CN104829732A - 一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统中的表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HBV pre-c-Fc重组蛋白及其编码核苷酸序列，并公开了含有该蛋白的编码序列的重组载体和宿主细胞，本发明还公开了一种重组杆状病毒和获得重组杆状病毒的方法及在昆虫杆状病毒表达系统中表达该HBV pre-c-Fc重组蛋白的方法，还公开了含有HBV pre-c-Fc编码基因的重组杆状病毒及HBV pre-c-Fc重组蛋白在制备预防或治疗乙型肝炎的疫苗或药物中的应用。通过本发明的方法得到的HBV pre-c-Fc重组蛋白注射免疫BALB/c小鼠，检测发现小鼠血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体产生量远高于传统方法上用于制备乙肝疫苗的抗原。

Description

一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统中的表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组蛋白及其在昆虫杆状病毒表达系统中的表达方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球尤其是我国疾病负担之一：全世界超过2亿的人已经或正在感染乙型肝炎病毒，它能够引起肝炎、肝硬化乃至肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)。据统计，每年约有78万人死于乙型肝炎及其引起的相关疾病中，严重危害人类的健康，影响人们的生活质量。HBV全基因组可编码多种病毒蛋白，深入探讨各种病毒蛋白的生物学功能对HBV感染相关疾病的发生机制的揭示和临床检测治疗的指导具有非常重要的意义。

目前，上市的乙肝疫苗大多数是HBV的表面抗原即s蛋白，但乙肝病毒逃逸现象仍然严重，相关研究表明乙肝病毒c蛋白和e蛋白与乙肝病毒逃逸现象的发生密切相关。乙肝病毒前c蛋白(hepatitis Bvirus precore,HBV pre-c)是乙型肝炎病毒c蛋白和e蛋白的前体，生物学功能尚不十分明确。相关研究表明，HBV pre-c蛋白与c蛋白结合形成的复合物可能有利于病毒的持续感染^[8]。

设计疫苗的关键在于能够有效地活化抗原呈递细胞(antigenpresenting cell,APC)，促进抗原呈递和激活免疫反应。并且由于APC的表面能够表达FcR(Fc receptor)，所以抗原-Fc融合蛋白可以作为抗原的运载工具，借助Fc片段靶向作用结合APC，从而缩短抗原在血液中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，因而能够提高抗原半衰期，加强抗原的呈递。

1983年由smith等建立了具有蛋白表达水平高、对目的蛋白有翻译后修饰、周期短等优势的杆状病毒表达系统(baculovirus expressionvector system,BEVS)。继2007年第一个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的宫颈癌预防双价人乳头瘤病毒疫苗Cerearix批准上市，2013年美国FDA批准预防18～49岁人群季节性流感的疫苗FluBlok上市以来，杆状病毒表达系统现已广泛应用于疫苗的生产、生物制药和基因工程当中。

发明内容

针对以上发现，本发明运用杆状病毒表达系统表达乙型肝炎病毒前C蛋白-小鼠IgG Fc的融合蛋白作为疫苗，以获得具有免疫活性的重组蛋白，以大大减少乙肝病毒逃逸的问题，为慢性乙型肝炎的免疫治疗的研究奠定基础并开拓新的思路。

本发明的目的之一是提供一种HBV pre-c-Fc蛋白，其能够大大减少乙肝病毒逃逸现象，且由于该蛋白融合小鼠IgG Fc，能够缩短抗原在血液中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，加强抗原的呈递。

本发明的还有一个目的是提供一种重组杆状病毒，其能够成功表达HBV pre-c-Fc蛋白，并能够大规模生产HBV pre-c-Fc蛋白。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种重组HBV pre-c-Fc蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。

一种DNA分子，其编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

一种重组载体，其含有所述的DNA分子和与所述DNA分子连接的用于表达的调节序列。

宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的DNA分子。

另一方面，提供了一种获得重组杆状病毒的方法，包括如下步骤：

步骤一、对如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列进行密码子优化得到如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，之后通过人工合成如SEQID NO:2所示的核苷酸序列并将其构建到pUC57质粒上得到pUC57HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤二，

