CN110511871A - 一种细胞共培养的装置及牛肌细胞与脂肪细胞的共培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种细胞共培养的装置，涉及细胞培养领域，其是由皿体和皿盖构成，皿体为上开口的中空结构，皿体开口处有皿盖，皿体内有隔离圈，隔离圈将皿体的内部分割为区域Ⅰ和区域Ⅱ，隔离圈内有爬片。利用上述装置在实现牛肌细胞与脂肪细胞直接接触共培养的同时，又可将爬片上的单类细胞（肌细胞或脂肪细胞）进行收集进行后续转录组及蛋白组的分析处理，以用来研究共培养环境下对肌细胞或脂肪细胞的作用，因此有利于进一步探究肌细胞与脂肪细胞之间的相互作用；经多次观察证实用这种方法培养的肌细胞和脂肪细胞成活效率高、活力好、细胞特征明显，并与单独培养的肌细胞和脂肪细胞形态一致，是一种很好的体外研究模型，具有一定的推广研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种细胞共培养的装置及牛肌细胞与脂肪细胞的共培养方法。
背景技术
相较于单层细胞培养技术，为了能够建立更接近体内环境的培养体系，在20世纪80年代后期，细胞共培养技术应运而生。细胞共培养又称为复合培养或混合培养，是将两种或两种以上的细胞共同培养于同一环境中，由于它考虑到活体细胞间的相互作用，最大程度地模拟体内微环境，弥补了单层细胞培养的缺陷，所以能更好地研究细胞与细胞之间的相互作用。
目前，研究细胞共培养的技术主要包括直接接触共培养和间接接触共培养两种。直接接触共培养是将将两种或两种以上的细胞按照一定的接种比例放在同一培养环境中共同混合培养，其缺陷是无法对单类细胞进行后续转录组或蛋白组的分析处理；间接接触共培养是将两种或两种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后再将这两种载体置于同一培养环境中，较为典型的方法是Transwell共培养体系，包含上室和下室两部分，其中，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上、下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将两种细胞分别接种于上、下室内，由于聚碳酸酯膜具有通透性，上、下层的培养液中的成分可以互相扩散，而细胞本身无法通过，所以可以用来研究两种细胞之间的相互作用情况，但同时也存在的问题是:（1）Transwell培养系统上下室以聚碳酸酯膜相隔，为防止细胞穿过，共培养中要选用0.4微米孔径的膜，会影响细胞分泌因子的通过和作用时间；（2）不易对上下室细胞进行较为直观地观察和后续操作；（3）价格昂贵。
牛肉中的脂肪类型主要包括两种：肌间脂肪和肌内脂肪。其中，肌内脂肪是形成牛肉大理石花纹的物质基础，肌内脂肪含量可以改善牛肉的风味、多汁性和嫩度，是衡量牛肉品质的重要因素。在大理石纹牛肉中，肌细胞与脂肪细胞交杂分布，两种细胞通过直接接触，自分泌或旁分泌一些细胞因子，相互调控生命进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛肌细胞与脂肪细胞共培养的装置及其培养方法，旨在解决单独培养肌细胞与脂肪细胞，而忽略了活体中肌细胞与脂肪细胞的相互作用，不能全面解析大理石纹牛肉性状形成的分子机理的问题。
本发明的一种细胞共培养装置，是由皿体和皿盖构成，所述皿体为上开口的中空结构，皿体开口处设有皿盖，皿体的内部设有隔离圈，隔离圈为上下开口的中空结构，隔离圈将皿体的内部分割为区域Ⅰ和区域Ⅱ，隔离圈的内部为区域Ⅰ，隔离圈与皿体之间为区域Ⅱ，隔离圈的内部设有爬片。
作为本发明的进一步改进，所述的皿体和隔离圈均为圆柱体。
作为本发明的进一步改进，所述的皿体的直径60mm，隔离圈的直径为35mm，爬片为24mm*24mm的盖玻片。
利用上述细胞共培养装置，共培养牛肌细胞与脂肪细胞的方法，其操作步骤如下：
（1）在无菌条件下，分别取牛背最长肌和肾周脂肪组织，切除可见的血管和结缔组织，用5%～10%质量百分比双抗的1xPBS冲洗，然后将组织剪成1mm3大小的小块，备用；
（2）分别在（1）步骤中剪碎的牛背最长肌肌肉组织加入0.25％的Ⅱ型胶原酶/0.1%的Ⅱ型中性蛋白酶消化液，在（1）步骤中剪碎的肾周脂肪组织中加入0.25％的Ⅰ型胶原酶消化液，恒温振荡水浴锅37℃消化直至细浆状，得到细浆液；
