CN105671081A - 利用昆虫细胞表达系统制备鸡akirin2蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用昆虫细胞表达系统制备Akirin2蛋白的方法，该方法包括根据昆虫细胞偏爱密码子对鸡Akirin2基因进行密码子优化、Akirin2序列合成、PCR扩增Akirin2、构建杆状病毒表达载体pFastBac1-his-thrombin-Akirin2、在昆虫细胞sf9中进行pFastBac1-his-thrombin-Akirin2杆状病毒载体包装、鸡Akirin2病毒蛋白的表达和纯化等步骤。本发明所述的方法具有较高的表达水平，可以生产的带有适当的翻译蛋白便于蛋白的修饰，简化细胞生长条件。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种利用昆虫细胞表达系统制备Akirin2蛋白的方法。
背景技术
Akirin是Goto等在2008年对果蝇细胞进行功能性全基因组的RNAi筛选时发现的一种天然免疫蛋白。Akirin由201个氨基酸组成，在不同的物种间高度保守。高等的哺乳动物包括人、牛、小鼠、大鼠和犬等均发现了Akirin1和Akirin2两个基因，且哺乳动物之间Akirin2的同源性明显高于Akirin1的同源性。在鸡中只有akirin2基因，在植物、细菌和酵母中未发现该基因。
研究表明，Akirin2在果蝇和小鼠的免疫炎症反应中起着重要作用，是天然免疫反应信号通路如Imd和TLR所必须的核内因子，并参与到NF-κB依赖的基因转录中，促进多种免疫应答基因的转录。而且Akirin2的存在促进IL-6的表达，在获得性免疫中，IL-6能够刺激已经分化的B淋巴细胞的生长，因此，Akirin2与先天性免疫和获得性免疫均有关联。Goto等发现，敲除Akirin1的小鼠胚胎可正常发育，但Akirin2敲除小鼠胚胎无法正常发育，表明Akirin2是小鼠胚胎正常生长发育所必需的。Akirin还参与动物肌肉的生长发育，研究发现Akirin2基因单核苷酸多态性与日本黑牛的肌内脂肪分布存在相关性
常用的蛋白表达系统主要有原核表达系统，其蛋白表达量较高，但产物往往为包涵体，不具备生物活性；酵母表达系统对表达产物的糖基化修饰不完全；而哺乳动物细胞表达系统虽然能够对表达产物进行糖基化等修饰，产生活性蛋白，但其表达水平较低、不易于放大，而且细胞生长条件要求较高。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用昆虫细胞表达系统制备Akirin2蛋白的方法，简化细胞培养条件，提高蛋白表达水平、以生产带有适当修饰的活性蛋白。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：
利用昆虫细胞表达系统制备Akirin2蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
1)根据昆虫细胞偏爱密码子对鸡Akirin2基因进行密码子优化，得到优化后的鸡Akirin2基因序列SEQIDNO:1；
2)Akirin2序列的合成：化学合成优化后的鸡Akirin2基因序列，将其合成到pUC57载体上，得到的载体命名为pUC57-Akirin2；
3)PCR扩增Akirin2：在扩增引物中引入His标签、BamHI+HindIII酶切位点，以pUC57-Akirin2为模板，PCR扩增Akirin2基因，用琼脂糖凝胶回收目的条带，得到扩增产物；
4)构建杆状病毒表达载体：pFastBac1载体质粒和扩增产物分别BamHI+HindIII双酶切，回收得到质粒pFastBac1BamHI+HindIII大片段和Akirin2基因酶切产物，并将两者连接，再经过转化、测序鉴定，挑取正确的重组克隆，得到杆状病毒表达载体命名为pFastBac1–his–thrombin-Akirin2；
5)在昆虫细胞sf9中进行pFastBac1-his-thrombin-Akirin2杆状病毒包装：重组pFastBac1-his-thrombin-Akirin2并转染至sf9细胞，制备P1病毒原种，并对病毒进行鉴定，得到重组病毒；
6)鸡Akirin2重组病毒的增殖：将获得的重组病毒按MOI＝0.05-0.1接种sf9细胞，48h-96h后收获上清，用于病毒滴度测定。应用此步骤反复感染sf9细胞提高病毒滴度。
进一步的方案中，该方法还包括在步骤6)之后的7)鸡Akirin2蛋白的表达和纯化：将高滴度重组病毒感染对数生长期的sf9细胞，24h-96h后收集细胞，经离心、亲和层析的方法得到鸡Akirin2蛋白。
具体的，本发明所述的步骤3)中，扩增引物包括：
pFastBac1-Akirin-F1：5‘-ATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTTGTGGTGCCACTCTCAAGCGTACT-3’
pFastBac1-Akirin-BamHIF2：5‘-CGCGGATCCATGCATCACCATCACCATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTTG-3’
pFastBac1-Akirin-HindIII-R：5‘-CCCAAGCTTTTAGGACACGTAGGAGGCGGGCTGTTCA-3’。
