CN118028227A - 普适性低氧型间充质干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

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CN118028227A CN202410321465.0A CN202410321465A CN118028227A CN 118028227 A CN118028227 A CN 118028227A CN 202410321465 A CN202410321465 A CN 202410321465A CN 118028227 A CN118028227 A CN 118028227A
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颉丽英
裴可
曾泽皓
蔺宝
何跃腾
丁茜
蔡车国
胡隽源
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Abstract

本发明公开一种普适性低氧型间充质干细胞的制备方法及其应用，涉及间充质干细胞制备技术领域，该普适性低氧型间充质干细胞的制备方法包括S1、设定低氧培养条件：调控氧气浓度、温度和二氧化碳浓度，维持培养基pH在7.2‑7.4；S2、低氧下优化培养基；S3、制备低氧型间充质干细胞：S31、细胞采集与分离：采集间充质干细胞，分离过滤得到目的间充质干细胞，即为P0代；S32、初步培养与扩增：将间充质干细胞在常氧条件下进行初步稳定4‑12h，转移到低氧培养箱中，开始低氧培养和扩增过程；通过采用本申请提供的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，提高增殖率与加快增殖速度：增强分化潜能：提升旁分泌与免疫调节功能：更好地维持干细胞特性。

Description

普适性低氧型间充质干细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及间充质干细胞制备领域技术，尤其是指一种普适性低氧型间充质干细胞的制备方法及其应用。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)是一种多能干细胞， 具有自我更新和多向分化的潜能， 能够分化成骨、脂肪、软骨等多种细胞类型。它们主要存在于骨髓、脂肪组织、脐带及其他多种组织中， 因其独特的生物学特性和广泛的临床应用前景， 成为组织工程和再生医学领域的研究热点。MSCs在伤口愈合、骨折修复、免疫调节等多个领域显示出巨大的治疗潜力。例如，在骨髓移植中，MSCs能够促进造血干细胞的植入和减少移植物抗宿主病的发生(LeBlanc et al.,2008)；在软骨修复方面，MSCs通过分化成软骨细胞， 有助于恢复关节功能(Barry and Murphy,2004)。此外，MSCs还显示出调节免疫系统反应的能力， 为治疗自身免疫性疾病提供了新的策略(Uccelli et al,2008)。尽管MSCs的临床应用前景广阔，但在实际应用中仍面临多重挑战。一大挑战是在体外培养过程中，MSCs的分化潜力逐渐下降，细胞老化加速，这限制了它们的临床应用范围和效果。此外，传统的体外培养条件常常无法完全模拟体内环境， 导致细胞失去其原有的生物学特性。
近年来，研究表明低氧环境(hypoxia)对于维持MSCs的特性和功能具有重要作用。低氧环境能够模拟MSCs在体内的自然生长环境，有利于维持其干性和增强其增殖能力。例如，Grayson等人的研究表明，在低氧条件下培养的MSCs， 其增殖速率和干性标志物的表达水平均高于常氧条件下培养的细胞(Grayson et al., 2010)。此外，Tsai et al. (2011)发现，低氧环境下的MSCs表现出更高的分化潜能和更低的细胞衰老速率。
当前市场上的间充质干细胞(MSCs)制备技术主要集中在常氧环境下的培养， 这与MSCs自然存在于低氧环境的人体内部情况不符， 导致细胞的生物特性和治疗效能可能与其自然状态有所偏差。现有技术的制备缺陷包括：
1.增殖率低，增殖速度慢： 当前市场上的间充质干细胞(MSCs)制备技术主要集中在常氧环境下的培养，这与MSCs自然存在于低氧环境的人体内部情况不符， 导致细胞的生物特性和治疗效能可能与其自然状态有所偏差；
2.分化潜能受限： 在常氧环境下培养的间充质干细胞，其分化潜能受到明显限制；研究表明， 低氧环境能够促进间充质干细胞向骨、脂肪和软骨等多种细胞类型的分化，而常氧条件下的细胞表现出较弱的分化能力。这一限制显著降低了间充质干细胞在再生医学和组织工程中的应用潜力；
3.细胞的旁分泌与免疫抑制功能降低： 在常氧环境下培养时，MSCs面临的过高氧分压直接影响其旁分泌及免疫调节功能。这种环境导致细胞内部的氧化应激增加， 干扰了细胞的正常代谢和信号传递机制。结果导致MSCs的生物活性降低，其分泌的免疫调节因子和生长因子的数量与活性都显著减少，从而削弱了它们在抗炎和组织修复中的效能；
4.维持干细胞特性的挑战：较于低氧条件， 常氧条件下的MSCs在维持其核心干细胞属性方面存在缺陷；有研究发现，常氧环境不仅能够显著减缓MSCs的增殖， 并下调维持干细胞相关基因如Oct-4和Nanog的表达，表明常氧条件不利于维持MSCs的干细胞状态， 更容易触发分化程序， 从而损失干细胞的本质特性； 细胞出现老化和凋亡：在常氧环境中培养的MSCs更易经历加速的老化过程及增加的凋亡率。
有研究表明，在常氧条件下，MSCs展现出较高的β-半乳糖酶活性，暗示常氧环境增强MSCs的老化过程。此外， 这种环境还能提高细胞凋亡率， 降低细胞的存活能力。 申请号为202110965758.9的中国发明专利公开了一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法；现有技术中的制备方法增殖率与加快增殖速度有待提高： 分化潜能低： 不能保证旁分泌与免疫调节功能；基于上述背景， 本申请建立一种普适性低氧型间充质干细胞的制备方法及其应用， 并通过各项功能检测以及安全性与有效性的评价，有望为提高MSCs的临床应用效果提供一种选择。
