CN103789252B

CN103789252B - 一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法

Info

Publication number: CN103789252B
Application number: CN201410052434.6A
Authority: CN
Inventors: 黄玉碧; 张军杰; 陈江; 刘汉梅; 胡育峰; 刘应红; 余国武; 顾勇
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2034-02-17
Also published as: CN103789252A

Abstract

本发明公开了一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法，涉及细胞工程领域。本发明是取授粉后6天到8天的玉米珠心组织，高渗处理后酶解，然后再用含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，制得珠心原生质体；最后采用PEG诱导转化。本发明操作简单，制备珠心原生质数量大、活性高，原生质细胞转化效率高，为后续基因功能分析，特别是有关细胞程序化死亡机理解析提供有力的技术支持。

Description

一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，尤其涉及的是一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法。

背景技术

植物原生质体指去除细胞壁并被质膜所包围的具有生活力的细胞。其结构包括细胞膜、细胞质和细胞核等部分。植物原生质体去除了细胞壁的保护，因而较易从外界摄入病毒、细菌、细胞器、细胞核、蛋白质、核酸等。植物原生质体这些特点，使其在基础理论研究及生物工程技术中都有重要利用。

原生质体的制备主要包括材料选择、材料预处理及原生质体的分离等过程。通常选用植物幼嫩组织作为原生质体制备材料，如幼根、子叶下胚轴、子叶、根及根毛等。研究表明不同组织原生质体的制备效率存在差异，如子叶原生质体制备效率高于叶、子叶下胚轴及根的原生质体制备。原生质体的分离前，通常会对材料进行预处理。材料预处理目的主要是改变细胞和细胞壁的生理状态，提高细胞壁酶解的效率，减少原生质体损伤的。高渗处理及暗处理是材料预处理常用的方法，如在紫罗兰原生质体制备时，将下胚轴先甘露醇高渗处理，再进行酶解，可提高原生质体制备效率。原生质体的分离主要有两种方式：机械分离法及酶解分离法。相对于机械分离法而言，酶解分离法是大量分离原生质体的常用方法。酶解分离原生质体中，纤维素酶和果胶酶是酶解过程中主要两种酶。纤维素酶主要用于酶解植物细胞壁主要成分纤维素，而果胶酶主要是用于分离酶解后原生质体细胞。在植物原生质体制备过程中，多种因素响原生质体的制备效率，包括材料细胞壁的厚度，酶解液渗透压，酶解时间，酶解过程中摇晃速度等情况。

植物原生质体的转化通常指原生质体细胞吸收外源核酸等，为外源核酸等提供一个行使功能的场所。原生质体的转化是进行下一步试验，特别是基因功能研究等试验的重要步骤。PEG（polyethyleneglycol）诱导转化植物原生质体是较早发现并利用较多的试验，PEG浓度过高过低都不利于原生质体的转化，PEG浓度过高会加快原生质体的融合，浓度过低转化效率也很低，并且PEG中加入MgCl₂能提高原生质体的转化效率。利用电击仪电击原生质体是另外一种原生质体转化方法，M.Nishiguchi试验首次利用电击转化实验将烟草花叶病毒RNA转化到了原生质体中。R.M.Hauptmann等在双子叶和单子叶植物中原生质体的电击转化系统进行了探索。此外，显微注射转化原生质体也是方法之一。目前，以上三种转化方法在原生质体的转化上都有利用，而对不同的实验内容及实验目的，为提高原生质体转化效率，需选择适合本身试验的最佳转化方法及体系。

植物原生质体制备和转化技术最为常见也最为成熟的是叶片原生质体的制备。叶片原生质体制备相关实验技术，在对目的蛋白进行亚细胞定位、蛋白活性、蛋白与蛋白间相互作用及基因调控都有很好利用。Lee,Y.等利用拟南芥叶片原生质体技术，借助于荧光标记蛋白GFP，鉴定了AtOEP7蛋白跨膜区及C端7个氨基酸在靶定到叶绿体中的重要作用。Worley,C.K.利用烟草叶片原生质体等技术，证明生长素响应因子PSIAA6参与生长素信号调控，该蛋白的降解为信号传导过程中的必须过程。ShuichiYanagisawa等利用拟南芥叶片原生质体相关技术，进一步阐明了转录因子EIN3参与了葡萄糖和乙烯相互作用信号的传递。

虽然叶片原生质体的利用在基础理论研究中取得了巨大成功，但对不同生理过程及代谢途径而言，叶片原生质体并不是通用载体对象。

珠心是高等植物胚囊周围的一种特殊组织。珠心在胚囊的发育过程中起了重要作用。研究报道，珠心的降解主要是为胚及胚乳提供营养物质，珠心停止降解将会导致胚乳发育的停止。珠心也是植物细胞程序化死亡研究的理想组织，珠心组织降解过程中存在着多种细胞程序化死亡方式，这对深入研究细胞程序化死亡机理具有重要意义。目前，对胚乳发育过程了解较为详细，但对胚乳发育调控研究还不清楚；同时，植物细胞程序化死亡机理的研究仍不清楚。珠心原生质体的制备及转化相关实验技术的利用将会为解决相关科学问题提供有力的技术支撑。

