CN113287603A - 一种生物样本保存液及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物样本保存液，属于生物样本保存技术领域，保存液含有肝素钠，人参皂苷，人血白蛋白，复方电解质溶液，高糖DMEM培养基溶液，人脐带间充质干细胞培养上清液，双抗。本发明的保存液能够保证组织或血细胞充足的营养供应，延长脐带组织、毛囊组织和经血样本的体外保存时间。本发明的保存液适用范围广，且能够使生物样本在保持高存活率和活性的情况下，满足生物样本长时间/长距离运输的需求，增加了间充质干细胞的应用前景。

Description

一种生物样本保存液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物样本保存技术领域，具体涉及一种生物样本保存液及其制备方法与应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，是一种应用广泛的干细胞。

间充质干细胞最初在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中，如骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺、脐带、毛囊等组织。间充质干细胞从组织如脐带中分离后，在体外培养中有较高的增殖能力和体外传代能力，满足临床治疗需要大量MSCs的要求。

但是MSCs的分离需在组织离开母体后短时间内进行，否则无法分离出足量的原代MSCs，导致后续MSCs培养和增殖受影响。目前通常是采用生理盐水或细胞培养基作为保存溶液，上述保存液仅能够在短时间内提供一定的营养物质或生存环境，长时间保存不能达到有效的保护作用，生物样本难以长时间保持生物活性，无法分离出原代细胞。此外，保存液中含有的血清容易导致病毒等微生物引入，无形中增加了产品的安全风险。因此急需研究一种生物样本保存液，使生物样本在保存液中维持较长时间的生物活性，满足长途运输的要求。

发明内容

本发明的目的在于一种生物样本保存液，该保存液延长了生物样本的保存时间，保证细胞的高存活率与活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种生物样本保存液，所述的保存液含有肝素钠，人参皂苷，人血白蛋白，复方电解质溶液，高糖DMEM培养基溶液，人脐带间充质干细胞培养上清液，双抗。

优选地，所述肝素钠的浓度为3～150U/mL，人参皂苷浓度为10～30mg/mL，人血白蛋白的浓度为10～20％，所述复方电解质溶液、高糖DMEM培养基溶液、人脐带间充质干细胞培养上清液与双抗的体积比为3～4:1～5:3～5:0.1～0.5。

优选地，所述的人脐带间充质干细胞培养上清液来源于第5代的人脐带间充质干细胞培养上清液。

优选地，所述人脐带间充质干细胞培养上清液在细胞密度为1.5×10⁵～2×10⁵个/mL时收集上清液。

优选地，所述的生物样本包括脐带组织、经血或毛囊组织。

优选地，所述人参皂苷的制备方法包括：人参与醇溶液混合，超声提取，离心干燥，即得。

优选地，所述醇溶液为70～80％乙醇溶液。

优选地，所述超声的频率为40kHZ，超声的功率为250W，超声时间为20min。

本发明提供了一种上述生物样本保存液的制备方法，所述制备方法包括如下：将所述高糖DMEM培养基溶液、复方电解质溶液和肝素钠搅拌混匀，然后加入人血白蛋白、人参皂苷、人脐带间充质干细胞培养上清液、双抗，搅拌混匀，即得。

本发明还提供了一种上述生物样本保存液在制备保存生物样本试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的保护液包括多种细胞因子、氨基酸、维生素、无机盐类等含量适宜的营养成分，能够保证组织或血细胞充足的营养供应，延长脐带组织、毛囊组织和经血样本的体外保存时间，对脐带、毛囊组织的保存时间能够达到12天，对经血样本的保存时间能够达到15天，本发明的保存液可有效保存间充质干细胞，使脐带间充质干细胞在保存12天后存活率分别达98.2％，符合间充质干细胞标志物表达量的基本要求，且通过本发明的保存液保存12天后的脐带组织分离培养出的间充质干细胞能有效的保证其成骨分化能力和免疫调节活性，因此本发明的保存液适用范围广，且能够使生物样本在保持高存活率和活性的情况下，满足生物样本长时间/长距离运输的需求，增加了间充质干细胞的应用前景。

