、Xba I双酶切鉴定，得合格的重组质粒。如图3所示。
上述双酶切的条件为：双酶切体系20-50ul：限制性内切酶BamH I和Xba I各1-5ul，目的基因片段或Pcold III载体5-10ug，酶切10×buffer加至1×，补充ddH2O至反应体系20-50ul；反应条件：22-25℃酶切2h，或者16℃酶切过夜，80℃灭活5-10min。
取合格的重组质粒转化BL21感受态株，转化后的大肠杆菌在含100-150ug/ml氨苄霉素的LB培养板上培养12-24h，挑取单克隆菌落加到含1ml含100-150ug/ml氨苄霉素的LB液体培养基中，于37℃,250r/min，摇床上振荡4h后，对菌液做PCR鉴定(体系：菌液取1ul，TaqMix10ul(含Taq酶、buffer、dNTP Mixture)，上下游引物各0.25ul，9uldH2O；反应条件：95℃3-4min,55℃30-40s，72℃45s-1min，25-35个循环，72延伸5-10min。1-2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。)，合格后，获得构建成功的质粒BL21菌液。
取构建好的质粒BL21菌液加到100ml含1ml含100-150ug/ml氨苄霉素的LB液体培养基中于37℃摇床，250r/min 16h，至OD值到0.4～0.5范围内。
取OD值为0.4～0.5范围内的构建好的质粒BL21菌液置于两瓶中，一瓶做对照不加诱导剂，另一瓶加入IPTG诱导剂(异丙基硫代半乳糖苷诱导剂)，放在15℃静置半小时，再放在15℃摇床，250r/min诱导表达24h，得诱导后的表达细胞。收集诱导后的表达细胞，4℃，8000×g离心5min倒掉上清，沉淀用PBS清洗2次，最后加入5-10ml(根据后面的浓缩10-20倍即可以算出)1XPBS重新悬浮细胞，浓缩10-20倍，得浓缩后细胞；将浓缩后细胞进行冰浴超声裂解，功率200W，持续15s，间隔30s，持续30min，然后4℃，12000×g离心10min，将上清和沉淀分开，将上清过HIS镍柱，用不同浓度的咪唑过柱洗脱(普通的利用重力自然下流洗脱)，得到不同程度纯化的可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白，SDS-PAGE观察纯化效果。如图4所示。
上述不同浓度的咪唑过柱洗脱的具体操作可以如下：
1、配制不同浓度的咪唑
平衡Buffer配置：500mM的NaCI，20mMTris HCI，PH7.9；
不同浓度咪唑的Buffer：在平衡buffer中加入咪唑，配成10mM，40mM,10mM，200mM，500mM。
2、平衡镍柱
A.取3ml镍柱胶加入到10ml的蛋白层析柱中，取5ml 1X BPS缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶；
B.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流平衡3-5次镍柱胶。
3、蛋白上清过柱
将蛋白表达上清缓慢加入层析柱中利用重力自然下流结合镍柱胶，可将穿透液重复过柱一次，或是蛋白上清先与镍柱胶在16℃摇床中缓慢混合1-4h再利用重力自然下流，接收穿透液。
4、不同浓度的咪唑洗脱
A.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶，洗脱为结合的杂蛋白，接收穿透液。
B.再分别取2ml 40mM,10mM，200mM和500mM的咪唑Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗2-3次镍柱胶，洗脱目的蛋白，接收穿透液。
(5)重组融合蛋白Galectin-1的免疫印迹鉴定
表达纯化的广州管圆线虫galectin-1蛋白融合有6个His氨基酸标记，利用His单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清分别进行WB(western blot)免疫鉴定。WB结果显示表达纯化的galectin蛋白能与His单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清发生免疫反应，与正常小鼠血清不发生免疫反应。这说明表达纯化的蛋白正是目的蛋白。如图5所示。
(6)重组融合蛋白Galectin-1的生物活性分析
利用新鲜的小鼠血细胞与不同稀释浓度的重组融合蛋白Galectin-1的凝集反应，检测目的蛋白的生物学活性。凝集反应结果显示10-5稀释的galectin-1蛋白仍能使小鼠血细胞发生凝集反应，说明表达纯化的重组融合蛋白Galectin-1具有较高的生物学活性。如图6所示。
实施例2
一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)galectin-1蛋白的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴引物合成
根据galectin-1基因cDNA序列设计引物，为了将目的基因克隆至pCold III载体，上游引物的5'端设计加入BamH I酶切位点和6个His(组氨酸)密码子；下游引物的5'端设计加入Xba I酶切位点；
