CN104928246A - 一种神经干细胞的大规模制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种神经干细胞的大规模制备方法及其在细胞移植、干细胞培养、扩增、定向分化和神经系统疾病治疗领域的用途。本发明所述的神经干细胞，该干细胞是按以下步骤制备的：从幼年动物或胚胎脑组织中采用机械法、酶法和机械-酶法和密度梯度离心法，联合提取神经干细胞；体外大规模培养，扩增，经神经干细胞鉴定后冻存备用。本发明所述方法比常规方法制备神经干细胞效率提高约10-1000倍，可用于组织工程学研究、神经干细胞制剂或干细胞药物的生产。

Description

一种神经干细胞的大规模制备方法

技术领域

本发明涉及一种神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的大规模制备方法，具体涉及NSCs的分离、培养和干细胞纯化及大规模扩增培养NSCs的方法及其在细胞移植、干细胞培养、组织工程，再生医学和药学方面的应用。

背景技术

干细胞是正常人体内存在的细胞群体，具有高度自我复制和高度的分化潜能。近年来随着干细胞研究的深入，人们发现利用干细胞可再生各种组织器官，如肝脏、胰腺、神经组织、骨骼、肌腱等。

因来源和分离的原因，现阶段临床应用的干细胞主要有成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和造血干细胞（hematopoieticstem cells，HSCs）、人外周血干细胞、人胚胎来源的干细胞如肝干细胞和神经干细胞、脐带血造血干细胞及胎盘或脐带间充质干细胞。

干细胞可分为长期亚群和短期亚群，长期亚群具有无限的自我更新能力，在个体中持续终生，短期亚群自我更新能力有限，如短期HSCs的自我更新能力仅维持8周左右；根据分化功能不同，干细胞分为全能性干细胞、多能性干细胞和单能性干细胞，个体形成中最早的干细胞为全能性干细胞，包括受精卵及胚泡的内细胞团。全能性干细胞进一步形成原始的生殖干细胞及成体干/祖细胞，并最终分化形成各种组织干细胞（如NSCs、肝干细胞、胰岛干细胞等）。

神经干细胞（nerve stem cells，HSCs）是来源于神经组织的干细胞或前体细胞。有研究表明，神经干细胞可以分化为神经元、神经胶质细胞和造血细胞等多种细胞。

现阶段人胚胎神经组织的分离和培养主要是从健康孕妇8～20周孕龄的胎儿，无菌条件下分离胚胎神经组织，制备成细胞悬液后接种于含有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和B27因子的无血清培养液中，接种密度为1×10⁵/ml。生长为神经细胞球后，用胰酶进行传代，接种密度为(7.5～10)×10⁴/ml；再次长成神经细胞球后用于移植手术。此制备方法可有效地从胎儿神经组织中分离到NSCs，但其缺点是一次只能从胎儿神经组织中最多分离到10⁹的神经细胞，经培养后NSCs的数量仅为10⁸。用原始的方法提取的神经干细胞，只能用于1-2个病人，加之胎脑来源有限，很大程度上限制了NSCs的临床推广应用。

NSCs来源与扩增困难是限制其成为药物研发的主要障碍。

名称为“一种神经干细胞制剂、其制备方法及其用途”的发明专利申请（专利号：ZL02100859.0，授权公告号：CN1194086C）揭示了一种神经干细胞制剂的制备方法，该方法采用人胚胎脑组织用消化液消化后加入培养基中止消化，离心后机械吹打为单细胞悬液，加入培养基，在CO₂、37℃下经过体外培养，筛选出神经干细胞球，即得到神经干细胞。分离培养的神经干细胞，在体外传3-6代，并在传代过程中纯化神经干细胞，得到的神经干细胞制剂。但是，该方法应用剪碎法加酶消化法提取的神经干细胞，细胞数仅为10⁸/个胎脑，如按平均每例使用5×10⁷个神经干细胞计算，只能用于1-2个病人，难以进行神经干细胞的新药研究和临床应用需求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种神经干细胞的大规模制备方法。

