CN109055295A - 一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，首先使用组合酶将马尾松针叶细胞酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。本发明构建得到马尾松原生质体瞬时表达系统，易于操作和实现，该方法的转化效率可达60％，为马尾松功能基因研究提供了快速便捷的研究平台。本发明所使用的酶解体系适用于马尾松实生苗，利用幼嫩的针叶可得到较高质量的原生质体，原生质体活力可达80％以上，对于野外的成熟叶组织也适用。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法。
背景技术
马尾松(Pinus massoniana lamb.)，松科(Pinaceae)松属(Pinus)双维管亚属(Subgen.Pinus)油松组(Sect.Pinus)常绿大乔木，原产于台湾，广泛分布于中国中部及以南(包括香港)和越南北部南方等亚热带地区。马尾松不仅是南方重要的材用树种，还是荒山恢复森林的先锋树种，在造林绿化、花粉和次生产物的利用上也有着广泛的应用，具有较高的经济价值和生态价值。
原生质体是进行遗传转化的理想受体，也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料，在细胞工程学、育种学、生物工程学等研究领域都得到了应用。目前，植物原生质体被广泛应用于研究瞬时表达、启动子分析、种质资源改良等领域。近年来，利用原生质体进行亚细胞定位、蛋白互作以及基因沉默与表达等研究在水稻和玉米等模式物种中常有报道。在原生质体瞬时表达系统具有检测快速、通量高等特点，结合报告基因的使用，该技术已被广泛用于目标基因表达、蛋白亚细胞定位、启动子及蛋白活性检测、蛋白与蛋白互作等基因功能分析研究。
早前有关马尾松分子生物学方面的研究多集中在遗传多样性、遗传连锁图谱构建等方面，近年来，随着转录组测序技术的发展，在马尾松中的研究也逐步开始展开。但目前关于马尾松基因组及转录组的数据仍较为缺乏，造成马尾松生长发育相关研究等研究相对滞后。目前马尾松的基因克隆进度多止步于定量验证，在基因功能验证方面的研究平台较为欠缺。由于裸子植物遗传背景的复杂性，以及在组培体系建立的困难，其遗传转化体系的构建上存在较高的难度，在马尾松中还尚未有过文献进行报道。因此，开发马尾松的原生质体酶解体系和瞬时表达体系，对马尾松中的分子克隆和遗传育种的深入研究有着重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，为马尾松的基因功能验证等提供快速便捷的研究平台。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，首先使用组合酶液将马尾松针叶酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG(polyethylene glycol)法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。
所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，组合酶含有1-3％vol纤维素酶和0.1-0.5％vol果胶酶。
所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，包括如下步骤：
1)取5-25天马尾松实生苗幼嫩针叶，切成细条状备用；
2)5mL组合酶液体系的配制：0.6M甘露醇、20mM MES、50mM KCl、组合酶，10mMCaCl2和0.1wt％BSA；0.45μm滤膜过滤灭菌；
3)将步骤1)的细条状针叶放入步骤2)制得的酶液中浸透，28℃静置4-6h；
4)在步骤3)的反应液中加入与酶液等体积的W5溶液，于冰上通过200目细胞筛过滤至50mL圆底管中；900rpm，4℃离心5min，吸出上清，再加入1-2mL W5溶液，轻柔摇匀，并用血球计数板计数；置于冰上黑暗静置15min，使原生质体沉于管底吸出上清，并加入MMG或WI将原生质体溶液的细胞浓度稀释成104-106个/mL，并重悬；
5)在EP管中加入5-25μg质粒，100μL步骤4)获得的原生质体悬混液，110μL 20-50wt％PEG溶液；轻柔混匀，室温孵育15-45min；加入1mL W5溶液，混匀后于1000rpm水平离心5min，吸出上清；并加入100μL WI溶液，并于25℃暗培16-24h。
步骤1)中，取10天的马尾松实生苗幼嫩针叶，切成细条状备用。
步骤2)中，组合酶为：2％vol纤维素酶，0.125％vol果胶酶。
步骤3)中，酶解5h。
步骤4)中，WI溶液组分中甘露醇浓度为0.6M。
步骤4)中，MMG溶液中甘露醇浓度为0.5M。
步骤5)中，在100μL浓度为106的原生质体中，加入45％的PEG4000、15ng质粒孵化30分钟，使用1mL W5终止反应，在100μL的WI溶液中暗培16-18h。
有益效果：与现有技术相比，本发明构建得到马尾松原生质体瞬时表达系统，易于操作和实现，该方法的转化效率可达60％。本发明适用于马尾松实生苗，利用幼嫩的针叶可得到较高质量的原生质体，原生质体活力可达80％以上。对于野外的成熟叶组织也适用，为马尾松功能基因研究提供了快速便捷的研究平台。
附图说明
图1是马尾松原生质体的制备图；
图2是马尾松嫩叶经酶解和纯化后得到的原生质体图；
图3是在马尾松针叶细胞原生质体中eGFP蛋白的亚细胞定位情况图；