引物序列如下：
上游引物：pcold3-G-F:5'-CGGGATCC ATGTCGTCTCCTCCA-3'(序列1)；
下游引物：pcold3-G-R:5'-CTTCTAGACTACTGAATTTGAATGCCGGT-3'(序列2)；
⑵galectin-1基因的扩增
利用life technologie公司的TRIzol试剂盒(货号：15596-026)提取广州管圆线虫5期总RNA，虫子数量20条，具体操作参考试剂盒说明书。
利用大连宝生生物有限公司的逆转录试剂盒(货号：D6110A)将提取的总RNA合成cDNA，具体操作参考试剂盒说明书。
利用大连宝生生物有限公司的Ex Taq酶扩增galectin-1基因，50ul反应体系：上、下游引物各0.25-0.5ul，cDNA模板0.5-1ul，Taq酶0.2-1.0ul，10×Taq Buffer 5ul，dNTPMixture 4ul，所述dNTP Mixture各2.5mM，补充ddH2O到50ul；PCR反应条件：94-95℃1-4min，94-95℃30s，55-60℃30-45s，72℃45s-1.5min，循环数25-35次；72℃5-10min，得PCR产物。
PCR产物以1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离产物，在850bp左右处可见目的片段，DNA凝胶回收试剂盒回收该目的片段，经上海生工生物有限公司测序确认该基因序列完成且无突变。如图1和图2所示。
⑶galectin-1重组质粒的构建
步骤(1)所述的6xHis标签和galectin-1基因插入到原pcoldIII质粒的BamHI和XbaI之间，如图1和图3，具体方法如下：
用限制性内切酶BamH I、Xba I对目的基因片段和Pcold III载体分别进行双酶切(双酶切体系50ul：限制性内切酶BamH I和Xba I各5ul，目的基因片段(或Pcold III载体)10ug，酶切10×buffer加至1×，补充ddH2O至反应体系50ul。反应条件：22-25℃酶切2h，或者16℃酶切过夜。80℃灭活10min。)后进行琼脂糖凝胶电泳回收，经T4连接酶连接后进行琼脂糖凝胶电泳回收，获得重组构建质粒pColdIII-galectin-1(如图1)。最终将重组质粒转化到大肠埃希菌E.coilBL 21感受态细胞中，由引物对pcold3-G-F/pcold3-G-R和BamH I/Xba I双酶切进行阳性克隆鉴定。相关酶切、酶连和胶回收方法参见相应试剂盒说明书，转化感受态细胞为常规热激转化法。如图3所示。
所述的T4连接酶的连接反应条件为：5U/ul T4DNA连接酶0.5ul，galectin-1基因片段和pCold III载体按物质的量比为1:1～1:10的配比混合，推荐实例为3pmolgalectin-1基因片段和0.3pmol pCold III载体，T4DNA连接酶10×buffer 2ul，加水至20ul，22-25℃放置1-2h；
所述热激转化法的步骤如下：
5-10ul连接反应液加入到50-100ul的BL21感受态细胞中，冰浴30-40min，42℃热激90s，冰浴1-3min，加入0.7-1ul LB培养液37℃200-250rpm摇床培养1-2h，取100-200ul培养液涂加有100-150ug/ml氨苄青霉素的LB平板培养过夜，挑取单克隆PCR鉴定阳性克隆。
⑷重组融合蛋白Galectin-1的诱导表达和纯化
活化菌种：筛选到的pColdIII-galectin-1BL21阳性克隆菌株经含100-150ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃，过夜培养活化后，挑取单克隆菌斑加到含100-150ug/ml氨苄青霉素的100ml LB培养液中，由250ml摇瓶盛装，于37℃摇床，220r/min培养至OD值到0.4～0.5范围内，约16h。
诱导表达：培养到适合OD值的菌液放在15℃静置半小时，加入终浓度为1.0mM的入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导剂，于15℃摇床，220r/min诱导表达12h。可设不加IPTG诱导组作为空白对照。
收集诱导后的表达细胞：4℃，8000×g离心5min倒掉上清，沉淀用1X PBS清洗2次，最后加入1XPBS重新悬浮细胞，约浓缩10-20倍。
超声破碎细胞：冰浴超声裂解，功率200W，持续15s，间隔30s，直续30-60min；4℃，12000×g离心10min去上清。
镍柱纯化：表达上清利用融合表达的his标记经镍柱进行纯化，用不同浓度的咪唑过柱洗脱，得到不同纯化的可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白，SDS-PAGE鉴定表达和纯化效果，酶标仪检测蛋白浓度。具体纯化流程参加镍柱纯化试剂盒说明书，其他操作为本领域的常规操作。如图4所示。
上述不同浓度的咪唑过柱洗脱的具体操作可以如下：
1、配制不同浓度的咪唑
平衡Buffer配置：500mM的NaCI，20mMTris HCI，PH7.9；
不同浓度咪唑的Buffer：在平衡buffer中加入咪唑，配成10mM，40mM,10mM，200mM，500mM。