（3）将（2）步骤制得的细浆液与等体积有血清培养液混合，终止消化，然后将细胞悬液通过80μm细胞筛过滤，经1200rpm/min离心10分钟，弃上清液以获得细胞沉淀，再加入适量血清培养液使细胞密度1×105～2×105/ml，吹打混匀，制成细胞悬液；
（4）将（3）步骤制得的细胞悬液接种于权利要求1所述的细胞共培养装置中，加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基，在区域Ⅰ接种一种细胞，在区域Ⅱ接种另一种细胞或按照1：1的比例接种两种细胞混合共培养，并置于37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞贴壁后将隔离圈取出，即完成牛肌细胞与脂肪细胞的共培养。
作为本发明的进一步改进，步骤（3）中的脂肪细胞有血清培养液配方为含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12培养基。
作为本发明的进一步改进，步骤（3）中的肌细胞有血清培养液配方为含20%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12培养基。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明所提供的细胞共培养装置，结构简单、制作方法简单、易操作，可同时将牛肌细胞与脂肪细胞接种于爬片及皿底区域，实现两种细胞共培养，最大程度地模拟体内微环境，以便于更好地观察细胞与细胞之间的相互作用，弥补了单层细胞培养的缺陷；
（2）本发明提供的细胞共培养装置在实现牛肌细胞与脂肪细胞直接接触共培养的同时，又可将爬片上的单类细胞（肌细胞或脂肪细胞）进行收集进行后续转录组及蛋白组的分析处理，以用来研究共培养环境下对肌细胞或脂肪细胞的作用，因此有利于进一步探究肌细胞与脂肪细胞之间的相互作用；
（3）本发明提供的牛肌细胞与脂肪细胞共培养的培养方法，通过应用所述的细胞共培养装置，用含10%胎牛血清、1%双抗（即10%青霉素/链霉素）的DMEM/F12完全培养基对牛肌细胞与脂肪细胞进行共培养，经多次观察证实用这种方法培养的肌细胞和脂肪细胞成活效率高、活力好、细胞特征明显，并与单独培养的肌细胞和脂肪细胞形态一致，是一种很好的体外研究模型，具有一定的推广研究价值。
附图说明
图1为本发明提供的牛肌细胞与脂肪细胞共培养装置的整体结构示意图；
图2为本发明提供的牛肌细胞与脂肪细胞共培养装置的侧视图；
图3为本发明提供的牛肌细胞与脂肪细胞共培养装置的俯视图（图中：FF和MM分别为单独培养体系中的脂肪细胞和肌细胞；FX和MX为共培养体系，爬片上分别为脂肪细胞和肌细胞）；
图4a、图4b分别为应用本发明共培养牛肌细胞与脂肪细胞中的脂肪细胞和单独培养的脂肪细胞的细胞形态图；
图5a、图5b分别为应用本发明共培养牛肌细胞与脂肪细胞中的肌细胞和单独培养的肌细胞的细胞形态图。
具体实施方式
本发明提供一种牛肌细胞与脂肪细胞共培养的装置及其培养方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1和图2所示，本发明所提供的一种细胞共培养装置，是由皿体1和皿盖2构成，所述皿体1为上开口的中空结构，皿体1开口处设有皿盖2，皿体1的内部设有隔离圈4，隔离圈4为上下开口的中空结构，隔离圈4将皿体1的内部分割为区域Ⅰ和区域Ⅱ，隔离圈4的内部为区域Ⅰ，隔离圈4与皿体1之间为区域Ⅱ，隔离圈4的内部设有爬片3。
所述的皿体1是横截面为直径60mm的圆柱体，隔离圈4是横截面直径为35mm的圆柱形塑料圈，由35mm细胞培养皿改造而成，主要在细胞接种后未贴壁前起到一个隔离的作用。所述的爬片3为24mm*24mm的盖玻片。
实施例2
利用实施例1所述的一种细胞共培养装置，共培养牛肌细胞与脂肪细胞的方法，其操作步骤如下：
（1）在无菌条件下，分别取牛背最长肌和肾周脂肪组织，切除可见的血管和结缔组织，用5%～10%质量百分比双抗（10%青霉素/链霉素）的1xPBS冲洗，然后将组织剪成1mm3大小的小块，备用；
（2）分别在（1）步骤中剪碎的牛背最长肌肌肉组织加入0.25％的Ⅱ型胶原酶/0.1%的Ⅱ型中性蛋白酶消化液，在（1）步骤中剪碎的肾周脂肪组织中加入0.25％的Ⅰ型胶原酶消化液，恒温振荡水浴锅37℃消化直至细浆状，得到细浆液；
（3）将（2）步骤制得的细浆液与等体积有血清培养液混合，终止消化，然后将细胞悬液通过80μm细胞筛过滤，经1200rpm/min离心10分钟，弃上清液以获得细胞沉淀，再加入适量血清培养液使细胞密度1×105～2×105/ml，吹打混匀，制成细胞悬液；其中，脂肪细胞有血清培养液配方为含10%胎牛血清、1%双抗（）的DMEM/F12培养基；肌细胞有血清培养液配方为含20%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12培养基。