本发明所述的规模化制备神经干细胞的方法，包括以下步骤：

A、幼年动物或胚胎脑组织，称重，按1：2加入0.1M/L磷酸盐缓冲液（PBS），采用电动机械法绞碎或匀浆；

B、离心，去上清，沉淀用10-100倍体积的0.01%的胶原酶或胰酶37℃搅拌消化30分钟，离心，用0.1M PBS洗涤1～3次；

C、用10-100倍体积的0.1MPBS液将沉淀洗出，加胶原酶、蛋白酶K、DNase继续搅拌消化30分钟，0.1M PBS洗涤3次，沉淀用10-100倍体积的0.1MPBS洗出上层悬浮细胞，过滤，离心后取细胞悬液进行细胞计数；

D、取上述细胞按1×10⁵/ml进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加bFGF、EGF和牛血清白蛋白，当培养中神经干细胞生长为神经细胞球后，采用胰酶消化法收集神经干细胞，传代，接种密度为1×10⁵/ml继续培养；

E、进行大规模（摆瓶法、转瓶法或发酵罐法）细胞扩增，同时保持细胞未分化；

F、当细胞扩增10-100倍后收集细胞，按1-2×10⁷/ml进行细胞冻存，备用；

G、细胞复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，符合神经干细胞的特征。

根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述神经组织来源是选自：灵长类、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、马的幼年动物或胎儿动物的大脑、小脑、中脑或脊髓。

根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤A中，所述的机械法包括：电动法（组织绞碎机，研磨机和匀浆机等），匀浆速度和处理时间由组织匀浆液的均匀度和细胞存活率决定，不做具体规定。

根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤A中，所述的加PBS的比例为：PBS的重量：神经组织重量为1-100：1之间的任一比例，优选为10：1。

根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤B中，所述的胶原酶浓度可为0.001%-1%，根据所用胶原酶的活力单位决定，所消化的时间因温度不同可为1分钟至48小时，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0.01%的Ⅱ胶原酶37℃消化30分钟。

根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤B中，所述的胰酶浓度可为0.001%-1%，根据所用胰酶的活力单位决定，所消化的时间因温度不同可为1分钟至48小时，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0.0125%的胰酶37℃消化30分钟。

根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述步骤E中，所述的方法为摆瓶法或转瓶法培养，和内加或不加支持物（如磁株、胶原、明胶和琼脂等有型物）的摆瓶法或转瓶法培养。

根据本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法的进一步特征，所述的摆瓶法或转瓶法主要是使神经干细胞处于悬浮状态生长，加入胶原或明胶等有型物的浓度可为0%-1%；摆瓶法的转速为55-65次/分钟。

优选地，胶原浓度为0.01%，明胶的浓度为0.005%。

本发明还提供了将本发明所述方法制备的神经干细胞的用途，包括：用于制备治疗神经系统疾病如病毒性脑炎、脑萎缩、遗传性小脑共济失调、侧索硬化、脑外伤、脑血管病、帕金森氏病、老年性痴呆的药物制剂，以及检测诊断试剂的用途。

本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法是综合采用电动匀浆法加酶促消化法，从幼年动物或胎儿动物神经组织中提取神经干细胞（NSCs），可明显提高神经干细胞收率，细胞数可达到1-10×10¹⁰/10g神经组织。本方法采用机械法与联合酶法相结合的办法，分离的神经细胞数量成10倍的增加，加之扩增培养技术的改进，NSCs数量可达传统方法的10倍至1000倍，因此，本方法的成功实施，可为NSCs的临床推广应用打下坚实的基础，并有可能将其作为NSCs药物进行开发研究。

附图说明

图1是神经干细胞移植前后各组实验动物行为学变化及脑梗死体积比较图。

图2是脑组织外观及HE染色图。

具体实施方式

发明人在多年干细胞的研究中发现，从胎鼠脑组织中可分离到NSCs，之后又从人胎脑中分离到NSCs，但分离到的NSCs数量极小，难以满足临床需求，因此，NSCs的产量成为了其大规模临床应用的主要瓶颈。自2010年12月始，立项进行NSCs产量的研究，经多次工艺改造后使神经细胞从原有的10⁷/次增加到现在10^9-10/次，经培养扩增后细胞数可达10^10-11/次，NSC细胞数量增加约10倍-1000倍；大大方便了临床操作。