步骤二、以pUC57 HBV pre-c-Fc重组载体为模板，利用如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列的基因片段并将其构建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤三，

步骤三、利用步骤二得到的pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体转座含有Bacmid质粒的E.Coli DH10Bac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤四，

步骤四，利用Bacmid-HBV pre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒。

优选的是，所述的获得重组杆状病毒的方法，在所述步骤四之后还包括步骤五：

将步骤四中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞以表达得到第二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法直到得到第四代重组杆状病毒。

优选的是，所述的获得重组杆状病毒的方法中，所述步骤四中，利用Bacmid-HBV pre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒的具体过程为：

(4.1)从含有Bacmid-HBV pre-c-Fc载体的E coli DH5α菌株中提取Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒；

(4.2)取对数生长期的Sf9细胞，加入到六孔板中，每孔8×10⁵个；

(4.3)静置30min使得Sf9细胞贴于下壁；

(4.4)取8μl细胞转染试剂加入到100μl的昆虫细胞培养基中混匀，取1μl Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒加入到100μl昆虫细胞培养基中混匀，然后将两种混合液混合，即得到转染混合物；

(4.5)将转染混合物滴加到细胞中，27℃孵育3-5小时；

(4.6)弃去转染混合物，加入2ml新的昆虫细胞培养基，27℃下培养72h；其中，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

在本发明的又一个方面，提供了一种重组杆状病毒，由如任一项所述的获得重组杆状病毒的方法获得，该重组杆状病毒包含编码SEQID NO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

在本发明的再一个方面，还提供可一种生产重组HBV pre-c-Fc蛋白质的方法，包括以下步骤：使用所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞，分离纯化产生的重组HBV pre-c-Fc蛋白。

本发明还提供了所述重组杆状病毒在制备预防或治疗乙型肝炎的疫苗或药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明成功在杆状病毒表达系统中表达了具有免疫原性的HBVpre-c-Fc蛋白，纯化后蛋白纯度达90％以上，蛋白产量约为3.03mg/L，纯化蛋白能有效刺激BALB/c小鼠产生特异抗体，为生产乙肝治疗性疫苗奠定了基础。

附图说明

图1显示了本发明的HBV pre-c-Fc表达纯化以及生物活性测定的流程示意图；

图2显示了本发明的pUC57载体的质粒图谱；

图3显示了本发明的pFastBac^TM1的质粒图谱；

图4显示了PCR扩增HBV pre-c-Fc基因跑胶图，图中1：DNAMarker DL 2000，2：HBV pre-c-Fc基因；

图5显示了pFastBac-HBV pre-c-Fc载体双酶切鉴定图，1：DNAMarker DL 2000，2：BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pFastBac-HBV pre-c-Fc载体；

图6显示了PCR鉴定重组杆状病毒DNA跑胶图，1：阴性对照，2：DNA Marker DL 2000，3，4：HBV pre-c-Fc上下游引物及M13上下游引物分别交错进行PCR；

图7显示了正常及感染重组杆状病毒后的Sf9细胞(100μm)，(a)为正常的Sf9细胞，(b)感染72h后的Sf9细胞；

图8显示了Western Blot检测不同时间表达蛋白表达情况

图9显示了HBV pre-c-Fc蛋白纯化结果，1：170KD预染蛋白标签170marker；2：总蛋白；3：穿出液；4-8是0.1M甘氨酸-盐酸洗脱起峰后每1ml收集的样品。

图10显示了小鼠血清中HBV核心蛋白抗体的Elisa检测。

具体实施方式

本发明人发现，将乙型肝炎病毒前C蛋白与小鼠IgG Fc融合，使该HBV pre-c-Fc蛋白能够被稳定表达，分泌到细胞周围或细胞内，能够通过简便的分离纯化步骤就可以方便收集，为生产乙肝治疗性疫苗奠定了基础。