发明内容
有鉴于此， 本发明针对现有技术存在之缺失， 其主要目的是提供一种普适性低氧型间充质干细胞的制备方法及其应用， 其通过采用本申请提供的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法， 提高增殖率与加快增殖速度： 增强分化潜能： 提升旁分泌与免疫调节功能： 更好地维持干细胞特性。
为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：
一种普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤；
S1、设定低氧培养条件： 调控氧气浓度、温度和二氧化碳浓度， 维持培养基pH在7.2-7.4之间；
S2、低氧下优化培养基：配置间充质干细胞培养基,向该间充质干细胞培养基中添加抗氧化剂N-acetyl cysteine和营养物质； 定期更换培养基， 监测细胞培养液中的pH和营养物质消耗情况， 根据需要补充培养基的组分；
S3、制备低氧型间充质干细胞：
S31、细胞采集与分离：从供体组织中采集间充质干细胞MSCs，分离过滤得到目的间充质干细胞， 即为P0代；分离采用酶解法或机械分离法进行；
S32、初步培养与扩增：将分离得到的P0代的间充质干细胞在常氧条件下进行初步稳定4-12h，待细胞恢复活力后，迅速转移到低氧培养箱中，开始低氧培养和扩增过程。
作为一种优选方案：所述步骤S1中调控氧气浓度、温度和二氧化碳浓度具体为：将培养箱内的氧气体积浓度设定为(1％-10％)±0.1％， 并根据细胞增殖生长代次和状态，进行梯度式调整；设置培养箱内温度为37℃±0.5℃；二氧化碳体积浓度为5％±0.1％。
作为一种优选方案：所述步骤S2中的间充质干细胞培养基包括基础培养基、营养添加物和人源血小板裂解物PLTGOLD；该94.4mL基础培养基、0.6mL营养添加物和2mL人源血小板裂解物PLTGOLD的体积比例为94.4:0.6:5。
作为一种优选方案：所述步骤S32中低氧培养和扩增过程中进行培养基优化：根据低氧条件下间充质干细胞的代谢特性，调整培养基配方， 包括增加抗氧化剂和适应低氧环境的营养物质， 以支持细胞的生长和维持其生物功能。
作为一种优选方案：所述步骤S31中细胞采集具体为： 取成熟商业化的脐带置于DMEM培养基中，使用D-PBS缓冲液冲洗后，剥离脐带动、静脉后重复清洗，将脐带组织剪为1mm大小的碎块，将组织碎块重悬于完全培养基，300g离心10min， 弃上清； 用间充质干细胞完全培养基重悬，使得组织块均匀分布于培养瓶中。
作为一种优选方案：所述步骤S31中间充质干细胞完全培养基包括94.4％间充质干细胞无血清基础培养基、0.6％间充质干细胞无血清营养添加物和5％血小板裂解物。
作为一种优选方案：所述步骤S32中低氧培养和扩增具体为：在体积浓度为5％低氧条件下监测细胞的生长状态和密度，根据细胞增殖情况，每2-3天更换一次新鲜完全培养基，待细胞汇合度达到80％时，进行细胞传代，生理盐水清洗后，0.25％胰酶消化至细胞变为圆形但未飘起，使用3倍体积的细胞基础培养基终止细胞消化，吹打收集细胞悬液，300g离心5min,弃上清，加入细胞完全培养基重悬，按(6-8)*103个/cm2的细胞密度种植于细胞培养瓶中进行继续培养；待细胞低氧培养至传至P3-P5代，收集细胞。
作为一种优选方案：所述步骤S2中的抗氧化剂N-acetyl cysteine的终浓度为0.1-10mM；该营养物质包括葡萄糖，该葡萄糖浓度为10-100mM。
作为一种优选方案：所述步骤S2中配置间充质干细胞培养基时，使用无菌技术并在使用前通过0.22μm滤膜进行过滤，确保间充质干细胞培养基处于无菌状态。
所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法的应用，所述制备方法应用于细胞分化诱导以及体内外模型有效性和安全性评价。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言， 由上述技术方案可知，通过采用本申请提供的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，
1.提高增殖率与加快增殖速度：本申请通过低氧培养条件，显著提高了MSCs的增殖率；低氧环境能够激活特定的信号通路，促进细胞周期的进程，从而加速MSCs的增殖速度；这一改进不仅提升了细胞制备的效率，还为大规模生产和应用提供了可能，突破了传统常氧培养条件下增殖率低、增殖速度慢的限制；
2.增强分化潜能：相较于常氧条件，本申请的低氧培养方法能够显著增强MSCs的分化潜能；低氧环境对细胞分化途径的正向调节作用为MSCs提供了更为有利的条件，促使其向骨、脂肪和软骨等多种细胞类型有效分化；这一特性极大地扩展了MSCs在再生医学和组织工程中的应用范围，解决了常氧条件下分化潜能受限的问题；
3.提升旁分泌与免疫调节功能： 本申请所采用的低氧培养技术， 通过减少氧化应激，优化了MSCs的旁分泌功能和免疫调节能力；研究显示，低氧条件下的MSCs能够更有效地分泌免疫调节因子和生长因子，增强其在抗炎、组织修复中的作用；这一发现标志着本申请在提高MSCs临床应用有效性方面的突破， 克服了常氧环境下旁分泌功能和免疫调节能力降低的局限；
4.更好地维持干细胞特性：通过模拟MSCs的自然低氧生长环境，本申请有效地维持了MSCs的干细胞特性，包括自我更新能力和多向分化潜力；这一创新解决了常氧条件下干细胞特性难以维持的问题，确保了MSCs在应用过程中保持其原始的高价值特性， 为其在组织工程和再生医学领域的应用提供了强有力的支持；
5、减缓细胞老化和降低凋亡率：本申请的低氧培养方法有效减缓了MSCs的老化过程并降低了凋亡率； 文献证实， 低氧环境能够减少细胞内的氧化应激，延长细胞的寿命，提高其在长期培养和应用中的稳定性；这一改进为MSCs的质量控制和后续的临床应用提供了重要保障， 解决了在常氧环境下细胞易老化和凋亡的问题。
