CN105814196A

CN105814196A - 终末分化的神经元谱系的获得方法及其用途

Info

Publication number: CN105814196A
Application number: CN201480067973.5A
Authority: CN
Inventors: 迪米特里奥斯·卡鲁西斯; 伊布拉伊姆·卡西斯
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2014-10-07
Publication date: 2016-07-27
Also published as: IL244932B; WO2015056258A2; IL244932A0; EP3354725A1; EP3354725B1; WO2015056258A3; EP3058063B1; CA2926575C; AU2014335680A1; US20190264172A1; EP3058063A2; US20160251619A1; CA2926575A1; US10336985B2

Abstract

本公开内容涉及一种诱导间充质干细胞(MSC)的转分化的方法，所述方法包括(a)在第一培养基中培养MSC，所述第一培养基包含选择的用于允许神经化的MSC(NMSC)形成的生长因子；(b)允许所述NMSC增殖足够的时间，其间所述培养基被更新至少一次；和(c)将(b)的NMSC在包含脑脊液(CSF)的第二培养基中培养足够用于所述NMSC分化成包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的时间。本发明还提供了MSC或NMSC用于提供包含所述群体的组合物的用途和包含MSC或NMSC及其使用说明书的试剂盒。

Description

终末分化的神经元谱系的获得方法及其用途

技术领域

本公开内容涉及干细胞操作，且特别是间充质干细胞(mesenchymalstemcell)向神经元谱系的操作。

现有技术

以下列出被认为与本公开的主题的背景相关的参考文献：

PittengerMF,MackayAM,BeckSC等.“Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells”.Science,284(5411),143-147(1999).

GonzalesC,VíoK,RI和RodríguezEM“TheCSFofnormalH-TxratspromotesneuronaldifferentiationfromneurospheresbutCSFofhydrocephalicH-Txratsdoesnot”CerebrospinalFluidRes.3(Suppl1):S10.(2006)

JudithBuddensiek,AlexanderDressel,MichaelKowalski,UweRunge,HenrySchroeder,AndreasHermann,MatthiasKirsch,AlexanderStorch,MichaelSabolekCerebrospinalfluidpromotessurvivalandastroglialdifferentiationofadulthumanneuralprogenitorcellsbutinhibitsproliferationandneuronaldifferentiationNeuroscience11:48(2010)

HarrisVK,YanQJ,VyshkinaT,SahabiS,LiuX,SadiqSA.Clinicalandpathologicaleffectsofintrathecalinjectionofmesenchymalstemcell-derivedneuralprogenitorsinanexperimentalmodelofmultiplesclerosis.JNeurolSci,313(1-2),167-177(2012)#1.

HarrisVK,FaroquiR,VyshkinaT,SadiqSA.Characterizationofautologousmesenchymalstemcell-derivedneuralprogenitorsasafeasiablesourceofstemcellsforcentralnervoussystemapplicationsinmultiplesclerosis.StemCellsDev,1(7),536-547(2012)#2.

YingYe,Yin-MingZeng,MeiRongWan,XianFuLu"InductionOfHumanBoneMarrowMesenchymalStemCellsDifferentiationIntoNeural-LikeCellsUsingCerebrospinalFluid"CellBiochembiophys59:179-184(2011).

Radtke等."Peripheralglialcelldifferentiationfromneurospheresderivedfromadiposemesenchymalstemcells",Int.J.DevlNeuroscience,27:817–823(2009).

本文中对以上参考文献的承认不应被推断为意味着它们以任何方式与本公开的主题的可专利性相关。

背景

MSC是骨髓干细胞库(repertoire)的重要成员。这些细胞被描述为非造血基质细胞，且它们的典型作用是支持造血和HSC植入过程以及产生中胚层起源细胞(例如成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞)[PittengerMF等1999]。

各种研究已经描述了MSC的作用，除其他的以外，它们转分化成内胚层和外胚层起源的细胞的能力，包括可能的神经转分化和广泛的免疫调节特性。在一个出版物中，示出了正常H-Tx大鼠的脑脊液(CSF)促进从神经球的神经元和胶质分化，并示出了来自脑积水H-Tx大鼠的CSF干扰神经元分化(Gonzales等2006)。另一出版物报道了，CSF可促进成年人类的神经前体细胞的存活和星形胶质细胞分化，但抑制增殖和神经元分化(Buddensiek等2010)。

存在近期的报道：在多发性硬化的实验模型中，小鼠来源的MSC神经前体(MSC-NP)的多次鞘内注射诱导对EAE的强有益的临床效果(HarrisVK等(2012)#1)。在同一小组的另一项近期研究中，从多发性硬化患者和健康供体产生了神经球-样细胞(HarrisVK等(2012)#2)。研究者报道，与单次注射相比，多次注射MSC-NP是有益的，且它们改善EAE的临床和病理学参数，并促进内源修复机制。

出版物WO2004/046348、WO2006/134602、WO2007/066338、WO2009/144718描述了神经元分化的方法。

Radtke等(2009)描述了从脂肪来源的(adipose-derived)干细胞形成神经球及所述神经球在培养中向外周胶质样细胞的分化。

在又另一项研究中，报道了来自健康人类供体的CSF可诱导人类骨髓MSC分化成神经样细胞(YingYe等(2011))。

一般描述

本公开内容提供一种诱导间充质干细胞(MSC)的转分化的方法，所述方法包括：(a)在第一培养基中培养MSC，所述第一培养基包含选择的用于允许神经化的MSC(NMSC)形成的生长因子；(b)允许所述NMSC增殖足够的时间，其间所述培养基被更新至少一次；和(c)将所述NMSC在包含脑脊液(CSF)的第二培养基中培养足够用于所述NMSC分化成包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的时间。

本公开内容还提供MSC用于制备包含细胞群体的组合物的用途，所述细胞群体包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在该方面中，本公开内容还提供中性化的间充质干细胞(NMSC)用于制备包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的用途。

本公开内容还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括一种包含间充质干细胞(MSC)的组合物和用于将所述MSC在制备包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的方法中使用的说明书，所述方法如本文所定义。

附图简述

为了更好地理解本文公开的主题并为了举例说明如何在实践中实施所述主题，现将参考附图仅以非限制性实例的方式描述实施方案，其中：

图1A-1C是示出了从MSC产生神经化的间充质干细胞-神经球(NMSC)的图；图1A示出了分离自MS患者的人MSC(第1代)的实例，其具有成纤维细胞样纺锤形的形态，图1B和1C示出了用神经球产生培养基培养MSC5天后，在培养物中出现的具有神经球样结构的漂浮NMSC(图1B-大视窗＝X20放大，条＝100μm；小视窗＝球体的X40放大，条＝50μm)；图1C示出了使用DAPI染色证明的形成球体的细胞的核染色(条50μm)。

