CN103881908A

CN103881908A - 一种用于细胞共培养的生物反应器系统

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Publication number: CN103881908A
Application number: CN201210560038.5A
Authority: CN
Inventors: 马小军; 于炜婷; 刘洋
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明涉及一种用于细胞共培养的生物反应器系统。该生物反应器系统中含有两种或两种以上规格粒径的包埋型载体，每种粒径规格载体包埋一种细胞，将包埋有不同种类细胞的不同规格载体在同一生物反应器中培养，从而在同一体系中实现了两种或两种以上细胞在三维生长条件下的动态共培养，在培养结束后，借助粒径筛分系统分别获得包埋在不同粒径规格载体中的各种细胞。

Description

一种用于细胞共培养的生物反应器系统

技术领域

本发明涉及细胞共培养领域，具体说涉及一种体外三维非接触式共培养领域。

背景技术

随着细胞生物学的发展，人们越来越认识到不同种类细胞间相互作用的重要性。细胞间相互作用包括由细胞间直接接触以及细胞间通过化学信号配体、受体（可溶性因子）所产生的生物学效应。研究细胞间相互作用的传统方法是细胞间直接接触共培养，但这种方法的最大缺点是难以区别生物学效应的产生是由于细胞间直接接触还是化学信号（可溶性因子）传导所致，且在此体系中不同种类细胞相互混合，无法实现目的细胞的完全分离。针对此问题，有研究者发明了Transwell insert技术[参考文献：LeVisage,C;Dunham,B;Flint,P，et al..Coculture of mesenchymal stem cells andrespiratory epithelial cells to engineer a human composite respiratory mucosa，Tissue Engineering,2004,10:1426-1435]，实现了两种细胞之间的二维非接触共培养，此体系可以仅通过可溶性因子来实现细胞间的相互作用，并且两种细胞可彻底分离，但该技术的最大缺陷是无法提供能够模拟细胞在体生长状态的三维微环境，且只能实现两种细胞之间的共培养，难以实现共培养规模的放大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于细胞共培养的生物反应器系统，该生物反应器系统中含有两种或三种以上规格粒径的包埋型载体，每种粒径规格载体包埋一种细胞，不同粒径规格载体中分别包埋不同种类细胞，将包埋有不同种类细胞的不同规格载体在同一生物反应器中培养，从而在同一体系中实现了两种或三种以上细胞在三维生长条件下的动态共培养，在培养结束后，借助粒径筛分系统分别获得包埋在不同粒径规格载体中的各种细胞。

该生物反应器系统中的包埋型载体粒径规格在100μm到2000μm范围内，各规格之间平均粒径相差大于等于200μm，且每个规格的载体微球粒径偏差±50μm之内。比如：五种粒径规格分别为150±50μm，350±50μm，550±50μm，750±50μm，950±50μm等。

其中，不同粒径规格载体的制备可借助已授权专利[精密高压脉冲静电式微胶囊制备仪ZL200720014715.8]和[一种具有相同变化电场力的多通道高效电极ZL200710158289.X]来实现。

该生物反应器系统中的生物反应器可以是旋转生物反应器、流化床或固定床型生物反应器、或搅拌式生物反应器。

该生物反应器系统中的包埋型载体为海藻酸钠基的球形载体；

海藻酸钠基包括海藻酸钠，以及RGD、IKVAV、YIGSR、PEG、胶原、透明质酸、硫酸软骨素、鱼精蛋白修饰的海藻酸钠中的一种或二种以上，海藻酸钠基与二价金属离子形成的凝胶微球，即为球形载体；

或，上述凝胶微球与聚阳离子静电络合形成的微胶囊，即为球形载体。

所述二价金属离子为钙离子、钡离子、锌离子中的一种或两种以上；

所述聚阳离子为壳聚糖、聚赖氨酸、聚鸟氨酸及它们衍生物中的一种或两种以上。

将细胞包埋在海藻酸钠基球形载体中的方法是一种公知的技术，比如采用静电液滴法、气动液滴法、乳化-外部凝胶化法、乳化-内部凝胶化、膜乳化/内部凝胶化、膜乳化/外部凝胶化、微通道阵列技术、震动喷嘴技术等均可以制备出本发明所述的海藻酸钠基球形载体，为简明起见，本发明对这些公知技术不作详细描述。有关这些公知技术的详细报道可参阅：

静电液滴法[参阅文献：Hommel M,Sun AM,Goosen MFA.Dropletsgeneration.Canadian patent No.1241598,1988];

气动液滴法[参阅文献：Miyawaki O,Nakamura K,Yano T.Agric.Biol.Chem.1980,44:2865-2870];

乳化/内部凝胶化[参阅文献：刘群，马小军，刘袖洞。一种乳化/内部凝胶化制备海藻酸钙凝胶珠的方法。中国专利No.ZL01109449.4];

膜乳化/内部凝胶化[参阅文献：刘袖洞，马小军，刘群。一种制备海藻酸钙凝胶珠的膜乳化/内部凝胶化耦合技术，中国专利No.ZL01104365.2]；

乳化/外部凝胶化[参阅文献：Lucinda-silva RM,Evangelista RC.J.Microencapsulation,2003,20:145-152]

膜乳化/外部凝胶化[参阅文献：You JO,Park SB,Park HY，Haam S,Chung CH,Kim WS.J.Microencapsulation,2001,18:521-532]