重组病毒的制备可以通过本领域的各种一致的途径制备。本发明优选了Bac-Bac系统，利用可在大肠杆菌和昆虫细胞之间穿梭的载体Bacmid，将HBV pre-c-Fc蛋白的序列转化杆状病毒，从而能够在昆虫细胞中高度表达HBV pre-c-Fc蛋白。

根据本发明，可采用本领域技能中的常规分子生物学、微生物学、细胞学和DNA重组技术。如果出现于本文下来术语的定义如下。

“DNA分子”指脱氧核糖核苷酸(胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤)的聚合形式，是染色体主要组成成分，同时也是组成基因的材料。这一术语只指分子的一级和二级结构，不限制其任何具体的三级形式。本术语包括特别是在线性DNA分子、病毒、染色体、质粒中国发现的双链DNA。这里讨论的结构，按照习惯上给出的只是DNA正义链的5'到3'方向的序列。

“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。在本发明中，可交互使用“质粒”和“载体”。

“重组载体”是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。

本文中的术语“宿主”不仅包括原核生物，也包括真核生物如酵母、植物和动物细胞。

本发明中的“反向互补”，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5’-A-T-G-3’”与序列“5’-C-A-T-3’”反向互补。

引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物成为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。

密码子优化：在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系统，以及基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

如图1所示，本发明将目的基因HBV pre-c-Fc连接到pFastBac1载体，获得的pFastBac1-HBV pre-c-Fc质粒转化E coli DH10Bac感受态细胞，通过Th7转座子将目的基因转座到Bacmid中，得到Bacmid-HBV pre-c-Fc穿梭载体，脂质体包被后转染Sf9昆虫细胞获得第一代(P1代)病毒，重复转染Sf9细胞获得高滴度病毒。收集细胞上清超滤后通过Protein G亲和层析柱纯化得到目的蛋白HBVpre-c-Fc。纯化的蛋白大腿内侧肌肉注射免疫BALB/c小鼠并检测血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体产生量。

本发明中的载体及菌种：含有HBV pre-c-Fc基因序列(昆虫密码子优化)的pUC57载体由华大基因提供，pFastBac1载体、E coliDH10Bac菌种、E coli.DH5α菌种均由本申请人保存。

试剂：Ex-Taq酶、限制性内切酶BamH Ⅰ和HindⅢ、DNA Marker2000/1000/15000、DNA连接试剂盒均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。高纯质粒小量制备试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自BioTeke公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Tansgene公司。PVDF膜购自BIO-RID公司。HBV核心蛋白单克隆抗体购自abcam公司。辣根过氧化酶标记驴抗鼠抗体购自Santa Cruz公司。Cellfectin Ⅱ Reagent购自Invitrogen公司。Sf900 ⅡSFM 1×、Sf9细胞均购自Gibco公司。引物由深圳华大基因科技有限公司合成。

实施例1

1.本发明的乙型肝炎病毒前C蛋白的基因序列和小鼠IgG Fc蛋白的基因序列均来自于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，将乙型肝炎病毒前C蛋白的基因序列和小鼠IgG Fc蛋白的基因序列直接组合，但是小鼠的IgG Fc基因序列中也包括它前面的连接蛋白序列的，整体没有改变序列，得到如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列，然后对SEQ ID NO:1进行密码子优化，得到如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列，密码子网址http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝10455：以便于该序列在昆虫细胞中表达。本发明的密码子优化是由华大基因公司直接优化，再全合成。具体优化密码子表如下

Spodoptera frugiperda MNPV[gbvrl]:151CDS's(43395codons)

fields:[triplet][frequency:per thousand]([number])

Coding GC 41.29％ 1st letter GC 43.19％ 2nd letter GC 30.76％ 3rdletter GC 49.91％

之后SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列由华大基因合成并直接克隆到pUC57载体中。pUC57载体也由华大基因公司提供，其质粒图谱如图2所示。