图4是利用FDA对马尾松针叶原生质体活力的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中，所使用的主要试剂配方如下：
W5溶液配方为：2mM pH为5.7的MES，154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，溶剂为水，0.2μm滤膜过滤灭菌，-40℃保存。
MMG溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.5M甘露醇，15mM MgCl2溶液，溶剂为水，0.2μm滤膜过滤灭菌，-40℃保存。
PEG溶液配方为：15-45wt％PEG4000或PEG6000，0.2-0.6M甘露醇、50-150mM CaCl2溶液，溶剂为水。PEG溶液一般现配现用，应在转化试验开始前1小时配好，使其慢慢溶解，用0.45μm的滤膜过滤灭菌。本次实验分别使用Sigma公司的PEG4000和PEG6000，以及Fluka的PEG6000进行条件优化。
WI溶液配方为：4mM pH为5.7的MES，0.6M甘露醇、20mM KCl溶液，溶剂为水，0.2μm滤膜过滤灭菌，-40℃保存。
质粒为p2FGW7.0，携带eGFP表达报告基因；有效转化的PEG溶液为110μL45wt％PEG4000溶液。
本发明中酶活的定义为：Sigma纤维素酶(≥700U/mL)，Sigma果胶酶(≥3800U/mL)。
实施例1马尾松原生质体的制备
1)材料选择：5-25天马尾松实生苗幼嫩针叶；
2)酶液配制(5mL体系)：0.6M甘露醇、20mM MES(pH＝5.7)、50mM KCl、组合酶(表1)，10mM CaCl2和0.1wt％BSA；0.45μm滤膜过滤灭菌；
3)马尾松原生质体的制备：将针叶切成细条状，放入步骤2)制得的酶液中浸透，28℃静置4-6h；
表1酶液组成及浓度
表中，1-6所使用的为Yakult公司生产的相关酶：纤维素酶R-10(Cellulase R10，5000U/g)、RS(Cellulase RS，16000U/g)、果胶酶Y23(Pectolyase Y23，1000U/g)，离析酶R-10(Macerozyme R10，3000U/g)。7-8为Sigma公司生产的纤维素酶(700U/mL)和果胶酶(3800U/mL)。
酶解结果如表2所示，表明不同的酶液组合对于马尾松针叶原生质体的获得效率有着较为显著的影响。从表2可以看出，相同纤维素酶组合和浓度下，Yakult公司的离析酶R-10比果胶酶Y23的酶解效果高；而在相同的果胶酶浓度下，纤维素R-10比RS的酶解效果要好。而Sigma的纤维素酶和果胶酶在同时加倍的情况下，其酶解效率并没有很大的提高。但综合酶解时间上来看，若要达到同样的酶解效率，Sigma的纤维素酶和果胶酶能够更加节省时间。
表2不同酶液组成及浓度对杨树针叶原生质体分离的影响
| 编号 | 酶解时间(h) | 原生质体产量/GFW |
| 1 | 4 | 1.85±0.65×10<sup>6</sup> |
| 2 | 4 | 1±0.6×10<sup>6</sup> |
| 3 | 4 | 0.2±0.2×10<sup>6</sup> |
| 4 | 6 | 5.15±0.45×10<sup>6</sup> |
| 5 | 6 | 2.3±0.65×10<sup>6</sup> |
| 6 | 6 | 0.85±0.05×10<sup>6</sup> |
| 7 | 3 | 2.17±0.12×10<sup>6</sup> |
| 8 | 3 | 2.25±0.07×10<sup>6</sup> |
实施例2
马尾松原生质体的制备方法同实施例1，本实施例中对于酶解时间、苗期、纤维素酶和果胶酶的浓度分别对马尾松实生苗幼叶进行酶解条件的试验。其中，酶解时间梯度为2-6h；苗期从萌芽开始计数，时间梯度为5-25天；纤维素酶浓度梯度为0-3％vol；而果胶酶浓度梯度为0-0.5％vol。
结果如图1和图2以及表3所示，图1中，上排L1、L2为马尾松嫩叶酶解过程，下排L1、L2为纯化后的马尾松原生质体。图2是马尾松嫩叶经酶解和纯化后得到的原生质体(比例尺＝100μm)，从图中可以看出，本实施例可以得到状态均一、活力较高的针叶原生质体。从表3可以看出，对于幼叶，最佳的酶解条件为：2％vol纤维素酶，0.125％vol果胶酶，10天的幼叶酶解5h。
表3不同条件下马尾松针叶原生质体酶解效率
| 序号 | 酶解时间(h) | 苗期(d) | 纤维素酶(％) | 果胶酶(％) | 产量(×10<sup>5</sup>) |
| 1 | 2 | 15 | 2 | 0.5 | 14.2 |
| 2 | 3 | 10 | 3 | 0.25 | 128.9 |
| 3 | 4 | 25 | 0 | 0.125 | 3.2 |
| 4 | 5 | 20 | 1 | 0 | 0 |
| 5 | 2 | 25 | 1 | 0.25 | 18.3 |
| 6 | 3 | 20 | 0 | 0.5 | 4.6 |
| 7 | 4 | 15 | 3 | 0 | 0 |
| 8 | 5 | 10 | 2 | 0.125 | 145.8 |
注：表中的产量为原生质体产量/GFW。
实施例3马尾松原生质体PEG转化
1)在实施例1或2的酶解反应液中加入与酶液等体积的W5溶液，于冰上通过200目细胞筛过滤至50mL圆底管中；900rpm，4℃离心5min，吸出上清，再加入1-2mL W5溶液，轻柔摇匀，并用血球计数板计数；置于冰上黑暗静置15min，使原生质体沉于管底吸出上清，并加入一定体积的MMG将原生质体溶液的细胞浓度稀释成104-106个/mL，并重悬。