至今，国内外还未曾发现有对珠心细胞原生质体的制备及转化相关研究报道，由于珠心材料的特殊性，使其原生质体制备与转化都与叶片原生质体制备有所不同。同时，相对于其他植物而言，玉米珠心组织发育成熟后寿命较长，组织较大，易于分析，因此选用玉米珠心组织为对象，对玉米珠心原生质体的制备及转化条件进行摸索。该试验技术的成功探索，将为其他植物珠心原生质体的制备及转化提供借鉴，同时为研究玉米胚囊发育及细胞程序化死亡提供技术支撑。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法。

本发明的技术方案如下：

一种玉米珠心原生质体的制备方法，其步骤如下：

（1）在授粉后6天到8天，取玉米珠心组织2g，加入20mL浓度为0.6M的甘露醇高渗暗处理10分钟，去除甘露醇后加入20mL酶解液，立即用真空泵在压力0.04x10⁵Pa-0.05x105Pa之间抽真空30min，然后酶解，酶解条件是28℃恒温摇床，80rpm黑暗情况下摇4-6小时，在摇的过程中，隔一小时用手来回晃荡两次，使其充分酶解；

（2）将（1）中酶解后的珠心混合液加入W5溶液终止酶解反应后，80g水平离心3min，弃去上清，用4mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，重悬液转移至5mL的EP管中自然放置30分钟；然后弃去上清，保留下面沉淀，再用2mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，制得珠心原生质体；

所述的酶解液如下表所示：

所述的W5溶液如下表所示：

所述的0.55M甘露醇的MMG溶液如下表所示：

所述制备方法制得的玉米珠心原生质体的转化方法，是在离心管中加入10μg质粒DNA，其体积不超过20μl，再加入玉米珠心原生质体100μL，轻轻混合；然后采用PEG诱导转化，加入W5终止转化过程后，80g水平离心3min，弃去上清，用500μL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬培养，培养12小时后进行相应试验分析。

本发明操作简单，制备珠心原生质数量大、活性高，原生质细胞转化效率高，为后续基因功能分析，特别是有关细胞程序化死亡机理解析提供有力的技术支持。

附图说明

图1为不同授粉时期玉米籽粒解剖图：授粉后2-16天间隔两天解剖图；其中A表示籽粒，B表示解剖图。

图2为珠心取材及材料预处理流程图：其中，A为用镊子剥去种皮；B为挑去珠心；C为分离胚乳和珠心细胞；D为等渗放置；E为高渗处理；F为加入酶解液。

图3为不同渗透压梯度存储对珠心原生质体影响图：其中，A为0.25M甘露醇的MMG溶液；B为0.35M甘露醇的MMG溶液；C为0.45M甘露醇的MMG溶液；D为0.55M甘露醇的MMG溶液；E为0.65M甘露醇的MMG溶液；注：图片在体视显微镜下用10x10照相观测图。

图4为制备珠心原生质体及存放时间图：其中，A为制备珠心原生质体图；B为珠心原生质体存放2天后观测图；C为2天后珠心原生质体细胞用台酚蓝染色后图片；注：图片在体视显微镜下用10x10照相观测图。

图5为原生质体转化荧光图：其中，A为未转化YFP的珠心原生质体细胞；B为转化YFP后培养12小时候的珠心原始质体细胞；注：此图在尼康荧光显微镜下10x10观测。

图6为改造YFP质粒的原始质粒pBI221：主要是用YFP基因替换掉质粒pBI221上的GUS基因。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例

1、取材及处理：玉米材料大田种植管理，套袋授粉，标好授粉日期。玉米珠心细胞从授粉后1-10天都存在，不宜选择在6天前及8天后的材料。授粉后6天前的珠心细胞很多代谢过程还未开始，此外由于珠心太小，不易将珠心和胚乳分离。而授粉后8天后的珠心细胞大部分开始降解。实验结果表明，选取授粉后7天的材料用于珠心原生质体制备较好（图1）。选取授粉后7天左右的玉米籽粒，取回实验室处理。用75%酒精消毒后的小镊子沿籽粒基部划一道口子后，剥去外层种皮（图2A），随后用镊子的一支脚挑取整个珠心组织（图2B），分离去除胚乳组织（图2C），挑出的珠心组织首先放在0.2M的甘露醇中保存（图2D）。挑取至2g左右的珠心组织后，用纱布过滤珠心组织，用滤纸吸干，然后用20ml0.6M甘露醇高渗暗处理10分钟（图2E），处理完后用纱布过滤，用滤纸吸干，倒入配好的酶解液20ml（图2F）。

