CN109402068A - 一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，属于生物技术及微生物技术领域。本发明提供的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，通过多次血清浓度逐渐降低的培养液培养BHK‑21细胞，将猪伪狂犬病毒接种于已经适应低浓度血清培养的BHK‑21细胞，并在接种病毒时使用无血清培养液进行培养，就能得到大量无血清残留的猪伪狂犬病毒；采用低浓度的血清培养细胞并使用无血清培养液培养病毒能很好的节约成本，技术成熟，且易于推广。

Description

一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法
技术领域
本发明涉及生物技术及微生物技术领域，具体而言，涉及一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法。
背景技术
猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)具有广泛的细胞嗜性，可在多种动物细胞中增殖，如猪肾细胞、兔肾细胞、牛睾丸细胞、鸡胚成纤维细胞等原代细胞和PK15、Vero、ST、BHK-21等传代细胞，并产生明显的细胞病变。但不同病毒株在不同的细胞上增殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量均有所差别。生产中根据不同毒株对细胞敏感性差异挑选合适细胞株以期达最佳生产效率。BHK-21细胞来源广，生物安全性高，对猪伪狂犬病毒感染敏感且病毒滴度高是生产猪伪狂犬病毒抗原的理想细胞。但现有工艺基本上使用含8％-10％血清的DMEM或MEM培养基培养BHK21细胞，并使用含1％～2％血清的DMEM或MEM培养液制备猪伪狂犬病毒。
近几年随着牛血清价格的不断攀升且供货的紧张，对疫苗生产产生明显的限制。尽管市场上应运而生出各种低血清培养基、无血清培养基、定制化专用培养基。使用无血清或低血清培养基在一定程度上降低了生产成本，但无血清培养基或低血清培养基，成本依然较高。并且其中添加的动物源成分的蛋白质对疫苗的安全性难以考究，因此急需更为经济的猪伪狂犬病毒规模化制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，使用该方法可以显著降低猪伪狂犬病毒的生产成本，制备出无血清残留，无额外水解蛋白添加物的猪伪狂犬病毒液。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤：
用2.5％-4％的新生牛血清与0.1％-4％的TPB溶液混合的细胞培养液重悬培养宿主细胞连续培养5代，传代比例为1:6-8，得到初代宿主细胞；
用0.5％-1.5％的新生牛血清与0.1％-0.8％的TPB溶液混合的细胞培养液重悬并培养初代宿主细胞，传代比为1:4，待初代宿主细胞长满单层后；以0.5％-1.5％的新生牛血清与0.1％-0.8％的TPB溶液混合的细胞培养液连续传代5-7代，传代比为1:6-8，得到低血清宿主细胞；
将猪伪狂犬病毒接种于低血清宿主细胞，并以无血清细胞培养液维持培养，低血清宿主细胞发生病变，收取细胞培养液，得到猪伪狂犬病毒液。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，通过多代次血清浓度逐渐降低的培养液培养BHK-21细胞，然后将猪伪狂犬病毒接种于已经适应低浓度血清的BHK-21细胞，接种后使用无血清的细胞培养液进行维持培养，就能得到大量无血清残留的猪伪狂犬病毒；采用该方法可以实现猪伪狂犬病毒的规模化制备，其制备成本仅为无血清或低血清培养基的1/5～1/10，能很好的节约成本，技术成熟，且易于推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供不同血清浓度培养BHK-21细胞显微镜观察图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面对本发明实施例的一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法进行具体说明。
一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤：
用2.5％-4％的新生牛血清与0.1％-4％的TPB溶液混合的细胞培养液重悬培养宿主细胞连续培养5代，传代比例为1:6-8，得到初代宿主细胞；
用0.5％-1.5％的新生牛血清与0.1％-0.8％的TPB溶液混合的细胞培养液重悬并培养初代宿主细胞，传代比为1:4，待初代宿主细胞长满单层后；以0.5％-1.5％的新生牛血清与0.1％-0.8％的TPB溶液混合的细胞培养液连续传代5-7代，传代比为1:6-8，得到低血清宿主细胞；
将猪伪狂犬病毒接种于低血清宿主细胞，并以无血清细胞培养液维持培养，低血清宿主细胞发生病变，收取细胞培养液，得到猪伪狂犬病毒液。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，宿主细胞为BHK-21细胞。
宿主细胞可以有很多种选择，本发明中，优选宿主细胞为BHK-21细胞。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，宿主细胞由原代宿主细胞接种于8％-10％新生牛血清细胞培养液进行复苏培养；然后以2.5％-4％的新生牛血清与0.1％-4％的TPB溶液混合的细胞培养液进行原代传代培养得到。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，细胞培养液包括但不限定于DMEM、MEM和RPMI 1640。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，原代传代的传代比为1:3-8。
