CN112891340A

CN112891340A - Pso用于制备治疗蒽环类化疗药物诱发的心脏毒性药物的应用

Info

Publication number: CN112891340A
Application number: CN202110232455.6A
Authority: CN
Inventors: 杨阳; 陈颖; 王正; 杨雯雯; 陆晨曦; 吴雪; 邓超
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2021-06-04

Abstract

本发明公开了PSO用于制备治疗和/或预防蒽环类化疗药物诱发的心脏毒性药物的应用。发明人通过离体细胞实验和在体动物实验证实，PSO可恢复蒽环类化疗药物引起的HL‑1细胞活力下降、减少心肌细胞凋亡率、降低氧化应激和乳酸脱氢酶水平、发挥显著的抗心肌细胞凋亡和抗氧化应激作用；PSO可抑制蒽环类化疗药物诱导的小鼠生存率下降、改善小鼠心脏收缩功能、抑制小鼠心肌组织纤维化及氧化应激水平，减轻心脏毒性的炎症反应，降低心脏、肝脏、肾脏毒性，有着良好的临床应用前景。

Description

PSO用于制备治疗蒽环类化疗药物诱发的心脏毒性药物的应用

技术领域

本发明涉及PSO的新适应症，特别是涉及PSO制备治疗和/或预防蒽环类化疗药物引起的心脏毒性药物的应用。

技术背景

补骨脂定PSO结构式如式Ⅰ所示，其具有多种药理活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗抑郁和雌激素样作用等。

发明内容

发明人通过构建蒽环类化疗药物诱发的心脏毒性细胞模型(HL-1细胞)并观察心肌损伤相关指标发现，PSO可恢复蒽环类化疗药物引起的HL-1细胞活力下降、减少心肌细胞凋亡率、降低氧化应激和乳酸脱氢酶水平、同时发挥显著的抗心肌细胞凋亡和抗氧化应激作用；

通过蒽环类化疗药物心脏毒性动物模型，证实PSO可抑制蒽环类化疗药物心脏毒性小鼠的体重下降，降低白细胞(White Blood Cell，WBC)，单核细胞(Monocytes，MON)，粒细胞(Granulocyte，GRA)数量以及肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)，谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase，AST)，尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)水平，提高淋巴细胞(Lymphocyte，LYM)数量、白蛋白(Albumin，ALB)水平以及小鼠每搏输出量(StokeVolume；SV)和心输出量(Cardiac Output；CO)，减轻心肌组织纤维化，降低心肌组织氧化应激水平，发挥较强的心脏毒性抗炎，抗纤维化，改善心脏收缩功能的作用。

基于上述发现，本发明提供了PSO用于制备治疗和/或预防蒽环类化疗药物诱发的心脏毒性药物的应用。尤其是蒽环类化疗药物诱发的急性心脏毒性。

同时，所述药物由PSO和药物辅料制备而成。

进一步，所述药物为静脉注射给药制剂。

更进一步，所述药物的给药剂量为每千克体重12.5mg-50mgPSO。

附图说明：

图1为蒽环类化疗药物代表阿霉素心肌细胞毒性损伤模型与PSO毒性探索；A图为不同浓度的阿霉素处理HL-1细胞活力；B图为不同浓度的PSO处理HL-1细胞活力；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；

图2为不同浓度的PSO对阿霉素心肌细胞毒性损伤模型细胞活力和细胞凋亡的影响；A图为不同浓度的PSO处理阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型的细胞活力；B图为不同浓度的PSO处理阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型的细胞凋亡率；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；^#vs.ADR组，P<0.05；

图3为不同浓度PSO对阿霉素心肌细胞毒性损伤模型氧化应激的影响；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；^#vs.ADR组，P<0.05；

图4为不同浓度PSO对阿霉素心肌细胞毒性损伤模型乳酸脱氢酶释放水平的影响；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；^#vs.ADR组，P<0.05；

