CN106591224B - 高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法，包括将鸡胸肌组织剪成肉糜，用I型胶原酶消化后离心；吸取上层成熟肌内脂肪细胞，接种于培养瓶，去分化处理，最终获得鸡前体肌内脂肪细胞；将离心后下层细胞沉淀重悬，差速贴壁纯化细胞，得到高纯度的肌卫星细胞，将前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞分别接种于transwell小室或配套的培养板，构建共培养体系。该发明方法突破了一直以来无法单独分离纯化鸡前体肌内脂肪细胞的技术瓶颈，可应用于量化模拟鸡肌肉组织，体外精准研究鸡肌内脂肪细胞与肌细胞之间的相互影响关系及分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发。

Description

高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细 胞共培养体系的方法

技术领域

本发明涉及细胞学领域，具体涉及鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化，并构建鸡前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞共培养体系的方法。

背景技术

动物脂肪主要分布在内脏周围、皮下和肌肉等组织部位。其中，肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)是指沉积于肌内膜或肌束膜内外的脂质，可以影响肌肉品质(嫩度、口感、风味)。在一定范围内，肌内脂肪的含量越高，肉的品质就越好；然而，鸡腹部脂肪蓄积过多会降低饲料的利用效率，也会额外增加加工费用，并造成一定的环境污染。因此，肌内脂肪和腹脂沉积涉及肉品质与生产效率两个指标，其均衡调控是肉鸡生产中重要科学命题。高肌内脂肪、低腹脂的体脂分布是优质肉鸡胴体性状改良的理想目标之一。

与猪、牛、羊等家畜不同，鸡肌内脂肪组织分布不均匀，一般不可见，无法直接采集纯的脂肪组织；另外，由于从肌肉组织分离前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞的密度差异不大，只能获得细胞的混合物。所以一直以来无法有效分离高纯度的前体肌内脂肪细胞。这一技术难题极大地限制了体外开展针对鸡肌内脂肪细胞、鸡肌内脂肪细胞与肌细胞之间的相互影响关系及分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发等方面的研究工作。

过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPARγ)、脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，LPL)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein 4，FABP4)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)、肉碱软脂酰转移酶-1b(Carnitinepalmitoyl transferase-1b，CPT-1b)是脂肪细胞的标志性基因。其中，LPL是脂肪细胞早期分化的标志性基因；PPARγ是脂肪开始生成转录的标志性蛋白；FABP4作为脂肪酸结合蛋白家族中的一员，在脂肪细胞分化过程中起着转运脂肪酸的关键作用；FASN和ACC是脂肪细胞分化过程中调控脂肪酸合成的关键酶；而CPT-1b则在脂肪酸氧化供能过程中的关键调控作用。

本发明提供了一种可以分离获得高纯度的鸡肌内前体脂肪细胞，并高效、量化模拟体内肌肉组织细胞发育环境的鸡肌内前体脂肪细胞和肌卫星细胞的共培养体系；并针对上述相关的标志性基因鉴定鸡前体脂肪细胞，鸡前体脂肪细胞的增殖、分化和传代能力，以及构建的共培养体系的有效性。

发明内容

本发明的目的是提供一种高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法，该发明方法突破了一直以来无法单独分离纯化鸡前体肌内脂肪细胞的技术瓶颈，可应用于量化模拟鸡肌肉组织，体外精准研究鸡肌内脂肪细胞与肌细胞之间的相互影响关系及分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发。

本发明所述方法包括将鸡胸肌组织剪成肉糜，用I型胶原酶消化后离心；吸取上层成熟肌内脂肪细胞，接种于培养瓶，去分化处理，最终获得鸡前体肌内脂肪细胞；将离心后下层细胞沉淀重悬，差速贴壁纯化细胞，得到高纯度的肌卫星细胞，将前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞分别接种于transwell小室或配套的培养板，构建共培养体系。

