CN112080465A - 一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法 - Google Patents

一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；加入适量脂肪细胞消化液进行消化；离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子；所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L‑谷氨酰胺、D‑葡萄糖和L‑抗坏血酸组成的，L‑谷氨酰胺、D‑葡萄糖和L‑抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。本发的方法可从脂肪组织中稳定的提取脂肪干细胞，并利用脂肪干细胞提取脂肪干细胞旁分泌因子，细胞质量和因子提取效率稳定，脂肪干细胞在GMP环境下分离并长期培养，不接触任何动物源性成分，可高效表达表达CD29、CD44、CD105等脂肪干细胞标志物。

Description

一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法
技术领域
本发明涉及一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，属于细胞生物学技术领域。
背景技术
旁分泌(paracrine)指某种细胞因子的产生细胞和靶细胞非同一细胞，但二者相邻近；该因子对靶细胞表现出的生物学作用即为旁分泌效应。旁分泌的信号分子包括生长因子、淋巴因子等。目前研究发现多种组织来源的干细胞都可分泌产生不同的细胞因子，即干细胞的旁分泌作用具有普遍性。
间充质干细胞已用于治疗十余种难治性疾病的治疗研究，除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。间充质干细胞作用机理尚不完全明确，一般认为主要通过以下机制：1、旁分泌作用(分泌细胞营养因子、细胞生长因子、抗凋亡因子等)。2、代替或修复死亡或受损的细胞。3、细胞直接接触，调控细胞的功能。越来越多的研究表明，间充质干细胞的旁分泌效应在其发挥治疗效果中起主要作用。间充质干细胞通过分泌各类细胞因子对邻近细胞产生作用，从而发挥其功效。研究证实间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如VEGF(血管内皮生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)、GDNF(胶质源性神经营养因子)等。间充质干细胞分泌的活性因子具有改善炎性环境、调节机体免疫状态、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、促进血管再生、促进脂肪干细胞迁移和分化等作用。
脂肪组织来源的干细胞(adipose stem cells，ADSCs)具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、具有多向分化潜能等优点，ADSCs逐渐成为近年来干细胞储存的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点，具有更大的应用潜能。大量研究证实：ADSCs能够增殖分化形成缺少损伤的细胞，拥有促进神经元再生，保护神经元的作用。ADSCs的分化结果证实其可被诱导分化成多种细胞，包括脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞和神经细胞等。越来越多的研究证明，ADSCs对多种疾病模型都具有积极的作用，如帕金森病、多发性硬化症、脑损伤。目前间充质干细胞治疗机制普遍认同是干细胞的迁移和分化能力，但新的研究结果证实更重要的是干细胞的旁分泌作用。ADSCs在体外培养能分泌多种因子，可以抑制神经元凋亡、促进神经细胞扩增、调节免疫反应。脂肪干细胞旁分泌因子(adipose-derived stem cell paracrine factor ASCF)来源于脂肪间充质干细胞，含有多种成分如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等，各种实验研究也证实ASCF可以通过其包含的多种细胞因子抑制神经细胞凋亡、提高神经细胞再生能力，从而有利于神经损伤的修复。
