CN104630135A - 大规模制备肝干细胞的方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肝干细胞的大规模制备的方法及其在细胞移植、干细胞培养、扩增、定向分化和组织器官形成领域的用途。本发明所述的肝干细胞的制备方法，包括以下步骤：从动物或人肝组织中采用机械法、酶法和机械-酶法和密度梯度离心法，联合提取肝干细胞；体外大规模培养，扩增，经肝干细胞鉴定后冻存备用。此方法比常规方法制备肝干细胞效率提高约100-10000倍，可用于组织工程学，肝干细胞制剂或干细胞药物的生产，以达到为人类疾病提供一种新的治疗手段。

Description

大规模制备肝干细胞的方法与用途

技术领域

本发明涉及一种肝干细胞（hepatic stem cells，HSCs）的制备方法，具体涉及HSCs的分离、培养和干细胞纯化及大规模扩增培养HSCs的方法及其在细胞移植、干细胞培养、组织工程，再生医学和药学方面的应用。

背景技术

干细胞是正常人体内存在的细胞群体，具有高度自我复制和高度的分化能力。近年来随着干细胞研究的深入，人们发现利用干细胞可再生各种组织器官，如肝脏、胰腺、神经组织、骨骼、肌腱等。

因来源和分离的原因，现阶段临床应用的干细胞主要有成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和造血干细胞（hematopoieticstem cells,HSCs）、人外周血干细胞、人胚胎来源的干细胞和脐带血造血干细胞及胎盘或脐带间充质干细胞。按HSCs来源分为：骨髓移植（BMT）、外周血造血干细胞移植（PBS缓冲液CT）、脐带血干细胞移植、纯化的CD34+细胞移植、胎肝HSCT。按免疫遗传学分为：异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、自体干细胞移植。

干细胞领域研究最多和最清楚的仍是造血干细胞，它在基础与临床应用研究处干细胞的最前沿，并不断为其它干细胞研究提供理论和实践的指导和依据。

干细胞可分为长期亚群和短期亚群，长期亚群具有无限的自我更新能力，在个体中持续终生，短期亚群自我更新能力有限，如短期HSCs的自我更新能力仅维持8周左右；根据分化功能不同，干细胞分为全能性干细胞、多能性干细胞和单能性干细胞，个体形成中最早的干细胞为全能性干细胞，包括受精卵及胚泡的内细胞团。全能性干细胞进一步形成原始的生殖干细胞及体干/祖细胞，并最终分化形成各种组织干细胞（如NSCs，肝干细胞，胰岛干细胞等）。

肝干细胞(hepatic stem cels，HSCs)则是来源于肝组织的干细胞。有研究表明，肝干细胞可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞等多种细胞^[1，2]。

现阶段人胚胎肝组织的分离和培养主要是从健康孕妇8～20周孕龄自然流产的胎儿，无菌条件下分离胚胎肝组织，制备成细胞悬液后接种于含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27因子的无血清培养液中，接种密度为1×10⁵/ml。生长为类上皮细胞后，每隔7～10d传代1次，接种密度为(7.5～10)×10⁴/ml；再次长满后用于移植手术。此制备方法可有效地从胎肝组织中分离到HSCs，但其缺点是一次只能从胎肝组织中最多分离到10⁸的肝细胞，经培养后HSCs的数量仅为10⁷。而据文献报道，治愈一个重型肝炎病人需用10⁹肝细胞，因此，用原始的方法提取的肝细胞，只能用于0.1-1个病人，加之胎肝来源有限，很大程度上限制了HSCs的临床推广应用。

