CN102154197A - 一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的bhk-21细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞及其培养方法，培养方法包括以下步骤：1）将冻存的BHK-21细胞复苏并贴壁培养，得到贴壁培养的BHK-21细胞；2）贴壁培养的BHK-21细胞利用培养液传代培养得到悬浮培养的BHK-21细胞并冻存；3）悬浮培养的BHK-21细胞进行复苏培养并进行生物学特性鉴定；4）鉴定合格的悬浮培养的BHK-21细胞进行生物反应器适应培养。本发明的有益效果为：本发明提供的细胞驯化方法及得到的可悬浮培养的BHK-21细胞，节省了培养液和牛血清，将悬浮培养的细胞运用到实际生产中在场地和人力投入上也会大幅度节省，符合目前节能、环保及低碳理念，在带来可观地经济效益的同时，也会产生较好地社会效益。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体讲涉及在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞及其制备方法。
背景技术
BHK-21细胞即叙利亚仓鼠肾细胞，英文名称：Baby Hamster Kidney cell简称BHK-21或BHK21，该细胞系于1961年由Macpherson IA、Stoker MGP建系，源自5只未辨性别的1天龄仓鼠肾，1963年进行了单细胞克隆。广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗，如口蹄疫疫苗。因原始的BHK-21细胞株为成纤维细胞，贴壁依赖性生长，生产生物制品时用10升和15升滚瓶贴壁单层培养，由于滚瓶表面积有限，很难到得足够多的细胞来表达相应病毒，也需要大面积厂房设施和众多手工操作。
发明内容
本发明的目的就是提供一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞，是通过将贴壁培养BHK-21细胞驯化后得到的，并适应生物反应器培养。
本发明的另一个目的是提供一种如上所述的在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞的驯化培养方法，包括以下步骤：
1）将冻存的BHK-21细胞复苏并贴壁培养，得到贴壁培养的BHK-21细胞；
2）贴壁培养的BHK-21细胞利用培养液传代培养得到悬浮培养的 BHK-21细胞并冻存；
3）悬浮培养的BHK-21细胞进行复苏培养并进行生物学特性鉴定；
4）鉴定合格的悬浮培养的BHK-21细胞进行生物反应器适应培养。
所述步骤1）中，细胞复苏的方法为，40℃水浴中快速解冻冻存的细胞，每支冻存管中细胞数量至少为3.0×106个，并将解冻的细胞接种到含10%的牛血清的MEM培养液中，置37℃5%CO2培养箱培养2小时后以同样的含10%的牛血清的MEM培养液对之前的培养液进行替换，待细胞长成致密单层后，用0.25%胰酶消化并按照将1瓶分成3瓶的比例传代培养至致密单层，培养条件为37℃5%CO2。
所述步骤2）中，BHK-21细胞的驯化过程为：
a）用含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12和MEM等体积的混合培养液传代培养两代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
b）用含体积百分含量8%牛血清的按体积比DMEM/F12：MEM为3:1的混合培养液传代培养三代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
c）用含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12培养液传代培养三代，培养条件为37℃体积百分含量5%的CO2环境，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
d）用含体积百分含量5%牛血清和10%上清液的DMEM/F12培养液传代培养三代，所述上清液为步骤c中含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12培养液细胞传代培养后的上清液，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
e）用含体积百分含量3%牛血清和5%前一阶段细胞培养后上清液的DMEM/F12培养液培养五代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
f）用含体积百分含量3%牛血清和2.5%前一阶段细胞培养后上清液的DMEM/F12培养液培养五代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