目前行业内对干细胞旁分泌因子研究才刚刚起步，大都以研究阶段为主，未进行生产阶段转化，无明确的行业标准和生产质量标准，存在以下不足之处：旁分泌因子样本来源不规范，培养规模较小，质量层次不齐，诱导细胞因子分泌过程不够高效，分离纯化过程不具规模化，产品保质期短等，这大大限制了旁分泌因子的生产和使用。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，包括脂肪间充质干细胞分离制备和鉴定、脂肪间充质干细胞提取液获取、脂肪间充质干细胞因子的分离纯化，分泌因子的鉴定。本发明建立了完善的样本采集规范，建立了标准的脂肪干细胞制备提取工艺，同时建立了大规模脂肪干细胞培养及诱导分泌细胞因子工艺，设计了一套高效连续细胞因子分离纯化工艺，产品经超低温冷冻可长期保存。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；向洗涤后的脂肪组织中加入适量脂肪细胞消化液进行消化；消化后，离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子。
所述脂肪细胞消化液，是由DMEM/F12培养基(DMEM培养基与F12培养基按1:1的体积比混合而成)和Ⅰ型胶原酶组成的，Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1％～0.3％(重量百分数)。
所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸组成的，其中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。
具体的，步骤如下：
(一)脂肪干细胞原代提取
(1)取采集的脂肪标本，离心(800g，8min)；
所述脂肪标本，是从被采集者(性别不限，年龄优选35岁以下)的大腿部、脐下腹部采集的皮下脂肪，这些部位的脂肪组织含量丰富，且脂肪颗粒细腻均匀纯净；采集时，被采集者俯卧固定于手术台上，常规消毒铺单，用抽脂针等抽脂设备按需求抽取皮下脂肪，采集的脂肪样本体积为100～200ml，样本为单人样本，不可为混合样本；采集后，立即置于无菌采集袋中(避免长时间暴露在外部环境中导致污染)，4℃保存，备用；
进一步的，所述被采集者的HBsAg、Anti-HCV-IgG、Anti-HIVI/II-IgG、Anti-CMV-IgM、TP、Elisa、EBV等的检测结果合格；
(2)离心后，吸掉上层油脂，将中层脂肪组织转移至新的离心管中，等体积加入生理盐水，离心(800g，8min)；
(3)重复步骤(2)两次，得脂肪组织；
(4)向脂肪组织中加入等体积的脂肪细胞消化液，混匀，放入37℃摇床，100转/min消化1.0h；
(5)消化后，离心(800g，10min)；弃掉上层脂肪，细胞沉淀用DMEM/F12培养基重悬，用40um滤网过滤细胞，离心(800g，10min)；弃上清，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，计数，离心(800g，10min)；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬，置于培养瓶中铺瓶培养(培养条件为：置于恒温培养箱中，37℃，5％CO2；48小时后进行全量换液，去除未贴壁细胞)，在培养瓶上标记样本条形码、操作时间及细胞代次；当细胞生长密度达到80％时，进行脂肪干细胞传代培养；
进一步的，所述换液的具体方法为：
①打开层流，打开生物安全柜的紫外线灯照射30min；
②将脂肪干细胞培养瓶取出，在倒置显微镜下观察细胞生长状况；
③用75％酒精消毒培养瓶外壁，放置到生物安全柜上；
④用移液管吸弃全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新鲜完全培养基；
⑤换液完毕，用酒精擦拭培养瓶表面，放回恒温培养箱中；
(二)脂肪干细胞传代
(1)取出培养瓶，吸弃旧培养基，于非细胞培养面加入适量生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；
(2)向培养瓶中适量胰酶或胰酶溶液，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液终止消化；用100μm细胞筛网收集细胞，加入适量生理盐水，轻柔吹打后离心(1200转/min，6min)；弃上清，沉淀用适量生理盐水重悬，离心(1200转/min，6min)；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬铺瓶，保证接种细胞密度在8×104/ml以上，置于培养箱中培养(培养条件为：37℃，5％CO2)；
(三)扩大培养
对脂肪间充质干细胞进行扩大培养，在37℃、5％二氧化碳浓度、2％氧分压的环境中培养，模拟体内低氧环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高产量；