HSCs来源与扩增困难是限制其成为药物研发的主要障碍。

名称为“一种分离猪肝干细胞的方法”（专利号：ZL03156803.3，授权公告号：CN1233821C）的发明专利公开了一种采用大部分肝切除、酶消化与密度梯度离心法分离出猪肝干细胞的方法，其步骤包括：大部分肝切除促进肝再生、胶原酶将肝组织消化为单个细胞、离心去除肝内的成纤维细胞、蛋白酶E特异性消化肝实质细胞，Percoll密度梯度离心进一步纯化，获得纯度高、数量多且活性好的猪肝干细胞。但是，该方法应用剪碎法加酶消化法提取的猪肝干细胞，细胞数仅为4.8-6.4×10⁷/叶猪肝（约500g），难以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可大规模制备肝干细胞的方法及其用途，并提供了将该方法制备的肝干细胞用于HSCs的体外分离培养、扩增，再生修复，组织工程，肝脏疾病治疗药物的用途。

发明人在多年干细胞的研究中发现，从胎鼠肝中可分离到HSCs，之后又从人胎肝中分离到HSCs，但分离到的HSCs数量极小，难以满足临床需求，因此，HSCs的产量成为了其大规模临床应用的主要瓶颈。自2009年12月始，立项进行HSCs产量的研究，经三年多的实验研究，经多次工艺改造后使HSCs从原有的10⁷/次增加到现在10^9-10/次，经培养扩增后细胞数可达10^10-11/次，肝干细胞数量增加约100倍-10000倍；大大方便了临床操作。

经发明人反复探索，发现采用机械法（手动或电动）可有效地从肝组织中分离HSCs，经胶原酶和胰酶联合搅拌消化，细胞数明显增加，经15-20天的培养扩增，细胞总数可达10^10-11个/次，其中干细胞比例可达10-20%，此HSCs可低温长期保存，大大方便了临床操作。

本发明所述的一种规模化制备肝干细胞的方法，包括以下步骤：

A、称取幼年动物或胚胎肝组织，加入10至100倍体积的0.1M/L PBS缓冲液，采用机械法剪碎，绞碎或匀浆；

B、离心，去上清，沉淀用0.001%-1%胶原酶37℃搅拌4℃-37℃消化10分钟至24小时，收集细胞，细胞计数和存活率检测；用10至100倍体积的0.1MPBS缓冲液洗涤1～3次，离心，去上清，沉淀用0.001%-2.5%的胰酶4℃-37℃消化10分钟至24小时，收集细胞，细胞计数和存活率检测；

C、用10-100倍体积的0.1M PBS缓冲液将沉淀洗出，加0.001%-1%胶原酶、0.001%-0.5%蛋白酶K、0.0001%-0.05%DNase继续搅拌4℃-37℃消化10分钟至24小时，0.1M PBS缓冲液洗涤3次，沉淀用10-100倍体积的0.1M PBS缓冲液洗出上层悬浮细胞，过滤，离心后进行细胞计数和存活率检测；

在步骤C中，优选10倍体积的0.1MPBS缓冲液将沉淀洗出，优选0.01%胶原酶，0.02%的蛋白酶K，0.005%的DNA酶37℃消化30分钟；

D、50ml离心管中加入肝干细胞分离液（比重1.120），取上述细胞按1×10⁷/ml细胞悬浮液约10ml-20ml，小心加至分离液之上，离心，取分离液与上清液界面的细胞，用0.1MPBS缓冲液洗涤3次，细胞计数；

E、用比重为1.070-1.077的淋巴细胞分离液纯化肝干细胞；

在本发明的一个具体实施例中，将淋巴细胞分离液20ml加入50ml离心管中，取上述细胞悬液20ml，匀速加至淋巴细胞分离液之上，500-2000g离心15分钟，取细胞沉淀用PBS缓冲液洗出，细胞计数和存活率检测；

F、取上述细胞按1×10⁵/ml进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加bFGF、EGF和胎牛血清，当细胞长满约90%密度培且细胞生长为三角样细胞后，采用胰酶消化法收集肝干细胞，传代，接种密度为1×10⁵/ml继续培养；