通过模拟MSCs在人体内的自然低氧环境，本申请的方法与细胞的生理条件更为吻合， 从而更有效地维护细胞的原有生物特性和功能， 科学依据强；增强的分化潜能和旁分泌功能使得本申请中的MSCs能够更广泛地应用于多种疾病的治疗， 包括但不限于组织修复、免疫调节及抗炎作用， 应用范围广；维持干细胞特性和减缓细胞老化的能力，使得本申请中的MSCs在临床应用中具有更长的有效期和更高的安全性， 有望提高治疗效果， 临床应用潜力大；提升的增殖率意味着在较短的时间内可以获得更多的细胞， 为大规模生产和商业化应用打下了坚实的基础， 生产效率高。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效， 下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
附图说明
图1为本发明之低氧型间充质干细胞的制备方法流程图；
图2为本发明之不同氧浓度对细胞增殖特性的影响示意图；
图3为本发明之不同氧浓度对细胞活力特性的影响示意图；
图4为本发明之不同氧浓度对细胞三系分化特性的影响示意图；
图5为本发明之不同氧浓度对细胞三系分化特性的影响柱状对比示意图；
图6为本发明之不同氧浓度对细胞免疫抑制特性的影响示意图；
图7为本发明之不同氧浓度对细胞缺氧耐受特性的影响示意图；
图8为本发明之不同氧浓度对细胞干性维持特性的影响示意图；
图9为本发明之不同氧浓度对细胞衰老特性的影响示意图；
图10为本发明之不同氧浓度对细胞分泌特性的影响示意图；
图11为本发明之不同氧浓度对细胞培养过程的安全性评价示意图；
图12为本发明之不同氧浓度下细胞标准化制备工艺的安全性评价示意图；
图13为本发明之不同的氧浓度对细胞表面标记物表达的影响示意图；
图14为本发明之不同的氧浓度对细胞染色体结构的影响示意图；
图15为本发明之体外软骨细胞损伤模型的造模与治疗的流程图；
图16为本发明之不同氧浓度对损伤软骨细胞修复的免疫荧光分析示意图；
图17为本发明之不同氧浓度对损伤软骨细胞修复后荧光强度统计图；
图18为本发明之不同氧浓度对损伤软骨细胞修复后标记物统计图；
图19为本发明之不同氧浓度培养的细胞对大鼠骨关节炎创面修复形貌图；
图20为本发明之不同氧浓度培养的细胞对大鼠骨关节炎修复Micro-CT分析图。
具体实施方式
本发明如图1至图20所示， 一种普适性低氧型间充质干细胞的制备方法， 包括如下步骤；
S1、设定低氧培养条件： 调控氧气浓度、温度和二氧化碳浓度， 维持培养基pH在7.2-7.4之间；
氧气浓度调控
①使用三气培养箱，预设氧气浓度为1-10％，具体浓度根据实验目的和前期小规模试验结果决定；
②实验前进行至少24小时的培养箱内气体稳定性测试，确保氧气浓度稳定在预设值±0.5％的范围内；
③在培养过程中，每24小时使用氧气浓度监测仪器校验一次，确保氧气浓度的准确性。
温度和二氧化碳浓度调控
①设置培养箱温度恒定在37℃，二氧化碳浓度恒定在5％， 以维持培养基pH在7.2-7.4之间；
②使用自动pH监测和调节系统，确保培养过程中培养基pH的稳定。
S2、低氧下优化培养基：配置间充质干细胞培养基,向该间充质干细胞培养基中添加抗氧化剂N-acetyl cysteine和营养物质； 定期更换培养基， 监测细胞培养液中的pH和营养物质消耗情况， 根据需要补充培养基的组分；
①根据低氧条件下MSCs的代谢特性， 向培养基中添加适量的抗氧化剂N-acetylcysteine(最终浓度为1mM)和营养物质， 如葡萄糖(调整至高浓度， 如4500 mg/L)；
②定期(每2天)更换培养基，监测细胞培养液中的pH和营养物质消耗情况， 根据需要及时补充培养基的组分。
低氧环境促使细胞更多地依赖于厌氧代谢过程， 如糖酵解， 来满足其能量需求。增加培养基中的葡萄糖浓度能够满足细胞在低氧状态下增加的能量需求。 同时，低氧环境增加了活性氧(ROS)的产生，这可能导致细胞应激和损伤。
S3、制备低氧型间充质干细胞：
S31、细胞采集与分离：从供体组织中采集间充质干细胞，分离过滤得到目的间充质干细胞， 即为P0代，该分离采用酶解法或机械分离法进行；也可采用新型细胞分离和培养技术， 如微流控技术或光学特性的细胞分选方法。
细胞采集与分离
①取成熟商业化的脐带15cm置于DMEM培养基，在超净工作台使用D-PBS缓冲液冲洗3次后， 剥离脐带动、静脉后重复清洗3次， 使用手术剪将脐带组织剪为1mm大小的碎块，将组织碎块重悬于完全培养基，300g离心10min，弃上清；用15mL间充质干细胞完全培养基重悬，使得组织块均匀分布于培养瓶中； 本申请中所用脐带均采用成熟商业化的脐带。
间充质干细胞完全培养基成分94.4％Nutristem MSC XF Basal Medium间充质干细胞无血清基础培养基、0.6％utristem MSC XF Supplement Mix间充质干细胞无血清营养添加物和5％StemulateXeno-and heparin-free pooled platelet lysate血小板裂解物。
②培养5天之后，进行换液，将组织块倒入50mL离心管中，用生理盐水轻微冲洗细胞培养瓶， 使组织块倒出完全； 300g离心10min,去上清， 加入8-10mL间充质干细胞完全培养基，倒回原来的细胞培养瓶；培养基颜色偏黄，补充细胞培养基。
③继续培养6天之后， 吸去培养上清，加入8-10mL新鲜完全培养基。
④继续培养3天之后， 吸去培养上清，加入8-10mL新鲜完全培养基。
⑤继续培养3天之后， 吸去培养上清，加入8-10mL新鲜完全培养基。
⑥培养过程中， 随时观察细胞爬出状态， 如细胞爬出较多， 可进行消化收集；组织块可重新种回培养瓶中。
⑦分离后的细胞通过70μm细胞过滤器过滤， 去除未分解的组织块和大颗粒物。
⑧使用密度梯度离心法(如用Ficoll溶液)进一步纯化MSCs，收集中间层的细胞作为P0代MSCs。
S32、初步培养与扩增：将分离得到的P0代的间充质干细胞在常氧条件下进行初步稳定4-12h，待细胞恢复活力后，迅速转移到低氧培养箱中，开始低氧培养和扩增过程。