经发明人反复探索，发现采用机械法（电动）可有效地从神经组织中分离NSCs，经胶原酶和胰酶联合搅拌消化，细胞数明显增加，经15-20天的培养扩增，细胞总数可达10^10-11个/次，其中干细胞比例可达10-20%，此NSCs可低温长期保存，大大方便了临床操作。

采用此方法分离，提取，培养扩增所得的细胞，细胞数量和质量稳定，可能/可以做为干细胞药物进行研究或应用。

本发明所述的一种NSCs的制备方法，是按以下步骤制备的：

A、取自然流产的胎脑或动物胎脑组织，4℃无菌条件下分离，采用电动机械法（可同时加入胰酶或胶原酶）匀浆后制备成组织匀浆液。经CD133、CD44、CD34和SOX2、巢蛋白等检测，NSCs的比例约占分离细胞的0.01%-0.15%。

B、匀浆液可用胶原酶或胰酶消化，消化方式为4℃-37℃，10分钟-24小时，摆动50-500次/分钟，0.1M/L磷酸盐缓冲液（以下均称PBS）洗涤3次。

C、用2-100倍体积的0.1MPBS液将沉淀洗出，加0.001%-0.5%胶原酶，蛋白酶K，DNase继续搅拌消化10分钟-24小时，温度为4℃-37℃；0.1M PBS洗涤3次，沉淀用2-100倍体积的0.1M PBS洗出上层悬浮细胞，过滤，离心后进行细胞计数。

D、取上述细胞按1×10⁵/ml进行培养，培养基为：

1、有血清培养基：DMEM/F12培养基（Sigma），内加bFGF，EGF和胎牛血清。

2、无血清培养基：DMEM/F12培养基（Sigma），加bFGF，EGF，植物重组人血清白蛋白（武汉禾元生物科技有限公司提供），转铁蛋白（Sigma），胰岛素(通化东宝)，胆固醇脂溶液（Gibco公司），亚硒酸钠（Sigma）等。

3、当培养中神经干细胞生长为细胞球后，收集神经细胞球，采用胰酶消化法收集神经干细胞，传代，接种密度为1×10⁵/ml继续培养；用DMEM/F12（sigma公司）培养，内含LIF1.0IU/ml,EGF10.0ng/ml,bFGF20ng/ml和B27因子等。培养96-128小时后换液。

E、加入贴壁材料或磁珠，进行大规模（摆瓶法或转瓶法）的细胞扩增，同时保持神经干细胞未分化。

F、当细胞扩增10-1000倍后收集细胞，按1-2×10⁷/ml进行细胞冻存，备用。

G、细胞复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，符合神经干细胞的特征。

经培养后NSCs在形态上呈小园型，均质性，高表达CD133、CD44、SOX2和巢蛋白，低表达CD34、CD45，因此以下均称为NSCs。

所述步骤A中，采用机械法分离神经组织，具体方法如下：

1、手动法(对照)：脑组织，称重，用剪刀剪碎约0.1mm³，按1：10加入PBS，250g离心5分钟，去上清，沉淀用0.1M/L的PBS洗三次；收集组织备用。

2、电动机械法：脑组织，称重，按1：10加入PBS，用组织绞碎机或匀浆机，3000转-12000转/分钟，匀浆10秒-3分钟，1次-3次；优选用7000转/分钟，匀浆1分钟。匀浆液250g离心5分钟，去上清，沉淀用0.1M/L的PBS洗三次；收集组织备用。

所述步骤B中，采用胶原酶和胰酶消化法分离神经细胞（内含神经干细胞），具体方法如下：

1、250g离心5分钟，沉淀用0.001%-0.1%的胶原酶37℃消化30分钟-18小时；优选0.01%的胶原酶37℃消化30分钟，收集细胞，细胞计数和存活率检测。