具体地，本发明上述方法包括以下步骤：

(1)无菌条件下取材鸡胸肌组织，去掉可见血管和筋膜，剪至1mm³大小肉糜，加入含1％双抗的PBS缓冲液静置，待组织样品沉淀后，弃上层液和漂浮组织，加入0.1％I型胶原酶消化后，再加入与反应体系等体积的含10％FBS的DMEM/F12培养基中止消化；

(2)将细胞悬液过滤，收集滤液离心后，吸取上层成熟脂肪细胞，接种于细胞培养瓶中，使用含10％FBS的DMEM/F12培养基去分化状态下培养10-14天；出现前脂肪细胞形态时，更换培养基(指更换新的含10％FBS的DMEM/F12培养基)，继续培养至前脂肪细胞长满培养瓶，得到高纯度的肌内前脂肪细胞；

(3)将步骤(2)离心后所得细胞沉淀用含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬，再离心、弃上清，再次重悬细胞并接种于培养皿中，使用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养；利用细胞差速贴壁法进一步筛选，得到纯化的肌卫星细胞；

(4)将肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞分别接种于transwell小室或配套的培养板中，共同在DMEM/F12培养基中培养，即可获得高纯度的鸡前体脂肪细胞和肌卫星细胞的共培养体系。

优选地，本发明的鸡胸肌组织选自10-21日龄雏鸡，此日龄阶段的优势在于，保证肌卫星细胞比较丰富的同时，收集更多的成熟脂肪细胞。

其中，步骤(1)中鸡胸肌组织取材时，去掉可见血管和筋膜，并在PBS溶液中漂洗(一般3-5次)，尽可能的去除红细胞和膜细胞的污染。

步骤(1)中0.1％I型胶原酶的加入量优选为处理后的鸡胸肌组织体积的5-15倍，进一步优选为9倍。

步骤(1)中所述消化温度为37-39℃，消化时间为30min-45min；以消化至消化液粘稠为佳。

进一步优选地，所述0.1％I型胶原酶消化的温度为37℃、消化时间为30min，避免因细胞过度消化而造成损伤，可获得更高的活细胞产量。

本发明所述含1％双抗的PBS缓冲液为本领域通用术语，一般是指PBS缓冲液中含有青霉素100U/ml和链霉素100U/ml，可购自试剂公司。

本发明所述0.1％的I型胶原酶为本领域通用术语，一般是指100ml的DMEM/F12培养基中含有0.1g I型胶原酶。I型胶原酶可购自试剂公司。

本发明所述含10％FBS的DMEM/F12培养基为本领域通用术语，一般是指DMEM/F12培养基中FBS的体积分数为10％。

步骤(2)的细胞悬浮液过滤优选为依次经100目、200目、600目滤筛过滤；所述离心条件优选为：离心转速为1500rpm/min，离心10min，确保上清液中成熟脂肪细胞纯度。

步骤(2)中吸取上层白色或黄色的成熟脂肪细胞，由于成熟脂肪细胞密度低，故倒置接种于细胞培养瓶中。

步骤(2)中接种成熟脂肪细胞后，培养瓶中灌满含10％PBS的DMEM/F12培养基，以彻底排除空气，使细胞进入去分化状态。进一步地，该培养基组成为：89％DMEM/F12培养基+10％FBS+1％双抗。

本发明所述双抗是指青霉素和链霉素。

步骤(2)中倒置培养去分化状态的细胞需要在培养3-5天使换液，以去除细胞排出的脂滴和其他杂质，防止影响细胞的活性状态。

步骤(3)中分离获得的细胞差速贴壁2h后，吸出培养基并重新接种，继续培养得到进一步纯化的肌卫星细胞。可采用现有细胞差速贴壁法(如张艳芳等，猪肌内前体脂肪细胞的体外培养，2011；焦泽华等，大鼠肌肉卫星细胞的分离、鉴定与诱导分化；2011，理论上前体肌内脂肪细胞和膜细胞在2h内完全贴壁，而肌卫星细胞贴壁时间大于2小时，故可纯化肌卫星细胞。