2、平衡镍柱
A.取3ml镍柱胶加入到10ml的蛋白层析柱中，取5ml 1X BPS缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶；
B.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流平衡3-5次镍柱胶。
3、蛋白上清过柱
将蛋白表达上清缓慢加入层析柱中利用重力自然下流结合镍柱胶，可将穿透液重复过柱一次，或是蛋白上清先与镍柱胶在16℃摇床中缓慢混合1-4h再利用重力自然下流，接收穿透液。
4、不同浓度的咪唑洗脱
A.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶，洗脱为结合的杂蛋白，接收穿透液。
B.再分别取2ml 40mM,10mM，200mM和500mM的咪唑Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗2-3次镍柱胶，洗脱目的蛋白，接收穿透液。
(5)重组融合蛋白Galectin-1的免疫印迹鉴定
表达纯化的广州管圆线虫galectin-1蛋白融合有6个His氨基酸标记，利用His单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清分别进行WB(western blot)免疫鉴定。WB结果显示表达纯化的galectin蛋白能与His单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清发生免疫反应，与正常小鼠血清不发生免疫反应。这说明表达纯化的蛋白正是目的蛋白。如图5所示。
(6)重组融合蛋白Galectin-1的生物活性分析
利用新鲜的小鼠血细胞与不同稀释浓度的重组融合蛋白Galectin-1的凝集反应，检测目的蛋白的生物学活性。凝集反应结果显示10-5稀释的galectin-1蛋白仍能使小鼠血细胞发生凝集反应，说明表达纯化的重组融合蛋白Galectin-1具有较高的生物学活性。如图6所示。
实施例3
一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)galectin-1蛋白的方法，步骤如下：
⑴引物合成
根据galectin-1基因cDNA序列设计引物，为了将目的基因克隆至pCold III载体，上游引物的5'端设计加入BamH I酶切位点和6个组氨酸密码子标签；下游引物的5'端设计加入Xba I酶切位点；
引物序列如下：
上游引物：pcold3-G-F:5'-CGGGATCC ATGTCGTCTCCTCCA-3'(序列1)；
下游引物：pcold3-G-R:5'-CTTCTAGACTACTGAATTTGAATGCCGGT-3'(序列2)；
所述6个组氨酸密码子标签和galectin-1基因插入到原pcoldIII质粒的BamHI和XbaI之间；
⑵galectin-1基因的扩增
利用试剂盒提取广州管圆线虫5期总RNA；
利用逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA；
利用Ex Taq酶扩增galectin-1基因，50ul反应体系：上、下游引物各0.25-0.5ul，cDNA模板0.5-1ul，Taq酶0.2-1.0ul，10×Taq Buffer 5ul，dNTP Mixture 4ul，所述dNTPMixture各2.5mM，补充ddH2O到50ul；PCR反应条件：94-95℃1-4min，94-95℃30s，55-60℃30-45s，72℃45s-1.5min，循环数25-35次；72℃5-10min，得PCR产物；
PCR产物以1-1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离产物，在850bp附近处可见目的片段，DNA凝胶回收试剂盒回收该目的片段，经测序确认该基因序列完成且无突变后，得目的基因片段；
⑶galectin-1重组质粒的构建
用限制性内切酶BamH I、Xba I对目的基因片段和Pcold III载体分别进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳回收，经T4连接酶连接(连接反应条件可以为：5U/ul T4DNA连接酶0.5ul，galectin-1基因片段和pCold III载体按物质的量比为1:1～1:10的配比混合，优选地，galectin-1基因片段和pCold III载体为3pmol galectin-1基因片段和0.3pmol pColdIII载体，T4DNA连接酶10×buffer 2ul，加水至20ul，22-25℃放置1-2h。)后进行琼脂糖凝胶电泳回收，获得重组构建质粒pColdIII-galectin-1；最终将重组质粒转化到大肠埃希菌E.coil BL 21感受态细胞中，该转化感受态细胞方法为热激转化法，步骤为：5-10ul连接反应液加入到50-100ul的BL21感受态细胞中，冰浴30-40min，42℃热激90s，冰浴1-3min，加入0.7-1ulLB培养液37℃200-250rpm摇床培养1-2h，取100-200ul培养液涂加有100-150ug/ml氨苄青霉素的LB平板培养过夜，挑取单克隆PCR鉴定阳性克隆；由引物对pcold3-G-F/pcold3-G-R和BamH I/Xba I双酶切进行阳性克隆鉴定，筛选合格后，得pColdIII-galectin-1BL21阳性克隆菌株；