具体地，按照8×104/ml细胞密度接种脂肪间充质干细胞于T75细胞培养瓶或细胞工厂(一个4层细胞工厂＝33个T75瓶)，细胞工厂可以加脂肪间充质干细胞培养基400ml，1个T75培养瓶加培养基15ml；将细胞工厂放置于37℃、5％二氧化碳浓度、2％氧分压的环境中培养，使用细胞工厂作为培养载体，模拟体内低氧环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高产量；
(四)脂肪干细胞旁分泌因子提取
培养72小时，细胞生长密度达到80％左右，将无血清培养基留存；细胞工厂加200ml盐水洗一次，T75培养瓶用10ml盐水洗一次，弃掉上清；每个细胞工厂加入200ml旁分泌因子提取液，每个T75培养瓶加入5mL PBS；
(五)脂肪干细胞旁分泌因子纯化
(1)将细胞工厂以及T75瓶中加提取液培养24小时后，收集所有提取液至50ml离心管中(每管40ml提取液)(准备高速离心去沉渣)；
(2)离心管中提取液低温高速离心，4℃，4000g，8min，目的是去除细胞沉渣；
(3)将收集的提取液转移至T75培养瓶中(根据提取液量选择合适的容器存放)；
(4)将去沉渣后的提取液用移液管转移至准备好的10KD超滤管(提前用超纯水浸泡24h)中，每管20ml，低温高速离心，4度，4000g(根据经验，20ml液体设定1小时离心时间即可)；
(5)离心后上层的液体剩余不到1.0ml时，收集下层浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存；更换新的超滤管重复过滤，直至所有的提取液都浓缩收集完毕；
(6)当去沉渣后的提取液用移液管转移至准备好的5KD超滤管(提前用超纯水浸泡24h)中，每管20ml，低温高速离心，4℃，4000g；
(7)将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，每管20ml，进一步浓缩(离心时间大约3小时左右，剩余液体低于2.0ml)，弃掉超滤管下面的液体；
(8)每管加盐水至20ml，重复离心洗涤两次；最后一次盐水洗涤后每个超滤管浓缩液剩余量控制在1.0ml以内；
(9)最终离心后的浓缩液体用生理盐水重悬调整体积(一套工厂浓缩后应调整体积为3.5ml)(一套工厂＝一个四层工厂+一个T75培养瓶)；
(10)浓缩液过滤：先用生理盐水0.5ml左右浸润0.22um滤器，浸润滤器后的盐水弃掉，然后用注射器抽取细胞因子浓缩液通过0.22um滤器过滤，最后量取并用生理盐水调整细胞因子体积；
(六)细胞因子的鉴定
提取得到细胞因子后，进行总蛋白含量鉴定、VEGF因子含量测定、HGF因子含量测定和BDNF因子含量测定。
利用上述方法提取的脂肪干细胞旁分泌因子，利用BCA试剂盒进行蛋白含量检测，测得脂肪干细胞旁分泌因子总蛋白浓度为435.42±49.71(μg/ml)。酶联免疫吸附法(ELISA法)检测低氧分压下(2％氧分压)脂肪间充质干细胞分泌的干细胞旁分泌因子的分泌情况，测定浓缩后因子悬液中血管内皮细胞生长因子(VEGF)浓度为11092.17±17.50(pg/ml)，肝细胞生长因子(HGF)浓度为10937.67±310.10(pg/ml)，脑源细胞生长因子(BDNF)浓度为22.77±6.92(pg/mL)。
本发明的脂肪间充质干细胞旁分泌因子的分离提取制备方法，主要包括：利用脂肪干细胞提取试剂进行脂肪干细胞提取，提取后进行培养扩增，培养的细胞符合脂肪间充质干细胞相关特性，利用细胞工厂进行大规模的脂肪干细胞的培养，通过脂肪干细胞提取液对脂肪干细胞进行细胞因子的提取，利用超滤法对脂肪干细胞进行超滤浓缩，从而获得浓缩后的脂肪间充质干细胞旁分泌因子。
本发明提供了一种脂肪干细胞旁分泌因子培养提取体系，可从脂肪组织中稳定的提取脂肪干细胞，并利用脂肪干细胞提取脂肪干细胞旁分泌因子，细胞质量和因子提取效率稳定，减少研究误差，脂肪干细胞在GMP环境下分离并长期培养，不接触任何动物源性成分，可高效表达表达CD29、CD44、CD105等脂肪干细胞标志物，不表达CD34、CD45、HLA-DR，体外可以分化为脂肪、骨、软骨的细胞。长期培养过程中，细胞核型稳定，利用旁分泌因子提取液可从脂肪干细胞中提取VEGF、HGF、BDNF等因子，经BCA蛋白检测试剂盒和R&D检测试剂盒可检测其总蛋白和因子浓度。
通过本发明的方法建立的脂肪干细胞系，经鉴定显示能表达多种干细胞标志物，可向脂肪、骨、软骨细胞进行分化，具有非常好的稳定性，适宜于长期培养，可获得大量足够的脂肪干细胞，采用无血清培养基培养，降低培养带来的细胞分化问题。采用旁分泌因子提取液，在维持细胞活性的前提下最大限度分泌细胞因子；纯化采用全密封装置，利用超滤法浓缩提高旁分泌因子的提取效率(超滤法提取，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，根据要提纯因子的分子量选择合理的截留量的超滤管或超滤膜包，实现因子的精准筛选截留，超滤离心法简单高效，且不影响旁分泌因子的生物活性，是提取细胞因子的一种新方法)，实现连续高效纯化流程，通过控制超滤管截留量来筛选截留所需的蛋白种类，并最大限度维持细胞因子活性。