①将分离得到的P0代MSCs在常氧条件下(21％氧气浓度)进行初步培养4-12小时，加入完全培养基， 细胞种植密度为(6-8)*103个/cm2，观察细胞状态是否良好；
②常氧预培养结束后， 迅速转移到预设氧气浓度5％的低氧培养箱中， 继续完全培养基进行低氧培养；
③在低氧条件下密切监测细胞的生长状态和密度，根据细胞增殖情况，每2-3天更换一次新鲜完全培养基，待细胞汇合度达到80％时，进行细胞传代，生理盐水清洗2次后，0.25％胰酶消化至细胞变为圆形但未飘起，使用3倍体积的细胞基础培养基终止细胞消化，轻轻吹打收集细胞悬液，300g离心5min,弃上清，加入细胞完全培养基重悬，按(6-8)*103个/cm2的细胞密度种植于细胞培养瓶中进行继续培养。
④待细胞低氧培养至传至P3-P5代， 收集细胞用于后续实验。
该步骤S1中调控氧气浓度、温度和二氧化碳浓度具体为：将培养箱内的氧气体积浓度设定为(1％-10％)±0.1％， 并根据细胞增殖生长代次和状态，进行梯度式调整； 设置培养箱内温度为37℃±0.5℃； 二氧化碳体积浓度为55％±0.1％。
该步骤S2中的间充质干细胞培养基包括基础培养基、营养添加物和人源血小板裂解物PLTGOLD； 该94.4mL基础培养基、0.6mL营养添加物和5mL人源血小板裂解物PLTGOLD的体积比例为94.4:0.6:5。
该步骤S32中低氧培养和扩增过程中进行培养基优化： 根据低氧条件下间充质干细胞的代谢特性，调整培养基配方，包括增加抗氧化剂和适应低氧环境的营养物质， 以支持细胞的生长和维持其生物功能。
该步骤S31中细胞采集具体为：取成熟商业化的脐带置于DMEM培养基中，使用D-PBS缓冲液冲洗后， 剥离脐带动、静脉后重复清洗，将脐带组织剪为1mm大小的碎块，将组织碎块重悬于完全培养基，300g离心10min， 弃上清；用间充质干细胞完全培养基重悬，使得组织块均匀分布于培养瓶中。
该步骤S31中间充质干细胞完全培养基包括94.4％间充质干细胞无血清基础培养基、0.6％间充质干细胞无血清营养添加物和5％血小板裂解物。
该步骤S32中低氧培养和扩增具体为：在体积浓度为5％低氧条件下监测细胞的生长状态和密度，根据细胞增殖情况，每2-3天更换一次新鲜完全培养基，待细胞汇合度达到80％时，进行细胞传代，生理盐水清洗后， 0.25％胰酶消化至细胞变为圆形但未飘起，使用3倍体积的细胞基础培养基终止细胞消化， 吹打收集细胞悬液， 300g离心5min,弃上清，加入细胞完全培养基重悬， 按(6-8)*103个/cm2的细胞密度种植于细胞培养瓶中进行继续培养；待细胞低氧培养至传至P3-P5代， 收集细胞。
该步骤S2中的抗氧化剂N-acetyl cysteine的终浓度为0.1-10mM；该营养物质包括葡萄糖，该葡萄糖浓度为10-100mM。
该步骤S2中配置间充质干细胞培养基时，使用无菌技术并在使用前通过0.22μm滤膜进行过滤，确保间充质干细胞培养基处于无菌状态。
细胞鉴定与功能验证： (增殖、分化、抗衰、干性维持及分泌与免疫上的生物功能变化)
一、使用流式细胞术分析扩增后的MSCs，检测典型的MSC细胞表面标志物， 如CD105, CD73和CD90的表达， 同时确认不表达血细胞标志物CD45和CD34。
流式细胞术细胞处理步骤：
取P3-P5代MSCs，用0.25％胰蛋白酶进行消化，操作过程同上述消化步骤。待转移至离心管后， 1200rpm/min离心10min去上清，用PBS洗涤细胞2次，加入1mLPBS重悬细胞。
将收集的细胞悬液等分为3组进行染色：
第1组为同型对照组，加入Mouse IgG1 FITC，APC Mouse IgG1， PE Mouse IgG1各1-2μl。
第2组为阴性配色组，分别加入Anti-human CD34 PE、Anti-human CD45FITC各1-2μl。
第3组为阳性配色组，分别加入Anti-human CD90FITC 5μl、Anti-human73APC、Anti-human CD105 PE各1-2μl，4℃下避光孵育15min，离心去上清，每组细胞中加入500μlPBS重新悬浮细胞沉淀，过滤后上流式细胞仪进行分析，采用FlowJ对数据进行分析，观察各组细胞表面标记物的表达。
1.从板或烧瓶中取出组织培养基，并用室温PBS(不含Ca2+或Mg2+)清洗细胞。
2.将Accutase添加到细胞中以覆盖孔或培养瓶的表面， 在室温下孵育5-10分钟，或直至细胞脱落。
3.加入培养基或PBS(例如6孔板加2mL)协助洗去细胞，轻轻上下移液以帮助分散双峰。
4.将内容物转移到新的15mL试管中。可选取出少量液体并在显微镜下检查以确认是否存在单细胞。如果观察到细胞团块，请收集细胞悬液并将其通过70μm细胞过滤器。
5.用两到四倍体积的PBS洗涤细胞，300g离心5分钟。
6.在染色缓冲液(1％FBS)中清洗细胞， 并以适合细胞计数的体积重悬。使用血细胞计数器或其他细胞计数器的标准方法确定细胞浓度。
7.重悬细胞至浓度为1x107个细胞/mL，将100μL添加到12x75毫米流式管或微孔板的圆底孔。
8.通过流式细胞术分析染色的细胞样本。
二、通过特定的分化诱导实验，如成骨、成脂和成软骨分化，评估MSCs的分化潜能。
注：成骨成脂成软骨实验均需提前明胶包被六孔板，每孔加入1mL明胶，37°孵育半小时。培养基均需提前按照试剂商提供说明书提前配置完成， 预热至37℃待使用。脐带间质干细胞成骨诱导分化培养基(厂家：赛业生物)；脐带间质干细胞成脂诱导分化培养基(厂家： 赛业生物)； 人间充质干细胞成软骨诱导分化与染色试剂盒(厂家： 大连博格林)
MSC成骨分化：
1、加1mL0.1％明胶到六孔板中，摇匀，使其能均匀覆盖各孔底面。
2、将铺有0.1％明胶的六孔板放置在超净台或CO2培养箱至少30min。
3、30min后吸去明胶即可用于接种细胞。
4、将待诱导的间充质干细胞按照2×104Cells/cm2的细胞密度接种于六孔板中，每孔加入2mL普通完全培养基。
5、细胞置于37℃， 5％的CO2培养箱中培养。