步骤(4)中接种的鸡前体脂肪细胞和肌卫星细胞均经过传代1次，共培养体系使用第2代细胞，此时的细胞状态和活力最佳。

步骤(4)中接种的肌卫星细胞，获得后先冻存，使用时复苏。这样可以保证共培养体系中两种细胞的时间同步。

步骤(4)中肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞的接种位置根据研究目标的不同而有所不同：研究脂肪细胞，肌细胞接种于transwell小室，脂肪细胞接种于配套的培养板；研究肌细胞，则脂肪细胞接种于transwell小室，而肌细胞接种于配套的培养板。

步骤(4)中不同研究目标，使用的DMEM/F12培养基有所不同:研究脂肪细胞和肌细胞的增殖，使用含有10％FBS的DMEM/F12培养基；研究脂肪细胞的分化，使用含有10％FBS和分化诱导剂的DMEM/F12培养基；研究肌细胞的分化，使用含有2％马血清的DMEM/F12培养基。

本发明还提供了上述方法在针对肌卫星细胞与前体肌内脂肪细胞纯度鉴定、前体肌内脂肪细胞增殖和分化能力、体外肌细胞与肌内脂肪细胞之间的相互调控关系及分子机理研究等方面的应用。

利用显微镜观察和油红O染色，以已有方法分离的前体腹脂脂肪细胞为对照，分析了本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的形态和纯度。通过显微镜观察，2种前体脂肪细胞在形态上具有一致性；经过脂肪细胞分化诱导处理96h后，通过油红O染色检测，发现本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的沉脂含量均略高于腹脂前体脂肪细胞，但无显著差异。可以认定本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞确为前体脂肪细胞，并且纯度高于以往方法所获得的前体腹脂脂肪细胞的纯度。

利用MTT、红油O染色、q-PCR等技术，以腹脂来源的前体脂肪细胞(腹脂前体脂肪细胞和腹脂成熟脂肪细胞去分化得到的前体脂肪细胞)为对照，分析了本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的细胞增殖和细胞分化能力等方面的差异。检测发现3种细胞在增殖期的增殖数目无差异；沉脂含量和标志性相关功能基因(PPARγ、LPL、FAS)的表达均略高于腹脂前体脂肪细胞，但无显著差异。说明本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞具有与以往方法分离获得的前体脂肪细胞相同的细胞增殖和分化能力。

利用显微镜观察和MTT等技术，以腹脂来源的前体脂肪细胞(腹脂前体脂肪细胞和腹脂成熟脂肪细胞去分化得到的前体脂肪细胞)为对照，分析获得的鸡前体肌内脂肪细胞的传代能力。结果显示，本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞与对照细胞的传代能力相同：均为原代细胞生长较为缓慢，第2-4代细胞增殖较快；从第5代开始，细胞增殖速度变缓慢；第8代细胞的形态和状态出现异常，主要表现为细胞形态消瘦，出现粘附现象。

利用红油O染色、MTT、q-PCR等技术，对比分析了共培养体系中前体肌内脂肪细胞与单独培养的前体肌内脂肪细胞增殖、分化和相关标志性基因(PPARγ、FABP4、LPL、FAS、ACC、CPT-1b)的表达。结果发现，培养96小时后，在均保证充足培养基的情况下，与单独培养的前脂肪细胞相比，共培养体系中脂肪细胞的脂肪含量显著降低(20％)，但细胞数目无显著差异。反映了共培养体系中肌卫星细胞影响前体肌内脂肪细胞的分化与脂肪沉积，不影响脂肪细胞前体肌内脂肪细胞的增殖；从功能基因表达调控角度，共培养体系中脂肪细胞中PPARγ、FABP4、LPL、FAS和ACC、等标志性基因的表达均显著下调，而CPT-1b的表达却显著上调，与脂肪含量的变化具有一致性。说明了检测结果的准确性与性共培养体系的有效性。