脂肪干细胞旁分泌因子提取时采用D-葡萄糖提供营养支持，避免细胞因饥饿而产生活率下降，细胞裂解等问题，最大可能保留了脂肪干细胞的活性，也是对其干细胞特性的维持。只采用PBS溶液提取时，提取后细胞活率低，可见大量细胞裂解释放出絮状的DNA，损失的细胞超过30％。而采用本发明的提取液，提取后细胞活率超过90％以上，同时很少有细胞裂解释放DNA，以此保护脂肪干细胞免受损伤，进而提高旁分泌因子的释放数量。脂肪干细胞系建立在GMP控制下，且在培养、冻存过程中不使用任何抗生素及不明成分动物源性成分，对细胞未来可能的临床试验研究的安全性保证做到了最大。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：本发明的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法的工艺流程图。
图2：贴壁培养的脂肪干细胞(P03、P05)在普通光学倒置显微镜观察结果示意图(100×)。
图3：贴壁培养的脂肪干细胞流式鉴定结果示意图，由图可知，可高效表达表达CD29、CD44、CD105等脂肪干细胞标志物，不表达CD34、CD45、HLA-DR。
图4：贴壁培养的脂肪干细胞成脂分化结果示意图，由图可知，脂肪间充质干细胞诱导而成的脂肪细胞累积脂质，经油红O染色呈鲜红色(100×)。
图5：贴壁培养的脂肪干细胞成骨分化结果示意图，由图可知，脂肪间充质干细胞诱导形成间质内含大量矿盐沉积的钙化结节。茜素红S染色矿化结节呈现红色(100×)。
图6：贴壁培养的脂肪干细胞成软骨分化结果示意图，由图可知，脂肪间充质干细胞诱导形成软骨细胞，经阿利辛蓝染色后可见到细胞被染成蓝色(100×)。
图7：贴壁培养的脂肪干细胞5代和10代核型分析结果示意图，由图可知，培养5、10代的脂肪干细胞为正常核型(22+XY)。
图8：贴壁培养的脂肪干细胞CCK-8法测量增殖曲线分析结果示意图。
图9：分泌因子含量鉴定结果示意图。
图10：实验2中总蛋白含量鉴定结果示意图，其中，1、2％氧分压；2、5％氧分压；3、21％氧分压。
图11：实验2中VEGF含量鉴定结果示意图，其中，1、21％氧分压；2、5％氧分压；3、2％氧分压。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
本发明所用各种液体说明如下：
脂肪间充质干细胞完全培养基：采购的商品化的脂肪间充质干细胞培养基。
脂肪组织消化液：由胶原酶和DMEM/F12组成。其中，胶原酶浓度为0.1-0.3g/100ml例如0.120g/100ml。
脂肪干细胞消化液：由胰蛋白酶组成，其中胰蛋白酶的浓度为0.25-0.3g/100ml,例如0.27g/100ml。
脂肪干细胞旁分泌因子提取液：提取液含有PBS、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸在诱导分泌培养基中的浓度分别为、1-3mmol/L、10-20μmol/L、10-100μmol/L。
脂肪间充质干细胞培养基，是脂肪间充质干细胞常用的培养基，可购自商业公司，本文中提到的脂肪间充质干细胞培养基采购自北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，货号:16070007。
胶原酶是水解结缔组织中胶原蛋白成分的一种试剂，可购自商业公司，本文中使用的胶原酶是采购自SIGMA公司的Ⅰ型胶原酶，货号:C0130,DMEM/F12是细胞培养中常用的基础培养基，本文使用的DMEM/F12采购自gibco公司，货号：C11330500BT。
PBS、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸是细胞培养中常见的试剂，PBS采购自Hyclone公司，货号：SH30256.01，L-谷氨酰胺采购自Gibco公司，货号：SH30034.01，L-抗坏血酸采购自SIGMA公司，货号S7506。
本发明所用各种耗材说明如下：10ml移液管、50ml离心管均采购自Corning公司，10ml移液管货号为4488，50ml离心管货号为430828，50ml超滤管采购自赛多利斯，货号为：VS2011。
实施例1从脂肪干细胞提取旁分泌因子
脂肪细胞消化液，是由DMEM/F12培养基(DMEM培养基与F12培养基按1:1的体积比混合而成)和Ⅰ型胶原酶组成的，Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1％～0.3％(重量百分数)。
旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸组成的，其中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：2mmol/L，15μmol/L，50μmol/L。
