CN113444689B - 人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养诱导分化成神经样干细胞的方法 - Google Patents

人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养诱导分化成神经样干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种使用人源自体脂肪干细胞，经过与脐带间充质干细胞共培养以及细胞因子诱导成为神经样干细胞，可以提供给医疗机构治疗少儿脑瘫等神经细胞缺失性疾病。此发明避免了伦理问题和异体细胞移植的不安全性，分离纯化后的人源自体脂肪干细胞经转化，可获得纯度较为一致的、非基因编辑的、安全稳定且适用于大批量培养的神经类干细胞，适用于脑瘫的个体化治疗，可以为临床治疗脑瘫提供一种稳定可行的方法。

Description

人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养诱导分化成 神经样干细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养诱导分化成神经样干细胞的方法，属于细胞技术领域。
背景技术
人源自体脂肪干细胞（ADSCs）是存在于人体脂肪组织中，具有多能分化能力的细胞，大量实验证实，在一定诱导环境中，脂肪细胞可分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等，移植后具有良好的替代、修复及治疗作用，且无致瘤性，不与自体发生免疫排斥。
ADSCs朝向神经细胞方向分化的常用方法包括神经诱导培养基培养、共培养、基因转染和电刺激。
神经诱导培养基诱导培养是采用直接诱导分化或分步诱导分化法，即 ADSCs 先转分化为神经干细胞( neural stem cells，NSCs) ，再朝向神经细胞分化。在培养基中添加生长因子运用得较为广泛，也有添加激素类蛋白、小分子化合物等。Mostafavi 等采用分步诱导分化法，将人 ADSCs 和人 BMSCs 进行对比实验，他们将这两种细胞在 b-FGF、EGF、B27的联合诱导下先形成神经球，再在含有 B27的神经培养基中培养成神经元样细胞。培养出的神经元样细胞表达 MAP2 和 GFAP 基因，而作为星形胶质细胞的标记物，GFAP 基因在ADSCs 的表达量低于 BMSCs，成熟神经元标记物 MAP2 在这两种细胞中相当，由此可见，想要获得神经元样细胞，ADSCs 相较于 BMSCs 而言是更好的选择。
除了在神经培养基里添加各种细胞因子，激素类蛋白的添加，如 T3、雌激素、催产素等，也能促进 ADSCs 产生神经方向的分化。Ｒazavi 团队前后试验了 T3 和雌激素协同b-FGF、EGF、 B27对于人 ADSCs 的神经分化作用，他们均采用分步诱导分化法，发现雌二醇或许能够通过产生神经营养因子提高人 ADSCs 的增殖速率和神经分化效率，而 T3 则促进人 ADSCs 朝向神经胶质细胞分化。而催产素，作为神经垂体激素，对小鼠 ADSCs 的神经分化作用具有时间依赖性和浓度依赖性。只有在含 10－7mol/L 催产素的神经培养基中，CHAT 的基因有表达。而 GFAP 的不表达表明，催产素诱导的神经分化直接朝向神经元而不是胶质细胞。
小分子化合物，属于化学生物学范畴，它使用方便、可控，它在 ADSCs 朝向神经方向分化过程中，主要是作用于细胞信号传导通路，使细胞重编程，再定向分化。Park 等运用TGF-β受体抑制剂 SB431542 和选择性 BMP 信号通路抑制剂 LDN193289 分三步进行诱导。使用小分子化合物，将人 ADSCs 转分化为神经干细胞。最终超过 76% 的细胞诱导为能产生膜电位的神经元，而功能性γ氨基丁酸能神经元的诱导效率超过 45%。小分子化合物的使用，为 ADSCs 朝向神经方向分化提供了可重复且有效的方法。