图2A至2D示出了NMSC的表征，图2A和2B是示出了从hMSC产生的NMSC针对标志物巢蛋白(图2A)和PS-NCAM(图2B)被阳性染色的图；图2C是在图2A和2B中测量的两个标志物的合并的显微图，图2D示出了hMSC和NMSC的代表性FACS分析，表明hMSC针对中胚层标志物CD90和CD105被阳性染色且针对造血标志物CD34和CD45是阴性的，而NMSC针对巢蛋白和PSNCAM被阳性染色且显示针对间充质标志物和造血标志物CD34、CD45、CD90和CD105的低至阴性染色。

图3是示出了NMSC的存活和增殖动力学的图，发现NMSC的最佳培养条件是以两种生长因子EGF和FGF的组合作为培养基的补充物；失去这些生长因子的一种导致增殖率的停止，而失去所述两种生长因子最终引起NMSC的死亡和解体。

图4A至4J是神经元细胞的图；图4A-4D示出了NMSC的神经元分化；用0.2％(MS患者的)同种异体CSF培养接种于经聚L-赖氨酸包被的培养孔的NMSC(来自第二周的培养物)，在培养物中观察到类似神经和胶质样细胞的形态变化，观察到分化的细胞针对神经元标志物MAP2(图4A)、神经元标志物III类β-微管蛋白(图4B)、星形胶质细胞标志物GFAP(图4C)和针对少突胶质细胞标志物CNP酶(CNPase)(图4D)的阳性染色，条＝100μm。图4E是从大脑分离的星形胶质细胞的图(现有技术)；图4F-4J示出了用同种异体CSF培养的MSC，细胞用Ye等描述的方法生长并处理。图4F-4G示出了GFAP(图4F)、III类微管蛋白(图4G)的免疫组织化学染色；图4H-4J示出了GFAP(图4H)、III类微管蛋白(图4I)的免疫荧光染色，以及所述两种标志物的合并(图4J)。

图5是示出了NMSC抑制淋巴细胞增殖的柱状图；使用3H-胸苷掺入测定观察到NMSC对淋巴细胞增殖的显著的剂量依赖性抑制(*p<0.05，**p<0.001)，所述淋巴细胞获自健康供体的外周血。

图6是示出了在处理的或未处理的EAE诱导的小鼠中的慢性EAE临床评分的图。

实施方案的详述

神经退行性紊乱(例如多发性硬化、阿尔茨海默氏病、帕金森病和亨廷顿病)涉及大脑中的神经元死亡。对于脊髓损伤也是如此。此类疾病的治疗目前受到限制，并因此需要替代疗法。一种方法包括提供由例如干细胞产生的可移植的细胞，所述细胞可用于替换非活性神经元。

如本文所示，本发明人已开发出一种用于通过建立中间体神经球从人骨髓来源的间充质干细胞(MSC)产生终末分化的神经元细胞的新方法，如以下讨论的。

具体地，本发明人已经发现，在生长因子的存在下，由培养MSC获得的神经球(在相同形态和标志物方面)类似于从成人神经干细胞产生的神经球(因此这些神经球被认为是神经化的间充质干细胞(NMSC))。发现这些NMSC是稳定的，即，在随后增殖阶段保持其形态并表达标志物。

此外，本发明人示出了，用脑脊液(CSF)处理这些稳定的NMSC允许所述NMSC分化成外胚层谱系的全部三种细胞类型，即星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，如它们的特定标志物所表现的(见以下表2)。

由CSF诱导的分化是细胞特异性的，且所述NMSC失去了它们的分化成为中胚层谱系细胞的潜力。

因此，根据其第一方面，本公开内容提供了一种诱导间充质干细胞(MSC)的转分化的方法，所述方法包括：

(a)在第一培养基中培养MSC，所述第一培养基包含选择的用于允许中性化的MSC(NMSC)形成的生长因子；

(b)允许所述NMSC增殖足够的时间，其间所述培养基被更新至少一次；

(c)将所述NMSC在包含脑脊液(CSF)的第二培养基中培养足够用于所述NMSC分化成包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的时间。

以上步骤在通常可接受的培养箱条件下进行，所述培养箱条件保持最佳温度(例如，约37℃)、湿度(通常>95％)和其他条件诸如培养箱内的气氛的二氧化碳(CO₂，通常5％)和氧含量，定期更新(更换和补充)各种培养基。

如本文使用的，术语“分化”是指较不特化的细胞藉以变为更加特化的细胞类型的过程。分化是常见的过程，其中例如干细胞例如在组织修复和正常细胞更新期间分裂并产生部分或完全分化的子代细胞。分化显著地改变细胞的大小、形状、膜电势、代谢活性和对信号的反应性。

此外，如本文使用的，术语“转分化”指当非-干细胞转化成不同类型的细胞时发生的过程，或当已经分化的干细胞产生其已建立的分化路径以外的细胞时发生的过程。根据本公开内容，间充质干细胞(中性化的那些)转分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，其各自以统计学显著量获得。

如本文使用的，术语“间充质干细胞”(MSC)指具有分化成中胚层谱系细胞(例如脂肪细胞(adipocyte)(脂肪细胞(fatcell))、成骨细胞(骨细胞)和软骨细胞(chondrocyte)(软骨细胞(cartilagecell))的能力的多能基质干细胞。

术语“多能的(multipotent)”指能够产生多个细胞类型的干细胞。

根据本公开内容的MSC的来源不受限制，并且可源自任何适当的生物来源，例如来自骨髓、脂肪组织、脐带组织、脐带血和外周血。来源可为人类或非人类。在一个实施方案中，MSC是人MSC。

在一些实施方案中，MSC获自骨髓。“骨髓”(BM)指骨骼内部发现的柔性组织。

在一些实施方案中，MSC不获自脂肪组织。

在一些另外的实施方案中，NMSC不是由脂肪来源的干细胞形成。

MSC可通过常规方法例如穿刺或活体组织检查或提供MSC的任何其他方法从BM获得。在BM穿刺中，得到半流体，其可被外周血进一步稀释。

在一些实施方案中，采集BM并处理所述BM样品以选择间充质细胞(也被称为基质细胞)。可以以多种方式选择BM间充质/基质细胞。例如，可在塑料容器内分散并培养基质细胞，且随后通过其在特定培养基中的存活和对塑料的粘附性将其分离。