图5为PSO对小鼠阿霉素心肌毒性损伤模型生存率的影响；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；^#vs.ADR组，P<0.05；

图6为PSO对小鼠阿霉素心肌毒性损伤模型体重的影响；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；^#vs.ADR组，P<0.05；

图7为PSO对小鼠阿霉素心肌毒性损伤模型血常规各项指标的影响；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；^#vs.ADR组，P<0.05；

图8为PSO对小鼠阿霉素心肌毒性损伤模型血生化各项指标的影响；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；^#vs.ADR组，P<0.05；

图9为PSO对小鼠阿霉素心肌毒性损伤模型心肌组织纤维化和氧化应激的影响；A图为心肌组织切片Masson染色结果；B图为心肌组织切片DHE染色结果；

图10为PSO对小鼠阿霉素心肌毒性损伤模型心功能的影响；A图为超声心动图长轴切面、M模典型图片以及各项心脏功能指标的统计分析图；B图为超声心动图短轴切面、M模典型图片以及各项心脏功能指标的统计分析图；结果以均数±标准差表示，^*vs.Control组，P<0.05；^#vs.ADR组，P<0.05；SV，每搏输出量；CO，心输出量。

具体实施方式

除非有特殊说明，本文中的术语根据相关领域的常规认识理解。

蒽环类化疗药物包括阿霉素、表阿霉素、柔红霉素和阿克拉霉素等，其通过使用化学治疗药物杀灭癌细胞的手段对血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤有治疗效果，如急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、软组织肉瘤和卵巢癌等。并且蒽环类药物可以与其他化疗药物及分子靶向药物联合应用。

蒽环类化疗药物同时会诱发累积性、剂量依赖性且不可逆转的心脏毒性，最终导致扩张型心肌病或充血性心力衰竭等。研究发现心脏毒性的致病因素主要包括心功能降低、炎症反应、自由基损伤、线粒体损伤、能量代谢异常、钙超载等。目前临床用于减轻蒽环类化疗药物心脏毒性的药物主要有美司钠、右雷佐生和氨磷汀等西药。

阿霉素属于蒽环类常用化疗药，是目前临床上应用最多的高效、广谱的抗肿瘤药物之一，常用于治疗各种恶性肿瘤，以下实施例中选优阿霉素为代表，但本发明的成果并不限于此，本领域技术人员根据本发明公开的精神可知，系列蒽环类药物心脏毒性均可采用本发明的成果进行治疗。

需要说明的是，以下实施例所用的补骨脂定(Psoralidin，PSO)是从补骨脂种子中提取的一种天然酚类香豆素，其具有多种药理活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗抑郁和雌激素样作用。其结构式如图1所示。纯度为HPLC≥98％。所用动物购自第四军医大学实验动物中心，所用试剂为市场采购。如无特殊说明，以下实施例中所采用的实验方法或相关检测方法采用本领域已知方法。

实施例1:发明人研究发现PSO对正常心肌细胞无毒性作用。

方案：

采用阿霉素处理HL-1心肌细胞，在细胞水平模拟化疗药物心脏毒性模型；在相同条件下，用PSO处理HL-1细胞。

步骤：

(1)HL-1心肌细胞培养：按照常规培养HL-1心肌细胞，接种于细胞培养皿，置正常环境的CO₂培养箱中进行培养；

(2)阿霉素心肌细胞毒性给药方法：阿霉素处理HL-1心肌细胞，分组为：Control组，ADR 1μM组,ADR 2μM组，ADR 4μM组,ADR 8μM组；根据各组细胞活力结果，确定ADR最佳损伤浓度并用于后续实验；

(3)PSO细胞毒性检测给药方法：PSO处理HL-1心肌细胞，分组为：Control组，PSO10μM组，PSO 20μM组，PSO 50μM组，PSO 100μM组；

