CN115154589B - 白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在缓解蒽环类药物诱导的心脏及肝脏毒性中的应用 - Google Patents

白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在缓解蒽环类药物诱导的心脏及肝脏毒性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在缓解蒽环类药物诱导的心脏及肝脏毒性中的应用。本发明通过研究发现白藜芦醇能够显著抑制成纤维细胞生长因子1的促肿瘤增长活性，白藜芦醇和成纤维细胞生长因子1联合应用可以有效缓解阿霉素造成的心脏及肝脏功能紊乱、炎症、氧化应激和凋亡。当两者联合使用时，对阿霉素诱导的心脏毒性和肝脏毒性的预防和治疗均强于单独用药，表现出良好的协同作用，因此具有重要的临床意义和社会价值。

Description

白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在缓解蒽环类药物诱导 的心脏及肝脏毒性中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在缓解蒽环类药物诱导的心脏及肝脏毒性中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
蒽环类药物阿霉素(DOX)是一种广泛使用的化疗药物，因其在对抗多种癌症方面的疗效，被认为是美国食品和药物管理局批准的最有效的化疗药物之一。但由于其剂量相关的器官损伤，需要严格限制DOX的剂量和给药时间。DOX引起的器官毒性机制复杂，包括氧化应激，炎症反应，线粒体损伤，内质网应激，钙离子稳态失衡、细胞凋亡、纤维化和自噬失调等。其中心肌细胞的再生能力较低，因此可能更容易受到DOX的不良反应的影响，临床数据表明，当化疗患者接受DOX的累计剂量超过500mg/m2时，其心力衰竭的发生率将进行性增加。此外，肝脏作为代谢中枢，在DOX治疗过程中接受、积累和代谢高浓度的阿霉素。因此，肝脏是受DOX副作用影响最大的器官之一。DOX引起的急性肝损伤是临床常见的危及生命的疾病之一，可发展为急性肝功能衰竭，死亡率高，因此寻找一种方法预防或减少DOX在化疗中的副作用迫在眉睫。
成纤维细胞生长因子1(FGF1)是一种有丝分裂因子，是FGFs家族的重要成员之一，在心脏中具有高水平的表达，并能够发挥广泛的生物学功能，如，促进血管生成、减轻细胞凋亡、氧化应激和纤维化等。同时，FGF1能促进肝源性干细胞的分化和成熟，表明其对各种肝脏疾病具有潜在的治疗作用。然而，FGF1具有强大的促有丝分裂和增殖能力，可能会对其临床应用产生负面影响，例如促肿瘤增长和转移。
白藜芦醇(RES)是一种天然植物抗毒素，存在于葡萄、花生、桑葚和其他植物中，被认为是一种作用广泛的营养补剂。有研究发现，RES在人体可发挥多种功能，从增强免疫力，延缓衰老过程，模仿卡路里限制的效果进而抵抗肥胖，到预防或缓解糖尿病等疾病以及神经退行性和心血管疾病的特定作用。目前，RES对癌症的抑制作用已经被大家所公认，RES不仅在癌变的四个主要阶段(即启动，促进，进展和转移)中可作为化学预防剂，而且在诱导癌细胞凋亡方面具有很高的效率。然而，迄今为止，尚未有将FGF1和RES联用用于缓解蒽环类药物DOX诱导的心脏及肝脏毒性的报道。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在缓解蒽环类药物诱导的心脏及肝脏毒性中的应用。本发明通过研究发现，白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1联合用药后能够显著改善阿霉素所导致的心脏损伤和肝脏损伤等症状。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在如下任意一种或多种中的应用：
1)制备改善蒽环类药物所导致的心脏毒性的产品；
2)制备改善蒽环类药物所导致的肝脏毒性的产品。
其中，所述蒽环类药物可以为阿霉素，所述产品可以为药物。
本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括上述白藜芦醇和成纤维细胞生长因子1。
所述组合物具有如下任意一种或多种应用：
1)制备改善蒽环类药物所导致的心脏毒性的产品；
2)制备改善蒽环类药物所导致的肝脏毒性的产品。
其中，所述蒽环类药物可以为阿霉素，因此，
所述改善阿霉素所导致的心脏毒性具体表现为：
1-1)减轻阿霉素诱导的心肌损伤；
1-2)减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡；
1-3)减轻阿霉素诱导的心肌炎症；
1-4)减轻阿霉素诱导的心脏氧化应激。
所述阿霉素所导致的肝脏毒性的具体表现为：
2-1)减轻阿霉素诱导的肝脏损伤；
2-2)减轻阿霉素诱导的肝脏细胞凋亡；
2-3)减轻阿霉素诱导的肝脏炎症；
2-4)减轻阿霉素诱导的肝纤维化；
2-5)减轻阿霉素诱导的肝脏氧化应激。
本发明的第三个方面，提供一种改善阿霉素所导致的心脏毒性的方法，所述方法包括向受试者施用上述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1或上述组合物。
本发明的第四个方面，提供一种改善阿霉素所导致的肝脏毒性的方法，所述方法包括向受试者施用上述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1或上述组合物。
与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：