使用前，可在适当条件下保存从受试者获得的BM样品，例如，在使用例如Sepax分离法分离单核细胞中的BM后，可将样品保存于液氮中，或可在移出后立即使用。

在一些实施方案中，BM可获自健康供体。可选地，BM可获自被诊断患有疾病的受试者，所述疾病包括但不限于神经退行性疾病或炎性紊乱，包括自身免疫性紊乱。在一些实施方案中，BM获自被诊断患有多发性硬化(MS)的受试者。

如本文指出的，BM是MSC(基质细胞)的来源。为了鉴定所述细胞，可使用五个标志物通过FACS分析来鉴定MSC。

例如，细胞可由至少针对CD34和CD45是阴性的且针对CD73、CD105和CD90是阳性来表征。使用术语阴性表示在FACS分析中没有观察到强度或与对照强度类似的强度。使用术语阳性表示在FACS分析中观察到高于对照的强度。

根据本公开内容，在培养基中培养MSC，所述培养基支持从在本文被称为“中性化的MSC”的MSC形成MSC-衍生的NP样结构。

如本文使用的，本文中可互换使用的术语“神经化的MSC”或“NMSC”指干细胞的非粘附的(自由漂浮的)球形簇及其后代。NMSC具有由非限制性标志物(巢蛋白和PS-NCAM)表征的神经球样结构，所述非限制性标志物是神经球的特征性抗原；NMSC进一步由诱导淋巴细胞增殖的剂量依赖性抑制的能力表征。如此，当具有神经球结构时，将它们与由成人神经干细胞产生的典型神经球区别开(至少出于它们从不同的细胞来源产生的原因)。

支持从MSC形成NMSC的培养基至少包含至少一种生长因子。此外，该培养基包含由血清替代物补充的无血清培养基。在一些实施方案中，该培养基包含至少两种生长因子。本文中，该培养基被称为“第一培养基”。

如本领域已知的，支持由MSC形成NMSC的第一培养基可包含无血清培养基、血清替代物和生长因子的不同组合。例如但不受其限制，支持NMSC的定向形成的第一培养基包含基础无血清培养基，其选自Neurobasal^TM(Gibco，Invitrogencellculture，USA目录号21103-0491998/1999)、DMEM-F12(Gibco，Invitrogencellculture，USA目录号11320-033)、Cellgro干细胞生长培养基(目录号2001CellGenixGermany2005)、KO-DMEM(目录号10829-018Gibco1998/1999)和X-Vivo10(目录号04-380QLonzaSwitzerland2007)组成的组。

在一些实施方案中，无血清培养基是DMEM-F12。无血清培养基DMEM-F12通常包含以下组分：

培养基可由已知用于培养基的成分进一步补充，所述成分例如无血清补充物。在一些其他实施方案中，无血清补充物是B27。

以下提供B27的成分：

第一培养基还包括至少一种生长因子，优选至少两种生长因子，所述生长因子能够至少刺激培养基中的细胞生长，并且可能地还刺激其增殖和分化。在一些实施方案中，生长因子选自由表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)诸如FGF-β(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)组成的组。在一些实施方案中，使用至少两种生长因子。当使用两种生长因子时，优选的实施方案包括使用EGF和bFGF。

如图3中所示的，生长因子的存在促进NMSC的形成。具体地，NMSC增殖和生存力要求培养基中存在EGF和bFGF中的至少一种。缺少这些特定因子的一种引起NMSC增殖和生存力的下降。缺少两种生长因子最终引起NMSC的解体和死亡。

因此，在一些实施方案中，生长因子是EGF和bFGF的至少一种。在一些实施方案中，生长因子是EGF和bFGF的组合。

在一些实施方案中，EGF是人EGF，这包括但不限于本领域已知促进细胞生长的6045DaEGF蛋白。

根据一些实施方案，NP样结构的形成在塑料培养皿(烧瓶)上进行。在一些另外的实施方案中，细胞在烧瓶中生长，具有最小的细胞粘附。如本领域已知的，这可通过使用超低粘附^TM(ultralow-adherence^TM)烧瓶实现。使用此类非粘附性生长环境允许细胞自由漂浮以及非粘附性漂浮球的形成。

优选地，第一培养基被更新至少一次并在数天后。在一个实施方案中，每2-4天更换第一培养基，并且在又一些实施方案中，至少每周一次且甚至每周两次更换第一培养基。

根据一些实施方案，在第一培养基中的培养持续足以允许建立/形成NMSC的时间(由至少一种NMSC的特征性标志物(例如巢蛋白和PS-NCAM)和其来源的标志物(即MSC标志物)的消失体现，如以下进一步讨论的)。

如所理解的，从MSC形成NMSC的最短时间将取决于，尤其是培养条件，但也取决于原始MSC培养物和MSC的密度。本领域技术人员将能够例如通过反复试验确定足以形成NMSC的时间。

在一些实施方案中，在至少24-48小时后观察到NMSC的形成。尽管如此，有时将NMSC用第一培养基维持培养多于48小时，以使培养物中NMSC的密度和其稳定性最大化。为此目的且根据一些实施方案，将NMSC在第一培养基中培养至少2-10天，优选4-7天(定期补充)以获得NMSC的期望的质量和密度。因此，在一些实施方案中，足以用于在第一培养基中培养的时间为在2-10天之间，有时在2至9天、3-8天、3-7天之间，且优选地在4-7天之间。在这些条件下，培养物主要包括少量但显著比例(95％)的NMSC(少于5％的MSC)。

获得经修改的培养物(即主要包含NMSC的培养物)，即，存在培养物中形成神经球样结构的证据之后，将第一培养基用新鲜的一定量的相同的第一培养基或其改良版本替换至少一次(这被称为“更新培养基”)，所述改良版本包含至少一种生长因子和/或至少一种无血清培养基。在一些实施方案中，该待被更新的培养基包含相同的第一培养基(可能为无血清培养基)和生长因子且缺乏血清替代物(例如B-27补充物)。在一个实施方案中，为了NMSC的增殖和维持，培养基至少包含DMEM-F12、EGE和bFGF。

本发明人已经发现，与培养的MSC(其在其表面表达CD90和CD105)不同，单个神经球样结构内(即，NMSC内)超过90％的细胞表达巢蛋白和PS-NCAM，其为中性化的MSC的特征性抗原。

因此，NMSC的形成由选自由CD90和CD105组成的组的MSC标志物的低表达或缺乏(以科学术语来说，阴性)和选自由巢蛋白和PSNCAM组成的组的神经球标志物的阳性表达表征。