g）用含体积百分含量1%牛血清的DMEM/F12培养液和无血清培养基等体积混合培养液培养两代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可，最后一代按质量比1：1.5传代培养24小时后置于2-8℃静置48小时；
h）将步骤g）中最终得到的细胞培养液取出，轻摇细胞瓶收集悬浮在培养液中细胞和贴附性不好的细胞，并用胰酶轻度消化后吸集剩余细胞，补加无血清培养液至40ml，所述无血清液中含1%牛血清，0.03%PF68，0.02%的细胞分散因子，CO2环境摇床培养24小时，振荡速度为110r/min；
i）将步骤h）最终得到的细胞培养液静置30分钟，弃上清20ml, 剩余培养液移至另外的培养瓶中补加无血清培养液至40ml，所述无血清培养液中含1%牛血清、0.03%PF68和0.02%细胞分散因子；并重复一次上述操作；
j）收集步骤i）中得到的细胞至250ml悬浮培养瓶, 补加无血清培养液体积至200ml, 搅拌过夜，130 r/min；
k）将步骤j）得到的细胞培养液静置30分钟，弃上清100ml, 剩余培养液移至另一烧瓶中，补加无血清培养液至40ml，所述无血清培养液中含1%牛血清、0.03%PF68和0.02%细胞分散因子；进行细胞计数，并进行冻存，每支冻存管至少含1.0×107个细胞。
所述步骤3）中，悬浮培养的BHK-21细胞复苏培养过程为：将步骤2）得到的冻存的BHK-21细胞置于40℃水浴中快速溶解并接种入含20%牛血清的无血清培养液中；置于37℃ 5% CO2摇床培养24小时，110r/min；用含5%牛血清的无血清培养液按照将1瓶分成2瓶的比例培养48小时后直接用无血清培养基培养。
所述步骤4）中，在反应器中，接种细胞密度为1.0×106/ml，加入无血清培养基2.0L，反应器参数设定为四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2、转速70r/min、温度37℃、溶氧40%、pH 7.20，培养36小时补加无血培养基至3.5L,并将反应器参数设定为四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2、转速80r/min、温度37℃、溶氧60%、pH 7.10；培养72小时后计数。
本发明的有益效果为：本发明提供的细胞驯化方法及得到的可悬浮培养的BHK-21细胞，在一个650L的反应器（实际培养体积500L计算）以无血清培养的较低密度5×106/ml计算，得到2.5×1012的细胞，是1000个15L滚瓶的细胞数量，培养和接种病毒共用消耗500L不含牛血清的培养液，而1000个15L滚瓶培养细胞和接种病毒至少消耗2500L培养液和维持液以及150L牛血清，将悬浮培养的细胞运用到实际生产中在场地和人力投入上也会大幅度节省，符合目前节能、环保及低碳理念，在带来可观地经济效益的同时，也会产生较好地社会效益。
附图说明
图1为驯化前贴壁培养的BHK-21细胞。
图2为驯化后悬浮培养的BHK-21细胞。
图3为驯化后悬浮培养的BHK-21细胞在锥形细胞瓶培养中用无血清培养基和低血清培养基培养的生长曲线图。
图4为驯化后悬浮培养的BHK-21细胞转染红色荧光蛋白24小时表达图。
图5为驯化后悬浮培养的BHK-21细胞转染红色荧光蛋白48小时表达图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法和所用的试剂，如无特别说明，均为常规方法和常规试剂。
材料来源：
1）细胞株：叙利亚仓鼠肾传代细胞（BHK-21细胞）由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供；
2）DMEM培养液，Invitrigen Corporation，批号：309313；
3）DMEM/F12培养液，Invitrigen Corporation，批号：789727；
4）MEM Invitrigen Corporation，批号：864685；
5）BDPM-BHK21低血清培养基（干粉），兰州百灵生物技术有限公司，批号：20100507；
6）BFPM-BHK21无血清培养基（干粉），兰州百灵生物技术有限公司，批号：20100420；
7）牛血清（胎牛血清），兰州民海生物工程有限公司，批号：20090613；
8）PF-68，Sigma-aldrich Corporation，批号：129K0055；
9）细胞分散因子（Anti-Clumping Agent），Invitrigen Corporation，批号：725230；
10）DMSO（二甲基亚砜），Thermo Fisher Scientific Corporation，批号：LA138890；
11）胰酶，Sigma，批号：010M1348。
所用仪器设备：