G、加入贴壁材料或磁珠，采用摆瓶法或转瓶法进行大规模细胞扩增，同时保持肝干细胞未分化；

H、当细胞扩增10-10000倍后收集细胞，经检测符合肝干细胞的特征，按1-2×10⁷/ml进行细胞冻存，备用。

经培养后HSCs在形态上呈多角型，均质性，高表达CD133、CD90、CD44、CD40，CK7，CK8和nestin，低表达CD34、CD45，因此以下均称为HSCs。

细胞复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，也符合肝干细胞的特征。

根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述肝组织是来自包括人类以及小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、马等幼年动物的肝脏。

根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤A中，所述的机械法包括：手动法（剪刀，研磨和匀浆法），电动法（组织绞碎机，研磨机和匀浆机）；匀浆速度和处理时间是取决于组织匀浆液的均匀度和细胞存活率。

根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤A中，所述PBS缓冲液与肝组织的重量比为10：1。

根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤B和C中，所述的胶原酶浓度为0.1%，消化30分钟。

所述的胶原酶浓度取决于所用胶原酶的活力单位，所消化的时间因温度不同可为10分钟至24小时不等，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0.1%的Ⅱ胶原酶（sigma公司）37℃消化30分钟。

根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤F中，所述胰酶消化法中，胰酶浓度为0.125%，37℃消化30分钟。

所述的胰酶浓度取决于所用胰酶的活力单位，所消化的时间因温度不同可为10分钟至24小时不等，由最后所得的细胞数和细胞活力决定。

根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤E中，所述的纯化方法是摆瓶法或者转瓶法，内加或不加支持物。

通常分离纯化HSCs的方法可包括：（1）贴壁分离法。该法主要利用干细胞具有在塑料培养瓶中贴壁生长特性的差异将干细胞与其它细胞相分离。（2）流式细胞分选法。该法是根据干细胞体积小、相对缺少颗粒和独特的表面标志等特性对其加以分离。（3）免疫磁珠法。该法是根据免疫学原理，利用包备有抗体的磁珠与干细胞表面的一些特殊标志如CD133，nestin蛋白特异结合，通过一定强度磁场时被滞留而分选。

然而，本发明需选择摆瓶法或者转瓶法，目的是保持细胞不贴壁生长，采用搅拌（如加入磁力转子用磁力搅拌器搅拌）、振荡、旋转等方法分离纯化HSCs，使干细胞处于悬浮状态生长状态。

根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述的摆瓶法或转瓶法中，所述支持物为胶原、明胶或琼脂等有型物，胶原浓度为0.01%-1%（重量比），明胶或琼脂的浓度为0.005%-1%（重量比），优选的转速为55-65次/分钟。

本发明采用明胶和胶原为基质培养扩增HSCs，主要是为悬浮培养的干细胞提供一个起支撑膜作用的物质，与悬浮培养协同促进HSCs生长。也可用其它胶样物质如阿拉伯胶，聚乳糖胶，聚乙烯胶等。

在本发明的一个具体实施例中，加入HSCs专用培养基进行培养，内加胶原或明胶。当细胞浓度为0.5-1×10⁵/ml，采用摆瓶法或转瓶法于37℃培养，转速为10-200次/分钟，优选60次/分钟。培养72-96小时，当细胞浓度为0.1-1×10⁷/ml时，收集细胞按1-2×10⁷/ml冻存，或换大瓶继续培养后再冻存备用。

