CN103031275A

CN103031275A - 脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法

Info

Publication number: CN103031275A
Application number: CN 201210504988
Authority: CN
Inventors: 陆华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2013-04-10

Abstract

本发明提供一种脐带间充质干细胞(UC-MSCs)分化为神经干细胞的诱导方法，所述诱导方法包括如下步骤：UC-MSCs的分离、原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测。本发明的诱导方法应用全反式维甲酸联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞，经分裂增殖多次传代后仍然保持较强的活力。反式维甲酸联合细胞因子诱导UC-MSCs转化为神经干细胞，实现了间充质细胞跨胚层分化为非间充质细胞的能力，使其有可能成为今后临床应用更为理想的种子细胞。

Description

脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种应用全反式维甲酸联合细胞因子诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的方法。

背景技术

目前，神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导或是直接从发育中和成年哺乳动物的中枢神经系统中分离培养获得。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量的有限，在一定程度上限制了神经干细胞的移植应用。因此，很有必要寻找其它能够获得神经干细胞的途径来克服这些限制。中胚层来源的间充质干细胞向外胚层来源的神经干细胞转化的研究正处于起步阶段，脐带间充质干细胞(UC-MSCs)来自新生儿，取材方便、易于体外扩增、安全无病毒感染风险以及不受伦理和法律限制等优势，表达胚胎干细胞特异性基因、端粒末端转移酶SSEA4和TAR-1-60等原始干细胞表面标志，如能将UC-MSCs诱导为神经干细胞后应用将规避上述不足之处。全反式维甲酸是维生素A的衍生物，能够明显增加神经细胞的数量并呈剂量依赖效应，能调节表皮生长因子(EGF)反应的神经干细胞分化，增加神经元细胞和星形胶质细胞的合成。将其与神经营养因子和细胞因子联合用于诱导胚胎干细胞向神经干细胞方向分化，同体内发育过程相似，且可以部分模拟体内环境，可以诱导UC-MSCs转化为神经干细胞，使其有可能成为今后临床应用更为理想的种子细胞。

发明内容

为使UC-MSCs有效转化为神经干细胞，本发明提供一种应用全反式维甲酸(ATRA)联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导脐带间充质干细胞(UC-MSCs)分化为神经干细胞的方法，UC-MSCs经诱导转化为神经干细胞，经分裂增殖多次传代后仍然保持较强的活力，实现了间充质细胞跨胚层分化为非间充质细胞的能力。

具体的，本发明的脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法包括如下步骤：UC-MSCs的分离、原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测。

其中，所述的UC-MSCs的分离、原代培养的步骤包括：无菌条件下，将健康胎儿的脐带用含有双抗和两性霉素的D-Hanks液充分冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存积血；撕掉脐带表面的羊膜得到间充质组织，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，将组织块移至内含一磁力搅拌子的玻璃瓶中，加入胶原酶37℃下持续磁力搅拌消化30分钟；向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.125％的胰酶，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10％体积的FBS终止消化；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500转/分钟旋转15分钟洗涤后收集细胞；用含20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×10⁶细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次；细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，得到原代细胞。

所述UC-MSCs的传代培养与扩增步骤包括：观察原代培养细胞贴壁生长至80-90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液，浸漫覆盖瓶底；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1∶2-1∶3比例在细胞培养箱中传代培养，计为第1代UC-MSC；待细胞生长至80-90％汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增。

所述UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞步骤包括：取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60％时，换成全反式维甲酸联合细胞因子的诱导培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养；待培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养；无菌条件下，在倒置显微镜下用玻璃微针将其中的大于200μm的大克隆球切成数块，继续培养；7～10天传代1次；传代后的细胞再无血清诱导培养基培养体系中继续培养。

所述神经干细胞的分化培养步骤包括：将以上获得的、来自单细胞的克隆球经胰酶消化后，种植于预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和经过滤灭菌后的新鲜成人脑脊液中进行分化培养。

所述的免疫荧光法检测步骤包括：将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿中，用无血清培养基贴壁培养12小时后行荧光检测；经分化培养后的细胞分别于2、7、14和21天行荧光检测。

本发明应用全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导脐带间充质干细胞(UC-MSCs)分化为神经干细胞，经分裂增殖多次传代后仍然保持较强的活力，并呈巢蛋白(Nestin)的阳性表达，分化后细胞行免疫荧光检测显示均表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilamentacidic protein，GFAP)；具有自我更新及多分化潜能，证明UC-MSCs仍然保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经干细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：

图1所示为本发明的脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法的步骤流程示意图。

具体实施方式

如图1所示为本发明的脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法的步骤流程示意图，所述实施例的方法包括如下步骤：

S1、UC-MSCs的分离、原代培养：

无菌条件下，将剖宫产足月妊娠健康胎儿的脐带10cm，用含有1％双抗和250ug/mL两性霉素的D-Hanks液充分冲洗脐带外表面，并用20mL注射器分别插入两根脐静脉及一根脐动脉内反复冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存积血；撕掉脐带表面的羊膜得到间充质组织，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，将组织块(约30-40ml)移至内含一磁力搅拌子的100mL玻璃瓶中，加入0.2％胶原酶II30-40mL(终浓度约为0.1％)，37℃，持续磁力搅拌下消化30分钟；向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.125％的胰酶，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10％体积的胎牛血清(FBS)终止消化；将收集的细胞用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液)30mL吹打成均匀悬液，1500转/分钟旋转15分钟洗涤2次，收集细胞；用含20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×10⁶细胞/ml，接种于包被后的T75cm²型细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA(乙二胺四乙酸)消化，所得细胞为原代细胞。