2.设计引物PCR扩增HBV pre-c-Fc基因片段

pUC57载体中包含编码HBV pre-c-Fc全长的433个氨基酸序列，HBV pre-c-Fc蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。运用primer 5.0软件设计含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的上游引物和下游引物，得到目的片段。上游引物：5’-GGATCCATGGACATTGATCC-3’(SEQID NO:4)；下游引物：5’-AAGCTTTTAGCTACCGCG-3’(SEQ IDNO:5)；PCR扩增^[13]。PCR产物切胶回收。

扩增HBV pre-c-Fc的基因的条件为：

PCR反应体系为

PCR反应条件：94℃变性4min；循环体系94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s共30个循环；72℃延伸10min。

HBV pre-c-Fc基因PCR扩增鉴定：

HBV pre-c-Fc基因由433个氨基酸组成，全长1299bp。以克隆有HBV pre-c-Fc基因的pUC57载体为模板，PCR扩增目的基因片段。将产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图4所示，在1000多bp左右可见特异性目的条带。

3.重组pFastBac-HBV pre-c-Fc载体的构建

同时对pFastBac^TM1质粒(该质粒图谱如图3)及含HBV pre-c-Fc基因的质粒进行BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切，酶切产物切胶回收。DNA连接试剂盒连接两个片段。连接体系为：

将反应物混合均匀于PCR仪中，保持16℃反应过夜。然后将连接产物转化感受态DH5α，37℃过夜，挑取单菌落、进行菌落PCR验证。挑选阳性克隆株进行菌液的小量提取，及酶切鉴定，用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切鉴定，如图5所示，酶切后大、小片段的位置与预期结果一致。将鉴定正确的菌液送Invitrogen基因测序。取测序正确的菌株即得到含有pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体的E coliDH5α菌株。

4.重组Bacmid-HBV pre-c-Fc载体的构建

将测序正确的pFastBac-HBV pre-c-Fc质粒转座含有Bacmid质粒的DH10Bac感受态，具体步骤为：

1)从含有pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体的E coli DH5α菌株中提取pFastBac1-HBV pre-c-Fc质粒；

2)取5μl pFastBac1-HBV pre-c-Fc质粒加入到E coli DH10Bac感受态细胞中混匀；

3)冰上静置30min；

4)42℃热击90s；

5)迅速放于冰上静置2min；

6)5)加入900μl的SOC培养基；

7)37℃，225rpm振荡4h；

8)离心菌液，取100μl涂有X-gal和IPTG的筛选LB固体培养基；

9)37℃恒温培养箱中2d；

10)挑取白色单菌落，重复划线于筛选LB固体培养基几次，直到抗体LB固体培养基中不出现蓝色菌落为止，即获得高纯度的单克隆含重组杆状病毒的E coli DH10Bac菌株。

LB液体培养基配方

筛选LB培养基中含有：

以Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒为模板，HBV pre-c-Fc上下游引物及M13上下游引物分别交错进行PCR对重组杆状病毒进行PCR扩增鉴定，产物跑胶验证，进行鉴定。如图6所示，结果显示大约在2000bp左右位置处有目的条带出现，与预期结果一致，即Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒构建正确。

5.重组杆状病毒的获得

(1)从E coli DH5α菌株中提取Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒；

(2)取对数生长期的Sf9细胞，加入到六孔板中，每孔8×10⁵个。

(3)静置30min使得Sf9细胞贴于下壁。

(4)细胞转染用溶液：取8μl细胞转染试剂(Cellfectin ⅡReagent)加入到100μl的昆虫细胞培养基(SF-900 Ⅱ SFM)中混合，取1μl Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒加入到100μl昆虫细胞培养基中混匀，然后将两种混合液混合，即得到转染混合物。

(5)将转染混合物滴加到细胞上中，27℃孵育3-5小时。

(6)弃去转染混合物，加入2ml新的昆虫细胞培养基，27℃下培养72h。

(7)待75％细胞发生病毒侵染时，收货上清即得到第一代重组杆状病毒(P1病毒)。取第一代重组杆状病毒再次侵染贴壁Sf9细胞，重复步骤(2)～(6)3次后即获得第四代重组杆状病毒(P4病毒)。