本发明进一步提供了所述的方法制备的肝干细胞的用途，即用于制备治疗肝脏疾病的药物制剂和生物人工肝的用途。

根据本发明所述的用途，所述肝脏疾病包括：病毒性肝炎、肝硬化、脂肪性肝炎、酒精性肝硬化。

采用本发明所述方法分离，提取，培养扩增所得的细胞，细胞数量和质量稳定，可以作为干细胞药物进行研究或应用。

本发明所述的方法是直接从幼年动物或胎儿动物中提取肝干细胞，可减少肝部分切除对动物手术污染的机会和工作量，还能提高肝干细胞收集的效率，细胞数可达到1-10×10¹⁰/100g肝组织。本方法采用机械法与联合酶法相结合的办法，分离的肝细胞数量成100倍的增加，加之扩增培养技术的改进，HSCs数量可达传统方法的100至10000倍，并保持干细胞的多能性。本发明所述方法较目前常用的方法效率提高了100倍以上，可满足临床用干细胞的需求，为干细胞制剂的新药研究开发提供了基础。

具体实施方式

实施例一：肝干细胞分离和培养的常规方法

目的：从大鼠胚胎肝组织中分离肝干细胞

一、材料与方法

一）材料

1、试剂和溶剂

1）灭菌注射用水，生产单位：自制

2）肝干细胞培养基（DMEM/F12培养基，内含B27(1:50)、bFGF(20ng/mL)、EGF(20ng/mL)、LIF(10ng/mL)和肝素(5μg/mL)。）；

3）生理盐水和Hank’s缓冲液；

4）酒精；

5）胶原酶；

6）胰酶；

7）DMEM/F12培养基；

8）手术器械

2、试验动物和饲养条件

2.1试验动物

1)等级、种系：SPF级SD大鼠

2)动物管理：动物由取得实验动物管理资格认可的人员饲养管理

3)购入时间：2010年11月13日。

4)购入时周龄：6-8周龄

5)购入时体重、数量、性别:130～200g，7只，雌性孕鼠。

6)生产单位：中山大学实验动物中心

7)实验动物生产许可证号为：SCXK（粤）2011-0029，广东省科学技术厅颁发。

8)动物的饲养环境

饲养地点：中山大学实验动物中心（东校区）北区屏障系统，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2011-0112。

温、湿度：温度20～26℃；湿度40%～70%

换气次数：饲养室大于15次/小时

饲养密度：群养，每笼不多于5只。

照明时间：12小时（上午7:00开灯～下午7:00关灯）

饲养笼种类：大鼠盒，聚丙烯材料（长×宽×高：48cm×33cm×20cm）

饲料：SPF级鼠灭菌饲料

来源：广东省医学实验动物中心

生产许可证：SCXK（粤）2008-0002

给料方法：检疫期所有动物及溶剂对照组使用，自由摄取，解剖前禁食过夜。

饲料常规营养成分：符合中华人民共和国国家标准GB14924.3-2010。

饲料的保存：保存在专门的饲料间里，保持通风、清洁、干燥

给料方法：检疫期后造模动物使用，自由摄取，解剖前禁食过夜。

饲料的保存：保存在专门的饲料间里，保持通风、清洁、干燥。

饮用水：

饮用水种类：经121℃（1.0kg/cm2）、30min灭菌自来水

给水方法：经饮水瓶自由摄取

9）动物尸体处理

动物尸体暂存于动物暂存间内的约－20℃专用冰箱内，集中交给广东生活环境无害化处理中心进行无害化处理。

3、主要仪器

电子天平：METTLER TOLEDO AB104S

冰冻切片机：Leica，CM1900

生物荧光显微镜：Leica，DM5000B

全自动生化分析仪：Beckman Counter CX5

台式高速低温离心机：Eppendoff Centrifuge5804R

细胞计数器：Invitrogen,Countess.