Ｒazavi 等首先将人 ADSCs 诱导成神经营养因子分泌细胞，再将其制成细胞微胶囊与人 ADSCs 诱导成的神经球以 1 ∶1的比例共培养，最终诱导成的细胞表达的 MAP2和 nestin 明显升高，而 GFAP 下降，表明将人 ADSCs 和神经营养因子分泌细胞共培养促进了朝向神经元的分化，这种促进作用是通过分泌神经营养因子分泌细胞分泌 BDNF、神经营养因子( nerve growth factor，NGF) 、睫状神经营养因子( ciliary neurotrophicfactor，CNTF) 等产生。
Bahmani 团队将小鼠 ES 细胞与小鼠 ADSCs 进行非接触共培养 48 h 后，再进行神经诱导 2 周，神经特定标记物的表达量多于未共培养 ADSCs。RT-PCR 检测结果显示，共培养后，小鼠 ADSCs 表达 PCNA 基因、SOX2 基因、OCT4 基因上调，这些多能性标记物的升高提示小鼠 ES 细胞分泌细胞因子和生长调节剂以增加小鼠 ADSCs 的多能性来促进其朝向神经分化。
除了在神经培养基中添加各类细胞因子、激素、小分子化合物，或是 ADSCs 与有分泌功能的细胞共培养促进神经方向的分化外，科研人员还采用基因转染技术，将 BDNF和神经营养因子-3( neurotrophin-3) 经由慢病毒转入 SD 大鼠的 ADSCs，再经由神经培养基诱导，其表达的 NSE 基因量有所增加。
Yang则将不同强度电刺激作用于 SD 大鼠的ADSCs，最终筛选出最适宜人源自体脂肪干细胞神经分化的电刺激强度( 1 V/cm) ，在此电刺激强度下，人源自体脂肪干细胞增殖活力增强，且能促进人源自体脂肪干细胞向神经方向分化。而后结合基因转染技术，将Nurr-1 基因转入 ADSCs，发现电刺激联合 Nurr-1 基因转染作用于人源自体脂肪干细胞后能进一步提高其向神经方向分化的能力。
然而，目前人源自体脂肪干细胞诱导成神经类干细胞的，诱导分化率不高，而且诱导分化出的神经类干细胞稳定性差。
发明内容
本发明的目的是提供一种人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养诱导分化成神经样干细胞的方法。
本发明实施例公开了一种人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养诱导分化成神经样干细胞的方法，获取纯化分离的人源自体脂肪干细胞和纯化分离的脐带间充质干细胞，在包含有诱导分化剂的分化培养基中共培养所述人源自体脂肪干细胞和所述脐带间充质干细胞，即可诱导分化得到神经样干细胞。
在本发明实施例中，所述诱导分化剂为化学诱导剂和/或生长因子诱导剂。
在本发明实施例中，所述化学诱导剂选自丁基羟基茴香醚、白藜芦醇和维甲酸中的一种。
在本发明实施例中，所述生长因子诱导剂选自表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子中的一种。
在本发明实施例中，所述的方法具体包括以下步骤：
获取纯化的第三代人源自体脂肪干细胞和纯化的第六代脐带间充质干细胞；
将所述第三代人源自体脂肪干细胞接种于1 mmol/L ß-BME培养液预诱导24h；
再加入至包含分化培养基的共培养皿中，所述分化培养基包含所述化学诱导剂，并同时将所述共培养皿转入至接种有第六代脐带间充质干细胞的孔板中，进行共培养和诱导分化5~8天，即可得到分化的神经样干细胞。
在本发明实施例中，所述方法具体包括以下步骤：
获取纯化的第三代人源自体脂肪干细胞和纯化的第六代脐带间充质干细胞；
将所述第三代人源自体脂肪干细胞接种于第一分化培养基中预诱导5~8天，所述第一分化培养基包含两种生长因子，每天半量换液，每3天加入新鲜的该两种生长因子；
待形成悬浮球状的人源自体脂肪干细胞后转接至包含第二分化培养基的共培养皿中，并同时将所述共培养皿转入至接种有第六代脐带间充质干细胞的孔板中，进行共培养和诱导分化5~8天，即可得到分化的神经样干细胞；