将低温冻存的原代宿主细胞通过几代的培养，使细胞恢复活性，便于后续进行的连续传代培养。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，TPB溶液由TPB母液稀释得到，TPB母液由TPB干粉溶解于PBS溶液，并以0.22μm滤膜过滤除菌得到。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，猪伪狂犬病毒以0.1％-5％的体积比接种于低血清宿主细胞。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，猪伪狂犬病毒的含量为106.0-109.5TCID50/mL。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，当70％-95％的低血清宿主细胞发生病变，收取细胞培养液。
在进行细胞培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，本方法中以BHK-21细胞作为宿主细胞；具体的培养方法包括配制TPB溶液、BHK-21细胞驯化和猪伪狂犬病毒培养。
配制TPB溶液，称取6gTPB干粉溶解于100mL的PBS溶液中，并用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到TPB母液，通过稀释TPB母液可以得到各种浓度的TPB工作液。
BHK-21细胞驯化和猪伪狂犬病毒的培养；
1.1将液氮罐中冻存无外源污染的BHK-21细胞作为原代宿主细胞，以含10％新生牛血清DMEM培养液复苏至T75细胞瓶中，置37℃含5％二氧化碳培养箱中培养复苏至致密单层备用；
1.2将复苏的BHK-21细胞进行消化，以2.5％的新生牛血清与0.1％的TPB溶液混合的DMEM培养液进行原代传代培养得到宿主细胞，传代比为1:6；
1.3用2.5％的新生牛血清与0.1％的TPB溶液混合的DMEM培养液培养经原代传代的宿主细胞BHK-21细胞，并连续培养5代，传代比为1:8，得到初代宿主细胞BHK-21细胞；
1.4传至第6代，以0.5％的新生牛血清与0.1％的TPB溶液混合的DMEM培养液重悬并培养初代宿主细胞BHK-21细胞，传代比为1:4；
1.5待初代宿主细胞BHK-21细胞长满单层后，以0.5％的新生牛血清与0.1％的TPB溶液混合的DMEM培养液连续传代7代，传代比为1:8，得到适应低浓度血清的低血清BHK-21细胞；
1.6将致密单层的低血清BHK-21细胞的培养基去掉，并将病毒含量为107.5TCID50/mL的猪伪狂犬病毒SA215株毒种，以1％的体积比接种于低血清BHK-21细胞；
1.7然后以无血清DMEM培养液置37℃含5％二氧化碳培养箱中维持培养24h左右；
1.8待80％以上BHK-21细胞发生病变，收获细胞培养液，即为猪伪狂犬病毒液。
实施例2
本实施例提供一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，本方法中以BHK-21细胞作为宿主细胞；具体的培养方法包括配制TPB溶液、BHK-21细胞驯化和猪伪狂犬病毒培养。
配制TPB溶液，称取6gTPB干粉溶解于100mL的PBS溶液中，并用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到TPB母液，通过稀释TPB母液可以得到各种浓度的TPB工作液。
BHK-21细胞驯化和猪伪狂犬病毒的培养；
1.1将液氮罐中冻存无外源污染的BHK-21细胞作为原代宿主细胞，以含8％新生牛血清DMEM培养液复苏至T75细胞瓶中，置37℃含5％二氧化碳培养箱中培养复苏至致密单层备用；
1.2将复苏的BHK-21细胞进行消化，以4％的新生牛血清与4％的TPB溶液混合的DMEM培养液进行原代传代培养得到宿主细胞，传代比为1:3；
1.3用4％的新生牛血清与4％的TPB溶液混合的DMEM培养液培养经原代传代的宿主细胞BHK-21细胞，并连续培养5代，传代比为1:8，得到初代宿主细胞BHK-21细胞；
1.4传至第6代，以0.5％的新生牛血清与0.1％的TPB溶液混合的DMEM培养液重悬并培养初代宿主细胞BHK-21细胞，传代比为1:4；
1.5待初代宿主细胞BHK-21细胞长满单层后，以0.5％的新生牛血清与0.1％的TPB溶液混合的DMEM培养液连续传代7代，传代比为1:8，得到适应低浓度血清的低血清BHK-21细胞；
1.6将致密单层的低血清BHK-21细胞的培养基去掉，并将病毒含量为108.0TCID50/mL的猪伪狂犬病毒SA215株毒种以0.8％的体积比接种于低血清BHK-21细胞；
1.7然后以无血清DMEM培养液置37℃含5％二氧化碳培养箱中维持培养24h左右；
1.8待80％以上BHK-21细胞发生病变，收获细胞培养液，即为猪伪狂犬病毒液。
实施例3
本实施例提供一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，本方法中以BHK-21细胞作为宿主细胞；具体的培养方法包括配制TPB溶液、BHK-21细胞驯化和猪伪狂犬病毒培养。
配制TPB溶液，称取6gTPB干粉溶解于100mL的PBS溶液中，并用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，得到TPB母液，通过稀释TPB母液可以得到各种浓度的TPB工作液。
BHK-21细胞驯化和猪伪狂犬病毒的培养；
1.1将液氮罐中冻存无外源污染的BHK-21细胞作为原代宿主细胞，以含9％新生牛血清DMEM培养液复苏至T75细胞瓶中，置37℃含5％二氧化碳培养箱中培养复苏至致密单层备用；
1.2将复苏的BHK-21细胞进行消化，以3％的新生牛血清与1.5％的TPB溶液混合的DMEM培养液进行原代传代培养得到宿主细胞，传代比为1:8；