酶标仪：Thermas,Multiscan FC

二）方法

1、怀孕二周左右SD大鼠，杀死后取胎鼠肝脏，在无菌条件下分离出肝组织，称重；按1：2加入DMEM培养基，组织剪碎，离心。

2、胎肝组织，先用0.01%胶原酶消化1小时，再用0.1%的胰酶消化20～40min终止消化，40目筛网过滤制成单细胞悬液，活细胞计数。

留部分细胞以5×10⁵/mL密度接种到75mL培养瓶，加入肝干细胞培养基。

3、培养3d左右换半液，培养6d第1次传代后，用N2(1:100)代替B27。每次传代均使用轻柔吹打的机械分离方法，将传代培养的细胞种植到多聚赖氨酸和明胶处理过的6孔培养板内,培养基中只添加B27,经2～7d的培养后使用nestin，CK7，CK8单抗进行免疫组织化学染色。将体外传代培养的hHSCs用冻存液(体积分数为90%的DMEM/F12,10%的DMSO)混悬后，匀速降温，最后冻存于液氮中。在4周、24周后分别复苏，计数活细胞比例并进行再培养。

二、结果

1、肝组织湿重为5.36g/10只胎大鼠。

2、分离细胞计数，细胞总数为0.4×10⁷

3、分十瓶75cm²培养，经肝干细胞培养基进行细胞扩增2周后可得肝干细胞总数为1.68×10⁷。

4、冻存细胞复苏后存活率为93%。

实施例二：本发明所述的大规模肝制备干细胞的方法

目的：采用规模化制备的方法，从幼年动物肝组织中分离并纯化肝干细胞

一、材料与方法

一）材料

1、一月左右新生乳猪，杀死后取肝脏，称重；

2、肝干细胞培养基（DMEM/F12培养基，内含B27(1:50)、bFGF(20ng/mL)、EGF(20ng/mL)、LIF(10ng/mL)和肝素(5μg/mL)。）；

3、生理盐水和Hank’s缓冲液；

4、酒精；

5、胶原酶；

6、胰酶；

7、DMEM/F12培养基；

8、电动匀浆泵，离心机和手术器械

二）方法

1、将乳猪(生后100天)在无菌条件下分离出肝组织，称重，按1：2加入DMEM培养基或含0.01%胶原酶的DMEM培养基。

2、组织匀浆机，7000转，匀浆1分钟，离心，取沉淀。

3、用0.1M PBS缓冲液将沉淀洗出，先用0.01%胶原酶37℃消化1小时，再用0.1%的胰酶37℃消化20～40min，用0.1M PBS缓冲液终止消化，40目筛网过滤制成单细胞悬液，活细胞计数。

4、按2-3×10⁹/mL细胞密度加入到肝干细胞分离液之上，离心，250g，30分钟，取分离液与上清液之间的细胞。0.1M PBS缓冲液洗涤三次后加入淋巴细胞分离液之上，离心，250g,30分钟，取沉淀的细胞，用PBS缓冲液将细胞洗出，活细胞计数。

5、留部分细胞以5×10⁵/mL密度接种到75mL培养瓶，加入肝干细胞培养基进行培养。

6、培养3d左右换半液，培养6d第1次传代。进行nestin，CK7，CK8单抗等进行免疫组织化学染色。和复苏，计数活细胞比例和再培养。

二、结果

1、肝组织湿重为202.35g。

2、组织匀浆后细胞计数，细胞总数为8.4×10¹¹

3、肝干细胞分离液分离后细胞计数，细胞总数为6.2×10¹⁰

4、淋巴细胞分离液纯化肝干细胞后，细胞总数为1.2×10⁹

5、分50瓶75cm2培养，经干细胞培养基进行细胞扩增后可得肝干细胞总数为7.43×10¹⁰。

6、冻存细胞复苏后存活率为96%。

实施例三：两种不同方法提取乳猪肝干细胞的效果比较

本实施例的目的是探索手动法和电动机械法在肝干细胞制备效率方面的差异。

一、材料

1、三月左右新生乳猪；

2、肝干细胞培养基（DMEM/F12培养基，内含B27(1:50)、bFGF(20ng/mL)、EGF(20ng/mL)、LIF(10ng/mL)和肝素(5μg/mL)。）；