转染病毒后昆虫细胞形态鉴定

如图7所示，重组杆状病毒载体在细胞转染试剂的介导下侵染昆虫细胞，72h后于光学显微镜下观察到被侵染的细胞与正常细胞相比，出现细胞破裂，证明杆状病毒已经包装完成，成为成熟杆状病毒。

6.利用噬斑法测定P4病毒滴度^[14]：

准备连续稀释的病毒，取10^-3到10^-8连续六个稀释梯度，于27℃一定湿度条件下含有琼脂糖的培养基中孵育7～10d，观察噬菌斑个数直到连续2d计数不变。按照公式计算病毒滴度。

滴度(pfu/ml)＝噬斑数×稀释倍数×1/每孔病毒体积

P4病毒即已为高滴度病毒，可用于蛋白的表达与鉴定。

实施例2HBV pre-c-Fc蛋白的表达与鉴定

1.HBV pre-c-Fc蛋白的表达与鉴定取对数生长期悬浮培养昆虫细胞，细胞密度2×10⁶个/ml。用P4病毒进行转染，27℃、无CO₂、110rpm/min悬浮培养。分别于36，48，60，72，84，96，108，120h收获细胞上清。并取同样生长状态下细胞五瓶，用不同感染复数MOI侵染细胞，84h后收获蛋白。Western Blot检测曝光。

蛋白上样缓冲液的成分是：5×蛋白上样缓冲液，其配置方法是：量取1M Tris-HCl(pH6.8)0.6ml；50％的甘油5ml；10％的SDS溶液2ml；1％的溴酚蓝1ml；加入去离子水定容至10ml；分装200μl每管；在4℃保存，使用前加入β-巯基乙醇50μl。

与样品使用时按照蛋白上样缓冲液：样品＝1：4使用。

Western Blot的具体过程：

1)电泳：等量收集的样品加入蛋白上样缓冲液，煮沸10min。20μl样品上样，80V电压电泳15min左右直到蛋白样品被压成一条直线，加压到120V大约1h后上样缓冲液在底部为止。

2)转膜：PVDF膜浸泡在甲醇中，卸下凝胶，按照预染Marker的指示位置切取目的条带大小的胶条置于滤纸上，按照顺序盖上滤纸和海绵，转膜架夹紧后，置于转膜液中，300mA转膜90min。

3)封闭：取出PVDF膜，TBS稍洗后放入封闭液中封闭2h。

4)孵育Ⅰ抗：按1:1000加入鼠源HBV核心蛋白单克隆抗体混匀，4℃过夜。

5)洗膜：TBST洗涤3次，每次7min。

6)孵育Ⅱ抗：用TBST按1:2000稀释驴抗鼠HBV核心蛋白二抗，室温孵育1h。

7)洗膜：TBST洗涤3次，每次7min。

8)曝光：现配曝光液，在凝胶成像系统中进行曝光。

HBV pre-c-Fc蛋白的表达P4病毒转染细胞后于不同时间点收获相同体积细胞上清进行Western Blot鉴定。如图8所示，结果表明，转染36小时开始表达蛋白，84h时蛋白的表达量最高；MOI为4时蛋白表达相对最高。

2.HBV pre-c-Fc蛋白的纯化

根据如上结果，用感染复数MOI为4的P4病毒侵染Sf9细胞，84h时收获转染病毒的上清，用50KDa超滤离心管(MILIPORE)处理，上样于20mM PB平衡过的HiTrap Protein G HP(GE)，用0.1M甘氨酸-盐酸洗脱，将各部分样品跑SDS-PAGE分析蛋白洗脱效果。