具体的，本发明所述的步骤3)中PCR反应体系为：
PCR反应条件为：95℃变性3min，1个循环；95℃变性20s，30个循环；55℃退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸5min，1个循环。
进一步的方案中，本发明所述的步骤4)具体如下：
①pFastBac1载体质粒和扩增产物分别BamHI+HindIII双酶切：pFastBac1载体质粒BamHI+HindIII双酶切过程在37℃水浴进行，酶切体系为质粒pFastBac11μg，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，ddH2Oupto20μl；扩增产物过程在37℃水浴进行，酶切体系为扩增产物14μl，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl。
②酶切产物的连接：连接反应在22℃反应，连接反应体系为Akirin2基因酶切产物6μl，质粒pFastBac1BamHI+HindIII大片段2μl，10×DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl；
③连接产物的转化：上述连接产物与JM109感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激后立即置冰上放置，加入培养基，37℃恒温摇床培养，离心后弃去部分培养上清，剩余部分培养上清用移液器混匀后均匀涂布于含Ampicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜；
④产物测序鉴定：转化产物中挑取1个单菌落接种Ampicillin抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，经质粒BamHI+HindIII双酶切鉴定，挑选正确的克隆细胞，即为pFastBac1–his–thrombin-Akirin2。
进一步的方案中，本发明所述的步骤5)具体如下：
①在六孔板中接种上述正确的克隆细胞，采用含有FBS的SF-Ⅱ900SFM培养基使细胞贴培养壁；
②制备pFastBac1-his-thrombin-Akirin2与CellfectinReagent复合物：用SF-Ⅱ900SFM培养基稀释Bacmid和CellfectinReagent，将两种稀释液合并，混匀，室温孵育15-45min；期间将六孔板中的培养基吸掉，用SF-Ⅱ900SFM培养基洗涤一次，去掉培养基；得到复合物
③在含有210ul的复合物的管内加入8SF-Ⅱ900SFM培养基轻轻混匀，加到每个孔中；
④将六孔板内的细胞在27℃恒温箱中孵育；
⑤去掉复合物混合液，每孔加入完全培养基，在27℃湿度培养箱中孵育直到细胞出现病毒感染迹象；
⑥将步骤⑤中的上层培养基转移到无菌带盖的EP管中，500g离心5min以去除细胞及大的碎片。用蛋白结合率低的0.2μm的滤膜过滤；
⑦将滤膜过滤上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中，得到的病毒液。
进一步的方案中，本发明所述的步骤6)具体如下：
①感染当天，在细胞培养瓶中接种5×106个细胞，用含有FB的SSF-Ⅱ900SFM使细胞贴壁；按MOI＝0.05-0.1加入病毒液，27℃培养48h-96h；
②按照步骤①反复感染sf9细胞提高病毒滴度。
进一步的方案中，本发明所述的步骤7)具体为：
①将扩增后的重组病毒感染对数生长期的sf9细胞，24h-96h后离心收集细胞，用12mL结合缓冲液重悬，并加入20μL100mmol/LPMSF，冰浴条件下超声破碎至细胞悬液清亮，4℃、10000r/min离心30min去除细胞碎片，取上清用0.45μm孔径滤膜过滤；
②取1mLNi-NTA，用10倍柱床体积的BindingBuffer，清洗平衡柱子，流速2mL/min；将鸡Akirin2病毒上柱，流速为1mL/min，收集穿透液；用10倍柱床体积的WashBuffer：清洗柱子，流速2mL/min；然后用ElutionBuffer洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明所用基因序列在昆虫细胞中进行过密码子优化，与没优化过的基因序列相比，可以避免利用率低和稀有密码子对蛋白表达造成的影响；
2、本发明采用化学合成鸡Akirin2基因的方法，与传统组织提取DNA或RNA获得目的基因的方法相比，基因合成无需模板，因而不受基因来源限制，更经济、简便、省时省力；
3、本发明以杆状病毒作为表达载体，以昆虫细胞作为生物反应器制备鸡Akirin2蛋白，与细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统相比，因sf9细胞生长条件简单，可无CO2、无血清、27℃生长，因此具有节省成本、产量高、可大规模制备的优点。
附图说明
图1为本发明所述的pFastBac1载体图谱；
图2为pFastBac1-his-thrombin-Akirin2质粒酶切鉴定结果图；
图3为本发明的方法所得到的P1代病毒感染SF9显微镜下细胞生长结果；