6、当细胞融合度达到70％时，将孔内完全培养基吸走，加入2mL成骨诱导分化培养基。
7、每隔3天换用新鲜的成骨诱导分化培养基。
8、诱导2-4周后， 观察细胞形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。
成脂分化：
1.明胶包被六孔板，细胞前期培养实验步骤同成骨分化实验。
2.当细胞汇合度达到100％时， 小心将孔内完全培养基吸走， 向六孔板中加入2mL间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液(按试剂商提供说明书进行)。
3.诱导3天后， 吸去六孔板中的A液，加入2 mL间充质干细胞成脂诱导分化培养基B液。
4.维持1天后， 吸去B液，换回A液进行诱导。
5.A液和B液交替使用，期间需每天观察细胞状态。若在A液诱导过程中出现细胞收缩、死亡的情况，请及时更换为B液，直至细胞状态恢复。
6.重复诱导和维持过程， 直到出现足量、大小适宜的脂滴， 即可准备油红O染色。
成软骨分化：
1.按试剂商提供说明书配制成软骨培养基；
2.收集P3-P5代细胞悬液至15mL离心管中， 每管细胞量为4*105个， 加入3 mL成软骨非完全培养基， 150g， 5min， 离心结束后弃上清， 重复2次。
3.加入2mL完全培养基， 150g， 5min， 离心1次。
4.拧松离心管盖， 以便于气体交换。将其竖立放置于37℃、5％CO2培养箱中培养；此步骤不需要吸去上清或重悬细胞且24h内不要晃动离心管。
5.自接种日计算， 每隔2天换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基， 约0.5-1mL。
6.持续诱导， 直至管内形成直径1.5-2mm的软骨球， 即可准备切片进行阿立新兰染色。
三、评估低氧条件下MSCs的免疫调节功能， 通过共培养实验观察MSCs对T细胞增殖的影响。
1.按试剂商说明书使用淋巴细胞分离液从全血样本中分离得到PBMC。
2.用10μg/mL丝裂霉素在37℃条件下处理MSC 2h，用D-PBS洗涤三次，用胰酶消化细胞， 收集并计数细胞； 1200rpm离心5分钟收集细胞， 弃上清；将处理后的MSC细胞按浓度为1x105个/mL接种在24孔板Transwell小室上层中， 待第二天完全贴壁后备用。
3、准备CFSE标记的PBMC:37C水浴复苏冻存的PBMC，D-PBS重悬复苏的细胞，1200rpm，8分钟离心洗涤细胞两次，弃上清，细胞以(5-10)×106的细胞密度，在室温条件下用含1μM CFSE的D-PBS避光孵10分钟，标记PBMC。
4、用预冷的完全培养基(RPMI 1640+10％FBS+2 mM谷氨酰胺)以5倍体积稀释标记的PBMC,4℃静置5分钟，终止CFSE的细胞标记；标记后的细胞用完全培养基1200rpm，8分钟离心洗涤3次，彻底去除残留的CFSE；
5、在Transwell小室下层按照1:5(MSC:PBMC)比例接种PBMC。在PBMC刺激孔中加入CD3功能抗体(0.5μg/mL)、CD28功能抗体(2μg/mL)和hlL-2(50ng/mL)进行刺激。
6、细胞共培养5天后， 收集悬浮细胞， 并用anti-human CD3流式抗体标记细胞，进行细胞增殖分析。
四、采用qPCR技术检测细胞干性基因凋亡特异性基因以及三系分化基因在mRNA水平的相对表达情况。
以GAPDH为内参基因,常规培养的MSCs为对照组，其目的基因相对表达量设为1。实验组目的基因的表达量表示为相对于对照组的变化倍数。
1.P3-P5代hUC-MSCs常规培养48h后(融合度达80-90％)，分别置于常规与低氧培养48h， 收集细胞，每组(1-2*106个细胞)。
2.Trizol，氯仿，异丙醇提取RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录后，进行实时定量PCR检测相关基因表达水平的变化。
总RNA的提取
a：在特定时间点，将样品用预冷PBS清洗2次；
b：转移所有样品至离心管中，每管均加入1mLTrizol溶液，并充分吹打样品，使Trizol溶液与细胞完全作用，室温静置10-30min；
c：向上述离心管中加入200μl氯仿/管，立即涡旋15s，室温静置10 min后， 4℃，12000rpm离心15min；
d： 取上清(400μl/管)转移至另一离心管中， 每管加入500μl预冷异丙醇，小心混合均匀管中液体，-20℃下静置过夜，4℃下12000 rpm离心15 min；
e： 弃异丙醇， 加入1mL预冷的95％的乙醇(DEPC水配制)， 混匀，4℃，12000rpm离心5min；
f:弃上清， 晾干剩余溶液后，加入DEPC水溶解RNA；
g:测定RNA浓度及纯度。
3、反转录所用溶液按照说明书标准配制，所获的cDNA于-80℃储存待用。
4、按照试剂盒说明书进行RT-qPCR检测
①95℃， 10min；
②40个循环： 95℃， 30s； 60℃， 30s； 72℃， 90s；
③72℃， 10min。
该普适性低氧型间充质干细胞的制备方法的应用， 该制备方法应用于细胞分化诱导以及体内外模型有效性和安全性评价。
细胞分化诱导： 根据再生医学的应用需求， 采用特定的诱导因子和培养条件，引导MSCs向目标细胞类型分化， 如成骨细胞、成脂细胞或软骨细胞；
体内外模型有效性与安全性评价： 通过体内外的细胞与动物模型评价制备细胞的安全性和有效性， 适应症包括但不限于骨折愈合、软骨损伤修复、慢性炎症治疗以及免疫调节疾病的治疗。这些应用体现了低氧培养条件下制备的MSCs在提高治疗效果和促进组织再生方面的潜力。
实施例1：低氧型间充质干细胞的制备方法；
1、实验室环境准备和低氧培养条件的设定
在实验开始前， 确保所有实验操作在无菌条件下进行， 包括使用经紫外线消毒的生物安全柜和无菌操作技术； 低氧培养条件需精确设定， 在三气培养箱中调整氧气浓度至1-10％(±0.1％)， 以模拟细胞在体内的低氧环境。同时，维持CO2浓度为5％±0.1％和温度为37℃±0.5℃，确保培养环境的稳定性和一致性。