2、洗涤，再用0.001%-2.5%的胰酶37℃消化10-60分钟，优选0.01%的胰酶消化10分钟；PBS洗涤3次，收集细胞，计数和存活率检测。

所述步骤C中，具体方法如下：

采用2-100倍体积的0.1M/L PBS液将沉淀洗出，优选10倍体积。加0.001%-0.5%胶原酶，0.001%-0.5%蛋白酶K，0.0001%-0.05%DNase4℃-37℃，继续搅拌消化10分钟-24小时，优选0.01%胶原酶，0.02%的蛋白酶K，0.005%的DNA酶37℃消化30分钟。

所述步骤E中，采用摆瓶法或转瓶法培养NSCs，具体方法如下：

加入NSCs专用培养基，内加胶原浓度为0.001%-0.1%，明胶的浓度为0.0005%-0.1%。细胞浓度为0.5-1×10⁵/ml，采用摆瓶法或转瓶法于37℃培养，转速为10-200次/分钟，优选60次/分钟。培养72-96小时，当细胞浓度为0.1-1×10⁷/ml时，收集细胞按1-2×10⁷/ml冻存，或换大瓶继续培养后再冻存备用。

本发明从人或动物脑组织中分离NSCs的方法并不限于以上典型方法，也可用如下方法：机械法如剪碎，电动组织绞碎机，电动匀浆机，电动磨浆机等从神经组织中获取神经细胞。

本发明分离纯化NSCs的方法可包括：

1、贴壁分离法。该法主要利用干细胞具有在塑料培养瓶中贴壁生长特性的差异将干细胞与其它细胞相分离。

2、流式细胞分选法。该法是根据干细胞体积小、相对缺少颗粒和独特的表面标志等特性对其加以分离。

3、免疫磁珠法。该法是根据免疫学原理，利用包备有抗体的磁珠与干细胞表面的一些特殊标志如CD133、巢蛋白特异结合，通过一定强度磁场时被滞留而分选。

本发明采用转瓶法培养NSCs的方法并不限于以上典型的方法，保持细胞不贴壁生长，也可用如下的方法：

1、搅拌法，如加入磁力转子用磁力搅拌器搅拌。

2、摇瓶法。

3、转瓶法。

4、振荡法，旋转法等。

5、发酵罐法和中空纤维柱法。

本发明采用明胶和胶原为基质培养扩增NSCs，主要是为悬浮培养的干细胞提供一个起支撑膜作用的物质，与悬浮培养协同促进NSCs生长。其中胶原浓度可为0-1%（重量比），明胶浓度可为0-1%（重量比），也可用其它胶样物质如阿拉伯胶，纤连素，聚乳糖胶，聚乙烯胶等。

本发明所提供的方法可将NSCs的数量扩增10-1000倍，并保持干细胞的多能性；较目前常用的方法效率提高了100倍以上，可满足临床用干细胞的需求，为干细胞制剂的新药研究开发提供了基础。

实施例一：神经干细胞分离和培养的常规方法（手动法）——本发明的对照方法

目的：从大鼠胚胎脑组织中分离神经干细胞。

一、材料与方法

一）材料

1、试剂和溶剂

1）灭菌注射用水，生产单位：自制

2）神经干细胞培养基：DMEM/F12培养基，内含N2（1:50）、bFGF（20ng/mL）、EGF（20ng/mL）、LIF（10ng/mL）和肝素（5μg/mL）；

3）生理盐水和Hank’s缓冲液；酒精；胶原酶；胰酶；DMEM/F12培养基；

4）手术器械等。

2、试验动物和饲养条件

2.1试验动物

1）等级、种系：SPF级SD大鼠

2）动物管理：动物由取得实验动物管理资格认可的人员饲养管理

3）生产许可证号：SCXK（粤）2011-0029，广东省科学技术厅颁发。

4）饲养环境：温、湿度：温度20～26℃；湿度40%～70%照明时间：12小时（上午7:00开灯～下午7:00关灯）。饲料：SPF级鼠灭菌饲料；饮用水：经121℃（1.0kg/cm2）、30min灭菌自来水，经饮水瓶自由摄取。