此外，本发明人已经发现，NMSC具有与幼稚MSC以及神经干细胞的免疫调节特性相似的免疫调节特性，并且显示诱导对淋巴细胞增殖的剂量依赖性抑制。

允许NMSC在替换的(更新)生长培养基中增殖。应注意，用于在更新的培养基中增殖的时间段尤其取决于多个因素，例如NMSC的密度、NMSC的数量和NMSC的生存力。

在一些实施方案中，足以用于进一步增殖(例如，在更新的培养基中)的时间为在1天至7天之间，有时在2天至6天之间，有时甚至在3天至4天之间。在约3天或4天的合适的时间段后，NMSC可被进一步使用。

形成期望的NMSC(“期望的”指至少表达上述标志物，且在第一培养基用新体积的第一培养基更换至少一次后)之后，培养基可用第二培养基更换，所述第二培养基至少包含如上定义的无血清培养基和脑脊液(CSF)。在一些实施方案中，无血清培养基至少包含DMEM-F12以及CSF。

当提及CSF时，应理解其意指在大脑中产生的透明无色流体，且其可通过任何已知的技术(包括但不限于腰椎穿刺)从需要治疗的受试者(如以下进一步讨论的)或从健康供体的脊髓收集。第二培养基中的CSF的量可变化，且在一些实施方案中，该体积为在培养基总体积的约0.1％(v/v)至约1％(v/v)CSF之间。

如以上指出的，CSF可为“同种异体的”或“自体的”。在一些实施方案中，CSF是同种异体CSF。

当提及同种异体CSF时，应注意，向受体提供的CSF来自遗传上不同的供体。即，从供体/患者获得CSF并将其提供给需要所产生的神经元细胞的不同的人。可从为例如急诊室或治疗部门的患者的供体或从供体自身收集CSF。

当提及自体CSF时，应注意，CSF获自并被提供给同一患者。

第二培养基诱导NMSC的分化。具体地，肉眼检查和特定标志物的免疫组织化学显示，NMSC分化成外胚层谱系细胞，包括终末分化的星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。具体地，如图4A-4D中所示，本发明人已经发现，由CSF诱导的分化引起具有神经元形态的微管相关蛋白2(MAP2)和III类β-微管蛋白(βIII-微管蛋白或β-微管蛋白III)阳性细胞(分别地图4A和4B)、具有星形胶质细胞形态的胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein；GFAP)-阳性细胞(图4C)和具有少突胶质细胞形态的2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP酶)-阳性细胞(图4D)的形成。

通常，如图4E所示，星形胶质细胞是“星形(star-shaped)”细胞。当提及例如离体组织中或体外分离的“星形胶质细胞”时，应理解为指具有成熟的星形胶质细胞形态(即，星形)且针对GFAP染色为阳性的细胞。不认为仅显示针对GFAP染色为阳性的细胞是星形胶质细胞。

此外，已知幼稚间充质干细胞即使在不处于其已分化的状态时，仍可保持GFAP的阳性表达(Foudah等2012，Blondheim等2006)。因此，“星形的”星形胶质细胞的形态学相似性对于定义星形胶质细胞是至关重要的。

在一些实施方案中，根据本发明的星形胶质细胞具有“星形”样结构，表明其与星形胶质细胞的相似性。

如图4C中所示，与从大脑中分离的真正的星形胶质细胞类似(图4E，现有技术)，所述细胞显示清楚的“星形”样结构且为GFAP阳性染色。

因此，在一些另外的实施方案中，分化的NMSC具有星形且针对GFAP为阳性。其尤其通过以下发现结果被支持：

为了与Ye等的细胞比较，用CSF处理MSC(如Ye等所述，出处同上)以获得“神经元样细胞”。图4F至4J示出了用CSF处理MSC产生分别显示针对GFAP和III类β-微管蛋白阳性染色的细胞。图4F和4G分别显示GFAP和III类β-微管蛋白的免疫组织化学染色，且图4H和4I分别显示GFAP和III类β-微管蛋白的免疫荧光染色。

然而，这些细胞的形态不像真正的神经元，因为没有观察到“星形”样结构。这些细胞保持它们的伸长的成纤维细胞样形状，该形状通过幼稚MSC鉴定到。

表2示出了，通过本文公开的方法获得的细胞(即用CSF处理NMSC(而非MSC)后)表达MAP-2、微管蛋白-β-III、GFAP、S100、GalC和CNP酶，如从这些标志物的染色所确定的。通过本文公开的方法获得的细胞显示这些标志物的至少10％表达。

例如，通过本文公开的方法获得的细胞显示GFAP和微管蛋白-β-III的至少10％表达，有时至少20％表达，有时至少30％表达，有时至少40％表达，有时至少50％表达，有时至少60％表达，有时甚至至少65％表达。

例如，通过本文公开的方法获得的细胞显示MAP2和S100的至少10％表达，有时至少20％表达，有时至少30％表达，有时甚至至少35％表达。

例如，通过本文公开的方法获得的细胞显示GalC和CNP酶的至少10％表达，有时甚至至少15％表达。

关于本公开内容，表达从如本文以下详述的确定的阳性染色细胞的比例确定。染色可从本领域已知的任何方法获得，诸如但不限于FACS、免疫荧光。

相比而言，与用本文公开的方法(即用CSF处理NMSC(而非MSC)后)获得的细胞相比，用CSF直接处理的MSC(根据Ye等的方法)显示出降低的表达。

如表2中所示，由标志物MAP2、微管蛋白-β-III、GFAP、S100、GalC和CNP酶的染色确定的表达在通过本文公开的方法(即用CSF处理NMSC(而非MSC)后)获得的细胞中升高。

具体地，在通过Ye等的方法获得的细胞中观察到“神经元样细胞”的GFAP和S100的阳性染色。然而，基本没有观察到β-微管蛋白或MAP2标志物的染色，并且也没有检测到少突胶质细胞标志物GalC和CNP酶染色。

不囿于理论，这些结果表明，通过Ye等描述的方法没有获得少突胶质细胞。

总而言之，这些结果表明，用CSF直接处理MSC且不经过预先形成NMSC不引起神经元的形成(所述神经元需要表现出表征神经元的多个特征)且不具有活性神经元。

另一方面，根据本公开内容源自NMSC的神经元显示出将所得细胞定义为神经元所需的特征。具体地，所得的源自NMSC的细胞显示出与在源自成年神经干细胞的已分化的神经球中观察到的染色和形态相同的抗原染色和细胞形态。