2、培养基的配置
(1)根据先前描述， 配置适用于MSCs生长的特殊培养基。 使用由BiologicalIndustries公司提供的专门的间充质干细胞培养基，该培养基结合了基础培养基与营养添加物，以及人源血小板裂解物PLTGOLD。根据94.4mL基础培养基、0.6mL营养添加物和5mLPLTGOLD的比例进行配制，旨在为MSCs提供一个富含营养的生长环境。
(2)此外， 为了降低低氧环境带来对MSCs的扰动， 添加一些抗氧化物质， 如N-acetyl cysteine等，其最终浓度，精确调整至0.1-10mM间， 以确保其在抑制氧化应激方面的最佳效果。同时，将葡萄糖浓度调整至较高水平，具体10-100mM间，旨在提供充足的能量源以支持细胞的高效生长和代谢活动。
(3)每次配置培养基时，使用无菌技术并在使用前通过0.22μm滤膜进行过滤， 以确保培养基的无菌状态。
3. 低氧型MSCs的制备与培养
(1)处理新鲜脐带：将新鲜脐带在无菌条件下清洗，并将其切割成2-3cm的段落。使用0.1％的抗生素-抗真菌剂溶液进行预处理，以减少微生物污染的风险。
(2)间充质干细胞的提取：抽离脐带中的血管后，将剩余脐带组织切成碎块并置于培养皿中，让MSCs自然爬出，每两天换一次液。待培养皿细胞达到一定密度后， 消化， 并过通过70μm细胞过滤器过滤， 去除未分解的组织块和大颗粒物； 使用密度梯度离心法(如用Ficoll溶液)进一步纯化MSCs，收集中间层的细标记为P0代， 继续传代培养。
(3)细胞分离与培养：消化结束后立即加入等体积的步骤2中的培养基以中和酶的活性。通过300g离心5分钟沉淀细胞，并用生理盐水洗涤细胞沉淀两次以去除残余的培养基。经过细胞计数后， 以8×103/cm2的密度接种至T75培养瓶中，先放入正常氧环境稳定4-12h。待细胞贴壁良好后，迅速转移至设置好的低氧培养箱中(1-10％范围的O2)培养。培养基每2-3天更换一次， 确保细胞所需营养和生长因子的连续供应。
(4)细胞的传代与纯化： 使用0.25％胰蛋白酶在37℃下处理细胞1min，快速且温和地使细胞脱落， 以减少细胞受到的损伤。消化终止后， 立即加入步骤2中的培养基，通过300g离心5分钟收集细胞。将收集到的细胞重悬于新鲜的专门间充质干细胞培养基中，调整细胞密度至8000个细胞/cm2， 并继续在低氧条件(1-10％O2)下进行培养。重复传代操作至P4代， 直至获得足够数量的MSCs。每次传代和培养基更换时，均需确保使用新鲜配制的特殊培养基， 以维持细胞生长所需的营养和环境条件。
(5)细胞质量控制与评价：在细胞扩增过程中，定期进行细胞质量控制，包括细胞活性、纯度和特定细胞标志物的检测。使用MTT或CCK-8等方法评估细胞活性，通过流式细胞术分析细胞表面标志物如CD73、CD90和CD105的表达， 以确认细胞的干细胞特性。同时，针对可能的微生物污染，包括细菌、真菌和内毒素， 采用相应的培养基和检测套件进行定期检测， 确保细胞制备的安全性。
验证实施例1： 低氧型间充质干细胞的功能鉴定；
低氧型MSCs由于其在低氧环境下的培养，具有较正常氧气培养条件下细胞更优异的生物功能， 包括增殖能力、分化潜能、抗衰老性能、干细胞特性的维持以及在分泌功能和免疫调节上的变化。本实施例旨在通过一系列实验验证这些特性。
1)试验1：增殖能力的评估
方法： 采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖试剂盒进行增殖测试。将细胞分别在低氧和常氧水平下培养， 并在设定的时间点(如24、48、72和96小时)加入CCK-8溶液， 通过测定吸光度(OD值)来评估细胞的增殖能力。
分析： 通过比较不同时间点的OD值， 分析低氧条件对MSCs增殖能力的影响。
2)试验2： 分化潜能的鉴定
方法： 成骨分化：使用成骨分化培养基培养细胞，通过Alizarin Red染色鉴定钙沉积。
成脂分化： 使用成脂分化培养基培养细胞， 通过Oil Red O染色检测脂滴的形成。
成软骨分化：使用成软骨分化培养基培养细胞，通过Alcian染色评估硫酸软骨素的沉积。
分析： 对染色结果进行定性和定量分析， 评价低氧型MSCs的分化潜能。
3)试验3：抗衰老性能的评价
方法： 通过β-galactosidase染色(SA-β-gal染色)评估细胞衰老情况； 同时，通过检测细胞中抗氧化相关基因和蛋白(如SOD1、CAT)的表达水平来评估其抗氧化能力。
分析： 比较低氧型与常规培养条件下MSCs的衰老情况和抗氧化基因、蛋白的表达差异。
4)试验4： 干性维持的检测
方法： 检测干细胞特异性基因(如OCT4、SOX2和NANOG)的mRNA水平。比较低氧型MSCs与常规氧气水平下培养的MSCs在干细胞标志物表达和特异性基因表达上的差异， 以评估低氧条件对干细胞特性的维持作用。
分析： 比较低氧型与常规培养条件下MSCs的衰老情况和抗氧化基因、蛋白的表达差异。
5)试验5： 分泌功能和免疫调节能力的变化
通过ELISA检测低氧型MSCs培养上清中关键促进组织修复和再生的因子(如VEGF、TGF-β和HGF)的浓度。
免疫调节能力评价：使用混合淋巴细胞反应(mLR)实验评估低氧型MSCs对T细胞增殖的影响。此外， 通过检测细胞中如IL-10和TGF-β的基因表达水平， 评估其免疫调节能力。
采用流式细胞术等精确技术进行MSCs的鉴定和功能评估，确保所制备细胞的质量和生物活性。
也可以整合基因组学、蛋白质组学分析方法， 为细胞鉴定和功能验证提供更广泛的技术路径。
验证实施例2： 低氧型间充质干细胞的制备方法与产品的安全性验证；
低氧型MSCs的制备方法及产品的安全性验证过程，重点关注方法安全性和细胞产品的生物安全性验证。本实施例旨在通过一系列严格的质量控制措施和生物安全性评估，确保低氧型MSCs的安全性和应用潜力。
1)试验1： 制备方法安全性评价