5）动物尸体处理

动物尸体暂存于动物暂存间内的约－20℃专用冰箱内，集中交给广东生活环境无害化处理中心进行无害化处理。

3、主要仪器

电子天平：METTLER TOLEDO AB104S，冰冻切片机：Leica，CM1900，生物荧光显微镜：Leica，DM5000B，全自动生化分析仪：Beckman Counter CX5，台式高速低温离心机：Eppendoff Centrifuge5804R，细胞计数器：Invitrogen,Countess，酶标仪：Thermas,Multiscan FC。

二）方法

1、怀孕二周左右SD大鼠，杀死后取胎鼠，在无菌条件下分离出脑组织，称重；按1：2加入DMEM培养基，组织剪碎，离心。

2、胎脑组织，先用0.01%胶原酶消化1小时，再用0.1%的胰酶消化20～40min终止消化，40目筛网过滤制成单细胞悬液，活细胞计数。

留部分细胞以5×10⁵/mL密度接种到75mL培养瓶，加入NSC培养基。

3、培养3d左右换半液，培养6d第1次传代。每次传代均使用轻柔吹打的机械分离方法，将传代培养的细胞种植到多聚赖氨酸和明胶处理过的6孔培养板内，培养基中添加N2，经2～7d的培养后使用巢蛋白单抗进行免疫组织化学染色。将体外传代培养的NSCs用冻存液（体积分数为90%的DMEM/F12，10%的DMSO）混悬后，匀速降温，最后冻存于液氮中。在4周、24周后分别复苏，计数活细胞比例并进行再培养。

二、结果

1、脑组织湿重11.08g/6只胎大鼠。

2、分离细胞计数，细胞总数为5.2×10⁷

3、分十瓶75cm²培养，经神经干细胞培养基进行细胞扩增2周后可得NSCs总数为2.01×10⁷。

4、冻存细胞复苏后存活率为99%。

实施例二：本发明所述的神经干细胞的大规模制备方法

目的：采用规模化制备的方法，从幼年动物脑组织中分离并纯化神经干细胞。

一、材料与方法

一）材料

1、一月左右新生乳猪，杀死后取脑神经组织，称重；

2、神经干细胞培养基：在DMEM/F12培养基中加入：N2（1:50）、bFGF（20ng/mL）、EGF（20ng/mL）、LIF（10ng/mL）和肝素（5μg/mL）；

3、生理盐水和Hank’s缓冲液；酒精；胶原酶；胰酶；DMEM/F12培养基；

4、电动匀浆泵，离心机和手术器械。

二）方法

1、将乳猪（生后30天）在无菌条件下分离出脑组织，称重，按1：2加入DMEM培养基或含0.01%胶原酶的DMEM培养基。

2、组织匀浆机，7000转，匀浆1分钟，离心，取沉淀。

3、用0.1M PBS将沉淀洗出，先用0.01%胶原酶37℃消化1小时，再用0.1%的胰酶37℃消化20～40min，用0.1M PBS终止消化，40目筛网过滤制成单细胞悬液，活细胞计数。

4、留部分细胞以5-10×10⁵/mL密度接种到75mL培养瓶，加入NSC培养基进行培养。

5、培养3d左右换半液，培养6d第1次传代。

6、当NSCs长成神经球后，收集悬浮的神经球，胰酶消化，分6孔板和培养瓶继续培养。

1）6孔板内加入涂有明胶的盖玻片，用NSC培养基培养1-2天，待细胞贴壁后用甲醛固定，进行巢蛋白免疫组织化学染色和神经干细胞鉴定。

2）消化后细胞加入培养瓶中继续培养，待出现新的神经球后，用胰酶消化成单个细胞进行冻存和复苏，或计数活细胞比例，NSC标志检测和再培养。

二、结果

1、脑组织湿重为118.42g。

2、组织匀浆后细胞计数，细胞总数为9.6×10¹⁰。

3、分50瓶75cm2培养，经干细胞培养基进行细胞扩增后可得NSCs总数为6.12×10⁹。

4、冻存细胞复苏后存活率为96%。

实施例三：两种不同方法提取乳猪神经干细胞的效果比较

目的：探索常规方法和规模化制备方法在神经干细胞制备效率方面的差异。

常规方法，参见实施例一。规模化制备方法，参见实施例二。

结果见表1。

表1：两种方法分离神经组织的效果比较

从上表可知：从约10克乳猪脑组织中，采用手动剪刀法一次只能获取NSC总数为5.8×8.9%×10⁸=5.1×10⁷，而用电动机械法一次能获取总数为7.8×62.5%×10¹⁰=4.88×10¹⁰NSC细胞，提示电动法比手动法细胞数增加约95.6倍。