步骤如下：
(一)脂肪干细胞原代提取
(1)取采集的脂肪标本，离心(800g，8min)；
所述脂肪标本，是从被采集者(性别不限，年龄35岁以下)的大腿部、脐下腹部采集的皮下脂肪，这些部位的脂肪组织含量丰富，且脂肪颗粒细腻均匀纯净；采集时，被采集者俯卧固定于手术台上，常规消毒铺单，用抽脂针等抽脂设备按需求抽取皮下脂肪，采集的脂肪样本体积为100～200ml，样本为单人样本，不可为混合样本；采集后，立即置于无菌采集袋中(避免长时间暴露在外部环境中导致污染)，4℃保存，备用；
所述被采集者的HBsAg、Anti-HCV-IgG、Anti-HIVI/II-IgG、Anti-CMV-IgM、TP、Elisa、EBV等的检测结果合格；
(2)离心后，吸掉上层油脂，将中层脂肪组织转移至新的离心管中，等体积加入生理盐水，离心(800g，8min)；
(3)重复步骤(2)两次，得脂肪组织；
(4)向脂肪组织中加入等体积的脂肪细胞消化液，混匀，放入37℃摇床，100转/min消化1.0h；
(5)消化后，离心(800g，10min)；弃掉上层脂肪，细胞沉淀用DMEM/F12培养基重悬，用40um滤网过滤细胞，离心(800g，10min)；弃上清，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，计数，离心(800g，10min)；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬，置于培养瓶中铺瓶培养(培养条件为：置于恒温培养箱中，37℃，5％CO2；48小时后进行全量换液，去除未贴壁细胞)，在培养瓶上标记样本条形码、操作时间及细胞代次；当细胞生长密度达到80％时，进行脂肪干细胞传代培养；
所述换液的具体方法为：
①打开层流，打开生物安全柜的紫外线灯照射30min；
②将脂肪干细胞培养瓶取出，在倒置显微镜下观察细胞生长状况；
③用75％酒精消毒培养瓶外壁，放置到生物安全柜上；
④用移液管吸弃全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新鲜完全培养基；
⑤换液完毕，用酒精擦拭培养瓶表面，放回恒温培养箱中；
(二)脂肪干细胞传代
(1)取出培养瓶，吸弃旧培养基，于非细胞培养面加入适量生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；
(2)向培养瓶中适量胰酶或胰酶溶液，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液终止消化；用100μm细胞筛网收集细胞，加入适量生理盐水，轻柔吹打后离心(1200转/min，6min)；弃上清，沉淀用适量生理盐水重悬，离心(1200转/min，6min)；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬铺瓶，保证接种细胞密度在8×104/ml以上，置于培养箱中培养(培养条件为：37℃，5％CO2)。
(三)扩大培养
按照8×104/ml细胞密度接种脂肪间充质干细胞于T75细胞培养瓶或细胞工厂(一个4层细胞工厂＝33个T75瓶)，细胞工厂可以加脂肪间充质干细胞培养基400ml，1个T75培养瓶加培养基15ml；将细胞工厂放置于37℃、5％二氧化碳浓度、2％氧分压的环境中培养，使用细胞工厂作为培养载体，模拟体内低氧环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高产量。
(四)脂肪干细胞旁分泌因子提取
培养72小时，细胞生长密度达到80％左右，将无血清培养基留存；细胞工厂加200ml盐水洗一次，T75培养瓶用10ml盐水洗一次，弃掉上清；每个细胞工厂加入200ml旁分泌因子提取液，每个T75培养瓶加入5mL PBS。
(五)脂肪干细胞旁分泌因子纯化
(1)将细胞工厂以及T75瓶中加提取液培养24小时后，收集所有提取液至50ml离心管中(每管40ml提取液)(准备高速离心去沉渣)；
(2)离心管中提取液低温高速离心，4℃，4000g，8min，目的是去除细胞沉渣；
(3)将收集的提取液转移至T75培养瓶中(根据提取液量选择合适的容器存放)；
(4)将去沉渣后的提取液用移液管转移至准备好的10KD超滤管(提前用超纯水浸泡24h)中，每管20ml，低温高速离心，4度，4000g(根据经验，20ml液体设定1小时离心时间即可)；
(5)离心后上层的液体剩余不到1.0ml时，收集下层浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存；更换新的超滤管重复过滤，直至所有的提取液都浓缩收集完毕；