①支原体检测：从低氧培养的MSCs批次中，每100mL培养基取1mL作为检测样本。使用专用支原体检测试剂盒，每个样本加入PCR反应混合物25μL，包含2xPCR Master Mix12.5μL，支原体特异性引物1μL(10μM)，模板DNA5μL， 补足体积至25μL的无核酸酶水。95℃预变性5分钟，之后40个循环(95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒)，最后72℃延伸7分钟。通过2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，对照标准条带判断是否有支原体污染；
②细菌培养检测： 从每批次培养的MSCs中取0.5 mL加入到10mL无菌生理盐水中。将样本接种到血琼脂平板上， 37℃培养24-48小时。观察平板是否有细菌生长，记录菌落形态；
③内毒素检测：采用LAL试剂盒，按照说明书准备试剂和稀释的MSCs培养上清样本。将样本与LAL试剂混合，按照试剂盒说明进行孵育，使用微孔板读数仪按照450 nm波长读取结果。根据标准曲线计算样本中的内毒素含量，结果需低于设定的安全阈值(<0.5EU/mL)。
2)试验2：细胞产品的生物安全性验证
①体外细胞安全性评估：将培养至对数生长期的MSCs收集，细胞密度调整至1×106/mL。使用秋水仙碱(0.1μg/mL，处理4小时)阻断细胞在中期，随后收集细胞进行染色体制备。将细胞涂片进行Giemsa染色，之后在显微镜下进行染色体计数和形态学分析；
②动物体内实验验证： 实验用6-8周龄的疫缺陷小鼠， 雄性；每只小鼠尾静脉注射1×106低氧型MSCs，细胞用PBS稀释至200μL进行注射。相同体积的生理盐水或PBS注射至另一组免疫缺陷小鼠中。注射后的1周和4周后，取心、肝、脾、肺和注射部位的组织进行检测相应的肿瘤和炎症的mRNA，并对各组织进行切片染色观察组织的病理变化， 特别注意是否有异物反应或组织损伤的迹象。
验证实施例3： 体外模型细胞治疗有效性评价；
炎症性关节疾病中， 软骨细胞(Chondrocytes)受到炎症因子如IL-1β或TNFα的损伤，导致软骨退化。专利旨在评估低氧型MSCs对IL-1β联合TNFα诱导的软骨细胞损伤的治疗效果， 并与常氧条件下培养的MSCs进行比较。
①实验材料与软骨细胞损伤模型建立： 使用人软骨细胞作为模型， 通过两因子联合处理来模拟软骨细胞的炎症损伤。软骨细胞以5×104的密度接种在24孔板中， 并在37℃、5％CO2的条件下培养。经过24小时稳定贴壁后，向培养基中加入IL-1β和TNFα， 以诱导炎症损伤模型的建立， 处理时间为24小时；
②对于MSCs的准备， 分别将低氧型MSCs在1-10％O2的条件下培养， 而常氧型MSCs则在21％O2的标准条件下培养，直至达到对数生长期。之后，将MSCs调整至2.5×105/mL的浓度，并将低氧型和常氧型MSCs分别与受损伤的软骨细胞以1:5的比例共培养。共培养过程在37℃、5％CO2的条件下进行，持续时间为48小时， 旨在评估MSCs对软骨细胞损伤的修复效果；
③评估指标：为了评估MSCs的治疗效果，本实验采用以下三个主要评估指标： a)细胞活性：采用CCK-8试剂，根据制造商提供的协议进行操作。在共培养的24、48小时时点取样， 向每个孔中加入10μL CCK-8溶液，孵育2小时后，使用酶标仪测量450nm处的吸光度值(OD值)。b)软骨特异性基因表达：共培养结束后，使用TRIzol提取共培养细胞的总RNA，并进行cDNA反转录。采用RT-qPCR技术， 使用特定引物对COL2A1和ACAN基因进行定量分析。PCR反应体系包括10μL SYBR Green Master Mix， 1μL正反向引物(10μM)， 2μL cDNA模板， 以及补足至20μL的无菌水。反应条件为95℃预变性10分钟，之后40个循环(95℃15秒，60℃1分钟)。c)炎症因子表达：使用ELISA试剂盒根据制造商的指导书测定共培养上清中IL-6和TNF-α的浓度。样品和标准品分别加入预包被特异性抗体的微孔板中， 孵育并洗涤后，加入生物素标记的检测抗体， 再次孵育和洗涤。最后加入底物溶液， 孵育产生颜色反应，停止反应后在450nm波长下读取吸光度值。
验证实施例4： 体外模型细胞治疗有效性评价；
本实施例旨在评估低氧型MSCs对于体内软骨损伤模型的治疗效果。通过建立动物炎症性骨关节炎模型比较：
1、实验设计与动物模型建立： 实验采用雄性SD大鼠， 年龄8周。使用单侧膝关节注射100uL的1.2％II型胶原酶， 以诱导关节炎模型， 模拟软骨损伤；
2、MSCs的处理与注射：在关节炎模型建立后的第10天， 分别将低氧型MSCs(培养条件为1-10％O2)和常氧MSCs(培养条件为21％O2)悬浮于无菌的生理盐水中， 调整至密度为1×106细胞/80μL。通过膝关节旁路注射的方式，将MSCs直接注入受损的膝关节中。为了对照，一组大鼠将接受等体积的生理盐水注射；
③效果评价指标与方法： 腿围和疼痛测试： 注射后的第10和20天， 通过检测疼痛程度和活动能力。临床评分标准包括肢体保护、行为变化等指标。同时对组织学评估：实验结束时(通常为治疗后第20天)，对大鼠进行安乐死， 收集受损的膝关节组织。采用苏番红固绿染色评估软骨的病理变化和损伤程度。此外， 用micro-CT分析软骨层的损伤与修复的动态变化。
本发明的设计重点在于， 通过采用本申请提供的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，
1.提高增殖率与加快增殖速度： 本申请通过低氧培养条件， 显著提高了MSCs的增殖率； 低氧环境能够激活特定的信号通路， 促进细胞周期的进程，从而加速MSCs的增殖速度；这一改进不仅提升了细胞制备的效率，还为大规模生产和应用提供了可能， 突破了传统常氧培养条件下增殖率低、增殖速度慢的限制；
2.增强分化潜能： 相较于常氧条件， 本申请的低氧培养方法能够显著增强MSCs的分化潜能； 低氧环境对细胞分化途径的正向调节作用为MSCs提供了更为有利的条件，促使其向骨、脂肪和软骨等多种细胞类型有效分化； 这一特性极大地扩展了MSCs在再生医学和组织工程中的应用范围，解决了常氧条件下分化潜能受限的问题；