1)生物反应器
a) B.Braun，型号：BIOSTATEOR B plus,培养罐体积5L
b) NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.,INC.型号：CelliGen 310，培养罐体积5L
2)摇床，上海堪鑫仪器设备有限公司，型号：TZ-05
3)磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，型号：驰久84-1
4)CO2培养箱，Thermo Fisher Scientific Corporation ，型号：3111
5)液氮贮存罐，乐山市东亚机电工贸有限公司，型号：YDS-50B-125F，YDS-100B-200F
6)冰箱，青岛海尔股份有限公司，型号：BCD-256KF B
7）离心机，上海安亭科学仪器厂，型号：TDL80-2B
8）相差倒置显微镜 OLYMPUS CKX41，OLYMPUS
9）荧光倒置显微镜，OLYMPUS AX71，OLYMPUS
10）移液器，BRAND GMBH+CO KG，型号：accu-jetORpro
实施例1：
1、细胞的引进培养：
打开包装箱检查确认干冰没有挥发完全的情况下取出细胞冰存管，在40℃水浴快速溶解后用将细胞移到事先准备好10%牛血清的培养液的细胞培养瓶中，37℃5%CO2培养。2小时后待大多数细胞贴壁后更换新鲜培养液。待细胞长成单层后用0.25%的胰酶消化后按1：3分瓶培养，待细胞长成致密单层取一瓶进行驯化。
2、细胞驯化：
1)用含8%牛血清的DMEM/F12：MEM（1：1）混合培养液传代培养两代；
2)用含8%牛血清的DMEM/F12：MEM（3：1）混合培养液传代培养三代；
3)用含8%牛血清的DMEM/F12培养液传代培养三代；
4)用含5%牛血清和10%前一阶段细胞培养后上清液（用含8%牛血清的DMEM/F12培养液的培养细胞长成致密单层后传代时从细胞瓶中弃去的废液）的DMEM/F12培养液传代培养三代；
5)用含3%牛血清和5%前一阶段细胞培养后上清液DMEM/F12培养液培养五代；
6用含3%牛血清和5%前一阶段细胞培养后上清液DMEM/F12培养液培养五代；
7)用含3%牛血清和2.5%前一阶段细胞培养后上清液DMEM/F12培养液培养五代；
8)用含1%牛血清的DMEM/F12：无血清培养基（1：1）混合培养液培养两代，最后一代按分瓶比例1：1.5传代培养24小时后置2～8℃冰箱48小时；
9）从冰箱中取出细胞置温箱2小时，用吸细胞轻轻吹打细胞表面收集悬浮在培养液中细胞和贴附性不好的细胞，再用胰酶轻度消化后吸集剩余细胞，一起放入锥形细胞培养瓶中，补加含无血清培养液（1%牛血清，0.03%PF68，0.02% Anti-Clumping）的至40ml，置CO2培养箱中的摇床上，摇床培养24小时，110r/min；
10）静止30分钟，弃上清20ml, 剩余移至另外一个锥形细胞培养瓶中补加无血清培养液（1%牛血清，0.03%PF68，0.02% Anti-Clumping）至40ml。再重复一次本操作；
11）收集两个锥形细胞培养瓶中细胞至250ml烧瓶, 补加无血清培养液体积至200ml, CO2培养箱中的磁力搅拌器上，130 r/min；
12）静止30分钟，弃上清100ml, 剩余移至另外一个烧瓶中，补加无血清培养液（1%牛血清，0.03%PF68，0.02% Anti-Clumping）至40ml。每隔24小时细胞计数，细胞密度达3.0×106/ml、活力96%以上的按常规方法液氮冻存，72小时密度达不到3.0×106/ml的，按1.0×106/ml进行悬浮传代培养驯化。
3、悬浮培养细胞复苏培养：
准备含20%牛血清的无血清培养液，从液氮中取出细胞冻存管，在40℃水浴快速溶解后用将细胞移到加有培养液的锥形细胞培养瓶中，置37℃5%CO2摇床培养，110r/min。培养24小时后用含5%牛血清的无血清培养液1：2分瓶培养。后可根据细胞密度直接用无血清培养基培养，绘制细胞生长曲线图。方法为：在125ml锥形细胞培养瓶接种4×105/ml细胞和无血清培养基共40ml，置37℃5%CO2摇床培养，110r/min。在培养的24、48、72小时计数，重复三次取平均数绘制细胞生长曲线图。表1为驯化后悬浮培养的BHK-21细胞在锥形细胞瓶中无血清培养计数表。
表1
4、低血清培养：
复苏后用含5%牛血清的无血清培养液培养阶段的细胞和已经用不加牛血清的无血清培养的细胞，直接用含3%牛血清的低血清培养液培养，绘制细胞生长曲线图。方法同上述第3步，培养基为3%牛血清低血清培养液。表2为驯化后悬浮培养的BHK-21细胞在锥形细胞瓶中低血清培养计数表。
表2
5、悬浮培养细胞的生物反应器培养：