如果考虑10Kg左右的乳猪，其脑组织重量可达100g，用手动法基本无法完成操作，而用电动法在3-5分钟之内就可完成组织机械分离，2小时内可完成脑组织的酶法分离，本发明的方法可满足神经干细胞大规模的生产和神经干细胞作为新药生产和研究的需要。

实施例四、三种方法分离人胎脑神经干细胞的效果分析

目的：采用手动法，电动法和胰酶电动法从人胚胎脑组织中分离人神经干细胞，比较三种分离神经干细胞的效果差异。

材料和方法：

取自然流产的人约16周胚胎，分离脑组织约12g。

取脑组织3g，分成三等份，分别做如下处理：

1、脑组织称重约0.98g，加入D-Hanks液约10ml，用剪刀剪成0.1mm3左右，加0.01%胰酶消化30分钟，吸管轻轻地反复吹打至成单细胞悬液。100μm滤网过滤，1200r/min离心5min，去上清，重复清洗3遍。细胞计数，存活率检测。

2、脑组织称重约1.06g，加入D-Hanks液约10ml，用组织绞碎机或匀浆机，7000转/分钟，匀浆2-3分钟。吸管轻轻地反复吹打。100μm滤网过滤，1200r/min离心5min，去上清，重复清洗3遍。细胞计数，存活率检测。

3、脑组织称重约0.89g，加入D-Hanks液约10ml，用组织绞碎机或匀浆机，7000转/分钟，匀浆2-3分钟。加0.01%胰酶消化30分钟，吸管轻轻地反复吹打至成单细胞悬液。100μm滤网过滤，1200r/min离心5min，去上清，重复清洗3遍。细胞计数，存活率检测。

以上分组根据细胞数量，转移至175cm2培养瓶中，加30mL/瓶神经干细胞培养基，37℃，5%CO₂条件下培养。经2～7d的培养后细胞计数，进行CD44、CD105、CD133、巢蛋白（nestin）和KDR流式细胞检测。

结果：

结果见表2

表2，三种方法分离人胚神经干细胞的结果分析

结果显示：

手动+酶组，电动组和电动+酶组，CD105和KDR呈减少趋势，而CD105，CD44和巢蛋白呈现渐渐增加的趋势。

结论

采用电动法分离的细胞数比手动+酶法分离细胞数约多16倍，而电动酶法比手动酶法多86倍；经神经干细胞培养后，电动酶组和电动组的细胞数分别约为手动组18倍和120倍。结果提示：电动酶法可提高从人胎脑组织中获取干细胞的效率比手动酶法高近100倍。

实施例五、人胎脑神经干细胞对脑血管病动物模型的影响

目的：通过股静脉注射移植神经干细胞到MCAO大鼠模型体内，观察其对MCAO的影响，为脑血管病治疗提供一种神经干细胞相关的治疗方法。

材料与方法

1、NSC的分离培养按实施例二的方法进行NSC的体外培养扩增，传至第三代做流式细胞鉴定。

2、动物行为训练对所有大鼠（体重约260g）进行行为学训练：1、贴附物移除实验，将圆形标签纸（直径16mm）贴到大鼠两前爪，放回笼子，记录其撕纸时间，大于1min按1min计算。每天3次中间间隔10min以上。2、转棒实验，将大鼠放到疲劳仪转棒上，设定疲劳仪转动时间3min，20rpm训练2次，25rpm训练2次，30rpm训练5次。每天训练3次，间隔10分钟以上。

3、制作MCAO模型将训练合格的大鼠（12s内移除贴附物，转棒仪跑步测序持续170s以上）制作MCAO模型，方法参照Kurozumi等人^[3]的制作方法。24h后对模型鼠进行功能评分，方法参照Long等人的评分方法并进行改良，方法如下：0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：提尾对侧肩内收，身体绻起；3分：提尾放地上向对侧转圈或轻微自发向对侧转圈；4分：向对侧倾倒；5分：意识丧失，不能自发行动。选取评分为2－3分的大鼠12只随机分成PBS对照组和hNSC治疗组，另制作假手术大鼠6只。