3.提升旁分泌与免疫调节功能： 本申请所采用的低氧培养技术， 通过减少氧化应激，优化了MSCs的旁分泌功能和免疫调节能力；研究显示，低氧条件下的MSCs能够更有效地分泌免疫调节因子和生长因子，增强其在抗炎、组织修复中的作用；这一发现标志着本申请在提高MSCs临床应用有效性方面的突破， 克服了常氧环境下旁分泌功能和免疫调节能力降低的局限；
4.更好地维持干细胞特性：通过模拟MSCs的自然低氧生长环境，本申请有效地维持了MSCs的干细胞特性，包括自我更新能力和多向分化潜力；这一创新解决了常氧条件下干细胞特性难以维持的问题，确保了MSCs在应用过程中保持其原始的高价值特性， 为其在组织工程和再生医学领域的应用提供了强有力的支持；
5、减缓细胞老化和降低凋亡率：本申请的低氧培养方法有效减缓了MSCs的老化过程并降低了凋亡率； 文献证实， 低氧环境能够减少细胞内的氧化应激，延长细胞的寿命，提高其在长期培养和应用中的稳定性；这一改进为MSCs的质量控制和后续的临床应用提供了重要保障， 解决了在常氧环境下细胞易老化和凋亡的问题。
综上所述，通过模拟MSCs在人体内的自然低氧环境，本申请的方法与细胞的生理条件更为吻合， 从而更有效地维护细胞的原有生物特性和功能， 科学依据强；增强的分化潜能和旁分泌功能使得本申请中的MSCs能够更广泛地应用于多种疾病的治疗， 包括但不限于组织修复、免疫调节及抗炎作用， 应用范围广；维持干细胞特性和减缓细胞老化的能力，使得本申请中的MSCs在临床应用中具有更长的有效期和更高的安全性， 有望提高治疗效果， 临床应用潜力大； 提升的增殖率意味着在较短的时间内可以获得更多的细胞， 为大规模生产和商业化应用打下了坚实的基础， 生产效率高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已， 并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤；
S1、设定低氧培养条件：调控氧气浓度、温度和二氧化碳浓度，维持培养基pH在7.2-7.4之间；
S2、低氧下优化培养基：配置间充质干细胞培养基,向该间充质干细胞培养基中添加抗氧化剂N-acetyl cysteine和营养物质；定期更换培养基，监测细胞培养液中的pH和营养物质消耗情况，根据需要补充培养基的组分；
S3、制备低氧型间充质干细胞：
S31、细胞采集与分离：从供体组织中采集间充质干细胞，分离过滤得到目的间充质干细胞，即为P0代；
S32、初步培养与扩增：将分离得到的P0代的间充质干细胞在常氧条件下进行初步稳定4-12h，待细胞恢复活力后，迅速转移到低氧培养箱中，开始低氧培养和扩增过程。
2.根据权利要求1所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中调控氧气浓度、温度和二氧化碳浓度具体为：将培养箱内的氧气体积浓度设定为(1％-10％)±0.1％，并根据细胞增殖生长代次和状态，进行梯度式调整；设置培养箱内温度为37℃±0.5℃；二氧化碳体积浓度为5％±0.1％。
3.根据权利要求1所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的间充质干细胞培养基包括基础培养基、营养添加物和人源血小板裂解物PLTGOLD；该94.4mL基础培养基、0.6mL营养添加物和5mL人源血小板裂解物PLTGOLD的体积比例为94.4:0.6:5。
4.根据权利要求1所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S32中低氧培养和扩增过程中进行培养基优化：根据低氧条件下间充质干细胞的代谢特性，调整培养基配方，包括增加抗氧化剂和适应低氧环境的营养物质，以支持细胞的生长和维持其生物功能。
5.根据权利要求1所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S31中细胞采集具体为：取成熟商业化的脐带置于DMEM培养基中，使用D-PBS缓冲液冲洗后，剥离脐带动、静脉后重复清洗，将脐带组织剪为1mm大小的碎块，将组织碎块重悬于完全培养基，300g离心10min，弃上清；用间充质干细胞完全培养基重悬，使得组织块均匀分布于培养瓶中。
6.根据权利要求5所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S31中间充质干细胞完全培养基包括94.4％间充质干细胞无血清基础培养基、0.6％间充质干细胞无血清营养添加物和5％血小板裂解物。
7.根据权利要求1所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S32中低氧培养和扩增具体为：在体积浓度为5％低氧条件下监测细胞的生长状态和密度，根据细胞增殖情况，每2-3天更换一次新鲜完全培养基，待细胞汇合度达到80％时，进行细胞传代，生理盐水清洗后，0.25％胰酶消化至细胞变为圆形但未飘起，使用3倍体积的细胞基础培养基终止细胞消化，吹打收集细胞悬液，300g离心5min,弃上清，加入细胞完全培养基重悬，按(6-8)*103个/cm2的细胞密度种植于细胞培养瓶中进行继续培养；待细胞低氧培养至传至P3-P5代，收集细胞。
8.根据权利要求1所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的抗氧化剂N-acetylcysteine的终浓度为0.1-10mM；该营养物质包括葡萄糖，该葡萄糖浓度为10-100mM。
9.根据权利要求1所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中配置间充质干细胞培养基时，使用无菌技术并在使用前通过0.22μm滤膜进行过滤，确保间充质干细胞培养基处于无菌状态。
10.一种根据权利要求1-9任意一项所述的普适性低氧型间充质干细胞的制备方法的应用，其特征在于：所述制备方法应用于细胞分化诱导以及体内外模型有效性和安全性评价。
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