接种细胞密度1.0×106/ml，无血清培养基2.0L,反应器（B plus型）参数设定：气体（空气、氧气、氮气和CO2）、转速70、温度37℃、溶氧40%、pH7.20，培养36小时时补加无血培养基至3.5L, 反应器参数设定为：气体（空气、氧气、氮气和CO2）、转速80、温度37℃、溶氧60%、pH7.10。培养72小时计数，用CelliGen 310型反应器重复一次计算两次试验的平均值。用3%牛血清的低血清培养液按上述方法培养。表3为驯化后悬浮培养的BHK-21细胞在反应器中培养的计数表。
表3
6、悬浮培养细胞的生物学特性鉴定：
1）活力检查，台盼蓝染料排除法，复苏的细胞活力≥92%。
2）形态学鉴定：
a) 倒置显微镜下直接观察, 细胞呈圆形，大小均一，悬浮均匀分布于培养液中，细胞间培养液清亮，细胞透亮，无结团现象，静置五分钟后多数细胞沉降到平皿底部，大小均一；
b) 透射电镜观察细胞超微结构, 细胞呈圆形，细胞间有类似桥粒的连接，核较大，细胞核内异染色质较多，并分布于核膜周围，细胞质内有较多大小不等的疑似溶酶体和过氧化物酶体泡状结构，胞质中可见线粒体及高尔基复合体，胞质内有大量微丝束，而且细胞内出现网球拍状膜性结构。还可见有细胞核分裂相，与驯化前贴壁培养时没有明显区别。
3）生长特性检测,采用生长曲线法：
a)低血清培养基（3%牛血清），细胞最在增殖浓度达5.6×106/ml以上，细胞倍增时间小于17小时；
b)无血清培养基细胞最在增殖浓度达5.0×106/ml以上，细胞倍增时间小于17小时。
4）无菌检查，用TSB、THIO培养基培养，结果为阴性。
5）支原体检查：
a)细胞裂解液用支原体平板培养基和液体培养基培养，结果均为阴性；
b)细胞裂解液用DNA荧光染色检查,结果为阴性。
6）病毒检测：
a) 细胞培养法,检查非血吸附病毒和血吸附病毒，结果均为阴性；
b) 荧光抗体试剂盒检测：
用美国VMRD公司的蓝舌病毒、牛腹泻病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛呼吸道合胞体、牛呼肠孤病毒和狂犬病病毒等直接荧光抗体试剂盒，结果均为阴性。
7) 染色体分析：
常规方法制备染色体标本后用油镜观察，选择染色体形态及分散良好的分裂相进行显微照相，统计100个分裂相予以确定染色体数目。
驯化后的BHK-21细胞染色体数目及类型：（42±2）占55%，见表4, 核型为 12M+19SM+11T，见表5。
表4
表5
| 染色体编号 | 臂比 值 | 着丝点指数 | 染色体类型 |
| 1 | 1.66±0.35 | 35.44±0.56 | M |
| 2 | 2.09±0.41 | 29.23±0.53 | SM |
| 3 | 1.91±0.30 | 35.91±0.42 | SM |
| 4 | 2.44±0.16 | 30.17±0.44 | SM |
| 5 | 1.86±0.22 | 36.63±0.24 | SM |
| 6 | 1.86±0.18 | 36.91±0.63 | SM |
| 7 | 1.84±0.39 | 38.85±0.31 | SM |
| 8 | 1.76±0.11 | 36.39±0.34 | SM |
| 9 | 1.84±0.21 | 33.20±0.32 | SM |
| 10 | 1.72±0.20 | 39.18±0.40 | SM |
| 11 | 1.53±0.23 | 42.95±0.55 | M |
| 12 | 1.64±0.09 | 39.80±0.19 | M |
| 13 | 1.41±0.12 | 40.64±0.21 | M |
| 14 | 1.58±0.17 | 36.77±0.36 | M |
| 15 | 1.53±0.06 | 40.73±0.27 | M |
| 16 | ∞ | 0 | T |
| 17 | ∞ | 0 | T |
| 18 | ∞ | 0 | T |
| 19 | ∞ | 0 | T |
| 20 | ∞ | 0 | T |
| 21（X） | 1,89±0.31 | 35±0.23 | SM |
| 22（Y） | ∞ | 0 | T |
8)荧光蛋白质粒转染表达,采用pDsRed-Monomer-N1质粒转染表达红色荧光蛋白实验。 如图4所示，24h 可见红色荧光蛋白表达，并如图5所示，48h增强，说明细胞能接受外源基因并表达。
Claims (6)
1.一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞，其特征在于：是通过将贴壁培养BHK-21细胞驯化后得到的，并适应生物反应器培养。
2.一种如权利要求1所述的在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞的驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将冻存的BHK-21细胞复苏并贴壁培养，得到贴壁培养的BHK-21细胞；
2）贴壁培养的BHK-21细胞利用培养液传代培养得到悬浮培养的 BHK-21细胞并冻存；