3、生理盐水和Hank’s缓冲液；

4、酒精；

5、胶原酶；

6、胰酶；

7、DMEM/F12培养基；

8、电动匀浆机，离心机和手术器械

二、方法和步骤

3.1肝干细胞的分离

将乳猪在无菌条件下处死后分离出肝组织，称重，按1：2加入DMEM培养基，初步剪碎约1cm3左右方块。

3.1.1手动法：取10g肝组织。用剪刀剪碎约0.1mm3，按1：10加入PBS缓冲液同时加入0.1%胶原酶（也可用胰酶），250g离心5分钟，去上清，沉淀用0.1M/L的PBS缓冲液洗三次；收集组织备用。

3.1.2电动机械法：取10g肝组织，称重。按1：10加入PBS缓冲液同时加入0.1%胶原酶（也可用胰酶），用组织绞碎机或匀浆机，7000转/分钟，匀浆1分钟。匀浆液250g离心5分钟，去上清，沉淀用0.1M/L的PBS缓冲液洗三次；收集组织备用。

3.2消化

3.2.1胶原酶、胰酶消化

3.2.1.1250g离心5分钟，沉淀用10倍体积的0.01%的胶原酶37℃消化30分钟-4小时，收集细胞，细胞计数和存活率检测。

3.2.1.2洗涤，再用10倍体积的0.01%的胰酶消化10-60分钟，观察消化效果；PBS缓冲液洗涤3次，收集细胞，40目筛网过滤制成单细胞悬液，计数和存活率检测。

3.2.2多酶消化

采用10倍体积的0.1MPBS缓冲液将沉淀洗出，加0.01%胶原酶，0.02%的蛋白酶K，0.005%的DNA酶37℃消化10-60分钟，分时观察消化效果。

3.3纯化

3.3.150ml离心管中分别加入干细胞分离液（1.080、1.084、1.088、1.092、1.096，1.100,1.104）中，取上述细胞按1×10⁷/ml细胞悬浮液约10ml，小心加至分离液之上（分离液：细胞悬液为1：1），离心，取分离液与上清液界面的细胞，用0.1MPBS缓冲液洗涤3次，细胞计数。

3.3.2聚乙烯吡咯烷酮分离（参见上述的专利CN1233821C）

向离心管中依次加入10ml的28.7%wt/v聚乙烯吡咯烷酮，10ml17.2%wt/v聚乙烯吡咯烷酮，10ml PBS缓冲液和10ml步骤）制得的细胞悬液，室温下以1500rpm转离心15-20min，收集17.2%wt/v聚乙烯吡咯烷酮和28.7%wt/v聚乙烯吡咯烷酮交界面的细胞。

3.4肝干细胞的扩增

取部分细胞以5×10⁵/mL密度接种到75cm²培养瓶中，加入干细胞培养基培养，培养3d左右换半液，培养6d第1次传代后，用N2(1:100)代替B27。每次传代均使用轻柔吹打的机械分离方法，将传代培养的细胞种植到多聚赖氨酸和明胶处理过的6孔培养板内,培养基中只添加B27,经2～7d的培养后使用nestin，CK7，CK8单抗进行免疫组织化学染色。

3.5冻存细胞复苏

将体外传代培养的细胞用冻存液(体积分数为90%的DMEM/F12,10%的DMSO)混悬后，匀速降温,最后冻存于液氮中。在4周、24周后分别复苏，计数活细胞比例并进行再培养。

三、结果

表一：

从上表可知：从约10克乳猪肝组织中，采用手动法一次只能获取肝干细胞总数为2.5×3.77%×10⁷=9.4×10⁵，而用电动机械法一次能获取总数为6.8×11.4%×10⁸=7.8×10⁷肝干细胞，提示电动机械法比手动法提取的细胞数增加约82倍。

如果考虑10Kg左右的乳猪，其肝组织重量可达300g，用手动法基本无法完成操作，而用电动机械法在3-5分钟之内就可完成组织机械分离，2小时内可完成细胞的酶法分离，可满足肝干细胞大规模的生产和临床生物人工肝的需要。