(4)CCK8细胞活力检测：差速贴壁完成的心肌细胞悬液接种于96孔板，控制每孔细胞数为10000-12000个之间，48h后观察并换液；各组处理后，小心吸取各孔上清液，使用37℃的PBS洗涤2遍；在避光条件下，按照10:1比例配置DMEM/F12与CCK8试剂混合液，每孔加入110μl混合液；在37℃，5％CO2、91％的细胞孵育箱中培养2h，使用酶标仪检测各孔在450nm处吸光度；各组OD值与细胞活力呈正比。

结果：

阿霉素损伤HL-1心肌细胞活如图1A所示，与Control组相比，不同浓度阿霉素处理HL-1细胞后，细胞活力呈现浓度依赖性降低，当阿霉素浓度为2μM时，细胞活力约50％(P<0.05)；PSO毒性检测HL-1细胞活力如图1B所示，PSO浓度在50μM范围内，与Control组相比，细胞活力无明显变化，因此确定PSO的安全浓度范围。

实施例2:发明人研究发现PSO能提高阿霉素心脏毒性细胞的细胞活力及细胞凋亡

方案：

采用阿霉素处理HL-1心肌细胞，在细胞水平上模拟化疗药物心脏毒性模型，再给予不同浓度的PSO进行处理。

步骤：

(1)阿霉素心肌细胞模型构建及给药：阿霉素处理HL-1心肌细胞，浓度为2μM,处理12h，PSO在阿霉素处理前3h给药，浓度为分别为：5μM、10μM、20μM。最后进行取材及检测。

(2)CCK8细胞活力检测：检测方法同实施例1。

(3)细胞凋亡检测：制作各组心脏切片或心肌细胞爬片，处理结束后40g/L多聚甲醛固定15min。PBS洗涤3min3 1次，滴加0.1％的Triton X-100穿孔3min，PBS洗涤3min3 3次。严格按照TUNEL试剂盒说明书操作，最后用50％石蜡封片后荧光显微镜下观察，其中凋亡细胞为绿色荧光，细胞核为蓝色荧光，随意选取10个视野计数。凋亡率为：凋亡细胞数/总细胞数×100％。

结果：

细胞活力检测结果如图2A所示，与Control组相比，ADR处理后细胞活力显著降低(P<0.05)，与ADR组相比，给予不同浓度的PSO处理后，细胞活力明显恢复(P<0.05)，但仍低于Control组。细胞凋亡结果如图2B所示，与Control组相比，ADR处理后细胞凋亡比例显著升高(P<0.05)，与ADR组相比，给予不同浓度PSO处理后，细胞凋亡比例明显降低(P<0.05)。

实施例3:发明人研究发现PSO能抑制阿霉素心脏毒性细胞的氧化应激水平

方案：

步骤同实施例2，PSO预处理HL-1细胞3h后，再给予ADR共处理12h，检测细胞氧化应激水平。

结果：

细胞氧化应激水平如图3所示，与Control组相比，ADR处理后细胞DHE水平显著升高(P<0.05)，与ADR组相比，给予不同浓度的PSO处理后，细胞DHE水平显著降低(P<0.05)。

实施例4：发明人研究发现PSO能抑制阿霉素心脏毒性细胞乳酸脱氢酶释放水平

方案：

步骤同实施例2，PSO预处理HL-1细胞3h后，再给予ADR共处理12h，检测细胞乳酸脱氢酶释放水平。

结果：

细胞氧化应激水平如图3所示，与Control组相比，ADR处理后细胞乳酸脱氢酶释放水平显著升高(P<0.05)，与ADR组相比，给予不同浓度的PSO处理后，细胞乳酸脱氢酶释放水平显著降低(P<0.05)。