所得细胞群体主要包含星形胶质细胞、神经细胞和少突胶质细胞的混合物。

使用术语“主要包含”表示其中至少50％、有时60％、有时甚至90％、有时95％，有时甚至99％或甚至100％的细胞表现出以上三种细胞类型的特征的群体。细胞类型之间的比例可变化。

在一些实施方案中，三种细胞类型之间的比例为神经元:星形胶质细胞:少突胶质细胞16:3:1。在一些其他实施方案中，该群体包含约80％神经元、约15％星形胶质细胞和约5％少突胶质细胞。

此外，发现NMSC失去分化形成中胚层谱系的细胞的潜力，包括其分化成脂肪细胞、成骨细胞或软骨细胞的能力(数据未示出)。

此外，发现从MSC分化的神经元细胞不仅表达神经元标志物，重要的是，还是有功能的。

具体地，如实施例中的表1中所示，分化的NMSC对N2A细胞中的神经突长度的作用优于未分化的NMSC或MSC，且与所用的阳性对照的作用一样好。

此外，如表3中所示，与通过本文开发的方法获得的细胞相比，通过Ye等的方法(即，用CSF处理MSC)获得的细胞的N2A细胞中的神经突长度更短。

通常，当细胞在培养中向神经元谱系细胞分化时，它们分泌神经营养因子例如：脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)等。这些因子的分泌在神经保护和可能的神经再生方面非常重要。如表4中所示，与幼稚MSC相比，根据本公开内容获得的细胞群体分泌至少5倍、6倍、7倍、8倍、9倍且甚至10倍量的NGF，以及与幼稚MSC相比，至少1.5倍、在1.5和2倍之间或甚至基本上2倍量的BDNF。相比而言，用CSF处理MSC(根据Ye等的方法)导致低的多的量的这些生长因子的分泌，如表4中所示(“CSF诱导的MSC”列)。

因此，在一些实施方案中，细胞群体至少分泌以上神经营养因子。在一些其他实施方案中，细胞群体至少分泌BDNF和NFG。

因此表明，如本文公开的获得的包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体具有神经营养作用并如此可促进神经退行性疾病的保护和修复。

换而言之，得出如下结论：将稳定的NMSC与CSF培养至少48小时导致相对于中胚层谱系有利于外胚层谱系的受控的分化路径，所述外胚层谱系包括终末分化的星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。

不囿于理论，本发明人表明，NMSC的形成是影响向外胚层谱系的分化路线从而获得终末分化的星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的至关重要的步骤。

总而言之，本文显示的结果提供了包含终末分化的星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的细胞群体，所述细胞群体对于神经元存活、神经元生长和分化有价值。

形成细胞群体之后，它们可被用于研究和医药方面的多种应用。当提及细胞群体时，应理解为指包含终末分化的星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的群体。

如实施例中的图6中所示，分化的NMSC对cEAE的临床评分和动物死亡率的影响优于未分化的NMSC或MSC。

在一些方面，本公开内容提供了MSC用于制备包含细胞群体的组合物的用途，所述细胞群体包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在一些其他方面，本公开内容提供了中性化的间充质干细胞(NMSC)用于制备包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的用途。

在一些实施方案中，根据本公开内容的NMSC的特征可以为MSC标志物的低表达或缺乏以及神经球标志物的表达，所述MSC标志物选自由CD90和CD105组成的组，所述神经球标志物选自由巢蛋白和PSNCAM组成的组。在一些其他实施方案中，细胞群体的特征可以为神经元特征性的人微管相关蛋白2(MAP-2)的表达、星形胶质细胞特征性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、以及少突胶质细胞特征性的2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP酶)的表达。细胞群体的特征可以为神经营养生长因子以高于来自幼稚间充质干细胞的所述神经营养生长因子的水平的水平分泌。例如，细胞群体的特征可以为NGF或BDNF以高于来自幼稚间充质干细胞的NGF或BDNF的水平的水平分泌。

本文描述的组合物可为药物组合物。所述药物组合物任选地还包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣等。此类介质和剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。

在一些实施方案中，药物组合物用于治疗神经系统的病理学状况。在一些其他实施方案中，药物组合物用于治疗神经退行性疾病或脊髓损伤。在一些其他实施方案中，所述用途和药物组合物用于治疗涉及神经元死亡的状况，且通过根据本发明的细胞群体的治疗涉及神经元的再生。

在本公开内容的上下文中，术语“神经退行性疾病”用于指特征为进行性神经系统机能障碍和/或神经元细胞死亡的任何状况。存在影响神经系统的多于600种状况。神经退行性疾病可与认知、运动、力量、协调或髓鞘损伤相关，其与外周神经系统(PNS)或自主神经系统(ANS)相关。

在一些实施方案中，神经退行性疾病可以是以下疾病的一种但不限于以下疾病：帕金森病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)和其他痴呆、退行性神经疾病、脑炎、癫痫(Epilepsy)、遗传性大脑紊乱(GeneticBrainDisorder)、头部和脑部畸形、脑积水(Hydrocephalus)、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症(ALS或路格里克氏病(LouGehrig'sDisease))、亨廷顿病(HD)、朊病毒病、额颞叶失智症、路易氏体失智症、进行性核上性麻痹、皮质基底核退化症、多系统萎缩症、遗传性痉挛性瘫痪(Hereditaryspasticparaparesis)、脊髓小脑萎缩、淀粉样变性、运动神经元疾病(MND)、脊髓小脑共济失调(SCA)、中风和脊髓性肌肉萎缩症(SMA)。

在一些实施方案中，神经退行性疾病是多发性硬化(MS)。多发性硬化，也被称为散播性硬化或散播性脑脊髓炎(encephalomyelitisdisseminata)，指一种炎性疾病，其中大脑和脊髓的轴突周围的髓鞘受损，导致髓鞘质损失和瘢痕形成。

在该方面的上下文中，当提及治疗时，其可包括抑制、预防、改善或推迟发作，其应被理解为指受试者中至少一个疾病特征的改善，例如：无病期的增加、急性病期的减少或疾病的严重度的降低，所述受试者表现出至少相同的疾病特征。

给予有需要的受试者的细胞群体可以是自身施用，也可由另一人施用至受试者。

组合物可包含一定量的细胞群体，基于待被治疗的特定状况的可接受的标准，所述组合物使受试者的状况得到医学统计上的改善。

在一些实施方案中，所述方法包括通过移植将细胞群体施用到受试者的大脑或脑脊液中。

根据一些另外的方面，本公开内容提供一种试剂盒，所述试剂盒包括：(i)包含间充质干细胞(MSC)的组合物，(ii)用于将所述MSC在制备包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的方法中使用的说明书，所述方法包括：(a)在第一培养基中培养MSC，所述第一培养基包含选择的用于允许神经化的MSC(NMSC)形成的生长因子；(b)允许所述NMSC增殖足够的时间，其间所述培养基被更新至少一次；(c)将(b)的NMSC在包含脑脊液(CSF)的第二培养基中培养足够用于所述NMSC分化成包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的时间。