为了进一步缓解阿霉素诱导的心脏及肝脏毒性并有效减轻成纤维细胞生长因子1单独使用所带来的促肿瘤生长的活性，上述技术方案提供一种联合用药组合物，包括白藜芦醇和成纤维细胞生长因子1。上述技术方案通过研究发现白藜芦醇能够显著抑制成纤维细胞生长因子1的促肿瘤增长活性，白藜芦醇和成纤维细胞生长因子1联合应用可以有效缓解阿霉素造成的心脏及肝脏功能紊乱、炎症、氧化应激和凋亡。当两者联合使用时，对阿霉素诱导的心脏毒性和肝脏毒性的预防和治疗均强于单独用药，表现出良好的协同作用，因此具有重要的临床意义和社会价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：(A-C)采用CCK-8法检测MCF-7、5637和HepG2细胞的活力。(D)采用TUNEL染色法检测MCF-7细胞的凋亡情况。*P<0.05。
图2：(A-C)检测血清中CK、LDH、cTnI的水平。(D)在心脏组织中通过TUNEL染色显示心脏细胞凋亡。(E和G)免疫组化(IHC)染色图像显示cleaved caspases-3蛋白表达水平。(F、H和I)Western blot显示，心脏组织中cleaved caspases-3、Bax、Bcl-2的蛋白表达。GAPDH作为内参对照。数据以均值±标准差(SD)表示。*P<0.05。
图3：(A-E)采用qRT-PCR检测心脏组织中Il1a、Il1b、Il6、Tnfa、Mcp1的相对mRNA水平。(F)心肌中CD68阳性细胞浸润。(G-I)Western blot检测p-IKBα、IKBα、p-p65、p65等蛋白在心肌中的表达水平(Ctrl：n＝4；其他组：n＝6)。GAPDH作为内参对照。数据以均值±标准差(SD)表示。*P<0.05。
图4：(A-B)DHE染色检测心脏组织中的超氧阴离子水平，并定量检测荧光强度。(C)心脏组织中MDA水平。(D)血清中GSH的水平。(E-H)Western blot检测心脏CAT、SOD1、SOD2蛋白表达水平。GAPDH作为内参对照。数据以均值±标准差(SD)表示。*P<0.05。
图5：采用CCK-8法检测HepG2细胞的活力。
图6：(A)肝脏重量/体重，计算肝指数。(B,C)检测血清中肝脏损伤指标ALT和AST的水平。(D)在肝脏组织中通过H&E染色显示肝脏组织形态学改变。(E)在肝脏组织中通过TUNEL染色显示肝脏细胞凋亡。
图7：(A-C)采用qRT-PCR检测肝脏组织中Tnfa、Il1b和Il6的相对mRNA水平。(D)免疫组化(IHC)染色图像显示肝脏组织中TNF-α的蛋白表达水平。(E，F)天狼星红(SiriusRed)染色显示肝脏组织中胶原沉积程度。
图8：(A-D)DHE染色检测肝脏组织中的超氧阴离子水平，并定量检测荧光强度。免疫组化(IHC)染色图像显示肝脏中3-NT和4-HNE的蛋白表达水平。(E-H)Western blot检测肝脏组织中n-NRF2、t-NRF2和HO-1等蛋白的表达水平(n＝6)。GAPDHβ-actin和Histone H3作为内参对照。(I-L)采用qRT-PCR检测肝脏中Cat、Sod、Ho-1和Nqo1的相对mRNA水平。(M,N)免疫荧光(IF)染色图像显示HO-1和NQO1蛋白表达水平。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，蒽环类药物阿霉素是一种广泛使用的化疗药物，因其在对抗多种癌症方面的疗效，被认为是美国食品和药物管理局批准的最有效的化疗药物之一。但由于剂量相关的器官损伤，因此需要严格限制DOX的剂量和给药时间。
为了缓解阿霉素诱导的心脏及肝脏毒性并有效减轻成纤维细胞生长因子1单独使用所带来的促肿瘤生长的活性，本发明提供一种药物组合物，即白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1联合应用，二者联用可以有效缓解阿霉素造成的心脏及肝脏功能紊乱、炎症、氧化应激和凋亡，表现出良好的协同作用。
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在如下任意一种或多种中的应用：
1)制备改善蒽环类药物所导致的心脏毒性的产品；
2)制备改善蒽环类药物所导致的肝脏毒性的产品。
其中，所述蒽环类药物可以为阿霉素，所述产品可以为药物。
因此，所述改善阿霉素所导致的心脏毒性具体表现为：
1-1)减轻阿霉素诱导的心肌损伤；
1-2)减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡；
1-3)减轻阿霉素诱导的心肌炎症；
1-4)减轻阿霉素诱导的心脏氧化应激。
所述阿霉素所导致的肝脏毒性的具体表现为：
2-1)减轻阿霉素诱导的肝脏损伤；
2-2)减轻阿霉素诱导的肝脏细胞凋亡；
2-3)减轻阿霉素诱导的肝脏炎症；
2-4)减轻阿霉素诱导的肝纤维化；
2-5)减轻阿霉素诱导的肝脏氧化应激。
所述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1的质量比为10:0.1-1，如10:0.1、10:0.5、10:1，优选为10:0.5。
本发明又一具体实施方式中，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括上述白藜芦醇和成纤维细胞生长因子1。
所述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1的质量比为10:0.1-1，如10:0.1、10:0.5、10:1，优选为10:0.5。
所述组合物具有如下任意一种或多种应用：
1)制备改善蒽环类药物所导致的心脏毒性的产品；
2)制备改善蒽环类药物所导致的肝脏毒性的产品。
其中，所述蒽环类药物可以为阿霉素，因此，
所述改善阿霉素所导致的心脏毒性具体表现为：
1-1)减轻阿霉素诱导的心肌损伤；
1-2)减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡；
1-3)减轻阿霉素诱导的心肌炎症；
1-4)减轻阿霉素诱导的心脏氧化应激。