(2)本发明的间充质干细胞保存液的制备方法简便、快捷，成本较低。

附图说明

图1为实施例1～3所述的人脐带间充质干细胞培养上清液的制备方法制得的上清液中各细胞因子含量图；

图2为实施例1的保存液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞形态图；

图3为对比例1的保存液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞形态图；

图4为对比例1的保存液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞形态图；

图5为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD14的分析结果图；

图6为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD19的分析结果图；

图7为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD34的分析结果图；

图8为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD45的分析结果图；

图9为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的HLA-DR的分析结果图；

图10为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD73的分析结果图；

图11为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD90的分析结果图；

图12为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD105的分析结果图；

图13为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD14的分析结果图；

图14为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD19的分析结果图；

图15为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD34的分析结果图；

图16为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD45的分析结果图；

图17为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的HLA-DR的分析结果图；

图18为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD73的分析结果图；

图19为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD90的分析结果图；

图20为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD105的分析结果图；

图21为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD14的分析结果图；

图22为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD19的分析结果图；

图23为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD34的分析结果图；

图24为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD45的分析结果图；

图25为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的HLA-DR的分析结果图；

图26为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD73的分析结果图；

图27为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD90的分析结果图；

图28为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的CD105的分析结果图；

图29为实施例1保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的诱导分化为成骨细胞的矿化结节染色图；

图30为常规保护液保存24h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的诱导分化为成骨细胞的矿化结节染色图；

图31为常规保护液保存48h后的脐带组织分离培养至第5代的间充质干细胞的诱导分化为成骨细胞的矿化结节染色图。

具体实施方式

本发明提供了一种生物样本保存液，所述的保存液含有肝素钠，人参皂苷，人血白蛋白，复方电解质溶液，高糖DMEM培养基溶液，人脐带间充质干细胞培养上清液，双抗。

在本发明的一优选实施例中，所述肝素钠的浓度为3～150U/mL，人参皂苷浓度为10～30mg/mL，人血白蛋白的浓度为10～20％，所述复方电解质溶液、高糖DMEM培养基溶液、人脐带间充质干细胞培养上清液与双抗的体积比为3～4:1～5:3～5:0.1～0.5。所述的肝素钠购自成都市海通药业有限公司。所述人血白蛋白购自瑞士杰特贝林生物制品有限公司。所述复方电解质溶液购自四川科伦药业股份有限公司。所述高糖DMEM培养基溶液购自Hyclone，货号SH30243.01。所述双抗中的青霉素购自石药集团中诺药业(石家庄)有限公司，链霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司，所述双抗的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的方法即可。

本发明对所述人参皂苷的来源没有特殊限定，可通过商家购买得到或通过制备得到。优选的制备方法为人参与醇溶液混合，超声提取，离心干燥，即得。其中，所述人参与醇溶液的重量体积比为1：25(g/mL)，所述醇溶液为70～80％乙醇溶液，所述超声频率为40kHz，超声功率为250W，超声时间为20min。更优选为取500g人参粉末，加入12500mL 70％乙醇溶液中，在70℃下，超声频率为40kHz，超声功率为250W进行超声，超声时间为20min，提取液冷却至室温，4000rpm离心8min，取上清液到蒸发皿中蒸干，即得人参皂苷。

本发明所述的人脐带间充质干细胞培养上清液来源于第5代的人脐带间充质干细胞培养上清液。本发明经过工艺研究发现，第5代的细胞产量高，细胞因子分泌量高，且工艺稳定。所述人脐带间充质干细胞培养上清液在细胞密度为1.5×10⁵～2×10⁵个/mL时收集上清液。优选的人脐带间充质干细胞培养上清液的制备方法如下：取健康脐带，生理盐水冲洗至表面无血液，剔除血管，剥出华通氏胶，剪碎，组织块培养法培养，于37℃，5％的CO₂培养箱培养到有细胞从组织块周围爬出，待细胞长至85～95％，用0.25％胰蛋白酶消化，传代培养至第5代，取第5代的间充质干细胞扩增培养至汇合率为85～95％时的上清液，细胞密度为1.5×10⁵～2×10⁵个/mL收集上清液，弃去沉淀，400目的过滤网过滤，即得人脐带间充质干细胞培养上清液。