本说明书提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用到本说明书中全文并入本文。

如说明书和权利要求中使用的，除非上下文明确另外指出，形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括单数和复数指代。例如，术语“一个干细胞(astemcell)”包括一个或更多个干细胞，且术语“干细胞(stemcells)”包括一个干细胞以及多于一个干细胞。

如本文使用的，术语“或”意指所列选项的一个或两个或更多个的组合。

此外，如本文使用的，术语“包括”意指所述方法和培养系统包括所列举的要素，但不排除其他要素。类似地，“主要由……组成”用于定义包括所列举的要素，但排除可对本发明的培养系统的功能具有重要意义的其他要素的方法和系统。例如，主要由基础培养基和培养基补充物组成的培养系统将不包括或仅包括非显著量(对培养系统中的细胞的繁殖将具有非显著作用的量)的对培养中的细胞有作用的其他物质。并且，主要由本文定义的要素组成的系统不排除微量污染物。“由……组成”将意指排除多于痕量的其他要素。由这些连接词的每一个定义的实施方案在本发明的范围以内。

此外，所有数值(例如浓度或剂量或其范围)是从所规定的值变化(+)或(-)多达20％，有时多达10％的近似值。即使不总是明确规定，也应理解所有数字指代前有术语“约”。还应理解，即使不总是明确规定，本文描述的试剂仅是示例性的且本领域已知其等价物。

非限制性实施例

材料和方法：

骨髓穿刺

当患者以左侧卧或右侧卧位躺下时，在短期全身麻醉下从髂嵴后上部穿刺进行骨髓穿刺。通常从每位患者获取约200mL骨髓接种物。

MSC制备和培养

在无菌条件下(正压洁净室)用经过过滤灭菌的具有低葡萄糖水平的Dulbecco改良的Eagle培养基(Qiagen，Valencia，California)制备纯化的MSC的培养物，所述培养基由10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素-制霉菌素溶液补充(全部来自BiologicalIndustries，KibbutzBeit-Haemek，Israel)。

随后，将间充质细胞培养40至60天直到它们达到汇合，并且然后进行收获，并将其在含有10％二甲基亚砜的培养基中冷藏于液氮中(-196℃)。2周时，取样品进行无菌测试和质量控制。

从hMSC产生中性化的MSC(NMSC)及其繁殖

为了产生NMSC，将hMSC在超低粘附^TM(ultralow-adherence^TM)烧瓶(Corning，Mexico)中在DMEM-F12无血清培养基(BiologicalIndustries，Israel)中培养，所述DMEM-F12无血清培养基包含2％B-27补充物(Gibco，USA)、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Peprotech，Israel)、25ng/ml表皮生长因子(EGF，Peprotech，Israel)、1％非必需氨基酸(BiologicalIndustries，Israel)。

将细胞培养14天，每周两次更换培养基。48小时后观察到漂浮的神经球样结构(NMSC)。随后，通过离心温和洗涤悬浮液，并将细胞沉淀物重悬于由20ng/mlbFGF、25ng/mlEGF、5μg/ml肝素、1％非必需氨基酸和1％MEM-α维生素补充的DMEM-F12无血清培养基中，并接种于超低粘附^TM(ultralow-adherence^TM)烧瓶进行繁殖。

使用脑脊液(CSF)的NMSC分化

为使NMSC终末分化成神经细胞谱系，使用第2代的完整的NMSC(即，NMSC在更新的培养基中繁殖至少一次之后，即，培养基被补充至少一次)。将第2代的NMSC在接种于普通附着性组织容器中(NUNC，USA)的以1％非必需维生素(biologicalindustries)和0.2％自体/同种异体CSF补充的DMEM-F12/GlutaMax^TM无血清培养基(Invitrogen)中培养。

NMSC和幼稚MSC的免疫染色

将培养基抽出，并用稀释于DPBS中的0.03％吐温20(Sigma-Aldrich，Rehovot，Israel)温和洗涤NMSC，且然后在室温下用新鲜的4％多聚甲醛固定20分钟。为了染色细胞内成分，用0.1％TritonX-100(Sigma-Aldrich，Rehovot，Israel)对细胞进行10分钟透性化处理。为了阻断非特异性结合，在室温、缓慢转动的平板上，用DPBS中的2.5％牛血清白蛋白冲洗细胞45分钟。随后，用稀释于PBS中的0.03％吐温20洗涤细胞3次，并与以下小鼠的一抗孵育120分钟：抗人CD34、抗人CD45、抗人CD90、抗人CD105、抗人巢蛋白、抗人PS-NCAM、抗人MAP2、抗人GFAP、抗人MAP2和抗人CNP酶(全部来自Abcam，UK)，所述抗体用含有1％牛血清白蛋白的DPBS缓冲液稀释到所需浓度。洗涤后，在室温、黑暗中，将细胞与稀释于1％牛血清白蛋白缓冲液中的山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素缀合的二抗和山羊抗兔异硫氰酸四甲基若丹明缀合的二抗在缓慢转动的平板上孵育45分钟。用DAPI-封固溶液(Vectashield，CA，USA)将细胞封固在载玻片上，并在荧光和光学显微镜术下检查。通过在荧光显微镜(Nikon，Japan)下被DAPI染色的细胞核确定免疫反应细胞的数量。

NMSC的增殖测试(免疫潜力测试(immunologicalpotentialtest))

使用基于XTT的测定(BiologicalIndustries，Israel)测量NMSC生长。将NMSC以2000NMSC/孔的密度接种到96孔板上，并在存在或不存在EGF(20ng/ml，Peprotech，Israel)、FGF-2(25ng/ml，Peprotech，Israel)下培养3天。3天后，向每孔加入50μlMTT反应溶液，并将板在37℃孵育2小时。用ELISA读取器(BeckmanCoulter，USA)在450-500nm波长处测量样品相对于背景对照的吸光度。为了测量参考吸光度(对于非特异性结合)，使用630-690nm的波长并将其从450-500nm测量值中减去。每个实验中，在3个重复孔之间计算590nm的吸光度的平均值。

N2A细胞的分化(神经营养作用模型)