S2、UC-MSCs的传代培养与扩增：

观察原代培养细胞贴壁生长至80-90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml 0.01M PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起；加入1.0ml FBS中止胰酶消化；加入10ml 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液，加入10mlDMEM/F12重悬细胞，按1∶2-1∶3比例传代培养；培养体系为20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶。置37℃，5％CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代(passage1，P1)UC-MSC；待细胞生长至80-90％汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩增。

S3、UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞：

取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60％时，换成全反式维甲酸联合细胞因子的诱导培养基(DMEM+10％FBS+1μmol/L ATRA+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF)。在37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养；待培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养。采用严格无菌操作，在倒置显微镜下用自制玻璃微针将其中的大克隆球(大于200μm)切成数块，小克隆球(小于100μm)不作处理，继续培养。根据克隆球生长情况，7～10天传代1次；传代后的细胞无血清诱导培养基培养体系中继续培养。

S4、神经干细胞的分化培养：

将以上获得的、来自单细胞的克隆球经胰酶消化后，种植于预先用多聚赖氨酸包被的、直径3.5cm的小培养皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和经过滤灭菌后的新鲜成人脑脊液中进行分化培养。神经干细胞在DMEM/F12+50g/L FBS有血清培养基中培养，12小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，2天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状；2周后部分分化细胞开始衰退。在DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基中，一部分细胞出现贴壁分化现象，另一部分细胞则继续分裂增殖，最后细胞可以很快贴满整个皿底。新鲜成人脑脊液中亦出现很好的分化现象，经适时更换脑脊液，细胞可以长期存活。

S5、免疫荧光法检测：

将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿中，用无血清培养基贴壁培养12小时后行荧光检测；经分化培养后的细胞分别于2、7、14和21天行荧光检测。每个培养皿用蜡笔画五个圈，分别用抗Nestin IgG、抗NSE IgG、抗GFAP IgG、抗CNP IgG和空白对照行免疫荧光染色，二抗为FITC荧光二抗。贴壁的克隆球呈巢蛋白(Nestin)抗原阳性，同时NSE、GFAP和CNP免疫荧光染色均呈阴性。在DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和新鲜成人脑脊液中分化的细胞，不同时间点均检测到NSE、GFAP和CNP阳性细胞，2周后几乎未找到Nestin阳性细胞。

本实施例从人脐带中分离培养出了人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)，发现其具有自我更新、体外易扩增、多向分化潜能以及免疫调节等多种生物学特性，其形态、免疫表型以及多分化潜能等多种生物学特性与BMSCs极为相似。应用全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导脐带间充质干细胞(UC-MSCs)分化为神经干细胞，经分裂增殖多次传代后仍然保持较强的活力，并呈巢蛋白(Nestin)的阳性表达，分化后细胞行免疫荧光检测显示均表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilament acidic protein，GFAP)；具有自我更新及多分化潜能，证明UC-MSCs仍然保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经干细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。

本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。

Claims

1.一种脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法，其特征在于应用全反式维甲酸和细胞因子诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞，所述诱导方法包括如下步骤：UC-MSCs的分离、原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测；其中，

所述的UC-MSCs的分离、原代培养的步骤包括：无菌条件下，将健康胎儿的脐带用含有双抗和两性霉素的D-Hanks液充分冲洗，冲去脐静脉及动脉内的残存积血；撕掉脐带表面的羊膜得到间充质组织，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，将组织块移至内含一磁力搅拌子的玻璃瓶中，加入胶原酶37℃下持续磁力搅拌消化30分钟；向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度为0.125％的胰酶，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10％体积的FBS终止消化；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500转/分钟旋转15分钟洗涤后收集细胞；用含20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×10⁶细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次；细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，得到原代细胞；

所述的UC-MSCs的传代培养与扩增步骤包括：观察原代培养细胞贴壁生长至80-90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液，浸漫覆盖瓶底；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1∶2-1∶3比例在细胞培养箱中传代培养，计为第1代UC-MSC；待细胞生长至80-90％汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增；

所述的UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞步骤包括：取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60％时，换成全反式维甲酸联合细胞因子的诱导培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养；待培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养；无菌条件下，在倒置显微镜下用玻璃微针将其中的大于200μm的大克隆球切成数块，继续培养；7～10天传代1次；传代后的细胞再无血清诱导培养基培养体系中继续培养；

所述的神经干细胞的分化培养步骤包括：将以上获得的、来自单细胞的克隆球经胰酶消化后，种植于预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和经过滤灭菌后的新鲜成人脑脊液中进行分化培养；以及

2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法，其特征在于，所述的UC-MSCs的传代培养与扩增步骤中，所述的传代培养体系为20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液。

3.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的诱导方法，其特征在于，所述的UC-MSCs体外诱导转化为神经干细胞步骤中，所述的诱导培养基为DMEM+10％FBS+1μmol/L ATRA+20ng/mlbFGF+20ng/ml EGF。