有益效果：

一直以来，受肉鸡肌内脂肪细胞分布不均匀、肉眼不可见等因素限制，无法常规获得或大批量获得高纯度的肉鸡前体肌内脂肪细胞。本方法仍然使用常规的技术和试剂，利用现有技术改进原有方法，实现了这一技术难题和瓶颈的突破，可以获得高纯度的肉鸡前体肌内脂肪细胞，并且数量足够支持持续研究使用。

本方法构建的共培养体系中，可应用于量化模拟体内肌肉组织，体外精准研究前体肌内脂肪细胞、肌细胞与前体肌内脂肪细胞之间的相互影响关系及分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发等。

较之以前的研究，本方法的技术操作简便、易于掌握、无额外的环境污染的特点；同时，本体系方法可在研究后分别回收高纯度的肌内脂肪细胞和肌细胞，同时具备高效、研究对象明确、结果精准等优点。

附图说明

图1为实施例1获得的高纯度鸡前体肌内脂肪细胞图1。

图2为实施例2鸡前体肌内脂肪细胞的形态与纯度鉴定图，其中：

图2A：倒置显微镜下(40×)，鸡前体肌内脂肪细胞与腹脂前体肌内脂肪细胞的形态均为长梭形；而分化后则细胞中出现大小不一的脂滴，形态逐渐变圆，呈现典型的成熟脂肪细胞形态特征；

图2B：油红O染色结果显示(200×)，鸡前体肌内脂肪细胞与腹脂前体肌内脂肪细胞在分化诱导前和分化后都有脂质沉积，但诱导后的细胞中脂质含量明显增加；

图2C：比较分析鸡前体肌内脂肪细胞与腹脂前体肌内脂肪细胞在诱导分化96h后脂质含量，发现本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的沉脂含量在分化前后均略高于腹脂前体脂肪细胞，但无显著差异(P>0.05)，Means±SD，n＝3。

图3为实施例3中获得的前体肌内脂肪细胞的增殖和分化能力鉴定图，其中：

图3A：MTT染色的细胞增殖曲线分析结果显示，本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的增殖能力与2种不同方法获得的腹脂前体脂肪细胞具有极高的契合度，在不同的时间点(12，24，48，72，96h)，3种细胞的细胞数目无显著差异(P>0.05)，Means±SD，n＝8；

图3B：3种细胞经过96h诱导分化处理，通过油红O染色，本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的脂质含量均与2种腹脂前体脂肪细胞无显著差异(P>0.05)，Means±SD，n＝3；

图3C：3种细胞经过96h诱导分化处理，收集细胞进行荧光定量PCR检测。发现相关基因PPARγ、LPL、FABP4的表达在本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞和2种腹脂前脂肪细胞的无显著差异(P>0.05)，Means±SD，n＝3。

图4为实施例4中获得的前体肌内脂肪细胞的传代能力鉴定图，其中：

图4A：本发明方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞与2种不同方法获得的腹脂前体脂肪细胞的传代能力相同：均为原代细胞生长较为缓慢，达到80％细胞融合需要培养3天，第2-4代细胞增殖较快，2天可达到80％细胞融合；而从第5代开始，细胞增殖速度又变缓慢；

图4B：3种都在第8代细胞的形态和状态出现异常，显微镜下观察(40×)其主要表现为细胞增殖速度变缓慢，形态消瘦，出现粘附死细胞现象。

图5表示实施例5鸡前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞共培养体系的应用效果，其中：

图5A：细胞培养96h后，与单独培养的前体肌内脂肪细胞比较，MTT检测发现共培养体系中前体肌内脂肪细胞数目无显著差异(P>0.05)，Means±SD，n＝3；

图5B：与单独培养的前体肌内脂肪细胞比较，油红O染色检测发现共培养体系中的前体肌内脂肪细胞在培养96h后，脂肪含量显著降低，下降20％(P<0.05)，Means±SD，n＝3；

图5C：与单独培养的前体肌内脂肪细胞相比，共培养体系中前体肌内脂肪细胞培养96h后PPARγ、FABP4、LPL、FAS和ACC等基因表达均显著下调(P<0.05或0.01)，而CPT-1b的表达却显著上调(P<0.05)，与脂肪含量的变化具有一致性，Means±SD，n＝3。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料和试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂，购自试剂公司。以下所述双抗指青霉素和链霉素。