在24孔板中在含有DMED(高葡萄糖制剂)、5％FBS和1％青霉素-链霉素(全部来自BiologicalIndustries，KibbutzBeit-Haemek，Israel)的培养基中培养N2A细胞(200细胞/孔)。在培养物汇合程度为25-50％时启动分化。向培养的N2A细胞中加入来自幼稚MSC、NMSC和终末分化的细胞的经调节的培养基，培养3天。为检测神经突突起生长，用神经元标志物MAP2(Cambridge，UK)对培养的细胞进行免疫染色。为测量分化后的神经突，使用计算机分析软件ImageJ，并以像素计计算神经突长度。

用脑脊液(CSF)处理MSC

采用Ye等的以下方案进行比较研究。简而言之，为了分化成神经元样细胞，于六孔板中，将来自两名健康志愿者的骨髓基质细胞分别以2x10⁶细胞/孔(0.1ml)接种于聚-1-赖氨酸包被(100mg/mlSigma)的盖玻片上。当细胞生长到70％汇合程度时，将细胞用每天补充10μl自体-CSF的培养基中培养7天。

经脑脊液(CSF)处理后的细胞的表征

通过研究另外的参数进一步分析经CSF处理的NMSC，所述另外的参数例如：针对标志物MAP2(神经元)、S100(星形胶质细胞)以及GalC和CNP酶(少突胶质细胞)的染色、神经突长度的计算机评价和已分化细胞的生长因子的分泌。将结果与通过本发明的方法获得的结果进行比较。

体内研究

如上所描述的，从多发性硬化患者的骨髓分离幼稚MSC。诱导这些细胞形成漂浮的神经球样结构(NMSC)。NMSC形成后(如上所描述的)，使用同种异体CSF将细胞暴露于神经元分化方案，以获得如上所描述的分化的NMSC。在雌性C57BL/6小鼠中用MOG_35-55肽诱导慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎(cEAE)。EAE诱导后第8天，将NMSC或分化的NMSC经脑室内注射至cEAE诱导的小鼠中。根据EAE临床严重程度量表针对神经学症状每天对小鼠评分(0＝无症状；1＝尾部紧张力的部分损失；2＝尾部瘫痪；3＝后肢无力；4＝后肢瘫痪；5＝四肢瘫痪；6＝死亡)。

在C57bl/6小鼠中进行的MOG-诱导的EAE的另一项研究中，在(诱导后)第8天，根据以下处理组之一，经脑室内(ICV)注射NMSC或分化的NMSC：

(1)EAE未处理的动物(n＝8)

(2)注射有幼稚MSC的EAE(n＝8)

(3)注射有暴露于CSF的MSC的EAE(n＝10)

(4)注射有NMSC的EAE(n＝8)

(5)注射有暴露于CSF的NMSC的EAE(n＝10)

从诱导起30天期间，通过EAE临床评分和组织病理学参数(炎症和轴突损失)评价动物。

结果

从BM-MSC衍生NMSC

为产生NMSC，用胰蛋白酶处理(第2-3代的)MSC(图1A)，收集并在NMSC诱导培养基中培养，所述NMSC诱导培养基包含补充有B27补充物、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF)的DMEM-F12无血清培养基。在这些培养条件下，细胞在培养2天后开始形成球体(NMSC)(图1B和1C)。

NMSC的表征

为确定源自MSC的NMSC是否类似于神经球，研究这些球体是否表达神经球的两种特征性抗原：巢蛋白和PS-NCAM。

免疫细胞化学表明，单个球体内的大多数细胞(>90％)表达巢蛋白和PS-NCAM(分别地图2A和2B，以及图2C)。此外，研究了这些MSC-NP是否表达MSC的特征性抗原。FACS分析表明，这些源自MSC的球体不表达CD34、CD45，但确实少量表达CD105(～5％)和CD90(～10％)(图2D)。

NMSC的增殖和扩张

为评价体外增殖率和影响生长动力学的因素，使用基于XTT的测定。在这些实验中，评价表皮生长因子和碱性生长因子的重要性。发现MSC-NP增殖和生活力要求在培养基中存在生长因子EGF和bFGF二者(图3)。缺乏所述因子的一种引起NMSC增殖和生活力的降低。缺乏两种生长因子最终导致NMSC的解体和死亡。

NMSC的神经分化

如方法中所描述的，培养NMSC以进行分化。在分化条件下培养7天后，对MSC-NP进行神经元(MAP2)和胶质细胞抗原(GFAP和CNP酶)的荧光免疫细胞化学。MSC-NP能够分化成具有星形胶质细胞形态的GFAP-阳性细胞、具有神经元形态的MAP2-阳性细胞和具有少突胶质细胞形态的CNP酶-阳性细胞(图4A至4D)。当分析其分化成中胚层谱系的细胞的潜力时，发现这些MSC-NP已经失去其分化成脂肪细胞、成骨细胞或软骨细胞的能力(数据未示出)。

NMSC抑制体外淋巴细胞增殖

为探索NMSC抑制从外周血捐赠物分离的淋巴细胞的增殖的能力，将不同剂量的幼稚NMSC(50、100和250个球体)与淋巴细胞在丝裂原PHA的存在下共培养。共培养3天后，使用³H-掺入测定测量增殖。如图5中所示，发现NMSC以剂量依赖性方式抑制淋巴细胞增殖，与通过幼稚MSC(Kassis等,2008)和NSC(Einstein等,2007)观察到的抑制作用类似。此外，显示NMSC具有与典型的源自成人NSC的神经球的更大的相似性。

此外，如表4中所示，经CSF处理的细胞分泌神经营养因子诸如：BDNF、NGF。已知这些因子在神经保护和可能的神经再生方面高度重要，并表明由本发明的方法获得的细胞的临床用途。

NMSC和终末分化的细胞具有体外神经营养作用

在N2A细胞体系中研究了NMSC和从所述NMSC分化的细胞的神经营养作用的评价。

在正常条件下，N2A细胞在暴露于视黄酸或血清剥夺后经历神经分化。用来自NMSC的和从NMSC分化的细胞的经调节的培养基(培养72小时后收集)培养N2A细胞。通过免疫染色神经元标志物MAP2使上清液对N2A的神经突突起生长的作用可视化，并通过ImageJ软件计算神经突长度。

在用来自全部细胞类型的细胞的上清液培养72小时后，检测到神经元标志物MAP2的阳性染色(未示出)。如表1中所示，用来自NMSC和分化的NMSC的上清液培养后，所产生的神经突的长度分别为85±10.7和127±20.43像素/神经突(计算20个细胞，150个神经突)(p>0.1)。