其中，所述第二分化培养基包含另外两种生长因子。
在本发明实施例中，所述方法具体包括以下步骤：
获取纯化的第三代人源自体脂肪干细胞和纯化的第六代脐带间充质干细胞；
将所述第三代人源自体脂肪干细胞接种于第一分化培养基中预诱导2~4天，所述第一分化培养基包含DMEM/ F12、2%B27、2~20 mmol/L 化学诱导剂；
待形成悬浮球状的人源自体脂肪干细胞后转接至包含第二分化培养基的共培养皿中，并同时将所述共培养皿转入至接种有第六代脐带间充质干细胞的孔板中，进行共培养和诱导分化5~8天，即可得到分化的神经样干细胞；
其中，所述第二分化培养基包含DMEM/F12+5mmol/L ß-BME + 2wt%DMSO + 20 pg/L所述生长因子诱导剂。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
使用人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞(UC-MSCs)共培养以及细胞因子诱导成为神经样干细胞，诱导分化率高，纯度一致，安全性高。此发明避免了伦理问题和异体细胞移植的不安全性，分离纯化后的人源自体脂肪干细胞经转化，可获得纯度较为一致的、非基因编辑的、安全稳定且适用于大批量培养的神经类干细胞，适用于脑瘫的个体化治疗，可以为临床治疗脑瘫提供一种稳定可行的方法。
附图说明
图1是本发明获得的具有典型神经细胞特征的神经类干细胞。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
发明人经创造性的研发，使用人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞(UC-MSCs)共培养以及细胞因子诱导成为神经样干细胞，诱导分化率高，纯度一致，安全性高。此发明避免了伦理问题和异体细胞移植的不安全性，分离纯化后的人源自体脂肪干细胞经转化，可获得纯度较为一致的、非基因编辑的、安全稳定且适用于大批量培养的神经类干细胞，适用于脑瘫的个体化治疗，可以为临床治疗脑瘫提供一种稳定可行的方法。
共培养(coculture)是人们为了建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖。细胞共培养技术是将2种或 2种以上的细胞共同培养于同一环境中，由于其具有更好地反映体内环境的优点，被广泛应用于现代细胞研究中。
神经退行性疾病是一类以神经元退行性病变为主要特征的疾病，目前在全球范围内频发，尚无有效的治疗措施。干细胞具有自我更新和定向分化的潜能，为神经退行性疾病中大脑功能的恢复提供了新的治疗方法。人源自体脂肪干细胞是由中胚层发育而来的多潜能干细胞，在特定的生长因子和环境诱导下可以向不同的谱系分化，同时具有获取方便、容易培养的特点，因此脂肪组织来源的干细胞在治疗神经退行性疾病方面有其独特优势。
本发明实施例公开了一种人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养诱导分化成神经样干细胞的方法，获取纯化分离的人源自体脂肪干细胞和纯化分离的脐带间充质干细胞，在包含有诱导分化剂的分化培养基中共培养所述人源自体脂肪干细胞和所述脐带间充质干细胞，即可诱导分化得到神经样干细胞。
本发明实施例中的共培养采用Transwell 共培养装置进行。
本发明实施例根据深圳市细胞治疗技术协会团体标准，由十度生物技术有限公司提供符合标准的ADSCs和UC-MSCs。
在本发明实施例中，所述诱导分化剂为化学诱导剂和/或生长因子诱导剂。
在本发明实施例中，所述化学诱导剂选自丁基羟基茴香醚、白藜芦醇和维甲酸中的一种。
在本发明实施例中，所述生长因子诱导剂选自表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子中的一种。
在本发明实施例的第一种共培养诱导方式采用化学诱导剂进行诱导，所述方法具体包括以下步骤：