2、珠心细胞的酶解：酶解液配方如表1所示，采用广口锥形瓶配制酶解液。特别注意的是在加入CaCl₂和BSA前，先将原液在55℃水浴锅中热激活10min，为了让酶解液充分溶解，热激活中途需摇晃两次，放至室温后加入CaCl₂和BSA。将配好的酶液加入到经甘露醇处理过的珠心组织后，立即用真空泵在压力0.04x10⁵Pa-0.05x10⁵Pa之间抽真空30min，进行酶解。酶解条件是28℃恒温摇床，80rpm黑暗情况下摇5小时，中间隔1小时用手剧摇晃一次。根据珠心组织的多少来选择用多少酶液，保证酶解液能完全淹没珠心组织，一般情况下，2g的珠心组织用20ml酶解液处理。

表1酶解液

3、酶解后处理：酶解后，加入等体积的W5（表2），用手剧烈摇动5s，然后用40μm尼龙过滤网过滤，用W5溶液再清洗酶解残渣2-3次，收集所有过滤液。将过滤液转移至10ml圆底EP管中，水平离心机80g，离心3min，用1ml移液枪吸取并去除上清。加入MMG溶液（表3）进行轻轻重悬（20ml酶解液体系，用4mlMMG溶液进行重悬），收集所有重悬液体，转移到5mlEP管中，室温自然沉淀30min，吸取上层液体，留下下层沉淀，保证珠心原生质体的完整性和纯度。然后再加入2mlMMG（表3）重悬保存备用。需注意的是所用的吸取原生质体的枪头都要用剪刀剪掉枪头尖端部位，然后高压灭菌处理。

此外，MMG渗透压对珠心的存储影响很大，实验中用0.35M（图3A）、0.45M（图3B）、0.55M（图3C）、0.65M（图3D）甘露醇的MMG溶液进行处理，结果表明用0.55M甘露醇的MMG对珠心的存储效果较好，并且制备的珠心原生质体在4℃储存2天后仍有高活性的原生质体存在（图4）。

表2W5溶液

表3MMG溶液

4、珠心原生质体瞬时转化：最后用于转化时，使重悬液体中原生质体浓度达到一定浓度（图5A）。在2mL离心管中加入10μg质粒DNA，含YFP标记基因质粒（由本实验室自备，制备过程为将pBI221载体为原始载体（图6），用BamHI和Sal进行酶切切除GUS基因，同时连接上带有BamHI和Sal酶切位点的YFP基因），质粒加入体积不超过20μL。加入步骤3中用含0.55M甘露醇的MMG溶液制得的原生质体100μL轻轻混合。加入120μLPEG（表4）溶液，充分混合。放置于25℃黑暗处理15min。用500μLW5溶液稀释上述液体，颠倒混匀液体终止转化反应。水平离心80g，3min，去除上清。再加入500mL含0.55M甘露醇的MMG溶液（表3）重悬原生质体，倾斜放置暗培养12小时。根据不同应用目的，使用所获得的瞬时表达了基因的原生质体。按照此方法制备及转化的原生质体转化率有50%以上（图5B）。

表4PEG溶液

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种玉米珠心原生质体的制备方法，其特征是，其步骤如下：

(1)在授粉后6天到8天，取玉米珠心组织2g，加入20ml浓度为0.6M的甘露醇高渗暗处理10分钟，去除甘露醇后加入20ml酶解液，立即用真空泵在压力0.04x10⁵Pa-0.05x10⁵Pa之间抽真空30min，然后酶解，酶解条件是28℃恒温摇床，80rpm黑暗情况下摇4-6小时，在摇的过程中，隔一小时用手来回晃荡两次，使其充分酶解；

(2)将(1)中酶解后的珠心混合液加入W5溶液终止酶解反应后，80g水平离心3min，弃去上清，用4mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，重悬液转移至5mL的EP管中自然放置30分钟；然后弃去上清，保留下面沉淀，再用2mL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬，制得玉米珠心原生质体；所述酶解液如下表所示：

所述W5溶液如下表所示：

所述0.55M甘露醇的MMG溶液如下表所示：

2.根据权利要求1所述的制备方法制得的玉米珠心原生质体的转化方法，其特征在于，在离心管中加入10μg质粒DNA，其体积不超过20μl，再加入玉米珠心原生质体100μL，轻轻混合；然后采用PEG诱导转化，加入W5溶液终止转化过程后，80g水平离心3min，弃去上清，用500μL含0.55M甘露醇的MMG溶液重悬培养，培养12小时后进行相应试验分析。