(6)当去沉渣后的提取液用移液管转移至准备好的5KD超滤管(提前用超纯水浸泡24h)中，每管20ml，低温高速离心，4℃，4000g；
(7)将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，每管20ml，进一步浓缩(离心时间大约3小时左右，剩余液体低于2.0ml)，弃掉超滤管下面的液体；
(8)每管加盐水至20ml，重复离心洗涤两次；最后一次盐水洗涤后每个超滤管浓缩液剩余量控制在1.0ml以内；
(9)最终离心后的浓缩液体用生理盐水重悬调整体积(一套工厂浓缩后应调整体积为3.5ml)(一套工厂＝一个四层工厂+一个T75培养瓶)；
(10)浓缩液过滤：先用生理盐水0.5ml左右浸润0.22um滤器，浸润滤器后的盐水弃掉，然后用注射器抽取细胞因子浓缩液通过0.22um滤器过滤，最后量取并用生理盐水调整细胞因子体积；
(六)细胞因子的鉴定
提取得到细胞因子后，进行总蛋白含量鉴定、VEGF因子含量测定、HGF因子含量测定和BDNF因子含量测定。
实验1
利用实施例1的方法提取旁分泌因子，结果如图2～9所示。
总蛋白含量鉴定：利用BCA试剂盒进行分泌因子总蛋白含量鉴定实验测得总蛋白含量为537左右(μg/ml)。
VEGF含量鉴定：利用R&D的VEGF的ELISA试剂盒进行含量测定，测得VEGF含量为：11092左右(pg/ml)。
HGF含量鉴定：利用R&D的HGF的ELISA试剂盒进行含量测定，测得HGF的含量为：13226左右(pg/ml)。
BDNF含量鉴定：利用R&D的BDNF的ELISA试剂盒进行含量测定，测得BDNF的含量为：22左右(pg/ml)。
实验2不同氧分压时的对比
实施例1的提取方法，扩大培养时，分别采用2％氧分压、5％氧分压、21％氧分压的培养条件培养(其它均同实施例1)，总蛋白含量鉴定如图10所示，VEGF含量鉴定如图11所示。
结果：如图10所示，与常氧分压下旁分泌因子蛋白浓度相比，两组(1、2)旁分泌因子蛋白浓度有显著差异(P＜0.05)，1组旁分泌因子浓度略低于常氧分压下(3)旁分泌因子蛋白浓度，但吴显著差异(p＞0.05)。
如图11所示，与常氧分压下旁分泌VEGF浓度相比，3组旁分泌因子VEGF有显著差异(P＜0.05)，2组旁分泌VEGF浓度略低于常氧分压下旁分泌因子浓度，但无显著差异(p＞0.05)。
实验3
实施例1的提取方法，进行脂肪干细胞旁分泌因子提取时，采用本发明的旁分泌因子提取液提取，并以PBS溶液提取作为对比(其它同实施例1)，结果：如表1所示，只采用PBS溶液提取时，提取后细胞活率67.5％，可见大量细胞裂解释放出絮状的DNA，损失的细胞超过30％。而采用本方法的含葡萄糖的旁分泌因子提取液，提取后细胞活率超过90％，同时很少有细胞裂解释放DNA。
表1
细胞提取液配比 细胞活率
PBS 67.5％
PBS+D-葡萄糖 91.2％
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；向洗涤后的脂肪组织中加入适量脂肪细胞消化液进行消化；消化后，离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子；
所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸组成的，其中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。
2.根据权利要求1所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述脂肪细胞消化液，是由DMEM/F12培养基和Ⅰ型胶原酶组成的，Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1％～0.3％。
3.根据权利要求1所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述旁分泌因子提取液中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：2mmol/L，15μmol/L，50μmol/L。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述原代培养的具体方式如下：
(1)取采集的脂肪标本，离心；
(2)离心后，吸掉上层油脂，将中层脂肪组织转移至新的离心管中，等体积加入生理盐水，离心；
(3)重复步骤(2)两次，得脂肪组织；
(4)向脂肪组织中加入等体积的脂肪细胞消化液，混匀，放入37℃摇床，100转/min消化1.0h；