实施例1高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离与获得

将10-21日龄北京油鸡放血致死，于75％(V:V)酒精溶液中完全浸泡消毒5min，于细胞室无菌超净工作台进行分离细胞工作。

用无菌的剪刀和镊子去除胸部皮肤、皮下脂肪和结缔组织。眼科剪取下胸大肌，迅速放入含有双抗(青霉素100U/ml和链霉素100U/ml)的PBS缓冲液中清洗3次，再将肌肉组织剪成1mm³大小的肉糜后，移入10ml离心管中，加入含1％双抗的PBS溶液静置1分钟，待肌肉组织沉淀，弃上层液及漂浮组织；再加入9倍体积的质量体积比为0.1％的I型胶原酶，于37℃水浴中振荡消化30min，肉眼可见胶原酶消化液变粘稠后，然后加入同体积含10％FBS的DMEM/F12培养基中止消化；将细胞悬浮液依次用100目、200目和600目的不锈钢筛过滤，收集滤液，1500r/min离心10min。吸取上层白色或黄色的成熟脂肪细胞，接种于细胞培养瓶，并灌满DMEM/F12培养基(89％DMEM/F12+10％FBS+1％双抗)使细胞保持去分化状态；在37℃，5％CO₂培养箱中倒置培养去分化状态的细胞3-5天至出现前体脂肪细胞形态，更换培养基以去除细胞排出的脂滴和其他杂质；正置继续培养7-10天，获得高纯度的鸡前体肌内脂肪细胞(见图1)。

将离心后所得细胞沉淀用含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬，再离心、弃上清，再次重悬细胞并接种于培养皿中，使用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养；利用细胞差速贴壁法进一步筛选，差速贴壁2h后，吸出培养基并重新接种，继续培养得到进一步纯化的肌卫星细胞。

图1表示鸡成熟肌内脂肪细胞去分化转化为前体肌内脂肪细胞过程中不同培养的细胞形态和数量变化，1d接种成熟肌内脂肪细胞，倒置培养3d，细胞外排脂质，开始出现前体脂肪细胞形态，此后从3d-15d前体细胞增多，逐渐长满细胞培养瓶(40×)。

实施例2获得的鸡前体肌内脂肪细胞的鉴定

将实施例1分离得到的鸡前体肌内脂肪细胞，以现有常规方法获得的鸡腹脂前体脂肪细胞为对照，分别按1×10⁵/ml密度接种于6孔细胞培养板，当细胞生长至100％汇合时，显微镜观察细胞形态，并将2种细胞均做分化诱导和未诱导2个处理。诱导组DMEM/F12培养基中(含有10％FBS，1％双抗)添加10μg/ml INS(胰岛素)和1μmol/L DEX(地塞米松)以及115ng/ml IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)的诱导分化剂，在诱导96h后所有细胞采用油红O染色法进行脂质含量检测，每种细胞每个处理均为3孔细胞重复。染色后显微镜观察拍照，异丙醇洗脱后洗脱液于酶标仪510波长测定OD值。

显微镜观察发现，2种前体脂肪细胞的形态具有一致性：在分化前均为长梭形；而分化后则长梭形细胞开始出现含有大小不一的脂滴，形态逐渐变圆，呈现典型的成熟脂肪细胞形态特征(图2A)。油红O染色结果表明，2种细胞分化诱导前后都有脂质沉积，但诱导后的细胞中脂质含量明显增加(图2B)。2种细胞比较，发现本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的沉脂含量在分化前后均略高于腹脂前体脂肪细胞，但无显著差异(P>0.05)(图2C)。

通过以上结果，说明本发明的方法中由成熟脂肪细胞去分化获得的细胞是前体肌内脂肪细胞，经分化诱导剂处理后分化为脂质含量较高的成熟脂肪细胞，并且纯度高于以往方法所获得的腹脂前体脂肪细胞的纯度。推测其原因在于，以往分离的前体腹脂脂肪细胞可能会混杂少量的结缔组织膜细胞，而本方法获得的前体肌内脂肪细胞完全由成熟脂肪细胞去分化而来，所以纯度更高。