将收获的细胞及上清上样于蛋白G柱，如图9所示，从洗脱样品的聚丙烯酰胺凝胶条带来看，目的蛋白在洗脱液0.1M甘氨酸-盐酸洗脱后每1ml收集样品，条带相对单一，由SDS-PAGE条带分析结果显示，蛋白纯度达到90％以上。由于重组蛋白中含有小鼠IgG Fc片段，因而可能会发生聚合现象，因而在高分子量处出现条带，在25kD处出现的条带由于降解所致。经测定，蛋白产量约为3.03mg/L。

3.免疫小鼠

将BALB/c小鼠随机分为3组，每组6只。空白对照组大腿内侧肌肉注射生理盐水，阳性对照组注射大肠杆菌来源的HBV核心蛋白(Asiapeptide亚肽生物)，实验组注射HBV pre-c-Fc 20μg/只，分别于0d，14d，28d共进行三次实验，于首次免疫后6周眼眶取血，血清储存于-80℃备用。

血清中抗体的检测：

分别使用HBV核心蛋白抗体免疫酶联反应(Elisa)试剂盒(InTec英科)，每孔加入PBS稀释2倍的血清100μl/孔。酶标仪450nm波长下检测吸光度值。具体步骤如下：

1)平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温(18-25℃)，微孔板开封后，余下的部分及时自封袋封存。

2)配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀。浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按照1：19的比例稀释后使用。

3)编号：将微孔条固定于支架上，按序编号。

临床诊断依据的样品必须将原倍血清样品按1：30稀释后再检验，稀释液应采用生理盐水或10M PBS；作为流行病学调查依据可以使用原倍血清检验。

4)加样：分别在每孔中加入阴性阳性对照血清各50μl或待测血清样品50μl到相应孔中。

5)加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50μl，轻拍混匀。

6)温育：放置在37℃。60min，再室温5min。

7)洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干(每次应保持30-60s的浸泡时间)。

8)显色：每孔加底物A、B各50μl，轻拍混匀，37℃暗置15min。

9)终止：每孔加入终止液50μl，混匀。

10)测定：用酶标仪单波长450nm或者双波长450/630nm测定各孔的OD值。

小鼠血清中HBV核心蛋白抗体的免疫酶联检测结果显示，对比于HBV c抗体免疫酶联检测试剂盒中的阳性和阴性对照，HBVpre-c-Fc蛋白组小鼠中大多数都有免疫反应，而大肠杆菌来源的标准蛋白HBV核心蛋白组小鼠仅有一只有阳性反应，生理盐水组小鼠没有阳性反应。如图9所示，t检验结果也显示：HBV pre-c-Fc蛋白和大肠杆菌生产的HBV核心蛋白免疫后两组小鼠的血清抗体产生量有显著性差异(p＝0.0044<0.05,n＝6)。图9中的穿出液指流出液，即含有蛋白的洗脱流出液。

HBV前c蛋白作为乙型肝炎病毒蛋白的表达前体蛋白，能够转变成HBV c蛋白和HBV e蛋白，HBV前c蛋白是参与慢性乙型肝炎感染过程的一个关键的病毒蛋白，例如下调先天的免疫应答。如果针对其病毒蛋白，或可提供一个新的潜在的治疗方法。目前市场上大多是以乙型肝炎病毒的s蛋白免疫蛋白的肌肉注射疫苗。但仍然有乙型肝炎病毒发生逃逸现象而无法免疫，因而仍然有很大潜在性感染慢性乙型肝炎。并且市场上的乙型肝炎疫苗大多采用大肠杆菌表达或者酵母菌表达，缺乏一定的糖基化，从而使得免疫原性大大降低。需要寻找新的免疫手段预防乃至治疗慢性乙型肝炎。

杆状病毒表达系统对于疫苗生产方面有以下几点优势：能够容纳较大外源基因插入而不影响表达；杆状病毒转染起1-2周即可完成蛋白的表达和纯化，疫苗正需要较短完成生产；能够对目的蛋白进行翻译后加工，昆虫细胞对蛋白的翻译后加工与哺乳动物十分接近，但是又有所不同，能够增加疫苗的免疫原性。