所述阿霉素所导致的肝脏毒性的具体表现为：
2-1)减轻阿霉素诱导的肝脏损伤；
2-2)减轻阿霉素诱导的肝脏细胞凋亡；
2-3)减轻阿霉素诱导的肝脏炎症；
2-4)减轻阿霉素诱导的肝纤维化；
2-5)减轻阿霉素诱导的肝脏氧化应激。
所述产品可以为药物，根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还可以包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，所述非人哺乳动物如大鼠、小鼠、兔、猴、猩猩等。
本发明又一具体实施方式中，提供一种改善阿霉素所导致的心脏毒性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的上述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1或上述组合物。
本发明又一具体实施方式中，提供一种改善阿霉素所导致的肝脏毒性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的上述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1或上述组合物。
本发明所述“有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
本发明又一具体实施方式中，所述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1的质量比为10:0.1-1，如10:0.1、10:0.5、10:1，优选为10:0.5。
以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
实施例1.RES可以显著抑制FGF1的促增殖能力并诱导癌细胞凋亡
一.材料
人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人膀胱癌细胞(5637)购自ATCC细胞库；RPMI1640培养基、高糖DMEM培养基(DMEM-LG)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；TUNEL染色试剂盒购自上海罗氏生物科技有限公司；DAPI染液(购自美国Abcam公司)
二.方法
1.细胞培养以及分组：MCF-7,HepG2细胞于含10％胎牛血清的DMEM培养液，5637细胞于含10％胎牛血清的1640培养液中，37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱内培养。选取处于对数生长期的细胞，制成单个细胞悬液，以合适的密度铺板。设①CTRL组、②RES(20μM,购自美国MCE公司)组、③FGF1(100ng/ml,由温州医科大学药学院赠与)组、④RES+FGF1联合用药(RES:20μM+FGF1:100ng/ml)组。
2.CCK-8检测细胞增殖活性：选取处于对数生长期的MCF-7,HepG2,5637细胞，分别制成单细胞悬液，以合适的密度铺96孔板。不同的处理条件：CTRL,RES,FGF1,RES+FGF1分别处理细胞24h后,每孔加入10μl CCK-8溶液，孵育1h，在酶标仪上450nm波长下检测吸光度值，进行统计作图。
3.TUNEL染色检测细胞凋亡：选取处于对数生长期的MCF-7细胞，制成单细胞悬液，以合适的密度铺6孔板。不同的处理条件：CTRL,RES,FGF1,RES+FGF1分别处理24h后,MCF-7细胞在15-25℃的4％多聚甲醛中固定20分钟，并用0.1％Triton X-100和0.1％柠檬酸钠的混合物孵育打孔。随后，将细胞与末端脱氧核苷酸转移酶反应混合物在37℃黑暗潮湿的环境中孵育60min。孵育后，DAPI进行核染色。荧光显微镜下检测凋亡细胞，激发波长为570～620nm。
三.结果
1.CCK-8试验表明，RES处理的：MCF-7、HepG2和5637细胞的增殖略有下降的趋势，而FGF1显著促进MCF-7、HepG2和5637细胞增殖。但是，两者联合使用后，RES抑制了FGF1的促增殖能力(图1A-B)。
TUNEL染色结果表明：与CTRL组比较，RES处理的MCF-7细胞的凋亡明显升高，FGF1处理的MCF-7细胞的凋亡有所下降。但是，两者联合使用后，RES促进了FGF1的促凋亡能力(图1D)。
实施例2.RES和FGF1联合治疗可进一步减轻DOX诱导的小鼠的心肌损伤和细胞凋亡
一.材料
1. 30只清洁级8周大C57BL/6J雄性小鼠，购自北京维通利华实验室，在无病原体(SPF)设施中的受控环境中饲养(22C，睡眠-觉醒周期转移12小时)，并给予免费获得足够的食物和自来水。所有动物在实验前适应性喂养1周；肌酸磷酸激酶(CK)(购自南京建成生物工程研究所)、乳酸脱氢酶(LDH)(购自南京建成生物工程研究所)和cTnT试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解缓冲液(Beyotime生物技术)；磷酸酶抑制剂(Beyotime生物技术)；BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime生物技术公司)；硝化纤维素膜(GE HealthcareLife Sciences，北京，中国)；化学发光检测试剂盒(Biosharp)；Image Quant 4.2软件(中国上海天能公司)
二.方法