实施例3获得的鸡前体肌内脂肪细胞的增殖和分化能力鉴定

将实施例1分离得到的鸡前体肌内脂肪细胞，分别以现有常规方法获得的鸡腹脂前体脂肪细胞和与实施例1相同方法处理得到的腹脂前体脂肪细胞作为对照，对比分析本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的增殖和分化能力。3种细胞均按细胞15％的最终密度接种于96孔细胞培养板，DMEM/F12培养基(含有10％FBS，1％双抗)培养，分别在培养12h、24h、48h、72h和96h时采用MTT法检测细胞数目，每个处理均为8孔细胞重复。MTT染色4h后，DMSO洗脱，洗脱液于酶标仪490波长测定OD值，最后绘制3种细胞的增殖曲线。

使用上一步分析中相同的细胞，按1×10⁵/ml密度接种于6孔细胞培养板，按照实施例2的处理方法诱导分化3种细胞。在诱导96h后3种细胞的2个处理均采用油红O染色法进行脂质含量检测，每种细胞每个处理均为3孔细胞重复。染色后显微镜观察拍照、测定OD值。同步在诱导96h时收集细胞，提取细胞总RNA(每个时间点3孔细胞重复)，分析脂肪细胞相关特异性基因(PPARγ、LPL、FAS)mRNA的表达，特异性引物信息见表1。

表1目的基因的特异性引物信息

采用SASV8统计软件中的ANOVA程序，采用T-test检验数据差异，结果用平均值±标准误表示，以P<0.05为差异显著性标准。

分析MTT染色的细胞增殖曲线结果发现，本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的增殖能力与2种不同方法获得的腹脂前体脂肪细胞具有极高的契合度，在不同的时间点，3种细胞的细胞数目无显著差异(P>0.05)(图3A)。3种细胞的油红O染色结果表明，本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞的沉脂含量在分化前后均与2种腹脂前体脂肪细胞无显著差异(P>0.05)(图3B)。同样，基因表达检测(图3C)发现，3种基因表达在本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞和2种腹脂前脂肪细胞的诱导或诱导后均无显著差异(P>0.05)。说明本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞具有与以往方法分离获得的腹脂前体脂肪细胞相同的细胞增殖和分化能力。

实施例4获得的鸡前体肌内脂肪细胞的传代能力鉴定

将实施例1分离得到的鸡前体肌内脂肪细胞，及实施例3中相同的对照细胞，对比分析其传代能力。3种细胞均按1×10⁵/ml密度接种于6孔细胞培养板，DMEM/F12培养基(含有10％FBS，1％双抗)中培养，细胞密度达到80％融合时传代。如此反复，记录每代细胞达到80％融合所需的培养天数，至细胞形态或状态发生异常结束。

结果显示，本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞与2种腹脂前体脂肪细胞的传代能力相同：原代细胞生长较为缓慢，第2-4代细胞增殖较快；从第5代开始，细胞增殖速度变缓慢；均在第8代细胞的形态和状态出现异常，主要表现为细胞形态消瘦，出现粘附死细胞现象(图4)。因此，使用本方法获得的鸡前体肌内脂肪细胞应选择使用具有较好的增殖能力和活性的第2-4代细胞。

实施例5本方法中鸡前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞共培养体系的应用效果

将按实施例1分离得到鸡前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞，研究处于增殖阶段的肌卫星细胞对鸡前体肌内脂肪细胞分化和脂质沉积的调控影响。鸡前体肌内脂肪细胞按1×10⁵/ml密度接种于6孔细胞培养板，肌卫星细胞接种于transwell小室。2种细胞的接种密度不同，当鸡前体肌内脂肪细胞密度达到100％融合、肌卫星细胞密度达到40％时在含10％FBS的DMEM/F12培养基中共培养，添加以上实施例中1/10剂量的诱导分化剂，每个组3孔重复。对照组除了不添加肌卫星细胞外，其他条件均与共培养组相同。每天换液1次，保证充足供应细胞养分。培养96h后，所有细胞进行MTT染色和油红O染色，检测脂肪细胞中细胞数目和脂质含量，同步检测相关的代表性功能基因(PPARγ、FABP4、LPL、FAS、ACC、CPT-1b)的表达。除此说明外，其他操作均与实施例2中相同。