3）悬浮培养的BHK-21细胞进行复苏培养并进行生物学特性鉴定；
4）鉴定合格的悬浮培养的BHK-21细胞进行生物反应器适应培养。
3.如权利要求2所述的驯化培养方法，其特征在于：所述步骤1）中，细胞复苏的方法为，40℃水浴中快速解冻冻存的细胞，每支冻存管中细胞数量至少为3.0×106个，并将解冻的细胞接种到含10%的牛血清的MEM培养液中，置37℃5%CO2培养箱培养2小时后以同样的含10%的牛血清的MEM培养液对之前的培养液进行替换，待细胞长成致密单层后，用0.25%胰酶消化并按照将1瓶分成3瓶的比例传代培养至致密单层，培养条件为37℃5%CO2。
4.如权利要求3所述的驯化培养方法，其特征在于：所述步骤2）中，BHK-21细胞的驯化过程为：
a）用含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12和MEM等体积的混合培养液传代培养两代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
b）用含体积百分含量8%牛血清的按体积比DMEM/F12：MEM为3:1的混合培养液传代培养三代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
c）用含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12培养液传代培养三代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
d）用含体积百分含量5%牛血清和10%上清液的DMEM/F12培养液传代培养三代，所述上清液为步骤c中含体积百分含量8%牛血清的DMEM/F12培养液细胞传代培养后的上清液，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
e）用含体积百分含量3%牛血清和5%前一阶段细胞培养后上清液的DMEM/F12培养液培养五代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
f）用含体积百分含量3%牛血清和2.5%前一阶段细胞培养后上清液的DMEM/F12培养液培养五代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可；
g）用含体积百分含量1%牛血清的DMEM/F12培养液和无血清培养基等体积混合培养液培养两代，培养条件为37℃5%CO2，通过倒置显微镜肉眼观察细胞长成致密单层即可，最后一代按质量比1：1.5传代培养24小时后置于2-8℃静置48小时；
h）将步骤g）中最终得到的细胞培养液取出，轻摇细胞瓶收集悬浮在培养液中细胞和贴附性不好的细胞，并用胰酶轻度消化后吸集剩余细胞，补加无血清培养液至40ml，所述无血清液中含1%牛血清，0.03%PF68，0.02%的Anti-Clumping，CO2环境摇床培养24小时，振荡速度为110r/min；
i）将步骤h）最终得到的细胞培养液静置30分钟，弃上清20ml, 剩余培养液移至另外的培养瓶中补加无血清培养液至40ml，所述无血清培养液中含1%牛血清、0.03%PF68和0.02% Anti-Clumping；并重复一次上述操作；
j）收集步骤i）中得到的细胞至250ml悬浮培养瓶, 补加无血清培养液体积至200ml, 搅拌过夜，130 r/min；
k）将步骤j）得到的细胞培养液静置30分钟，弃上清100ml, 剩余培养液移至另一烧瓶中，补加无血清培养液至40ml，所述无血清培养液中含1%牛血清、0.03%PF68和0.02%细胞分散因子；进行细胞计数，并进行冻存，每支冻存管至少含1.0×107个细胞。
5. 如权利要求4所述的驯化培养方法，其特征在于：所述步骤3）中，悬浮培养的BHK-21细胞复苏培养过程为：将步骤2）得到的冻存的BHK-21细胞置于40℃水浴中快速溶解并接种入含20%牛血清的无血清培养液中；置于37℃ 5% CO2摇床培养24小时，110r/min；用含5%牛血清的无血清培养液按照将1瓶分成2瓶的比例培养48小时后直接用无血清培养基培养。
6.如权利要求5所述的驯化培养方法，其特征在于：所述步骤4）中，在反应器中，接种细胞密度为1.0×106/ml，加入无血清培养基2.0L，反应器参数设定为四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2、转速70r/min、温度37℃、溶氧40%、pH 7.20，培养36小时补加无血培养基至3.5L,并将反应器参数设定为四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2、转速80r/min、温度37℃、溶氧60%、pH 7.10；培养72小时后计数。
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