1.动物模型的建立以及分组：30只C57BL/6J雄性小鼠随机分为5组。分别为①CTRL组、②DOX组、③DOX+RES组、④DOX+FGF1组和⑤DOX+RES+FGF1组，每组6只小鼠。各组小鼠给药方案为：①CTRL组：每天腹腔注射等体积生理盐水、②DOX组：连续7天腹腔注射等体积生理盐水后，单次腹腔注射DOX(20mg/kg)、③DOX+RES组：连续7天腹腔注射RES(10mg/kg/天)后，单次腹腔注射DOX(20mg/kg)、④DOX+FGF1组：连续7天腹腔注射FGF1(0.5mg/kg/天)后，单次腹腔注射DOX(20mg/kg)、⑤DOX+RES+FGF1组：连续7天腹腔注射RES(10mg/kg/天)和FGF1(0.5mg/kg/天)后，单次腹腔注射DOX(20mg/kg)。注射DOX 24h后采集心脏组织所有小鼠实验方案和实验均经山东大学动物护理与伦理委员会批准。
2.CK,LDH试剂盒：每组小鼠采集血清和心脏组织，并在-80℃下保存，用于后续分析。严格按照试剂盒说明说操作，检测血清中CK和LDH的水平，分析心脏损伤情况。
3.cTnT试剂盒：根据标准曲线确定浓度，用ELISA试剂盒按照制造商的说明检测血清中的心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平。
4.IHC:①石蜡切片置于65℃烘箱中，烘片30分钟。②脱腊至水③将组织切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液(PH＝6.0)中于微波炉内进行抗原修复。④自然冷却后将切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。⑤画组化圈，滴加3％过氧化氢溶液，室温避光孵育25分钟，阻断内源性过氧化物酶，甩掉过氧化氢，⑥将切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。⑦血清封闭：3％BSA室温封闭30分钟。⑧一抗孵育：甩掉封闭液，在切片上滴加CD68一抗，切片平放于湿盒内，4℃孵育过夜。⑨二抗孵育：切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。切片稍甩干后滴加二抗覆盖组织，室温孵育90分钟。⑩PBS洗3次，每次5分钟后，DAB显色。苏木素复染细胞核。/>脱水后中性树胶封片。/>显微镜下观察。
5.Western blot：使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液在冰上分离心脏组织蛋白。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。样品与上样缓冲液混合，在95℃下加热5min，用10％SDS-PAGE凝胶进行电泳，然后电转移到硝化纤维素膜上。用5％脱脂牛奶封闭1小时后，一抗在4℃下孵育过夜。第二天，用封闭液稀释二抗，室温孵育1h。使用增强化学发光检测试剂盒对探针蛋白进行可视化。采用Image J软件进行密度分析。
三.结果
1.CK、LDH和cTnT试剂盒结果：与CTRL组相比，DOX组血清中的CK、LDH和cTnI含量明显升高，表明DOX引起了心脏损伤。与DOX组相比，DOX+RES组或DOX+FGF1组的CK、LDH和cTnI含量均下降，表明心脏损伤被缓解，而DOX+RES+FGF1组中CK、LDH和cTnI含量出现进一步的下降，表明联合使用RES、FGF1时，心脏损伤缓解效果更好(图2A-C)。
2.TUNEL染色结果：与CTRL组相比，DOX组TUNEL阳性细胞明显增加，表明DOX引起了心肌细胞凋亡。而使用RES或FGF1预处理后，均可逆转DOX引起的心肌细胞凋亡。并且，当RES和FGF1共同治疗时，可进一步减少心肌细胞的凋亡(图2D)。
3.IHC染色结果：与CTRL组相比，DOX组的Cleaved-caspase3阳性区域明显增加，表明DOX引起了心肌细胞凋亡。而使用RES或FGF1预处理后，均可逆转DOX引起的Cleaved-caspase3水平的增加，减轻心肌细胞凋亡。并且，当RES和FGF1共同治疗时可进一步降低Cleaved-caspase3水平，表明联合使用RES和FGF1可以进一步缓解DOX诱导的心肌细胞凋亡(图2E和G)。
4.Western blot结果：抑制凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子Bax和凋亡相关标志物cleaved caspase-3条带结果表明。与CTRL组相比，DOX明显加重了心肌细胞的凋亡(cleaved caspase-3增加，Bcl-2/Bax下降)。而使用RES或FGF1预处理后，均可逆转DOX引起的凋亡。并且，当RES和FGF1共同治疗时可进一步减少心肌细胞的凋亡(图2F，H和I)。
实施例3.RES和FGF1联合治疗可进一步减轻DOX诱导的小鼠心肌炎症一.材料
1.小鼠白细胞介素-6(Il6)、小鼠白细胞介素-1β(Il1b)、小鼠肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1(Mcp-1)和小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)引物购自生工生物技术(中国上海)；TRIzol试剂(Cwbio,Jiangsu,China)；HiFiScript cDNA Synthesis Kit(Cwbio)。
二.方法
1.qRT-PCR实验：取组织10～20mg放于2ml EP管中，置于冰上。使用RNA抽提试剂Trizol提取小鼠心脏组织RNA，使用SMA100软件，测定样本RNA浓度以及纯度。逆转录试剂盒，逆转1μg RNA至cDNA(反应液配制在冰上进行)反应体系为上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、2×UHraSYBR Mixture 12.5μl、cDNA 1μl和ddH2O 10.5μl,总体积为25μl。应用CFXConnect Real-Time PCR Detect System，以GAPDH为内参进行RT-qPCR。