实施例5：发明人研究发现PSO能提高小鼠阿霉素心脏毒性引起生存率降低

方案：

采用腹腔注射阿霉素建立小鼠心肌毒性损伤模型，在动物水平上模拟化疗药物导致的心肌毒性损伤模型，给予不同浓度PSO进行处理。

步骤：

选取12周健康雄性BALB/c小鼠作为研究对象，按照研究设计，用随机数字表法进行分组：

(1)分组：将BALB/c小鼠分为Control组、ADR组、PSO组(12.5、25、50mg/kg浓度)，每组12只；

(2)动物模型建立及给药：按照10mg/kg剂量进行腹腔注射ADR；对于需要给予不同浓度的PSO组，于ADR给药前6天，按照12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg的浓度每隔一日给予一次PSO，腹腔注射，共给药3次，确保每次给药的时间段相同；在注射ADR后，连续观察并记录10天内各个分组小鼠的死亡数量，统计并分析生存率。

结果：

小鼠生存率曲线如图5A所示，与对照组相比，注射ADR后，小鼠10d内生存率为60％(P<0.05)，PSO(12.5mg/kg)处理后小鼠生存率约为60％(P>0.05)，PSO(25mg/kg)、PSO(50mg/kg)处理后小鼠无死亡情况(P<0.05)，提示PSO可以提高小鼠阿霉素心肌毒性损伤后的生存率，并选择PSO最佳保护浓度为25mg/kg(后续功能学检测将采用此最佳保护浓度)。

实施例6：发明人研究发现PSO能提高阿霉素心脏毒性小鼠体重

方案：

采用腹腔注射阿霉素建立小鼠心肌毒性损伤模型，在动物水平上模拟化疗药物导致的心肌毒性损伤模型，给予25mg/kgPSO进行处理。

步骤：

(1)分组：将BALB/c小鼠分为Control组、ADR组、PSO组(25mg/kg)，每组8只；

(2)动物模型建立及给药：按照10mg/kg剂量进行腹腔注射ADR。PSO组，于ADR给药前6天，按照25mg/kg的浓度每隔一日给予一次PSO，腹腔注射，共给药3次，确保每次给药的时间段相同。在注射ADR后，连续观察并记录10天内各个分组小鼠的体重变化，统计并分析体重变化曲线。

结果：

阿霉素心肌毒性模型小鼠体重变化结果如图5所示，与Control组相比，注射ADR后小鼠体重显著降低(P<0.05)，与ADR组相比，给予25mg/kg的PSO处理后，小鼠体重明显升高(P<0.05)。

实施例7：发明人研究发现PSO对小鼠阿霉素心脏毒性的各项血常规指标异常变化情况有改善作用

方案：

采用腹腔注射阿霉素建立小鼠心肌毒性损伤模型，在动物水平上模拟化疗药物导致的心肌毒性损伤模型，给予PSO进行处理。

步骤：

检测小鼠阿霉素损伤6天后血常规各项指标的变化：损伤6天后，采用眼球取血法取血，使用全自动血常规仪进行血常规检测。

结果：

小鼠血常规各项指标变化如图6所示，与Control相比，WBC、MON、GRA显著上升(P<0.05)，LYM显著降低(P<0.05)，而PSO处理后WBC、MON、GRA、均显著下降(P<0.05)，LYM有所恢复(P>0.05)，但是对RBC无显著影响(P>0.05)。

实施例8：发明人研究发现PSO对小鼠阿霉素心脏毒性的的各项血生化指标异常变化情况有改善作用

方案：

步骤：

检测小鼠阿霉素损伤6天后血生化各项指标的变化：损伤6天后，采用眼球取血法取血，收集每组全血，3000r/min，离心10min，吸取血清，随后使用全自动血生化分析仪进行检测。

结果：

小鼠血生化各项指标变化如图7所示，与Control组相比，LDH、CK、AST、BUN显著上升(P<0.05)，ALB显著降低(P<0.05)，而PSO处理后CK、AST、BUN均显著下降(P<0.05)，ALB显著升高(P<0.05)，但是对LDH无显著影响(P>0.05)。