所述双酶切的条件为：双酶切体系20-50ul：限制性内切酶BamH I和Xba I各1-5ul，目的基因片段或Pcold III载体5-10ug，酶切10×buffer加至1×，补充ddH2O至反应体系20-50ul；反应条件：22-25℃酶切2h，或者16℃酶切过夜，80℃灭活5-10min；
⑷重组融合蛋白Galectin-1的诱导表达和纯化
活化菌种：筛选到的pColdIII-galectin-1BL21阳性克隆菌株经含100-150ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃，过夜培养活化后，挑取单克隆菌斑加到含100-150ug/ml氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃摇床，220-250r/min培养至OD值到0.4-0.5范围内；
诱导表达：将OD值在0.4-0.5范围内的菌液置于15℃静置半小时，加入终浓度为1.0mM的入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，于15℃摇床，220-250r/min诱导表达12-24h，得诱导后的表达细胞；
收集诱导后的表达细胞：4℃，8000×g离心5min，倒掉上清，沉淀用1×PBS清洗2次，最后加入1×PBS重新悬浮细胞，浓缩10-20倍，得浓缩后细胞；
超声破碎细胞：将浓缩后细胞进行冰浴超声裂解，功率200W，持续15s，间隔30s，持续30-60min，然后4℃，12000×g离心10min得表达上清；
镍柱纯化：表达上清利用融合表达的组氨酸标记经镍柱进行纯化，用不同浓度的咪唑过柱洗脱，得到不同纯化的可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白，SDS-PAGE鉴定表达和纯化效果，酶标仪检测蛋白浓度，即得可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白。
上述用不同浓度的咪唑过柱洗脱的具体步骤如下：
⑴配制不同浓度的咪唑
平衡Buffer配置：500mM的NaCI，20mM Tris HCI，PH7.9；
不同浓度咪唑的Buffer：在平衡buffer中加入咪唑，配成10mM，40mM,10mM，200mM，500mM；
⑵平衡镍柱
A.取3ml镍柱胶加入到10ml的蛋白层析柱中，取5ml 1X BPS缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶；
B.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流平衡3-5次镍柱胶；
⑶蛋白上清过柱
将蛋白表达上清缓慢加入层析柱中利用重力自然下流结合镍柱胶，将穿透液重复过柱一次，或是蛋白上清先与镍柱胶在16℃摇床中缓慢混合1-4h再利用重力自然下流，接收穿透液；
⑷不同浓度的咪唑洗脱
A.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶，洗脱为结合的杂蛋白，接收穿透液；
B.再分别取2ml 40mM,10mM，200mM和500mM的咪唑Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗2-3次镍柱胶，洗脱目的蛋白，接收穿透液；
上述步骤⑷中获得的可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白通过如下步骤进行鉴定与分析：
重组融合蛋白Galectin-1的免疫印迹鉴定
表达纯化的广州管圆线虫galectin-1蛋白融合有6个组基酸标记，利用组基酸单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清分别进行WB免疫鉴定；
重组融合蛋白Galectin-1的生物活性分析
利用新鲜的小鼠血细胞与不同稀释浓度的重组融合蛋白Galectin-1的凝集反应，检测目的蛋白的生物学活性。
本发明方法的相关检测结果：
1).重组质粒pColdIII-galectin-1的构建图
如图1所示，6xHis标签和galectin-1基因插入到原pcoldIII质粒的BamHI和XbaI之间，这样使表达的融合蛋白带有质粒本身的氨基酸个数最少，同时利用pColdIII质粒的原有启动子启动转录，利用自身的终止密码子终止翻译。
2)galectin-1基因的扩增
如图2所示，以cDNA为模板经PCR扩增，得到850bp左右的扩增片段与gelectin-1目的片段一致。
3)重组质粒的双酶切鉴定
如图3所示，重组质粒经BamH I和Xba I双酶切得到850bp左右的片段与gelectin-1目的片段一致，另一大片段则与pColdIII质粒大小相符合。
4)纯化蛋白的SDS-PAGE分析
如图4所示，目的蛋白表达量高，可溶性好(大部分蛋白在上清中出现，只有少量在沉淀中)；诱导表达的蛋白经HIS镍柱结合后用不同浓度的咪唑洗脱，最后在浓度为500mM的咪唑下，得到无杂带的目的蛋白。经酶标仪测定该表达体系的表达纯化精制galectin-1蛋白的效率约为0.2mg/100mL。