获取纯化的第三代人源自体脂肪干细胞和纯化的第六代脐带间充质干细胞；
将所述第三代人源自体脂肪干细胞接种于1 mmol/L ß-BME培养液预诱导24h；
再加入至包含分化培养基的共培养皿中，所述分化培养基包含所述化学诱导剂，并同时将所述共培养皿转入至接种有第六代脐带间充质干细胞的孔板中，进行共培养和诱导分化5~8天，即可得到分化的神经样干细胞。
在本发明实施例的第一种共培养诱导方式采用生长因子进行诱导，一个实施例中，所述方法具体包括以下步骤：
获取纯化的第三代人源自体脂肪干细胞和纯化的第六代脐带间充质干细胞；
将所述第三代人源自体脂肪干细胞接种于第一分化培养基中预诱导5~8天，所述第一分化培养基包含两种生长因子，每天半量换液，每3天加入新鲜的该两种生长因子；
待形成悬浮球状的人源自体脂肪干细胞后转接至包含第二分化培养基的共培养皿中，并同时将所述共培养皿转入至接种有第六代脐带间充质干细胞的孔板中，进行共培养和诱导分化5~8天，即可得到分化的神经样干细胞；
其中，所述第二分化培养基包含另外两种生长因子。
在本发明实施例的第一种共培养诱导方式采用化学诱导剂和生长因子相结合的方式进行诱导培养，所述方法具体包括以下步骤：
获取纯化的第三代人源自体脂肪干细胞和纯化的第六代脐带间充质干细胞；
将所述第三代人源自体脂肪干细胞接种于第一分化培养基中预诱导2~4天，所述第一分化培养基包含DMEM/F12、2%B27、2~20 mmol/L 化学诱导剂；
待形成悬浮球状的人源自体脂肪干细胞后转接至包含第二分化培养基的共培养皿中，并同时将所述共培养皿转入至接种有第六代脐带间充质干细胞的孔板中，进行共培养和诱导分化5~8天，即可得到分化的神经样干细胞；
其中，所述第二分化培养基包含DMEM/F12+5mmol/L ß-BME + 2wt%DMSO + 20 pg/L所述生长因子诱导剂。
下方将结合上述具体的实施例进行说明。
1、人源自体脂肪干细胞（ADSCs）分离培养
采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，以进行人源自体脂肪干细胞的分离纯化，具体步骤如下：
1）采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗 5遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；
2）采用25m1的移液管经冲洗完毕的自体脂肪组织样品移入新的 50m1无菌离心管中，加入等体积的脂肪消化酶消化脂肪组织，振荡混匀后在37 ℃的恒温摇床中振荡25分钟，振荡过程中230r/min的均匀转速旋转，并且振荡过程中每间隔5分钟用手自上向下混匀一次；
3）振荡完毕以后，放置在离心机上进行离心分离，其中，离心分离过程中保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min,离心分离的时间不小于5分钟，去除顶层液体，采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本后采用A4分子筛(上海有新分子筛有限公司)过筛；
4）再次采用离机进行离心分离，离心分离过程中仍保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min,离心分离的时间不小于10分钟，之后再次采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本并进行冲洗之后，采用250r/min的离心机再次进行离心分离10分钟；
5）加入人源自体脂肪干细胞培养液（CM-H205，普诺赛公司）并调整细胞浓度至1.5x105、2.5x105/ml，培养48小时以使细胞融合度达到85％、90％之间；当细胞融合度达到85％、90％之间后，采用吸管吸出培养瓶内的培养基，加入PBS生理盐水洗涤细胞一次，之后加入1m1胰蛋白酶替代物消化3分钟，在显微镜下观察到细胞变圆后加入4ml培养基终止消化，之后轻轻吹吸若干次以使培养细胞从培养瓶的底部将脱落形成的细胞悬液吸入离心管中，采用280r/min的离心机进行离心分离10分钟后，舍弃上次清液，并加入2m1培养基进行吹吸混匀，吹吸混匀后平均分配到3个新的培养瓶中，即可得到分离纯化的人源自体脂肪干细胞；