Claims (10)

1.一种规模化制备肝干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、称取幼年动物或胚胎肝组织，加入10至100倍体积的0.1M/L PBS缓冲液，采用机械法剪碎，绞碎或匀浆；

B、离心，去上清，沉淀用0.001%-1%胶原酶37℃搅拌4℃-37℃消化10分钟至24小时，收集细胞，细胞计数和存活率检测；用10至100倍体积的0.1MPBS缓冲液洗涤1～3次，离心，去上清，沉淀用0.001%-2.5%的胰酶4℃-37℃消化10分钟至24小时，收集细胞，细胞计数和存活率检测；

C、用10-100倍体积的0.1M PBS缓冲液将沉淀洗出，加0.001%-1%胶原酶、0.001%-0.5%蛋白酶K、0.0001%-0.05%DNase继续搅拌4℃-37℃消化10分钟至24小时，0.1M PBS缓冲液洗涤3次，沉淀用10-100倍体积的0.1M PBS缓冲液洗出上层悬浮细胞，过滤，离心后进行细胞计数和存活率检测；

D、50ml离心管中加入比重为1.120的肝干细胞分离液，取上述细胞按1×10⁷/ml细胞悬浮液约10ml-20ml，小心加至分离液之上，离心，取分离液与上清液界面的细胞，用0.1MPBS缓冲液洗涤3次，细胞计数；

E、用比重为1.070-1.077的淋巴细胞分离液纯化肝干细胞；

F、取上述细胞按1×10⁵/ml进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加bFGF、EGF和胎牛血清，当细胞长满约90%密度培且细胞生长为三角样细胞后，采用胰酶消化法收集肝干细胞，传代，接种密度为1×10⁵/ml继续培养；

G、加入贴壁材料或磁珠，采用摆瓶法或转瓶法进行大规模细胞扩增，同时保持肝干细胞未分化；

H、当细胞扩增10-10000倍后收集细胞，经检测符合肝干细胞的特征，按1-2×10⁷/ml进行细胞冻存，备用。

2.根据权利要求1所述的大规模制备肝干细胞的方法，其特征在于：所述肝组织是来自包括人类以及小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、马等幼年动物的肝脏。

3.根据权利要求1所述的大规模制备肝干细胞的方法，其特征在于：所述步骤A中，所述的机械法包括：手动法（剪刀、研磨或匀浆法），电动法（组织绞碎机、研磨机或匀浆机）；匀浆速度和处理时间是取决于组织匀浆液的均匀度和细胞存活率。

4.根据权利要求1所述的大规模制备肝干细胞的方法，其特征在于：所述步骤A中，所述PBS缓冲液与肝组织的重量比为10：1。

5.根据权利要求1所述的大规模制备肝干细胞的方法，其特征在于：所述步骤B和C中，所述的胶原酶浓度为0.1%，消化30分钟。

6.根据权利要求1所述的大规模制备肝干细胞的方法，其特征在于：所述步骤F中，所述胰酶消化法中，胰酶浓度为0.125%，37℃消化30分钟。

7.根据权利要求1所述的大规模制备肝干细胞的方法，其特征在于：所述步骤E中，所述的纯化方法是摆瓶法或者转瓶法，内加或不加支持物。

8.根据权利要求7所述大规模制备肝干细胞的方法，其特征在于：所述的摆瓶法或转瓶法中，所述支持物为胶原、明胶或琼脂等有型物，胶原浓度为0.01%-1%（重量比），明胶或琼脂的浓度为0.005%-1%（重量比）；转速为55-65次/分钟。

9.根据权利要求1所述的方法制备的肝干细胞用于制备治疗肝脏疾病的药物制剂和生物人工肝的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述肝脏疾病包括：病毒性肝炎、肝硬化、脂肪性肝炎、酒精性肝硬化。