1.3用3％的新生牛血清与1.5％的TPB溶液混合的DMEM培养液培养经原代传代的宿主细胞BHK-21细胞，并连续培养5代，传代比为1:7，得到初代宿主细胞BHK-21细胞；
1.4传至第6代，以1％的新生牛血清与0.5％的TPB溶液混合的DMEM培养液重悬并培养初代宿主细胞BHK-21细胞，传代比为1:4；
1.5待初代宿主细胞BHK-21细胞长满单层后，以1％的新生牛血清与0.6％的TPB溶液混合的DMEM培养液连续传代7代，传代比为1:8，得到适应低浓度血清的低血清BHK-21细胞；
1.6将致密单层低血清BHK-21细胞的培养基去掉，并将病毒含量为109.5TCID50/mL的猪伪狂犬病毒SA215株毒种以0.5％的体积比接种于低血清BHK-21细胞；
1.7然后以无血清DMEM培养液置37℃含5％二氧化碳培养箱中维持培养24h左右；
1.8待95％的BHK-21细胞发生病变，收获细胞培养液，即为猪伪狂犬病毒液。
实验例1
本实验例以实施例1提供的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法与常规培养方法进行比较，测定不同批次培养猪伪狂犬病毒的TCID50。
验证BHK-21细胞驯化结果，将常规方法培养的BHK-21细胞，以含3％新生牛血清+0.5％TPB的DMEM培养，BHK-21细胞能快速适应，细胞增殖活性与形态良好，按1:6进行传代，48h可长成致密单层。以含3％新生牛血清+0.5％TPB的DMEM培养液连续传代培养5代后，更换1％新生牛血清+0.5％TPB的DMEM培养液，细胞生长速度与细胞形态均良好，按1:6进行传代，48h可长成致密单层；与10％新生牛血清培养无明显差异。结果如图1和表1所示。
表1细胞驯化过程中的各指标
如图1和表1所示，图1中A表示10％新生牛血清培养细胞48h形态，B表示3％新生牛血清+0.5％TPB培养细胞48h形态；C表示1％新生牛血清+0.5％TPB培养细胞48h形态，可以看出各代的细胞无明显差异；不同浓度的培养液平均细胞收获量以及平均细胞活性差距不明显。
在步骤1.6接种的猪伪狂犬病毒中，分别以传代第3代的低血清BHK-21细胞、第4代的低血清BHK-21细胞和第5代的低血清BHK-21细胞，按1％(V/V)接种猪伪狂犬病毒SA215株毒种(108.0TCID50/mL)，以无血清DMEM培养液维持培养至90％以上细胞病变时，收获病毒液，连续培养3批猪伪狂犬病毒。测得的猪伪狂犬病毒含量如表2所示。
表2不同代次细胞培养猪伪狂犬病毒结果
第3代细胞培养病毒含量为108.5TCID50/mL；第4代细胞培养病毒含量为109.0TCID50/mL；第5代细胞病毒含量为109.0TCID50/mL。适应低血清培养的BHK-21细胞培养猪伪狂犬病毒SA215株，病毒含量较高，且培养结果稳定。
以含10％新生牛血清的DMEM培养液培养BHK-21细胞与猪睾丸细胞(ST)，按1％(V/V)接种猪伪狂犬病毒SA215株毒种(108.0TCID50/mL)，以无血清DMEM培养液维持培养至90％以上细胞病变时，收获病毒液，两种细胞分别连续培养3批猪伪狂犬病毒。测定不同批次培养猪伪狂犬病毒的TCID50。实验结果见表3所示。
表3不同条件培养猪伪狂犬病毒对比试验结果
以1％新生牛血清+0.5％TPB培养的BHK-21细胞，连续培养3批猪伪狂犬病毒SA215株，病毒含量分别为109.5、109.25、108.75TCID50/mL；最高效价可达109.5TCID50/mL，显著高于10％NBS培养的BHK21细胞和10％NBS培养的ST细胞。。
综上所述，通过上述的实验说明本方法使用低浓度血清驯化培养细胞后，在培养猪伪狂犬病毒完全不会影响病毒的效价。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
用2.5％-4％的新生牛血清与0.1％-4％的TPB溶液混合的细胞培养液重悬培养宿主细胞连续培养5代，传代比例为1:6-8，得到初代宿主细胞；
用0.5％-1.5％的新生牛血清与0.1％-0.8％的TPB溶液混合的细胞培养液重悬并培养所述初代宿主细胞，传代比为1:4；
待所述初代宿主细胞长满单层后；以所述0.5％-1.5％的新生牛血清与0.1％-0.8％的TPB溶液混合的细胞培养液连续传代5-7代，传代比为1:6-8，得到低血清宿主细胞；
将猪伪狂犬病毒接种于所述低血清宿主细胞，并以无血清细胞培养液维持培养，所述低血清宿主细胞发生病变，收取细胞培养液，得到猪伪狂犬病毒液。
2.根据权利要求1所述的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所示宿主细胞为BHK-21细胞。
3.根据权利要求2所述的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述宿主细胞由原代宿主细胞接种于8％-10％新生牛血清细胞培养液进行复苏培养；然后以2.5％-4％的新生牛血清与0.1％-4％的TPB溶液混合的细胞培养液进行原代传代培养得到。
4.根据权利要求3所述的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述细胞培养液包括但不限定于DMEM、MEM和RPMI 1640。
5.根据权利要求4所述的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述原代传代的传代比为1:3-8。
6.根据权利要求2所述制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述TPB溶液由TPB母液稀释得到，所述TPB母液由TPB干粉溶解于PBS溶液，并以0.22μm滤膜过滤除菌得到。
7.根据权利要求6所述的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒以0.1％-5％的体积比接种于所述宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒的含量为106.0-109.5TCID50/mL。