2、人源自体脂肪干细胞（ADSCs）的传代培养
在新的培养瓶中补加适量培养基之后轻轻晃动培养瓶，待纯化的人源自体脂肪干细胞均匀分布之后放入37 ℃的5％二氧化碳培养箱中进行培养以使人源自体脂肪干细胞发生传代；将发生传代反应到第三至第五代的人源自体脂肪干细胞放置在用脐带间充质干细胞密度在5x105/ml包被的6孔培养板中进行诱导分化培养，培养密度为20000个/孔，培养一天之后采用生理盐水进行清洗一遍；清洗完毕之后将生长培养基替换为含有低糖。
3、UC-MSCs的分离培养
1）无菌条件下剪取脐带4-6cm长，在超净台中将其剪成1cm小段，再纵向剪开，用PBS多次漂洗以去除血液，将其剪成肉糜状，移入50 ml离心管，加入10 ml质量分数0.1%的经37℃预热的胶原酶II，于37℃水浴摇床中振荡消化60 min再加入质量分数0.25%的胰蛋白酶10 ml继续振荡消化30 min然后加入30 ml_DMEM/F12,用滴管反复吹打以尽量离散细胞，室温下以500×g离心5 min小心吸取上清，再500×g离心10 mm弃上清，将沉淀细胞用含体积分数100% PBS的DMEM/F12(含2 mmol/L谷胺酰胺，20 mmol/L HEPES)按1×109cells/L的密度接种于T25培养瓶，在饱和湿度、37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中培养。
4、UC-MSCs的传代培养
取原代UC-MSCs细胞培养4-5天首次换液，弃去未贴壁细胞，每3-4啦液1次，当细胞达80%融合后，用质量分数0.25%的胰酶消化，首次按1:2的比例传代培养，以后按1:3比例传代。传代时在显微镜下控制消化时间，避免过度消化，弃除紧密贴壁细胞，选用弱酸性的含20 mmol/L HEPES、10 v/v%的FBS的DMEM/F12培养基进行培养。
5、共培养
根据深圳市细胞治疗技术协会团体标准，选取第三代在十度生物技术有限公司细胞间培养的符合标准的人源自体脂肪干细胞作为共培养诱导ADSCs，UC-MSCs选取第六代作为共培养诱导细胞。
进行体外诱导分化，采用上述实施例的方式进行，具体可包括：2% B27（货号17504-044，上海恪敏生物科技有限公司）、青链霉素合剂、胎牛血清以及化学诱导剂或生长因子加入DMEM/F12 培养基以作为诱导分化培养基，以作为第一分化培养基或第二分化培养基。
6、筛选诱导分化分化培养基：
基于上述实施例可知，诱导分化分化培养基以基础培养基为DF12，在其中添加不同的诱导剂进行诱导。具体的诱导剂可采用化学诱导剂，生长因子诱导剂及二者的组合进行。
将按照上述实施方式中的共培养和诱导方法进行了多个实施例和对比例，将其列入表1中。表1中，BHA代表丁基羟基茴香醚，RA代表维甲酸，Res代表白藜芦醇，EGF代表表皮生长因子，bFCF代表碱性成纤维生长因子，BDNF代表脑源性神经营养因子，GDNF代表胶质细胞源性神经营养因子，“-”代表未使用该项。
表1
Figure RE-439663DEST_PATH_IMAGE001
例如，表1中的化学诱导剂组例如：取第3代ADSCs，以1×105 /cm2的密度接种于1mmol/L ß-BME培养液预诱导24 h，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，再加入到分化培养基（DMEM/F12 + 5 mmol/L ß-BME + 2wt%DMSO + 20 mmol/L BHA），诱导7 d。