2)在EP管中加入5-25μg质粒，100μL获得的原生质体悬混液，110μL20-50wt％PEG溶液；轻柔混匀，室温孵育15-45min；加入1mL W5溶液，混匀后于1000rpm水平离心5min，吸出上清；并加入100μL WI溶液，并于25℃暗培16-24h。
采用上述方法，以马尾松针叶原生质体为转化材料，并且利用eGFP标签的空载体进行转化实验，其中，PEG的种类有Sigma公司的PEG4000(A)和PEG6000(B)，以及Fluka的PEG6000(C)，分别设置浓度梯度15-45％；原生质体浓度梯度为104-107；孵化时间梯度为：15-45分种；质粒质量梯度为：5-15ng；而暗培的时间梯度为：16-24h。
表4不同条件下马尾松针叶原生质体转化效率
结果如表4所示，可见马尾松针叶原生质体转化条件为：在100μL浓度为106的针叶原生质体中，加入PEG溶液，其组分为：30％PEG4000、100mM CaCl2、0.4M甘露醇，并加入10ng质粒孵化30分钟，使用1mL W5终止反应，在100μL的WI溶液中暗培16-18h。最终在荧光显微镜下观察，如图3所示，分别从10倍镜(比例尺＝100μm)和63倍镜(比例尺＝10μm)对于转化成功的原生质体细胞进行拍摄，可以看出，含有eGFP融合蛋白在整个细胞中都可以表达，本发明所获得的转化效率达到60％。
实施例4
在实施例1或2的酶解反应液中加入与酶液等体积的W5溶液，于冰上通过200目细胞筛过滤至50mL圆底管中；900rpm，4℃离心5min，吸出上清，再加入1-2mL W5溶液，轻柔摇匀，并用血球计数板计数；置于冰上黑暗静置15min，使原生质体沉于管底吸出上清，并加入一定体积的MMG将原生质体溶液的细胞浓度稀释成104-106个/mL，并重悬。
本实施例中将提取的原生质体分别在MMG和WI溶液中暗培24h，并用FDA检测细胞活力，图4是利用FDA对马尾松针叶原生质体活力的检测结果(比例尺＝100μm)，表明不同酶解条件下原生质体呈现出不同的活力。从表5可以看出，当MMG中的甘露醇浓度为0.5M时，MMG溶液中原生质体的活力最高；而当WI中的甘露醇浓度为0.6M时，WI溶液中原生质体的活力最高。
表5 WI溶液和MMG培养后的马尾松叶原生质体活力
Claims (9)
1.一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，首先使用组合酶将马尾松针叶酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。
2.根据权利要求1所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，组合酶含有1-3％vol纤维素酶和0.1-0.5％vol果胶酶。
3.根据权利要求1或2所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取5-25天马尾松实生苗幼嫩针叶，切成细条状备用；
2)5mL组合酶液体系的配制：0.6M甘露醇、20mM MES、50mM KCl、组合酶，10mM CaCl2和0.1wt％BSA；0.45μm滤膜过滤灭菌；
3)将步骤1)的细条状针叶放入步骤2)制得的酶液中浸透，28℃静置4-6h；
4)在步骤3)的反应液中加入与酶液等体积的W5溶液，于冰上通过200目细胞筛过滤至50mL圆底管中；900rpm，4℃离心5min，吸出上清，再加入1-2mL W5溶液，轻柔摇匀，并用血球计数板计数；置于冰上黑暗静置15min，使原生质体沉于管底吸出上清，并加入MMG或WI将原生质体溶液的细胞浓度稀释成104-106个/mL，并重悬；
5)在EP管中加入5-25μg质粒，100μL步骤4)获得的原生质体悬混液，110μL 15-45wt％PEG溶液；轻柔混匀，室温孵育15-45min；加入1mL W5溶液，混匀后于1000rpm水平离心5min，吸出上清；并加入100μL WI溶液，并于25℃暗培16-24h。
4.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤1)中，取10天的马尾松实生苗幼嫩针叶，切成细条状备用。
5.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤2)中，组合酶为：2％vol纤维素酶，0.125％vol果胶酶。
6.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤3)中，酶解5h。
7.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤4)中，WI溶液组分中甘露醇浓度为0.6M。
8.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤4)中，MMG溶液中甘露醇浓度为0.5M。
9.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤5)中，在100μL浓度为106的原生质体中，加入45％的PEG4000、15ng质粒孵化30分钟，使用1mL W5终止反应，在100μL的WI溶液中暗培16-18h。
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