实施例9：发明人研究发现PSO能减轻小鼠阿霉素心脏毒性的心肌组织纤维化及氧化应激水平

方案：

步骤：

(1)心肌组织Masson染色

①石蜡包埋：心尖部缓慢注入含肝素生理盐水，右心耳流出的液体变为透明时，将灌注液体替换为4％多聚甲醛固定液；多聚甲醛组织固定成功后，沿心脏根部剪断各血管，完整取下心脏；心脏取出后，切下心脏左半边(左心房及左心室)放入4％多聚甲醛中，进行后固定至少24h；按照顺序依次在80％、95％、95％、100％乙醇中浸泡40min，再按照100％乙醇、100％乙醇∶二甲苯＝1∶1混合液、二甲苯浓度梯度浸泡30min进行组织脱水透明；然后于包埋机中浸蜡3h，最后进行滴蜡包埋；

②切片：设置切片厚度为5μm，使用捞片法将切片贴于多聚赖氨酸覆膜载玻片上，70℃烤片1h后，60℃烤片5h；

③染色：脱蜡至水；流水冲洗数分钟；1％的丽春红和酸性品红混合溶液滴染3-5min；蒸馏水洗；1％磷钼酸浸泡5min；2％亮绿溶液滴染3min；流水冲洗；0.2％醋酸溶液分色10s；流水冲洗；脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

(2)心肌组织DHE染色

①石蜡包埋、切片步骤同上；

②DHE染色：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再次浸泡10min，按照100％、100％、95％、95％、80％乙醇、去离子水的顺序浸泡2min脱蜡至水，以备染色。脱蜡结束后，使用DHE染色液于37℃下孵育30min，经过适当洗涤后，荧光显微镜下观察并拍照，荧光显微镜下组织切片呈红色荧光阳性染色部位，每张切片随机找出20-30个不重叠视野，采用医学图象分析软件Image-J 5.0软件半定量计算阳性物质的相对含量。

结果：

小鼠心肌组织Masson染色结果如图9A所示，与Control组相比，ADR损伤后蓝色胶原纤维显著增多(P<0.05)，PSO处理后蓝色部分显著减少，纤维化程度降低(P<0.05)；小鼠心肌组织DHE染色结果如图9B所示，与Control组相比，ADR损伤后红色荧光部位显著增多，且红色荧光强度显著增强(P<0.05)，PSO处理后其荧光部位显著减少，荧光强度明显下降(P<0.05)。

实施例10：发明人研究发现PSO能改善小鼠阿霉素心脏毒性的心脏功能

方案：

步骤：

在注射ADR后第6天使用小动物超声检测小鼠心脏功能：各组动物于超声检测前一天脱去小鼠左胸区域被毛，小鼠经2％异氟烷麻醉，麻醉气体流量为1L/min，异氟烷吸入麻醉后固定于37℃恒温板上，充分暴露左侧胸廓，采用30MHz探头，选取标准胸骨旁左室长轴切面及标准左心室乳头肌短轴切面，记录M模心脏超声切面图像，测量指标包括：每搏输出量，心输出量。

结果：

小鼠心脏功能结果如图10A(胸骨旁左室长轴超声结果)、10B(左室短轴超声结果)所示，与Control组相比，小鼠心脏的每搏输出量，心输出量显著下降(P<0.05)，给与PSO保护后，心功能明显改善(P<0.05)，表现为每搏输出量，心输出量升高(P<0.05)。

Claims

1.PSO用于制备治疗和/或预防蒽环类化疗药物诱发的心脏毒性药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蒽环类化疗药物诱发的心脏毒性为急性心脏毒性。

3.一种治疗和/或预防蒽环类化疗药物诱发的心脏毒性药物，其特征在于，所述药物由PSO和药物辅料制备而成。

4.如权利要求3所述药物，其特征在于，所述药物为静脉注射给药制剂。

5.如权利要求3或4所述药物，其特征在于，所述药物的给药剂量为每千克体重12.5mg-50mg PSO。