（4）将（3）步骤制得的细胞悬液接种于权利要求1所述的细胞共培养装置中，加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基，在区域Ⅰ接种一种细胞，在区域Ⅱ接种另一种细胞或按照1：1的比例接种两种细胞混合共培养，并置于37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞贴壁后将隔离圈4取出，即完成牛肌细胞与脂肪细胞的共培养；
（5）取出爬片3，使用相差显微镜观察牛肌细胞与脂肪细胞形态，细胞形态结果如图4、图5所示。图4a、图4b分别为培养48小时后，共培养牛肌细胞与脂肪细胞中的脂肪细胞和单独培养的脂肪细胞的细胞形态图，分别用FX-F和FF表示；图5a、图5b分别为培养48小时后，共培养牛肌细胞与脂肪细胞中的肌细胞和单独培养的肌细胞的细胞形态图，分别用MX-M和MM表示。从图中可以明显看出，共培养的脂肪细胞（或肌细胞）和单独培养的脂肪细胞（或肌细胞）形态一致，而且细胞形态明显。
为了探究牛肌细胞与脂肪细胞之间的相互作用，本发明创新的建立起了一种体外研究模型，公开了一种细胞共培养装置，将肌细胞与脂肪细胞在同一环境下共培养，最大程度地模拟体内微环境，不仅实现了脂肪细胞与肌细胞的直接接触共培养，还可对单独的肌细胞或脂肪细胞进行收集进行后续转录组及蛋白组的分析处理，并且其结构简单制作方法简单、易操作，实用性较强，具有一定的研究推广价值。
Claims (6)
1.一种细胞共培养装置，是由皿体（1）和皿盖（2）构成，其特征在于：所述皿体（1）为上开口的中空结构，皿体（1）开口处设有皿盖（2），皿体（1）的内部设有隔离圈（4），隔离圈（4）为上下开口的中空结构，隔离圈（4）将皿体（1）的内部分割为区域Ⅰ和区域Ⅱ，隔离圈（4）的内部为区域Ⅰ，隔离圈（4）与皿体（1）之间为区域Ⅱ，隔离圈（4）的内部设有爬片（3）。
2.根据权利要求1所述的一种细胞共培养装置，其特征在于所述的皿体（1）和隔离圈（4）均为圆柱体。
3.根据权利要求2所述的一种细胞共培养装置，其特征在于所述的皿体（1）的直径60mm，隔离圈（4）的直径为35mm，爬片（3）为24mm*24mm的盖玻片。
4.利用权利要求1所述的装置共培养牛肌细胞与脂肪细胞的方法，其操作步骤如下：
（1）在无菌条件下，分别取牛背最长肌和肾周脂肪组织，切除可见的血管和结缔组织，用5%～10%质量百分比双抗的1xPBS冲洗，然后将组织剪成1mm3大小的小块，备用；
（2）分别在（1）步骤中剪碎的牛背最长肌肌肉组织加入0.25％的Ⅱ型胶原酶/0.1%的Ⅱ型中性蛋白酶消化液，在（1）步骤中剪碎的肾周脂肪组织中加入0.25％的Ⅰ型胶原酶消化液，恒温振荡水浴锅37℃消化直至细浆状，得到细浆液；
（3）将（2）步骤制得的细浆液与等体积有血清培养液混合，终止消化，然后将细胞悬液通过80μm细胞筛过滤，经1200rpm/min离心10分钟，弃上清液以获得细胞沉淀，再加入血清培养液使细胞密度1×105～2×105/ml，吹打混匀，制成细胞悬液；
（4）将（3）步骤制得的细胞悬液接种于权利要求1所述的细胞共培养装置中，加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12完全培养基，在区域Ⅰ接种一种细胞，在区域Ⅱ接种另一种细胞或按照1：1的比例接种两种细胞混合共培养，并置于37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞贴壁后将隔离圈（4）取出，即完成牛肌细胞与脂肪细胞的共培养。
5.根据权利要求1所述的共培养牛肌细胞与脂肪细胞的方法，其特征在于步骤（3）中的脂肪细胞有血清培养液配方为含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12培养基。
6.根据权利要求1所述的共培养牛肌细胞与脂肪细胞的方法，其特征在于步骤（3）中的肌细胞有血清培养液配方为含20%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12培养基。
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