检测结果发现，基因表达结果与脂肪含量的变化具有一致性。与单独培养的前脂肪细胞相比，共培养体系中前脂肪细胞的脂肪含量显著降低(P<0.05)，下降比例达到20％(图5A)；但细胞数目无显著差异(P>0.05)(图5B)。共培养体系中前脂肪细胞的PPARγ、FABP4、LPL、FAS和ACC、等标志性基因的表达水平均显著下调(P<0.05或P<0.01)，而CPT-1b的表达却显著上调(P<0.05)(图5C)。揭示共培养体系中肌卫星细胞会调控前体脂肪细胞的分化和脂肪沉积，但不影响其细胞增殖；显示了检测结果的准确性与性共培养体系的有效性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的

方法

<130> KHP161119389.4Q

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

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Claims (3)

1.一种高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将10-21日龄北京油鸡放血致死，于75％酒精溶液中完全浸泡消毒5min，于细胞室无菌超净工作台进行分离细胞工作；用无菌的剪刀和镊子去除胸部皮肤、皮下脂肪和结缔组织；眼科剪取下胸大肌，迅速放入含有双抗的PBS缓冲液中清洗3次，再将肌肉组织剪成1mm³大小的肉糜后，移入10ml离心管中，加入含1％双抗的PBS溶液静置1分钟，待肌肉组织沉淀，弃上层液及漂浮组织；再加入9倍体积的质量体积比为0.1％的I型胶原酶，于37℃水浴中振荡消化30min，肉眼可见胶原酶消化液变粘稠后，然后加入同体积含10％FBS的DMEM/F12培养基中止消化；其中双抗具体为：青霉素100U/ml和链霉素100U/ml；

(2)将细胞悬浮液依次用100目、200目和600目的不锈钢筛过滤，收集滤液，1500r/min离心10min；吸取上层白色或黄色的成熟脂肪细胞，接种于细胞培养瓶，并灌满DMEM/F12培养基使细胞保持去分化状态；在37℃，5％CO₂培养箱中倒置培养去分化状态的细胞3-5天至出现前体脂肪细胞形态，更换培养基以去除细胞排出的脂滴和其他杂质；正置继续培养7-10天，获得高纯度的鸡前体肌内脂肪细胞，其中DMEM/F12培养基具体成分为：89％DMEM/F12+10％FBS+1％双抗；

(3)将步骤(2)离心后所得细胞沉淀用含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬，再离心、 弃上清，再次重悬细胞并接种于培养皿中，使用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养；利用细胞差速贴壁法进一步筛选，差速贴壁2h后，吸出培养基并重新接种，继续培养得到进一步纯化的肌卫星细胞；

(4)将肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞分别接种于transwell小室或配套的培养板中，共同在DMEM/F12培养基中培养，即可获得高纯度的鸡前体脂肪细胞和肌卫星细胞的共培养体系；接种的鸡前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞均使用第2代细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中研究前体肌内脂肪细胞时，肌卫星细胞接种于transwell小室，前体肌内脂肪细胞相应地接种于配套的培养板；研究肌细胞时，前体肌内脂肪细胞则接种于transwell小室，肌卫星细胞接种于配套的培养板。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，研究前体肌内脂肪细胞和肌细胞增殖时，使用含有10％FBS的DMEM/F12培养基；研究前体肌内脂肪细胞分化时，使用含有10％FBS和分化诱导剂的DMEM/F12培养基；研究肌细胞的分化时，使用含有2％马血清的DMEM/F12培养基。

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