2.CD68染色：①石蜡切片置于65℃烘箱中，烘片30分钟。②脱腊至水③将组织切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液(PH＝6.0)中于微波炉内进行抗原修复。④自然冷却后将切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。⑤画组化圈，滴加3％过氧化氢溶液，室温避光孵育25分钟，阻断内源性过氧化物酶，甩掉过氧化氢，⑥将切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。⑦血清封闭：3％BSA室温封闭30分钟。⑧一抗孵育：甩掉封闭液，在切片上滴加CD68一抗，切片平放于湿盒内，4℃孵育过夜。⑨二抗孵育：切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。切片稍甩干后滴加二抗覆盖组织，室温孵育90分钟。⑩PBS洗3次，每次5分钟。切片稍甩干后，在组化圈内滴加DAPI，盖玻片封片。荧光显微镜下观察染色结果。
5.Western blot：使用RIPA裂解缓冲液添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂在冰上分离心脏组织蛋白。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。样品与上样缓冲液混合，在95℃下加热5min，用10％SDS-PAGE凝胶进行电泳，然后电转移到硝化纤维素膜上。用5％脱脂牛奶封闭1小时后，一抗在4℃下孵育过夜。第二天，用封闭液稀释二抗，室温孵育1h。使用增强化学发光检测试剂盒对探针蛋白进行可视化。采用Image J软件进行密度分析。
三.结果
1.PCR结果：与Ctrl组相比，DOX显著增加促炎细胞因子(Il1-a,Il1-b,Il6,Tnf-a,Mcp-1)的mRNA水平，而RES或FGF1可以明显降低DOX相关的炎症炎症因子的表达。并且，联合应用RES和FGF1时，则可以进一步的抑制炎症因子的mRNA的表达。(图3A-E)
2.CD68染色结果：红染代表CD68炎症因子，绿染代表鬼笔环肽，蓝染代表细胞核。结果表明，DOX显著促进了CD68+巨噬细胞浸润，而RES或FGF1可以明显降低DOX相关的CD68+巨噬细胞浸润。并且，联合应用RES和FGF1时，则可以进一步的抑制DOX相关的CD68+巨噬细胞浸润(图3F)。
3.Western blot结果：转录因子NF-κB控制先天和适应性免疫功能的多个方面，它也涉及心脏组织，被认为是炎症反应的关键中介。Western blot结果表明，DOX显著提高了IKBα和p65的磷酸化水平，单独使用RES或FGF1可明显抑制DOX引起的IKBα和p65的磷酸化，而RES和FGF1共同使用后，则可进一步的逆转DOX引起的IKBα和p65的磷酸化的增加(图3G-I)。
实施例4.RES和FGF1联合治疗可进一步减轻DOX受损心脏的氧化应激
一、材料
DHE染色试剂盒，MDA试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，GSH试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)
二、方法
1.DHE染色：①将冰冻切片置于37℃烘箱中，烘片30分钟。②PBS洗三次后，③滴加DHE染液，将切片放于37℃烘箱，避光孵育30分钟，④PBS漂洗三次，每次5分钟，⑥滴加抗荧光衰减剂封片，⑦荧光显微镜下观察切片并拍照。
2.MDA，GSH检测：分别取小鼠的血清以及组织，按照说明书，分别使用MDA，GSH检测试剂盒检测血清中谷胱甘肽(GSH)的含量和心脏组织中丙二醛(MDA)的水平。
3.Western blot：使用RIPA裂解缓冲液添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂在冰上分离心脏组织蛋白。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。样品与上样缓冲液混合，在95℃下加热5min，用10％SDS-PAGE凝胶进行电泳，然后电转移到硝化纤维素膜上。用5％脱脂牛奶封闭1小时后，一抗在4℃下孵育过夜。第二天，用封闭液稀释二抗，室温孵育1h。使用增强化学发光检测试剂盒对探针蛋白进行可视化。
三、结果
1.DHE染色结果：使用DHE染剂所导致的红染代表组织ROS水平。在DOX处理的小鼠心脏中，ROS水平明显增高，RES或FGF1可减轻ROS的产生，而在共处理组中，ROS的产生进一步减轻(图4A-B)。
2.MDA，GSH检测结果：GSH代表细胞内的抗氧化能力，DOX还会导致细胞内GSH水平下降，而RES或FGF1处理可以逆转这一现象，并且两者联合应用时，可以使GSH水平进一步上升。MDA代表脂质氧化水平，与Ctrl组相比，DOX诱导下MDA明显增加，RES或FGF1处理可抑制其上升，而RES和FGF1联合处理可进一步抑制其上升(图4C-D)。
3.Western blot结果：抗氧化酶是ROS的清除和心肌细胞对DOX耐受的关键。结果表明，DOX受损的心脏组织中CAT、SOD1和SOD2等三种主要抗氧化酶的表达降低，但与RES或FGF1相比，RES和FGF1共同处理可显著挽救这种降低(图4E-H)。
实施例5.RES可以显著抑制FGF1的促增殖能力
一、材料：
人肝癌细胞(HepG2)购自ATCC细胞库；高糖DMEM培养基(DMEM-LG)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；TUNEL染色试剂盒购自上海罗氏生物科技有限公司；DAPI染液(购自美国Abcam公司)
二、方法：