在本发明中，所述的高糖DMEM培养基中含有多种氨基酸、维生素、无机盐等，用于维持组织的基本生物活性；所述人血白蛋白用于提供蛋白类营养物质；所述人脐带间充质干细胞培养上清液含有多种细胞因子，为生物样本提供营养物质，保证华通氏胶的活性；所述肝素钠具有抗凝血、防止血管内残留血液凝集、防止血液流入到保存液中凝集的作用；所述复方电解质溶液能够提供电解质，用于维持组织生物活性；所述人参皂苷用于维持生物活性、提高组织的保存时间；所述的双抗用于抗菌，避免产生细菌感染。

本发明提供了一种上述生物样本保存液的制备方法，所述制备方法包括如下：将所述高糖DMEM培养基溶液、复方电解质溶液和肝素钠搅拌混匀，然后加入人血白蛋白、人参皂苷、人脐带间充质干细胞培养上清液、双抗，搅拌混匀，即得。

本发明还提供了一种上述生物样本保存液在制备保存生物样本试剂中的应用。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

人脐带间充质干细胞培养上清液的制备方法如下：

取健康脐带，生理盐水冲洗至表面无血液，剔除血管，剥出华通氏胶，剪碎，组织块培养法培养，于37℃，5％的CO₂培养箱培养到有细胞从组织块周围爬出，待细胞长至90％，用0.25％胰蛋白酶消化，传代培养至第5代，取第5代的间充质干细胞扩增培养至汇合率为95％时的上清液，细胞密度为1.8×10⁵个/mL后收集上清液，弃去沉淀，400目的过滤网过滤，即得人脐带间充质干细胞培养上清液；

人参皂苷的制备方法如下：

取500g人参粉末，加入12500mL 70％乙醇溶液中，在70℃下，超声频率为40kHz，超声功率为250W进行超声，超声时间为20min，提取液冷却至室温，4000rpm离心8min，取上清液到蒸发皿中蒸干，即得人参总皂苷，紫外可见分光光度计在550nm下测定总皂苷得率5.80％～6.30％；

高糖DMEM培养基25mL、复方电解质溶液35mL、肝素钠5U/mL，置于2～8℃的涡旋搅拌器中，300rpm搅拌5分钟，停止搅拌后加入20％人血白蛋白5mL、人参总皂苷2.16g、第5代人脐带间充质干细胞培养上清液40mL、双抗3mL，100rpm搅拌10分钟，即得生物样本保存液。

实施例2

人脐带间充质干细胞培养上清液的制备方法如下：

取健康脐带，生理盐水冲洗至表面无血液，剔除血管，剥出华通氏胶，剪碎，组织块培养法培养，于37℃，5％的CO₂培养箱培养到有细胞从组织块周围爬出，待细胞长至95％，用0.25％胰蛋白酶消化，传代培养至第5代，取第5代的间充质干细胞扩增培养至汇合率为85％时的上清液，细胞密度为2×10⁵个/mL后收集上清液，弃去沉淀，400目的过滤网过滤，即得人脐带间充质干细胞培养上清液；

人参皂苷的制备方法同实施例1；

高糖DMEM培养基50mL、复方电解质溶液40mL、肝素钠10U/mL，置于2～8℃的涡旋搅拌器中，300rpm搅拌5分钟，停止搅拌后加入20％人血白蛋白10mL、人参总皂苷4.65g、第5代人脐带间充质干细胞培养上清液50mL、双抗5mL，100rpm搅拌10分钟，即得生物样本保存液。

实施例3

人脐带间充质干细胞培养上清液的制备方法如下：

取健康脐带，生理盐水冲洗至表面无血液，剔除血管，剥出华通氏胶，剪碎，组织块培养法培养，于37℃，5％的CO₂培养箱培养到有细胞从组织块周围爬出，待细胞长至85％，用0.25％胰蛋白酶消化，传代培养至第5代，取第5代的间充质干细胞扩增培养至汇合率为95％时的上清液，将细胞密度调整至1.5×10⁵个/mL后收集上清液，弃去沉淀，400目的过滤网过滤，即得人脐带间充质干细胞培养上清液；

人参皂苷的制备方法同实施例1；

高糖DMEM培养基10mL、复方电解质溶液30mL、肝素钠100U/mL，置于2～8℃的涡旋搅拌器中，300rpm搅拌5分钟，停止搅拌后加入10％人血白蛋白1mL、人参总皂苷0.72g、第5代人脐带间充质干细胞培养上清液30mL、双抗1mL，100rpm搅拌10分钟，即得生物样本保存液。