表1神经突突起生长

对照	MSC	MSC-NP	分化的MSC-NP(由CSF诱导)16 -->
				198±32.2	57±12.3	85±10.7	127±20.43

作为阳性对照，用20μM视黄酸培养N2A。分化的细胞显示神经元标志物MAP2的阳性染色。视黄酸分化的细胞的神经突长度测量值为198±32.2像素/神经突，表明分化的MSC-NP几乎和阳性对照一样好，说明NMSC具有非常强大的神经营养作用。

比较研究：

以下描述了以根据本发明的方法获得的细胞与根据Ye等描述的方法获得的细胞的形态中的差异。此外，展示了通过Ye等描述的方法获得的细胞的表征。

如下文所示，结果表明，通过Ye等的方法获得的细胞不分化形成少突胶质细胞，并且活性不如根据本发明的细胞。

通过使用Ye等使用的方案生长并用CSF处理的MSC也示出III类β-微管蛋白的阳性染色。然而，与以上不同，通过使用Ye等使用的方案生长并用CSF处理的MSC与从大脑分离的星形胶质细胞的形态不相似(图4F-4I)。这与通过本文描述的方法获得的细胞不同，本文描述的方法获得的细胞具有如从大脑分离的星形胶质细胞的“星形”样结构(图4C)。

比较通过Ye等方法获得的细胞和通过本发明的方法获得的细胞。结果总结于表2。

表2阳性染色的细胞的比例

*％阳性细胞，重复5孔。

从表2中可以看出，在通过Ye等的方法获得的细胞中，观察到具有标志物微管蛋白-β-III或MAP2的神经元样细胞的低阳性染色。一些细胞确实表现星形胶质细胞标志物GFAP和S100的阳性染色。

此外，没有检测到少突胶质细胞标志物GalC和CNP酶的阳性染色。此外，对于显示经CSF处理的细胞保留其延长的成纤维细胞样形状(该形状与幼稚MSC相同)的形态学结果，所述结果表明用CSF处理MSC不足以诱导如通过本发明的方法获得的分化。

为检测神经突突起生长，将培养的细胞用神经元标志物MAP2进行免疫染色。为测量分化后的神经突，使用计算机分析软件ImageJ并以像素计计算神经突长度。结果示于表3：

表3神经突突起生长

CSF诱导的MSC*	CSF诱导的NMSC*
		37±8像素/神经突	118±12像素/神经突

*像素±SD，150个神经突的计算值

表4生长因子分泌

*一式三份

如表4中所示，与通过本文描述的方法获得的细胞相比，通过Ye等的方法获得的细胞分泌少量神经营养因子(BDNF、NGF)。

NMSC在体内缓解慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎(cEAE)

如图6中所示，尽管在移植后，NMSC缓解疾病严重程度，但分化的NMSC提供显著更高的临床评分。具体地，cEAE的临床过程在经NMSC处理的动物中改善(n＝8)，具有死亡率0％和平均最大EAE评分1.75，在未处理动物中，死亡率33％且平均最大评分3.33(n＝10)。此外，使用分化的NMSC(n＝7)，效果更优越，具有死亡率0％和平均最大EAE评分0.6，对于NMSC，平均最大EAE评分为1.75且对于未处理动物，平均最大EAE评分为3.33。

Claims

1.一种诱导间充质干细胞(MSC)的转分化的方法，所述方法包括：

a.在第一培养基中培养MSC，所述第一培养基包含选择的用于允许神经化的MSC(NMSC)形成的生长因子；

b.允许所述NMSC增殖足够的时间，其间所述培养基被更新至少一次；

c.将(b)的NMSC在包含脑脊液(CSF)的第二培养基中培养足够用于所述NMSC分化成包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的时间。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述MSC获自健康供体或被诊断患有多发性硬化(MS)的受试者。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述MSC通过骨髓穿刺获得。

4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含选自碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的至少一种生长因子。

5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含补充有血清替代物的无血清培养基。

6.如权利要求1至5任一项所述的方法，所述方法包括至少每周一次更新所述第一培养基。

7.如权利要求6所述的方法，所述方法包括至少每周两次更新所述第一培养基。

8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述CSF是同种异体CSF。

9.如权利要求1至8任一项所述的方法，所述方法包括通过MSC标志物的低表达或缺乏和神经球标志物的表达确定NMSC的形成，所述MSC标志物选自由CD90和CD105组成的组，所述神经球标志物选自由巢蛋白和PSNCAM组成的组。

10.如权利要求1至9任一项所述的方法，所述方法包括通过确定神经元特征性的人微管相关蛋白2(MAP-2)的表达、星形胶质细胞特征性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、和少突胶质细胞特征性的2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP酶)的表达的水平确定所述细胞群体的形成。

11.如权利要求1至10任一项所述的方法，所述方法包括确定所述细胞群体的神经营养生长因子的水平为高于来自幼稚间充质干细胞的所述神经营养生长因子的水平的水平。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述生长因子是NGF或BDNF。

13.MSC用于制备包含细胞群体的组合物的用途，所述细胞群体包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

14.中性化的间充质干细胞(NMSC)用于制备包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的用途。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述NMSC的特征为MSC标志物的低表达或缺乏和神经球标志物的表达，所述MSC标志物选自由CD90和CD105组成的组，所述神经球标志物选自由巢蛋白和PSNCAM组成的组。

16.如权利要求13至15任一项所述的用途，其中所述细胞群体的特征为神经元特征性的人微管相关蛋白2(MAP-2)的表达、星形胶质细胞特征性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、和少突胶质细胞特征性的2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP酶)的表达。

17.如权利要求13至16任一项所述的用途，其中所述细胞群体的特征为神经营养生长因子以高于来自幼稚间充质干细胞的所述神经营养生长因子的水平的水平分泌。

18.如权利要求17所述的用途，其中所述神经营养生长因子是NGF或BDNF。

19.如权利要求13至18任一项所述的用途，其中所述组合物是药物组合物。

20.如权利要求19所述的用途，其中所述药物组合物用于治疗神经系统的病理状况。

21.如权利要求13至20任一项所述的用途，其中所述组合物用于治疗神经退行性疾病或脊髓损伤。

22.如权利要求13至21任一项所述的用途，其中所述组合物用于治疗多发性硬化。

23.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

组合物，所述组合物包含间充质干细胞(MSC)；和

用于将所述MSC在制备包含终末分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞群体的方法中使用的说明书，所述方法包括：

24.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述说明书包括如权利要求1至12任一项中定义的方法步骤。