5)重组融合蛋白Galectin-1的免疫印迹鉴定
如图5所示，表达纯化的galectin蛋白能与His单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清发生免疫反应，与正常小鼠血清不发生免疫反应。这说明表达纯化的蛋白正是目的蛋白。
6)重组融合蛋白Galectin-1的生物活性分析
如图6所示，10-5稀释的galectin-1蛋白仍能使小鼠血细胞发生凝集反应，说明表达纯化的重组融合蛋白Galectin-1具有较高的生物学活性。
综上所述，本发明巧妙地重组构建了pColdIII-galectin-1质粒，使表达的融合蛋白带有质粒本身的氨基酸量最少；本发明使用的表达体系在1.0mM IPTG诱导剂量下目的蛋白表达量高，可溶性好，经镍柱纯化精制蛋白的效率约为2mg/L；本发明最终纯化的galectin-1蛋白具有良好的生物学活性，能与His单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清发生免疫反应，10-5稀释的galectin-1蛋白仍能使小鼠血细胞发生凝集反应。因此，本发明具有设计巧妙、操作简便、成本低廉等优点，制备的广州管圆线虫表达量高、可溶性好、具有天然的生物活性，为进一步研究广州管圆线虫galectin-1蛋白的生物学功能和相关药物的开发奠定了基础。
Claims (4)
1.一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)galectin-1蛋白的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴引物合成
根据galectin-1基因cDNA序列设计引物，为了将目的基因克隆至pCold III载体，上游引物的5'端设计加入BamH I酶切位点和6个组氨酸密码子标签；下游引物的5'端设计加入Xba I酶切位点；
引物序列如下：
上游引物：序列1；
下游引物：序列2；
所述6个组氨酸密码子标签和galectin-1基因插入到原pcoldIII质粒的BamHI和XbaI之间；
⑵galectin-1基因的扩增
利用试剂盒提取广州管圆线虫5期总RNA；
利用逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA；
利用Ex Taq酶扩增galectin-1基因，50ul反应体系：上、下游引物各0.25-0.5ul，cDNA模板0.5-1ul，Taq酶0.2-1.0ul，10×Taq Buffer 5ul，dNTP Mixture 4ul，所述dNTPMixture各2.5mM，补充ddH2O到50ul；PCR反应条件：94-95℃1-4min，94-95℃30s，55-60℃30-45s，72℃45s-1.5min，循环数25-35次；72℃5-10min，得PCR产物；
PCR产物以1-1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离产物，在850bp附近处可见目的片段，DNA凝胶回收试剂盒回收该目的片段，经测序确认该基因序列完成且无突变后，得目的基因片段；
⑶galectin-1重组质粒的构建
用限制性内切酶BamH I、Xba I对目的基因片段和Pcold III载体分别进行双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳回收，经T4连接酶连接后进行琼脂糖凝胶电泳回收，获得重组构建质粒pColdIII-galectin-1；最终将重组质粒转化到大肠埃希菌E.coil BL 21感受态细胞中，由引物对序列1/序列2和BamH I/Xba I双酶切进行阳性克隆鉴定，筛选合格后，得pColdIII-galectin-1BL21阳性克隆菌株；
所述双酶切的条件为：双酶切体系20-50ul：限制性内切酶BamH I和Xba I各1-5ul，目的基因片段或Pcold III载体5-10ug，酶切10×buffer加至1×，补充ddH2O至反应体系20-50ul；反应条件：22-25℃酶切2h，或者16℃酶切过夜，80℃灭活5-10min；
⑷重组融合蛋白Galectin-1的诱导表达和纯化
活化菌种：筛选到的pColdIII-galectin-1BL21阳性克隆菌株经含100-150ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃，过夜培养活化后，挑取单克隆菌斑加到含100-150ug/ml氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃摇床，220-250r/min培养至OD值到0.4-0.5范围内；
诱导表达：将OD值在0.4-0.5范围内的菌液置于15℃静置半小时，加入终浓度为1.0mM的入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂，于15℃摇床，220-250r/min诱导表达12-24h，得诱导后的表达细胞；