1989年，Capon等首次在《自然》上报道了一种能够结合HIV囊膜蛋白gp120，阻碍HIV-1感染T细胞和单核细胞的CD4-Fc融合蛋白。此后，基于抗体Fc段的Fc融合蛋白研究和开发在世界范围内得到迅速的发展。Santiago T等人研究表明，APC的表面表达有Fc受体，所以抗原-Fc融合蛋白可以作为抗原的运载工具，借助Fc片段靶向作用结合APC，从而缩短抗原在血液中的游离时间，减少酶对抗原的降解，因而能够提高抗原半衰期，加强抗原的呈递作用。

本实验对重组HBV前c蛋白融合小鼠IgG Fc(HBV pre-c-Fc)的cDNA进行昆虫细胞密码子优化，融合杆状病毒转染了sf9昆虫细胞。将转染后不同时间点收获的蛋白进行Western Blot鉴定，结果显示：自转染36小时开始表达目的蛋白，84h时达到表达量最大值(图8)。转染84h后收获的蛋白经过蛋白G亲和层析柱后，纯度达到90％以上(图9)。纯化后蛋白产量经过BCA法检测为3.03mg/L。并且对小鼠免疫后的血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体抗体Elisa检测(图10)，由于鼠源IgG的提高抗原半衰期和加强抗原的呈递作用，该重组融合蛋白HBV pre-c-Fc能够大大提高小鼠的免疫反应。

目前，对于慢性乙型肝炎的治疗药物缺乏，而药物带来的副作用也无法估计。如若能够利用患者自身的免疫系统清除乙型肝炎病毒，将是比较理想的治疗方案。本发明对继续深入探究和尝试，从增强免疫方面引导患者自身免疫系统，加大对乙型肝炎病毒的识别和清除，从而治愈乙型肝炎提供了重要科研基奠。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种重组HBV pre-c-Fc蛋白质分子，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。

2.一种DNA分子，其编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的DNA分子和与所述DNA分子连接的用于表达的调节序列。

4.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的DNA分子。

5.一种获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、对如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列进行密码子优化得到如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，之后通过人工合成如SEQID NO:2所示的核苷酸序列并将其构建到pUC57质粒上得到pUC57HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤二，

步骤二、以pUC57HBV pre-c-Fc重组载体为模板，利用如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列的基因片段并将其构建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤三，

步骤三、利用步骤二得到的pFastBac-HBV pre-c-Fc重组载体转座含有Bacmid质粒的E.Coli DH10Bac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-HBV pre-c-Fc重组载体；之后进入步骤四，

步骤四，利用Bacmid-HBV pre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒。

6.如权利要求5所述的获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，在所述步骤四之后还包括步骤五：

将步骤四中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞以表达得到第二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法直到得到第四代重组杆状病毒。

7.如权利要求5所述的获得重组杆状病毒的方法，其特征在于，所述步骤四中，利用Bacmid-HBV pre-c-Fc重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒的具体过程为：

(4.1)从含有Bacmid-HBV pre-c-Fc载体的E coli DH5α菌株中提取Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒；

(4.2)取对数生长期的Sf9细胞，加入到六孔板中，每孔8×10⁵个；

(4.3)静置30min使得Sf9细胞贴于下壁；

(4.4)取8μl细胞转染试剂加入到100μl的昆虫细胞培养基中混匀，取1μl Bacmid-HBV pre-c-Fc质粒加入到100μl昆虫细胞培养基中混匀，然后将两种混合液混合，即得到转染混合物；

(4.5)将转染混合物滴加到细胞中，27℃孵育3-5小时；

(4.6)弃去转染混合物，加入2ml新的昆虫细胞培养基，27℃

下培养72h；其中，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

8.一种重组杆状病毒，其特征在于，由如权利要求5至7任一项所述的方法获得。

9.一种生产重组HBV pre-c-Fc蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求8所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞，分离纯化产生的重组HBV pre-c-Fc蛋白。

10.权利要求8所述重组杆状病毒在制备预防或治疗乙型肝炎的疫苗或药物中的应用。