图4为SDS-PAGE检测鸡Akirin2蛋白溶解于咪唑的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明所述的利用昆虫细胞表达系统制备Akirin2蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
1)根据昆虫细胞偏爱密码子对鸡Akirin2基因进行密码子优化，得到优化后的鸡Akirin2基因序列SEQIDNO:1；
2)pUC57-Akirin2载体制备：化学合成优化后的鸡Akirin2基因序列，将其克隆到pUC57载体上，得到的载体命名为pUC57-Akirin2；
3)PCR扩增Akirin2：在扩增引物中引入His标签、BamHI+HindIII酶切位点，以pUC57-Akirin2为模板，PCR扩增Akirin2基因，用琼脂糖凝胶回收目的条带，得到扩增产物；
4)构建杆状病毒表达载体：pFastBac1载体质粒和扩增产物分别BamHI+HindIII双酶切，回收得到质粒pFastBac1BamHI+HindIII大片段和Akirin2基因酶切产物，并将两者连接，再经过转化、测序鉴定，挑取正确的重组克隆，得到杆状病毒表达载体命名为pFastBac1–his–thrombin-Akirin2；
5)在昆虫细胞sf9中进行pFastBac1-his-thrombin-Akirin2杆状病毒包装：重组pFastBac1-his-thrombin-Akirin2并转染至sf9细胞，制备P1病毒原种，并对病毒进行鉴定，得到重组病毒；
6)鸡Akirin2重组病毒增殖：将获得的重组病毒按MOI＝0.05-0.1接种sf9细胞，48h-96h后收获上清，用于病毒滴度测定。
进一步的方案中，该方法还包括在步骤6)之后的7)鸡Akirin2蛋白的表达和纯化：将高滴度重组病毒感染对数生长期的sf9细胞，24h-96h后收集细胞，经离心、亲和层析的方法得到鸡Akirin2蛋白。
具体的，本发明所述的步骤3)中，扩增引物包括：
pFastBac1-Akirin-F1：5‘-ATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTTGTGGTGCCACTCTCAAGCGTACT-3’(SEQIDNO:2)
pFastBac1-Akirin-BamHIF2：5‘-CGCGGATCCATGCATCACCATCACCATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTTG-3’(SEQIDNO:3)
pFastBac1-Akirin-HindIII-R：5‘-CCCAAGCTTTTAGGACACGTAGGAGGCGGGCTGTTCA-3’(SEQIDNO:4)。
具体的，本发明所述的步骤3)中PCR反应体系为：
PCR反应条件为：95℃变性3min，1个循环；95℃变性20s，30个循环；55℃退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸5min，1个循环。
进一步的方案中，本发明所述的步骤4)具体如下：
①pFastBac1载体质粒和扩增产物分别BamHI+HindIII双酶切：pFastBac1载体质粒BamHI+HindIII双酶切过程在37℃水浴进行，酶切体系为质粒pFastBac11μg，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，ddH2Oupto20μl；扩增产物过程在37℃水浴进行，酶切体系为扩增产物14μl，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl。
②酶切产物的连接：连接反应在22℃反应，连接反应体系为Akirin2基因酶切产物6μl，质粒pFastBac1BamHI+HindIII大片段2μl，10×DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl；
③连接产物的转化：上述连接产物与JM109感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激后立即置冰上放置，加入培养基，37℃恒温摇床培养，离心后弃去部分培养上清，剩余部分培养上清用移液器混匀后均匀涂布于含Ampicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜；
④产物测序鉴定：转化产物中挑取1个单菌落接种Ampicillin抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，经质粒BamHI+HindIII双酶切鉴定，挑选正确的克隆细胞，即为pFastBac1–his–thrombin-Akirin2。
进一步的方案中，本发明所述的步骤5)具体如下：
①在六孔板中接种上述正确的克隆细胞，采用含有FBS的SF-Ⅱ900SFM培养基使细胞贴培养壁；
②制备pFastBac1-his-thrombin-Akirin2与CellfectinReagent复合物：用SF-Ⅱ900SFM培养基稀释Bacmid和CellfectinReagent，将两种稀释液合并，混匀，室温孵育15－45min；期间将六孔板中的培养基吸掉，用SF-Ⅱ900SFM培养基洗涤一次，去掉培养基；得到复合物