1.细胞培养以及分组：在5％CO2培养箱中，温度为37℃，HepG2细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基培养。设①CTRL组，②DOX(1μM，购自美国MCE公司)组，③RES(20μM,购自美国MCE公司)组、④FGF1(100ng/ml,由温州医科大学药学院赠与)组、⑤RES+FGF1联合用药(RES:20μM+FGF1:100ng/ml)组。
2.CCK-8检测细胞增殖活性：将HepG2细胞以3×103细胞/孔的密度植入96孔板中，然后在DOX(1μM)存在或不存在的情况下，用RES(20μM)和(或)FGF1(100ng/ml)处理。24小时后，根据说明书使用CCK-8试剂盒测定细胞增殖。
三、结果
CCK-8试验表明，DOX能有效抑制HepG2细胞的增殖，但是同时使用FGF1时我们发现HepG2细胞的增殖能力有所升高，在RES和FGF1联合使用时这种促增殖能力别明显抑制(图5)。
实施例6.RES和FGF1联合治疗可进一步减轻DOX诱导的小鼠的肝脏损伤和细胞凋亡
一、材料
8周龄的C57BL/6J雄性小鼠购自Vital River Laboratories(中国北京)，饲养在22℃的受控环境中，12小时光照/12小时黑暗循环，自由获取鼠粮和自来水。小鼠在每次实验前驯化1周；为了评估肝损伤的程度，使用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)按照制造商的说明检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)；
二、方法
1.动物模型的建立以及分组：将C57BL/6J雄性小鼠随机分为5组(每组n＝6):①对照组(Ctrl)；②DOX治疗组(DOX)；③DOX+RES治疗组(D+R)；④DOX+FGF1治疗组(D+F)；⑤DOX+RES和FGF1共处理(D+R+F)。建模过程同实施例2，注射DOX后24小时处死各组小鼠。取肝脏称重，计算肝脏指数(肝重/体重×100％)。所有涉及动物的实验程序均经山东大学动物保护与利用委员会批准。
2.ALT、AST试剂盒：各组小鼠均取血清样本，-80℃保存以备后续分析。为了评估肝损伤程度，使用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)按照制造商的说明检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。
3.小鼠组织H&E染色：小鼠肝组织分离，10％福尔马林固定，石蜡包埋，进行染色分析。脱蜡复水后，5μm厚的石蜡切片进行苏木精-伊红(H&E)染色，用于肝脏组织学形态学评估
4.TUNEL染色：采用Sigma-Aldrich公司的原位细胞死亡检测试剂盒(in SituCell Death Detection Kit)在组织切片上检测脱氧核苷酸转移酶末端末端标记(TUNEL)染色，用DAPI(Abcam)反染细胞核。冷冻肝组织在4％多聚甲醛中固定20分钟。染色切片或细胞在光学显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)或荧光显微镜(Nikon)上观察，并使用ImageJ软件(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)对结果进行量化。
三、结果
与Ctrl组相比，DOX组的肝脏指数显著升高，但与DOX组相比，单独使用RES或FGF1治疗显著降低了肝脏指数。值得注意的是，与RES或FGF1组相比，RES和FGF1联合治疗进一步降低了肝脏指数(图6A)。同时，与Ctrl组相比，DOX处理后小鼠的ALT和AST水平明显升高，表明DOX处理后产生肝损伤，而仅用RES或FGF1处理组的ALT和AST水平下降，表明RES或FGF1缓解DOX诱导的肝损伤。在同时使用RES和FGF1的组中，ALT和AST水平则出现进一步下降，表明联合使用RES和FGF1进一步缓解DOX诱导的肝脏损伤(图6B,C)。H&E染色和TUNEL染色显示，与Ctrl组相比，DOX处理后小鼠肝切片出现广泛的肝细胞坏死和空泡以及肝细胞凋亡(图6D)。通过RES或FGF1处理可以逆转肝细胞坏死和空泡以及凋亡细胞的增加，并且通过与RES和FGF1共同处理，广泛的肝细胞坏死和空泡以及肝细胞凋亡进一步减弱(图6D-E)。
实施例7.RES和FGF1联合治疗可进一步减轻DOX诱导的小鼠的肝脏炎症、纤维化
一、材料
小鼠白细胞介素-6(Il6)、小鼠白细胞介素-1β(Il1b)、小鼠Tnfa和小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)引物购自生工生物技术(中国上海)；TRIzol试剂(Cwbio,Jiangsu,China)；HiFiScript cDNA Synthesis Kit(Cwbio)；天狼星红染色(LeageneBiotechnology,Beijing,China)；抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α,1:30 00,Abcam,Cambridge,MA,USA)抗体。
二、方法
1.qRT-PCR实验：用TRIzol试剂从肝组织或原代肝细胞细胞中提取总RNA。利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit对RNA进行反转录。循环方案包括在95℃时进行初始变性步骤，在60℃进行40个循环。
2.组织染色：小鼠肝组织分离，10％福尔马林固定，石蜡包埋，进行染色分析。脱蜡复水后，5μm厚的石蜡切片进行天狼星红(Sirius Red)染色、免疫组化(IHC)染色。天狼星红染色切片(Leagene Biotechnology,Beijing,China)用于评估肝纤维化。使用抗肿瘤坏死因子-α抗体进行IHC染色用于评估肝组织炎症。
三、结果