(5)消化后，离心；弃掉上层脂肪，细胞沉淀用DMEM/F12培养基重悬，用40um滤网过滤细胞，离心；弃上清，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，计数，离心；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬，置于培养瓶中铺瓶培养；当细胞生长密度达到80％时，进行脂肪干细胞传代培养。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述传代培养的具体方式如下：
(1)取出培养瓶，吸弃旧培养基，于非细胞培养面加入适量生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；
(2)向培养瓶中适量胰酶或胰酶溶液，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液终止消化；用100μm细胞筛网收集细胞，加入适量生理盐水，轻柔吹打后离心；弃上清，沉淀用适量生理盐水重悬，离心；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬铺瓶，保证接种细胞密度在8×104/ml以上，置于培养箱中培养。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述扩大培养的具体方式为：对脂肪间充质干细胞进行扩大培养，在37℃、5％二氧化碳浓度、2％氧分压的环境中培养。
7.根据权利要求6所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述扩大培养的具体方式如下：按照8×104/ml细胞密度接种脂肪间充质干细胞于T75细胞培养瓶或细胞工厂，细胞工厂可以加脂肪间充质干细胞培养基400ml，1个T75培养瓶加培养基15ml；将细胞工厂放置于37℃、5％二氧化碳浓度、2％氧分压的环境中培养。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：用旁分泌因子提取液提取的具体方式为：培养72小时，细胞生长密度达到80％，将无血清培养基留存；细胞工厂加200ml盐水洗一次，T75培养瓶用10ml盐水洗一次，弃掉上清；每个细胞工厂加入200ml旁分泌因子提取液，每个T75培养瓶加入5mL PBS。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述旁分泌因子纯化的具体方式为：
(1)将细胞工厂以及T75瓶中加提取液培养24小时后，收集所有提取液至50ml离心管中；
(2)离心管中提取液低温高速离心，4℃，4000g，8min；
(3)将收集的提取液转移至T75培养瓶中；
(4)将去沉渣后的提取液用移液管转移至准备好的10KD超滤管中，每管20ml，低温高速离心，4度，4000g；
(5)离心后上层的液体剩余不到1.0ml时，收集下层浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存；更换新的超滤管重复过滤，直至所有的提取液都浓缩收集完毕；
(6)当去沉渣后的提取液用移液管转移至准备好的5KD超滤管中，每管20ml，低温高速离心，4℃，4000g；
(7)将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，每管20ml，进一步浓缩，弃掉超滤管下面的液体；
(8)每管加盐水至20ml，重复离心洗涤两次；最后一次盐水洗涤后每个超滤管浓缩液剩余量控制在1.0ml以内；
(9)最终离心后的浓缩液体用生理盐水重悬调整体积；
(10)浓缩液过滤：先用生理盐水0.5ml左右浸润0.22um滤器，浸润滤器后的盐水弃掉，然后用注射器抽取细胞因子浓缩液通过0.22um滤器过滤，最后量取并用生理盐水调整细胞因子体积。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：还包括以下步骤：
(六)细胞因子的鉴定：提取得到细胞因子后，进行总蛋白含量鉴定、VEGF因子含量测定、HGF因子含量测定和BDNF因子含量测定。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113262195A (zh) * 2021-06-02 2021-08-17 上海南滨江细胞生物科技有限公司 一种含干细胞外泌体的面霜及其制作方法
CN113398160A (zh) * 2021-06-24 2021-09-17 云南农业大学 一种猫用干细胞口腔喷剂及其制备方法
CN113481152A (zh) * 2021-07-12 2021-10-08 中科博赛干细胞再生医学科技(广州)有限公司 间充质干细胞旁分泌因子的制备方法及旁分泌因子应用
CN113712996A (zh) * 2021-09-09 2021-11-30 江苏中衍生科细胞技术研究院有限公司 一种脂肪间充质干细胞因子复合物促进头发再生的方法