③在含有210ul的复合物的管内加入8SF-Ⅱ900SFM培养基轻轻混匀，加到每个孔中；
④将六孔板内的细胞在27℃恒温箱中孵育；
⑤去掉复合物混合液，每孔加入完全培养基，在27℃湿度培养箱中孵育直到细胞出现病毒感染迹象；
⑥将步骤⑤中的上层培养基转移到无菌带盖的EP管中，500g离心5min以去除细胞及大的碎片。用蛋白结合率低的0.2μm的滤膜过滤；
⑦将滤膜过滤上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中，将得到的病毒液。
进一步的方案中，本发明所述的步骤6)具体如下：
①感染当天，在细胞培养瓶中接种5×106个sf9细胞，用含有FB的SSF-Ⅱ900SFM使细胞贴壁；按MOI＝0.05-0.1加入病毒液，27℃培养48h-96h；
②按照步骤①反复感染sf9细胞提高病毒滴度。
进一步的方案中，本发明所述的步骤7)具体为：
①将扩增后的重组病毒感染对数生长期的sf9细胞，24h-96h后离心收集细胞，用12mL结合缓冲液重悬，并加入20μL100mmol/LPMSF，冰浴条件下超声破碎至细胞悬液清亮，4℃、10000r/min离心30min去除细胞碎片，取上清用0.45μm孔径滤膜过滤；
②取1mLNi-NTA，用10倍柱床体积的BindingBuffer，清洗平衡柱子，流速2mL/min；将鸡Akirin2病毒上柱，流速为1mL/min，收集穿透液；用10倍柱床体积的WashBuffer：清洗柱子，流速2mL/min；然后用ElutionBuffer洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的载体、试剂及其他原料和和设备均可以通过购买方式获得。
实施例1
利用昆虫细胞表达系统制备Akirin2蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
1)参考GenBank上公布的鸡Akirin2基因序列(NO：HM357352)，根据昆虫细胞偏爱密码子对鸡Akirin2基因进行密码子优化，得到优化后的鸡Akirin2基因序列如SEQIDNO.1所示；
2)pUC57-Akirin2载体制备：化学合成优化后的鸡Akirin2基因序列，将其克隆到pUC57载体上，得到的载体命名为pUC57-Akirin2；
3)PCR扩增Akirin2：在扩增引物中引入His标签、BamHI+HindIII酶切位点，
扩增引物包括：
pFastBac1-Akirin-F1：5‘-ATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTTGTGGTGCCACTCTCAAGCGTACT-3’(SEQIDNO:2)
pFastBac1-Akirin-BamHIF2：5‘-CGCGGATCCATGCATCACCATCACCATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTTG-3’(SEQIDNO:3)
pFastBac1-Akirin-HindIII-R：5‘-CCCAAGCTTTTAGGACACGTAGGAGGCGGGCTGTTCA-3’(SEQIDNO:4)。
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：95℃变性3min，1个循环；95℃变性20s，30个循环；55℃退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸5min，1个循环；
用琼脂糖凝胶回收目的条带，得到扩增产物；
4)构建杆状病毒表达载体：
①pFastBac1载体质粒和扩增产物分别BamHI+HindIII双酶切：pFastBac1载体质粒(图谱如图1所示)BamHI+HindIII双酶切过程在37℃水浴进行，酶切体系为质粒pFastBac11μg，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，ddH2Oupto20μl；扩增产物过程在37℃水浴进行，酶切体系为扩增产物14μl，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl。
②酶切产物的连接：连接反应在22℃反应，连接反应体系为Akirin2基因酶切产物6μl，质粒pFastBac1BamHI+HindIII大片段2μl，10×DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl；
③连接产物的转化：上述连接产物与JM109感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激45s后立即置冰上放置2min，加入400μlLB培养基，37℃恒温摇床培养1h，4000rpm离心1min，弃去400μl培养上清，剩余100μl用移液器混匀后均匀涂布于含100μg/mlAmpicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜；