如图7A-D所示，与Ctrl组相比，DOX组TNF-α蛋白表达及Tnfa、Il1b、Il6 mRNA表达明显升高。然而，所有这些变化在单独使用RES或FGF1的组中均显著降低，在同时使用RES和FGF1的组中甚至进一步降低。通过天狼星红染色确定的胶原蛋白堆积增加，肝脏纤维化反应在DOX组中很明显(图7E)。
实施例8.RES和FGF1联合治疗可进一步减轻DOX诱导的小鼠的肝脏氧化应激
一、材料
小鼠过氧化氢酶(Cat)、小鼠超氧化物歧化酶(Sod)、小鼠血红素加氧酶-1(Ho-1)、小鼠NAD(P)H醌氧化还原酶-1(Nqo1)和小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)引物购自生工生物技术(中国上海)；TRIzol试剂(Cwbio,Jiangsu,China)；HiFiScript cDNA SynthesisKit(Cwbio)；RIPA裂解缓冲液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自碧云天；硝化纤维素膜(GEHealthcare Life Sciences，北京，中国)；增效化学发光检测试剂盒(Millipore)；ImageQuant 4.2软件(Tanon,Shanghai,China)；二氢乙二(DHE)荧光试剂盒(BeyotimeBiotechnology)
二、方法
1.DHE染色：冷冻肝组织在4％多聚甲醛中固定20分钟。染色切片在荧光显微镜(尼康)上观察，并使用ImageJ软件对结果进行量化。
2.IHC染色：小鼠肝组织分离，10％福尔马林固定，石蜡包埋，进行染色分析。脱蜡复水后，5μm厚的石蜡切片进行免疫组化(IHC)染色。使用抗3-硝基酪氨酸(3-NT,1:30 00,Millipore,Billerica,MA,USA)和抗4-羟基nonenal(4-HNE,1:3000,Abcam)以及抗血红素加氧酶-1(HO-1,1:20 00,Proteintech,Chicago,IL,USA)和抗nad(P)H醌脱氢酶1(NQO1,1:50,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)进行IHC染色。
3.qRT-PCR实验：用TRIzol试剂从肝组织或原代肝细胞细胞中提取总RNA。利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit对RNA进行反转录。循环方案包括在95℃时进行初始变性步骤，在60℃进行40个循环。
4.Western blot：肝脏组织或原代肝细胞细胞在RIPA裂解缓冲液(BeyotimeBiotechnology)中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Beyotime Biotechnology)冰上匀浆。使用BCA试剂盒(Beyotime Biotechnology)测定蛋白浓度。样品与负载缓冲液混合，在95℃加热10分钟，然后在10％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶上电泳，并电转移到硝化纤维素膜(GE Healthcare Life Sciences，北京，中国)。用5％脱脂乳封闭1h后，在一抗溶液中4℃孵育一抗一夜，第二天加入用封闭溶液稀释的二抗在室温孵育1.5h。使用增强化学发光检测试剂盒(Millipore)对探针蛋白进行可视化，并使用Image Quant4.2软件(中国上海，Tanon)进行分析。
5.IF染色：①石蜡切片置于65℃烘箱中，烘片30分钟。②脱腊至水③将组织切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液(PH＝6.0)中于微波炉内进行抗原修复。④自然冷却后将切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。⑤画组化圈，滴加3％过氧化氢溶液，室温避光孵育25分钟，阻断内源性过氧化物酶，甩掉过氧化氢，⑥将切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。⑦血清封闭：3％BSA室温封闭30分钟。⑧一抗孵育：甩掉封闭液，在切片上滴加HO-1或NQO1一抗，切片平放于湿盒内，4℃孵育过夜。⑨二抗孵育：切片置于PBS中漂洗三次，每次5分钟。切片稍甩干后滴加二抗覆盖组织，室温孵育90分钟。⑩PBS洗3次，每次5分钟。切片稍甩干后，在组化圈内滴加DAPI，盖玻片封片。荧光显微镜下观察染色结果。
三、结果
荧光探针DHE检测不同处理组肝细胞ROS水平，IHC染色中3-NT和4-HNE代表氧化应激水平，结果显示DOX显著增加肝脏的氧化应激(DHE,3-NT和4-HNE增加)，这些升高在RES或FGF1单独处理组明显被抑制，在RES和FGF1共同处理组被进一步被抑制(图8A-D)。Westernblot分析显示，DOX处理后肝细胞中NRF2蛋白核转移降低，HO-1蛋白表达降低。RES或FGF1治疗显著改善了这些变化，与单独RES或FGF1治疗相比，RES和FGF1联合治疗则进一步缓解了NRF2蛋白核转移和HO-1蛋白表达的降低(图8E-H)。此外，与Ctrl组相比，DOX处理后，抗氧化因子Cat、Sod、Ho-1和Nqo1的mRNA水平降低表明DOX导致抗氧化能力减弱，而仅使用RES或FGF1处理可逆转这些影响(图8I-L)。更重要的是，RES和FGF1共同处理则进一步挽救了DOX诱导的抗氧化能力的丧失。HO-1和NQO1的IF染色进一步证实了上述结果(图8M,N)。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.白藜芦醇联合成纤维细胞生长因子1在如下任意一种或多种中的应用：
1）制备改善蒽环类药物所导致的心脏毒性的产品；
2）制备改善蒽环类药物所导致的肝脏毒性的产品；
所述蒽环类药物为阿霉素，所述产品为药物；
所述改善阿霉素所导致的心脏毒性具体表现为：