对比例1

常规保存液的制备：高糖DMEM培养基450mL、20％人血白蛋白50mL于500mL无菌离心管中，混匀，取样，检测。

将实施例1所述的人脐带间充质干细胞培养上清液的制备方法制得的第5代的间充质干细胞，将第5代的间充质干细胞常规培养72h，收集上清液，检测上清液中的细胞因子含量，进行三次平行试验，通过ELISA法进行含量检测，检测结果如图1所示。结果表明，细胞因子HGF、EGF、FGF、VEGF、PDGF的平均含量分别为4302.5、1056.1、1514.4、988.1、1876.8，单位为pg/million cells。

实施例4

将实施例1的保存液与对比例1的常规保存液进行保存试验，试验过程如下：将无菌采集的大于20cm的脐带组织、毛囊组织和月经血分别置于200mL实施例1和对比例1所述的保护液中，于2～8℃无菌环境下保存，每天取样检测，得到所采集组织的保存期限。在本发明中，所述的保存期限判定标准为在保证组织活性的同时，还能够从该组织中制备出质量合格的间充质干细胞所保存的天数。

结果表明，本发明实施例1的保存液，对脐带、毛囊组织的保存时间能够达到12天，对月经血样本的保存时间能够达到15天，而采用常规保存液对脐带和毛囊组织的保存时间仅为24h，对月经血样本的保存时间为3天。

实施例5

将采用实施例1的保存液保存12天后、常规保存液保存24h和48h后的脐带组织中的间充质干细胞分别进行分离及培养，将分离出的间充质干细胞采用常规培养方法扩增培养至第5代进行细胞生物学评价，包括细胞生长的状态、细胞生长情况、免疫表型、诱导分化成骨和细胞因子PGE2分泌能力进行综合评估。

实施例1保存液保存12天后、常规保存液保存24h和48h后的脐带MSCs的分离和培养包括以下步骤：

取实施例1保存液保存12天后、常规保存液保存24h和48h后的脐带，生理盐水冲洗至表面无血液，剔除血管，剥出华通氏胶，剪碎，组织块培养法培养，于37℃，5％的CO₂培养箱培养到有细胞从组织块周围爬出，待细胞长至85％，用0.25％胰蛋白酶消化，传代培养至第5代。

1)脐带分离培养的间充质干细胞的细胞形态

结果如图2～4所示，实施例1的保护液保存12天后的脐带组织分离培养至第5代MSCs为均一的长梭形成纤维样细胞，呈旋涡状排列生长；常规保存液保存24h的脐带组织，提取分离出原代细胞数量能够达到标准范围内，为均一的长梭形成纤维样细胞，呈旋涡状排列生长，与实施例1保存液保存12天后的脐带组织分离培养第5代MSCs的数量和形态无显著性差异；而常规保存液保存48h的脐带组织分离培养至第5代MSCs为长梭形成纤维样细胞，但细胞数量少，且细胞体积大、均一性差、多数细胞胞内有大量颗粒物，在体外扩增培养过程中，随着传代次数的增加，衰老细胞逐渐凋亡。

2)脐带分离培养的间充质干细胞的生长情况

按照常规的体外扩增培养方法将实施例1保护液保存12天后和常规保存液保存24h、48h后的脐带组织间充质干细胞分成A组、B组和C组，分别扩增培养至25天，测定间充质干细胞的数量及活性，试验结果如表1所示。

表1间充质干细胞的数量及活性

3)间充质干细胞的免疫表型的鉴定

采用流式细胞仪对实施例1保护液保存12天后(A组)和常规保存液保存24h(B组)、48h(C组)后的脐带组织提取分离出MSCs、扩增培养至第5代MSCs进行CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、CD19和HLA-DR分析，脐带间充质干细胞细胞表面标志物表达量的结果见表2。

表2脐带间充质干细胞细胞表面标志物表达量

由图5～28以及表2的结果可知，本发明的保存液保存12天后的脐带组织分离、扩增培养MSCs的CD73、CD90、CD105表达量达95％以上，CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR表达量小于2％，表型符合2006年国际细胞疗法协会(ISCT)制定的MSCs最低的鉴定标准。常规保存液保存24h后的脐带组织分离、扩增培养的MSCs，细胞纯度与本发明保护液保存12天后的脐带组织分离、扩增培养MSCs相当，无显著性差异。而常规方法保存48h后的脐带组织分离、扩增培养的MSCs的细胞数量很少，扩增培养至第5代细胞数量较少、纯度低，5个指标不在标准范围内，如CD14、CD19和HLA-DR阳性表达率大于2％，CD73和CD105阳性表达率低于95％，不符合间充质干细胞标志物表达量的基本要求。