④产物测序鉴定：转化产物中挑取1个单菌落接种于含5ml，100μg/mlAmpicillin抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，经质粒BamHI+HindIII双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，阳性克隆可切出612bp的条带，挑选正确的细胞克隆，命名为pFastBac1–his–thrombin-Akirin2；
5)在昆虫细胞sf9中进行pFastBac1-his-thrombin-Akirin2杆状病毒包装：
①在六孔板中接种8×105个细胞/2ml/孔上述克隆细胞，采用含有终浓度为2％FBS的SF-Ⅱ900SFM培养基27℃培养1h，使细胞贴壁；
②制备pFastBac1-his-thrombin-Akirin2与CellfectinReagent复合物：用100μlSF-Ⅱ900SFM培养基稀释1μgBacmid，用100μlSF-Ⅱ900SFM培养基稀释6μlCellfectinReagent，将两种稀释液合并，混匀，室温孵育15-45min；期间将六孔板中的培养基吸掉，用2mlSF-Ⅱ900SFM培养基洗涤一次，去掉培养基；得到复合物
③在含有上述复合物的管内加入800μlSF-Ⅱ900SFM培养基轻轻混匀，加到每个孔中；
④将六孔板内的细胞在27℃恒温箱中孵育5h；
⑤去掉复合物混合液，每孔加入完全培养基(SF-Ⅱ900SFM培养基，含双抗、10％FBS)，在27℃湿度培养箱中孵育直到细胞出现病毒感染迹象；
⑥将步骤⑤中的上层培养基转移到无菌带盖的EP管中，500g离心5min以去除细胞及大的碎片。用蛋白结合率低的0.2μm的滤膜过滤；
⑦将滤膜过滤上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中，得到P1病毒液。
6)鸡Akirin2重组病毒扩增：
①感染当天，将获得的重组病毒按MOI＝0.05-0.1接种5×106个胞sf9细胞，用含有FB的SSF-Ⅱ900SFM使细胞贴壁；按MOI＝0.05-0.1加入病毒液，27℃培养48h，显微镜下细胞生长结果如图3所示；
②应用①步骤反复感染sf9细胞提高病毒滴度；
7)鸡Akirin2蛋白的表达和纯化：
①将高滴度重组病毒感染对数生长期的sf9细胞，24h-96h后离心收集细胞，用12mL结合缓冲液重悬，并加入20μL100mmol/LPMSF，冰浴条件下超声破碎至细胞悬液清亮，4℃、10000r/min离心30min去除细胞碎片，取上清用0.45μm孔径滤膜过滤；
②取1mLNi-NTA，用10倍柱床体积的BindingBuffer(50mMTris(PH8.0)，500mMNaCl，0.1％TritonX-100，1mMDTT，5％甘油)清洗平衡柱子，流速2mL/min；将鸡Akirin2病毒上柱，流速为1mL/min，收集穿透液；用10倍柱床体积的WashBuffer(PH8.0的50mMTris，500mMNaCl，0.1％TritonX-100，1mMDTT，5％甘油，20mM咪唑)清洗柱子，流速2mL/min；然后用ElutionBuffer洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，洗脱液用SDS-PAGE检测，结果如图4所示。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.利用昆虫细胞表达系统制备Akirin2蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)根据昆虫细胞偏爱密码子对鸡Akirin2基因进行密码子优化，得到优化后的鸡Akirin2基因序列SEQIDNO:1；
2)Akirin2序列的合成：化学合成优化后的鸡Akirin2基因序列，将其合成到pUC57载体上，得到的载体命名为pUC57-Akirin2；
3)PCR扩增Akirin2：在扩增引物中引入His标签和BamHI+HindIII酶切位点，以PUC57-Akirin2为模板，PCR扩增Akirin2基因，用琼脂糖凝胶回收目的条带，得到扩增产物；
4)构建杆状病毒表达载体：pFastBac1载体质粒和扩增产物分别BamHI+HindIII双酶切，回收得到质粒pFastBac1BamHI+HindIII大片段和Akirin2基因酶切产物，并将两者连接，再经过转化、测序鉴定，挑取正确的重组克隆，得到杆状病毒表达载体命名为pFastBac1–his–thrombin-Akirin2；
5)在昆虫细胞sf9中进行pFastBac1-his-thrombin-Akirin2杆状病毒包装：重组pFastBac1-his-thrombin-Akirin2转染至sf9细胞，制备P1病毒原种，并对病毒进行鉴定，得到重组病毒；
6)鸡Akirin2重组病毒的增殖：将获得的重组病毒按MOI＝0.05-0.1接种sf9细胞，48h-96h后收获上清，用于病毒滴度测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括在步骤6)之后的
7)鸡Akirin2蛋白的表达和纯化：将高滴度重组病毒感染对数生长期的sf9细胞，24h-96h后收集细胞，经离心、亲和层析的方法得到鸡Akirin2蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中，扩增引物包括：