1-1）减轻阿霉素诱导的心肌损伤；
1-2）减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡；
1-3）减轻阿霉素诱导的心肌炎症；
1-4）减轻阿霉素诱导的心脏氧化应激；
所述阿霉素所导致的肝脏毒性的具体表现为：
2-1）减轻阿霉素诱导的肝脏损伤；
2-2）减轻阿霉素诱导的肝脏细胞凋亡；
2-3）减轻阿霉素诱导的肝脏炎症；
2-4）减轻阿霉素诱导的肝纤维化；
2-5）减轻阿霉素诱导的肝脏氧化应激。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1的质量比为10:0.1-1。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1的质量比为10:0.5。
4.一种组合物在如下任意一种或多种中的应用：
1）制备改善蒽环类药物所导致的心脏毒性的产品；
2）制备改善蒽环类药物所导致的肝脏毒性的产品；
所述组合物其活性成分至少包括白藜芦醇和成纤维细胞生长因子1；
所述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1的质量比为10:0.1-1；
所述蒽环类药物为阿霉素，
所述改善阿霉素所导致的心脏毒性具体表现为：
1-1）减轻阿霉素诱导的心肌损伤；
1-2）减轻阿霉素诱导的心肌细胞凋亡；
1-3）减轻阿霉素诱导的心肌炎症；
1-4）减轻阿霉素诱导的心脏氧化应激；
所述阿霉素所导致的肝脏毒性的具体表现为：
2-1）减轻阿霉素诱导的肝脏损伤；
2-2）减轻阿霉素诱导的肝脏细胞凋亡；
2-3）减轻阿霉素诱导的肝脏炎症；
2-4）减轻阿霉素诱导的肝纤维化；
2-5）减轻阿霉素诱导的肝脏氧化应激。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述白藜芦醇与成纤维细胞生长因子1的质量比为10:0.5。
6.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述产品为药物。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
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Li et al. Melatonin attenuates doxorubicin‐induced cardiotoxicity through preservation of YAP expression
Zhang et al. Mitochondrial dysfunction and diabetic nephropathy: nontraditional therapeutic opportunities
Hu et al. Oral flavonoid fisetin treatment protects against prolonged high-fat-diet-induced cardiac dysfunction by regulation of multicombined signaling
Xiang et al. Protective effect and mechanism of chitooligosaccharides on acetaminophen-induced liver injury
Xue et al. Ginsenoside Rc alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by reducing mitochondrial oxidative stress and apoptosis: role of SIRT1 activation
Liu et al. Dihydroquercetin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury through modulating FOXO3-mediated NF-κB signaling via miR-132–3p
He et al. Piperine is capable of improving pancreatic β-cell apoptosis in high fat diet and streptozotocin induced diabetic mice
Lu et al. Ginsenoside Rg1 attenuates mechanical stress-induced cardiac injury via calcium sensing receptor-related pathway
He et al. Total triterpenoids from the fruits of Chaenomeles speciosa exerted gastroprotective activities on indomethacin-induced gastric damage via modulating microRNA-423-5p-mediated TFF/NAG-1 and apoptotic pathways
Pei et al. CoQ10 improves myocardial damage in doxorubicin-induced heart failure in C57BL/6 mice
Zhang et al. Lingonberry anthocyanins inhibit hepatic stellate cell activation and liver fibrosis via tgfβ/smad/ERK signaling pathway

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