4)脐带间充质干细胞的分化成骨能力

将实施例1保护液保存12天后(A组)和常规保存液保存24h(B组)、48h(C组)后的脐带组织提取分离出MSCs、扩增培养至第5代MSCs以2×10⁵个/孔接种至6孔板中，加入高糖DMEM培养基2mL/孔，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，当细胞达到80％时，诱导组更换成等体积的成骨诱导分化培养基，对照孔仍使用完全培养基，诱导分化21d，氯化钠注射液冲洗1次，4％多聚甲醛溶液1mL/孔，室温固定30min，弃固定液，氯化钠注射液冲洗2次，加入茜素红染色液2mL/孔，染色20min，弃去染色液，氯化钠注射液冲洗3次，观察并拍照，由图29～31的结果显示：A组、B组和C组的间充质干细胞均能够诱导分化为成骨细胞，茜素红染色成鲜红色，但B组与A组培养的间充质干细胞的成骨能力基本一致，镜下肉眼观察不到显著性差异，但是C组制备的MSCs诱导分化的成骨能力低，与A组具有显著性差异。

5)PGE2含量

将实施例1保护液保存12天后(A组)和常规保存液保存24h(B组)、48h(C组)后的脐带组织提取分离出MSCs、扩增培养至第5代MSCs，取扩增至第5代的脐带间充质干细胞以2×10⁵个/孔接种至6孔板中，加入高糖DMEM培养基2mL/孔，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，当细胞达到90％～95％时，即培养72h，收集培养上清液，采用ELISA试剂盒进行检测，操作方法同试剂盒说明书，PGE2的表达量结果见表2。

表2脐带间充质干细胞细胞的PGE2表达量

注：＞0.05*为制备方法1与常规方法24小时进行比较；＜0.05**为制备方法1与常规方法48小时进行比较。

PEG2是间充质干细胞起免疫调节关键蛋白，可以作为MSC免疫调节活性的评价指标，表达量越高表明细胞的免疫调节能力越强，表2表明，A组脐带间充质干细胞在PEG2的表达上明显高于C组，与B组无显著性差异。

综上所述，本发明的保存液不仅能够提高对生物样本的保存时间，而且还能够制备出符合标准的细胞，且纯度高、活性好，本发明的保存液保存12天后的脐带组织分离、培养出的MSCs细胞仍能有效保证其生物活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生物样本保存液，其特征在于，所述的保存液含有肝素钠，人参皂苷，人血白蛋白，复方电解质溶液，高糖DMEM培养基溶液，人脐带间充质干细胞培养上清液，双抗。

2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述肝素钠的浓度为3～150U/mL，人参皂苷浓度为10～30mg/mL，人血白蛋白的浓度为10～20％，所述复方电解质溶液、高糖DMEM培养基溶液、人脐带间充质干细胞培养上清液与双抗的体积比为3～4:1～5:3～5:0.1～0.5。

3.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述的人脐带间充质干细胞培养上清液来源于第5代的人脐带间充质干细胞培养上清液。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的保存液，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞培养上清液在细胞密度为1.5×10⁵～2×10⁵个/mL时收集上清液。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的保存液，其特征在于，所述生物样本包括脐带组织、经血或毛囊组织。

6.根据权利要求1～3任意一项所述的保存液，其特征在于，所述人参皂苷的制备方法包括：

人参与醇溶液混合，超声提取，离心干燥，即得。

7.根据权利要求6所述的保存液，其特征在于，所述醇溶液为70～80％乙醇溶液。

8.根据权利要求6所述的保存液，其特征在于，所述超声的频率为40kHZ，超声的功率为250W，超声时间为20min。

9.根据权利要求1～8任意一项所述保存液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将所述高糖DMEM培养基溶液、复方电解质溶液和肝素钠搅拌混匀，然后加入人血白蛋白、人参皂苷、人脐带间充质干细胞培养上清液、双抗，搅拌混匀，即得。

10.根据权利要求1～9任意一项所述的保存液在制备保存生物样本试剂中的应用。

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