9.根据权利要求1所述的制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，当70％-95％的所述宿主细胞发生病变，收取细胞培养液。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810952A (zh) * 2019-04-11 2019-05-28 郑州伊美诺生物技术有限公司 人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法
CN110643568A (zh) * 2019-09-23 2020-01-03 山东甲骨文生物科技有限公司 一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154197A (zh) * 2011-03-02 2011-08-17 马忠仁 一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的bhk-21细胞及其制备方法
CN104178459A (zh) * 2014-08-19 2014-12-03 青岛蔚蓝生物制品有限公司 一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法
CN104630158A (zh) * 2015-03-05 2015-05-20 成都天邦生物制品有限公司 低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法
CN105950540A (zh) * 2016-05-30 2016-09-21 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种pk15细胞的低血清培养方法、通过该方法获得的pk15细胞及其应用
CN106237324A (zh) * 2016-08-30 2016-12-21 齐鲁动物保健品有限公司 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法
CN107267468A (zh) * 2017-08-02 2017-10-20 华派生物工程集团有限公司 一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154197A (zh) * 2011-03-02 2011-08-17 马忠仁 一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的bhk-21细胞及其制备方法
CN104178459A (zh) * 2014-08-19 2014-12-03 青岛蔚蓝生物制品有限公司 一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法
CN104630158A (zh) * 2015-03-05 2015-05-20 成都天邦生物制品有限公司 低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法
CN105950540A (zh) * 2016-05-30 2016-09-21 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种pk15细胞的低血清培养方法、通过该方法获得的pk15细胞及其应用
CN106237324A (zh) * 2016-08-30 2016-12-21 齐鲁动物保健品有限公司 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法
CN107267468A (zh) * 2017-08-02 2017-10-20 华派生物工程集团有限公司 一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B.PULLA REDDY等: "Effect of fetal bovine serum concentration on the growth and survival of BHK21 cell lines.", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED BIOLOGY AND PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY》 *
PIERRE PERRIN等: "An experimental rabies vaccine produced with a new BHK-21 suspension cell culture process：use of serum-free medium and perfusion-reactor system.", 《VACCINE》 *
井莲娜等: "无血清培养基悬浮培养BHK21细胞驯化的研究", 《草食家畜》 *
洪艳等: "幼小仓鼠肾细胞（BHK21）低血清驯化及代谢比较", 《化学与生物工程》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810952A (zh) * 2019-04-11 2019-05-28 郑州伊美诺生物技术有限公司 人呼吸道合胞病毒大规模培养的方法
CN110643568A (zh) * 2019-09-23 2020-01-03 山东甲骨文生物科技有限公司 一种用于bhk-21细胞培养及相应病毒生产的低血清培养基

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