4、细胞移植前准备复苏待移植细胞，培养传代至细胞足量。移植前用0.05%的胰酶消化细胞，收集到离心管，离心，弃上清，加10ml PBS重悬后离心重复3次以彻底洗去血清，用血小板计数器计数。加适量PBS重悬使细胞密度为1.5×10⁶/ml。将细胞转入无菌EP管中，密封，置冰上，待移植。

5、MCAO后24h股静脉移植细胞麻醉大鼠，固定，从股静脉进针移植细胞，速度控制在5分钟/ml左右（其中假手术组和PBS对照组移植1mlPBS；hNSC治疗组移植1mlhNSC；和MCAO模型鼠。所有细胞密度都是1.5×10⁶/ml）。

6、体重变化及行为评估从手术造模开始每天称量大鼠体重。手术后3、5、7、10、14天进行行为学测试。方法同训练，贴附物移除实验计时改为5min，大于5min按5min计算，每天2次，中间间隔10min以上；转棒仪实验参数设定为25rpm3min，每天2次，间隔10分钟以上。用SPSS对行为学数据进行差异分析。

7、灌注取脑观察两周后深度麻醉大鼠，打开胸腔腹腔充分暴露心脏，用注射器经心尖通过左心室插入主动脉，剪开右心耳后灌注生理盐水250ml左右至右心耳流出透明液体。换4%多聚甲醛（PFA）液继续灌注，出现肌颤后缓慢灌注至肝脏的颜色变白变硬，约灌注250ml。取出大脑，置4%PFA中固定1d后观察梗死区域并拍照。

8、HE染色观察及脑梗死体积计算将所有实验组大鼠脑组织于4%多聚甲醛中固定1d后将脑组织切成2mm厚的5个冠状切片（从松果体腺往嗅球方向每隔2mm切一片）。将切片于4%多聚甲醛中固定2d，做常规石蜡切片，HE染色，显微镜下观察，拍照。用图像处理软件处理图像，测量切片梗死区域面积计算脑梗死相对体积，参照Neumann-Haefelin等的脑相对梗死体积百分比计算公式：各切片梗死面积＝对侧面积－梗死侧非梗死区域面积；各切片梗死体积＝切片两面梗死面积之和×切片厚度/2，相对梗死体积百分比＝各切片梗死体积之和/大脑体积。用SPSS软件分析各组别之间的差异。

9、统计学处理

用SPSS16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法）。

结果

1、细胞的分离与体外扩增

取培养后细胞做流式鉴定，结果表明：P3的hNSC已经有了较高的纯度。

2、细胞移植前后各组动物行为学变化及脑梗死体积比较

2.1左腿贴附物移除时间在第3天治疗组贴附物移除时间要显著短于PBS对照组（P＜0.05），第5天后差异不显著（P＞0.05），说明干细胞能促进脑损伤大鼠较早的恢复身体机能，见图1A。

2.2右腿贴附物移除时间1）hNSC组与PBS组相比在第14天有显著改善（P＜0.05），在其它时间点平均时间比PBS组短；2）PBS组大鼠贴附移除时间两周内与MCAO模型鼠组相比无显著改善（P＜0.05），而治疗组从第5天开始贴附移除时间接近于假手术组（P＞0.05）。见图1B。

2.3转棒仪跑步持续时间1)hNSC组平均跑步能力在所有时间点均高于PBS组；2)PBS组与MCAO模型鼠相比跑步能力一直未有显著恢复（P＜0.05），从第7天开始治疗组与假手术组跑步差异不显著（P＞0.05）；见图1C。

2.4脑梗死体积百分比hNSC组脑梗死体积占总脑体积百分比（12.2±2.2）显著比PBS组（15.4±1.3）小（P＜0.05），见图1D。

3、脑组织外观及HE染色

3.1脑外观1）假手术组脑组织表面光滑完整；2）MCAO模型鼠和PBS组脑组织表面粗糙，有一定程度的萎缩和较大面积的梗死区域；3）治疗组脑组织较为光滑，萎缩程度和梗死区域明显减小；见图2。