收集诱导后的表达细胞：4℃，8000×g离心5min，倒掉上清，沉淀用1×PBS清洗2次，最后加入1×PBS重新悬浮细胞，浓缩10-20倍，得浓缩后细胞；
超声破碎细胞：将浓缩后细胞进行冰浴超声裂解，功率200W，持续15s，间隔30s，持续30-60min，然后4℃，12000×g离心10min得表达上清；
镍柱纯化：表达上清利用融合表达的组氨酸标记经镍柱进行纯化，用不同浓度的咪唑过柱洗脱，得到不同纯化的可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白，SDS-PAGE鉴定表达和纯化效果，酶标仪检测蛋白浓度，即得可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白；
所述步骤⑵中galectin-1基因的扩增的具体步骤如下：
利用life technologie公司的TRIzol试剂盒提取广州管圆线虫5期总RNA，虫子数量20条，具体操作参考试剂盒说明书；
利用大连宝生生物有限公司的逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA，具体操作参考试剂盒说明书；
利用大连宝生生物有限公司的Ex Taq酶扩增galectin-1基因，50ul反应体系：上下游引物个0.5ul，cDNA模板1ul，其他组分参照试剂盒说明书；
所述步骤⑶中转化感受态细胞方法为热激转化法；
所述热激转化法的步骤如下：
5-10ul连接反应液加入到50-100ul的BL21感受态细胞中，冰浴30-40min，42℃热激90s，冰浴1-3min，加入0.7-1ulLB培养液37℃200-250rpm摇床培养1-2h，取100-200ul培养液涂加有100-150ug/ml氨苄青霉素的LB平板培养过夜，挑取单克隆PCR鉴定阳性克隆；
所述步骤⑷中获得的可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白通过如下步骤进行鉴定与分析：
重组融合蛋白Galectin-1的免疫印迹鉴定
表达纯化的广州管圆线虫galectin-1蛋白融合有6个组基酸标记，利用组基酸单抗和广州管圆线虫全虫蛋白免疫小鼠制备的多抗血清分别进行WB免疫鉴定；
重组融合蛋白Galectin-1的生物活性分析
利用新鲜的小鼠血细胞与不同稀释浓度的重组融合蛋白Galectin-1的凝集反应，检测目的蛋白的生物学活性；
所述用不同浓度的咪唑过柱洗脱的具体步骤如下：
⑴配制不同浓度的咪唑
平衡Buffer配置：500mM的NaCI，20mM Tris HCI，PH7.9；
不同浓度咪唑的Buffer：在平衡buffer中加入咪唑，配成10mM，40mM,10mM，200mM，500mM；
⑵平衡镍柱
A.取3ml镍柱胶加入到10ml的蛋白层析柱中，取5ml 1X BPS缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶；
B.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流平衡3-5次镍柱胶；
⑶蛋白上清过柱
将蛋白表达上清缓慢加入层析柱中利用重力自然下流结合镍柱胶，将穿透液重复过柱一次，或是蛋白上清先与镍柱胶在16℃摇床中缓慢混合1-4h再利用重力自然下流，接收穿透液；
⑷不同浓度的咪唑洗脱
A.再取5ml 10mM咪唑的Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗3-5次镍柱胶，洗脱为结合的杂蛋白，接收穿透液；
B.再分别取2ml 40mM,10mM，200mM和500mM的咪唑Buffer缓慢加入层析柱中利用重力自然下流清洗2-3次镍柱胶，洗脱目的蛋白，接收穿透液。
2.根据权利要求1所述的应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白的方法，其特征在于：所述步骤⑶中的连接反应条件：5U/ul T4 DNA连接酶0.5ul，galectin-1基因片段和pCold III载体按物质的量比为1:1～1:10的配比混合，T4 DNA连接酶10×buffer 2ul，加水至20ul，22-25℃放置1-2h。
3.根据权利要求2所述的应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白的方法，其特征在于：所述galectin-1基因片段和pCold III载体为3pmol galectin-1基因片段和0.3pmol pCold III载体。
4.根据权利要求1所述的应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫galectin-1蛋白的方法，其特征在于：所述步骤⑷中最后加入1×PBS体积为5-10ml。
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| CN201510024385.XA CN104593401B (zh) | 2015-01-19 | 2015-01-19 | 一种应用pCold载体表达可溶性广州管圆线虫galectin‑1蛋白的方法 |
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