例如，表1中的生长因子诱导剂组例如：以同等密度接种于培养基1（DMEM/F12 +2wt%B27 + 20 pg/L EGF + 20 pg/L bFCF)预诱导7 d，每天半量换液，每3 d加入新的因子，于3、4 d可在镜下见悬浮细胞球生成。然后用0.25％胰酶消化细胞球至单个细胞，移入培养基 ( DMEM/F12+ 20 pg/L BDNF + 20 pg/L GDNF)，每3 d换液，诱导7 d。
例如，表1中的化学结合生长因子结合诱导组：化学诱导3d以后，换液成生长因子诱导培养基每3d换液诱导7d。
例如，表1中的空白对照组使用的诱导培养基采用1%双抗，2%FBS，1%ITS，DMEM/F12，诱导方法参照化学诱导剂组。
7、体外人源自体脂肪干细胞诱导成神经干细胞的鉴定检测：
免疫荧光染色检测：(1)神经丝蛋白 (NF-M)的表达；(2)胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。NF-M、GFAP的表达：使用40g/L多聚甲醛对诱导分化后的细胞予以固定，山羊血清封闭，分别加入NF-M抗体(1:500)和GFAP抗体(1:500)并在4 ℃下孵育过夜，0.1 mol/L PBS洗涤后加入山羊抗鼠二抗(1∶100)于室温孵育60 min，0.1 mol/L PBS洗涤后Hoechst3342(0.5 mg/L)复染细胞核，Leica倒置荧光显微镜观察，共聚焦显微镜进行拍照。重复实验至少3次以上，每次分别采集共聚焦图片15张(放大250倍)，采用Image-Pro Plus6.0图像处理分析软件分别计算2种方法诱导后的阳性细胞百分数，以计量资料形式表示。2种方法分别设阴性对照(未加入NF-M及 GFAP)，应用免疫荧光法检测其细胞标志物NF-M、GFAP的表达。通过两种蛋白表达的阳性率来判断诱导分化效果，结果如表2所示。
表2,
Figure RE-294487DEST_PATH_IMAGE002
，n=5
Figure RE-11907DEST_PATH_IMAGE004
表2中分别列出了不同实施例和空白对照组的NF-M阳性率和GFAP阳性率，并对二者分别进行显著性差异标记，结果可知，实施例1-10的NF-M阳性率和GFAP阳性率均显著高于空白对照组，这表面本发明实施例提供的诱导分化方法和诱导培养基成功实现人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养以及细胞因子诱导成为神经样干细胞。并且对于NF-M阳性率，实施例8-11诱导效果最佳，具有预料不到的协同作用。
术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims (1)

1.人源自体脂肪干细胞与脐带间充质干细胞共培养诱导分化成神经样干细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
获取纯化的第三代人源自体脂肪干细胞和纯化的第六代脐带间充质干细胞；
将所述第三代人源自体脂肪干细胞接种于第一分化培养基中预诱导2~4天，所述第一分化培养基包含DMEM/ F12、2%B27和20mmol/L化学诱导剂；
待形成悬浮球状的人源自体脂肪干细胞后转接至包含第二分化培养基的共培养皿中，并同时将所述共培养皿转入至接种有第六代脐带间充质干细胞的孔板中，进行共培养和诱导分化5~8天，即可得到分化的神经样干细胞；
所述共培养采用Transwell 共培养装置进行；
所述第二分化培养基包含DMEM/F12、5mmol/L ß-BME 、 2wt%DMSO 和20 pg/L所述生长因子诱导剂；
所述化学诱导剂和生长因子诱导剂为：
当第一分化培养基中的化学诱导剂为BHA时，第二分化培养基中的生长因子诱导剂为EGF；
当第一分化培养基中的化学诱导剂为RA时，第二分化培养基中的生长因子诱导剂为BFGF；
当第一分化培养基中的化学诱导剂为Res时，第二分化培养基中的生长因子诱导剂为FGFs。
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