CN113827616A (zh) * 2021-08-20 2021-12-24 杭州三江上御生物科技有限公司 纳米脂肪提取物的制备方法及应用
CN114515296A (zh) * 2022-02-25 2022-05-20 和携科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法
CN117070451A (zh) * 2023-10-13 2023-11-17 北京中卫医正科技有限公司 一种间充质干细胞的传代培养方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106497873A (zh) * 2016-12-08 2017-03-15 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 一种大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基
CN106754639A (zh) * 2016-12-08 2017-05-31 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 一种间充质干细胞因子大规模制备方法
CN108309822A (zh) * 2018-02-26 2018-07-24 福建省银丰干细胞工程有限公司 一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106497873A (zh) * 2016-12-08 2017-03-15 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 一种大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基
CN106754639A (zh) * 2016-12-08 2017-05-31 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 一种间充质干细胞因子大规模制备方法
CN108309822A (zh) * 2018-02-26 2018-07-24 福建省银丰干细胞工程有限公司 一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MYROSLAVA MYTSYK等: "《Paracrine potential of adipose stromal vascular fraction cells to recover hypoxia-induced loss of cardiomyocyte function》", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
王倩等: "《低氧条件下人脂肪间充质干细胞分泌多种细胞因子的水平》", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113262195A (zh) * 2021-06-02 2021-08-17 上海南滨江细胞生物科技有限公司 一种含干细胞外泌体的面霜及其制作方法
CN113398160A (zh) * 2021-06-24 2021-09-17 云南农业大学 一种猫用干细胞口腔喷剂及其制备方法
CN113481152A (zh) * 2021-07-12 2021-10-08 中科博赛干细胞再生医学科技(广州)有限公司 间充质干细胞旁分泌因子的制备方法及旁分泌因子应用
CN113827616A (zh) * 2021-08-20 2021-12-24 杭州三江上御生物科技有限公司 纳米脂肪提取物的制备方法及应用
CN113712996A (zh) * 2021-09-09 2021-11-30 江苏中衍生科细胞技术研究院有限公司 一种脂肪间充质干细胞因子复合物促进头发再生的方法
CN114515296A (zh) * 2022-02-25 2022-05-20 和携科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法
CN114515296B (zh) * 2022-02-25 2024-01-12 和携科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法
CN117070451A (zh) * 2023-10-13 2023-11-17 北京中卫医正科技有限公司 一种间充质干细胞的传代培养方法
CN117070451B (zh) * 2023-10-13 2024-01-30 北京中卫医正科技有限公司 一种间充质干细胞的传代培养方法

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