pFastBac1-Akirin-F1：5‘-ATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTTGTGGTGCCACTCTCAAGCGTACT-3’
pFastBac1-Akirin-BamHIF2：5‘-CGCGGATCCATGCATCACCATCACCATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCGCTTG-3’
pFastBac1-Akirin-HindIII-R：5‘-CCCAAGCTTTTAGGACACGTAGGAGGCGGGCTGTTCA-3’。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中PCR反应体系为：
PCR反应条件为：95℃变性3min，1个循环；95℃变性20s，30个循环；55℃退火30s，72℃延伸2min；72℃延伸5min，1个循环。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4)具体如下：
①pFastBac1载体质粒和扩增产物分别BamHI+HindIII双酶切：pFastBac1载体质粒BamHI+HindIII双酶切过程在37℃水浴进行，酶切体系为质粒pFastBac11μg，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，ddH2Oupto20μl；扩增产物过程在37℃水浴进行，酶切体系为扩增产物14μl，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl。
②酶切产物的连接：连接反应在22℃反应，连接反应体系为Akirin2基因酶切产物6μl，质粒pFastBac1BamHI+HindIII大片段2μl，10×DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl；
③连接产物的转化：上述连接产物与JM109感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激后立即置冰上放置，加入培养基，37℃恒温摇床培养，离心后弃去部分培养上清，剩余部分培养上清用移液器混匀后均匀涂布于含Ampicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜；
④产物测序鉴定：转化产物中挑取1个单菌落接种Ampicillin抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，经质粒BamHI+HindIII双酶切鉴定，挑选正确的细胞克隆，即为pFastBac1–his–thrombin-Akirin2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5)具体如下：
①在六孔板中接种上述正确的克隆细胞，采用含有FBS的SF-Ⅱ900SFM培养基使细胞贴培养壁；
②制备pFastBac1-his-thrombin-Akirin2与CellfectinReagent复合物：用SF-Ⅱ900SFM培养基稀释Bacmid和CellfectinReagent，将两种稀释液合并，混匀，室温孵育15-45min；期间将六孔板中的培养基吸掉，用SF-Ⅱ900SFM培养基洗涤一次，去掉培养基；得到复合物
③在含有上述复合物的管内加入SF-Ⅱ900SFM培养基轻轻混匀，加到每个孔中；
④将六孔板内的细胞在27℃恒温箱中孵育；
⑤去掉复合物混合液，每孔加入完全培养基，在27℃湿度培养箱中孵育直到细胞出现病毒感染迹象；
⑥将步骤⑤中的上层培养基转移到无菌带盖的EP管中，离心以去除细胞及大的碎片，然后用蛋白结合率低的0.2μm的滤膜过滤；
⑦将滤膜过滤上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中，将得到的病毒液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤6)具体如下：
①感染当天，在细胞培养瓶中接种5×106个sf9细胞，用含有FB的SSF-Ⅱ900SFM使细胞贴壁；按MOI＝0.05-0.1加入病毒液，27℃培养48h-96h；
②步骤①反复感染sf9细胞提高病毒滴度。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7)具体为：
①将扩增后的重组病毒感染对数生长期的sf9细胞，24h-96h后离心收集细胞，用12mL结合缓冲液重悬，并加入20μL100mmol/LPMSF，冰浴条件下超声破碎至细胞悬液清亮，4℃、10000r/min离心30min去除细胞碎片，取上清用0.45μm孔径滤膜过滤；
②取1mLNi-NTA，用10倍柱床体积的BindingBuffer清洗平衡柱子，流速2mL/min；将鸡Akirin2病毒上柱，流速为1mL/min，收集穿透液；用10倍柱床体积的WashBuffer清洗柱子，流速2mL/min；然后用ElutionBuffer洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液。
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