3.2HE染色①假手术组脑组织细胞间紧密相连无梗死区域；②PBS组有较大面积梗死区域，梗死区域细胞稀疏排布；③治疗组梗死区域面积小，梗死区细胞排布稀疏程度低，见图2。

结论：

hNSC移植治疗MCAO模型大鼠，跟PBS对照组相比，能促进神经功能恢复并且能有效地减小脑梗死体积。

基于本实施例的研究结果，本发明所述方法制备的神经干细胞可用于制备治疗神经系统疾病如病毒性脑炎、脑萎缩、遗传性小脑共济失调、侧索硬化、脑外伤、脑血管病、帕金森氏病、老年性痴呆的药物制剂，以及检测诊断试剂。

Claims (10)

1.一种规模化制备神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、幼年动物或胚胎脑组织，称重，按1：2加入0.1M/L磷酸盐缓冲液（PBS），采用电动机械法绞碎或匀浆；

B、离心，去上清，沉淀用10-100倍体积的0.01%的胶原酶或胰酶37℃搅拌消化30分钟，离心，用0.1M PBS洗涤1～3次；

C、用10-100倍体积的0.1MPBS液将沉淀洗出，加胶原酶、蛋白酶K、DNase继续搅拌消化30分钟，0.1M PBS洗涤3次，沉淀用10-100倍体积的0.1MPBS洗出上层悬浮细胞，过滤，离心后取细胞悬液进行细胞计数；

D、取上述细胞按1×10⁵/ml进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加bFGF、EGF和牛血清白蛋白，当培养中神经干细胞生长为神经细胞球后，采用胰酶消化法收集神经干细胞，传代，接种密度为1×10⁵/ml继续培养；

E、进行大规模（摆瓶法、转瓶法或发酵罐法）细胞扩增，同时保持细胞未分化；

F、当细胞扩增10-100倍后收集细胞，按1-2×10⁷/ml进行细胞冻存，备用；

G、细胞复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，符合神经干细胞的特征。

2.根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述神经组织来源是选自：灵长类、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、马的幼年动物或胎儿动物的大脑、小脑、中脑或脊髓。

3.根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述步骤A中，所述的机械法包括：电动法（组织绞碎机，研磨机和匀浆机等），匀浆速度和处理时间由组织匀浆液的均匀度和细胞存活率决定，不做具体规定。

4.根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述步骤A中，所述的加PBS的比例为：PBS的重量：神经组织重量为1-100：1之间的任一比例，优选为10：1。

5.根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述步骤B中，所述的胶原酶浓度可为0.001%-1%，根据所用胶原酶的活力单位决定，所消化的时间因温度不同可为1分钟至48小时，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0.01%的Ⅱ胶原酶37℃消化30分钟。

6.根据权利要求1所述的大规模制神经干细胞的方法，其特征在于：所述步骤B中，所述的胰酶浓度可为0.001%-1%，根据所用胰酶的活力单位决定，所消化的时间因温度不同可为1分钟至48小时，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0.0125%的胰酶37℃消化30分钟。

7.根据权利要求1所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述步骤E中，所述的方法为摆瓶法或转瓶法培养，和内加或不加支持物（如磁株、胶原、明胶和琼脂等有型物）的摆瓶法或转瓶法培养。

8.根据权利要求7所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：所述的摆瓶法或转瓶法主要是使神经干细胞处于悬浮状态生长，加入胶原或明胶等有型物的浓度可为0%-1%；摆瓶法的转速为55-65次/分钟。

9.根据权利要求8所述的神经干细胞的大规模制备方法，其特征在于：胶原浓度为0.01%，明胶的浓度为0.005%。

10.如权利要求1所述的神经干细胞用于制备治疗神经系统疾病如病毒性脑炎、脑萎缩、遗传性小脑共济失调、侧索硬化、脑外伤、脑血管病、帕金森氏病、老年性痴呆的药物制剂，以及检测诊断试剂的用途。