海藻酸钠微胶囊[参阅文献：Ma X,Vacek I,Sun A.Artif Cells BloodSubstit Immobil Biotechnol,1994,22:43-69;参阅文献2:Mcknight C.A.,Ku A,Goosen M.F.A.,Sun D,Penney C.J BIOACT COMPAT POL,1988,3:334-355]

微通道阵列技术[参阅文献：A.M.Chuah,T.Kuroiwa,I.Kobayashi,et al.Preparation of uniformly sized alginate microspheres using the novel combinedmethods of microchannel emulsification and external gelation.Colloids andSurfaces a-Physicochemical and EngineeringAspects,2009,351(1-3):9-17]

震动喷嘴技术[参阅文献：H.H.Lee,O.J.Park,J.M.Park,et al.Continuousproduction of uniform calcium alginate beads by sound wave induced vibration.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，1996,67(3):255-259]

该生物反应器系统用于一种或两种以上基质细胞与目的细胞之间通过非直接接触方式由化学信号传递进行相互作用的不同细胞组合，通过细胞组合间的三维共培养可以相互影响细胞的增殖、凋亡、分化、细胞外泌功能中的一种或二种以上。

上述基质细胞为对目的细胞定向分化、增殖、组织化或凋亡等多种行为具有调控作用的多来源体细胞、转基因细胞或细胞株；

其中，多来源体细胞是指从动物或人的各种组织中通过分离、培养而得到的已分化成熟的细胞；转基因细胞是指导入了人工修饰基因的细胞，该细胞能够表达所修饰基因的特定功能；细胞株是指通过选择法或克隆形成法获得的具有特殊性质或标志物的克隆化细胞群；

上述目的细胞为多来源干细胞、体细胞、肿瘤细胞、转基因细胞或细胞株；

其中，多来源干细胞包括胚胎肝细胞或成体干细胞，多来源体细胞是指从动物或人的各种组织中通过分离、培养而得到的已分化成熟的细胞；转基因细胞是指导入了人工修饰基因的细胞，该细胞能够表达所修饰基因的特定功能；细胞株是指通过选择法或克隆形成法获得的具有特殊性质或标志物的克隆化细胞群。

上述基质细胞和目的细胞可以是同源同种细胞、同源异种细胞、或异源异种细胞。

该生物反应器系统中的粒径筛分系统可以是不同目数的筛网分离不同粒径规格的载体，也可以通过流化床体系，实现不同粒径规格载体的分离。

在完成细胞共培养后，可借助粒径筛分系统实现不同粒径规格微球载体的分离，从而实现不同种细胞的有效分离。其中粒径筛分系统可以是不同目数的筛网分离不同粒径规格的载体，也可以通过流化床体系实现不同粒径规格载体的分离[参阅文献：一种海藻酸钙胶珠分级的方法，中国发明专利，200810013524.9]

由此可见，本发明具有如下优点：

1、提供不同种类细胞的非直接接触空间；

2、实现不同种类细胞或组织均在三维环境中的生长；

3、不同细胞间通过化学信号传递产生生物学效应；

4、细胞间相互作用后产生的效应可以通过粒径筛分体系实现作用后不同种类细胞的分离；

5、实际应用时易于规模放大与工程化；

6、对现有细胞培养微载体或微胶囊体系的生物反应器均适用本发明的生物反应器系统，无需特殊改造。

附图说明

图1为本发明的结构示意图，其中，A-D微球粒径每组依次相差200微米。

具体实施方式

实施例1：考察软骨细胞与骨髓间充质干细胞两种细胞间的相互作用

1）从SD大鼠（4周龄）取得股骨和胫骨，用一次性注射器吸取无血清DMEM培养基冲洗骨髓腔，获得骨髓细胞，经细胞密度梯度离心法分离纯化，用含15%胎牛血清的DMEM细胞培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养传代，至第3代后，运用流式细胞仪检测细胞表面标记物进行骨髓间充质干细胞的验证；

2）从SD大鼠（4周龄）的股骨和胫骨头表面获取关节软骨，剪碎后，用2g/L的胰蛋白酶消化5hr后，再按体积比1:10加入2.5g/L的Ⅱ型胶原酶消化，获取关节软骨细胞，用含15%胎牛血清的DMEM细胞培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内进行原代培养，并运用甲苯胺蓝及苏木精/伊红染色进行关节软骨细胞的验证；

3）将关节软骨细胞以1×10⁶个/ml密度均匀分散到1.5%海藻酸钠溶液中，0.01mol/L的CaCl₂溶液作为凝胶浴，采用静电液滴法，制备出粒径为350μm包埋有关节软骨细胞的海藻酸钙微球，再与0.05%聚赖氨酸水溶液反应10min成膜，之后用55mmol/L柠檬酸钠溶液使内部液化，制备出内部为液体环境的包埋有关节软骨细胞的海藻酸钠微胶囊；

4）将第3代骨髓间充质干细胞以1×10⁶个/ml密度共同均匀分散到1.5%海藻酸钠溶液中，在0.01mol/L的CaCl₂溶液作为凝胶浴，采用静电液滴法，制备出粒径为600μm包埋有骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微球，清洗后，将微球与步骤3）制备的包埋有关节软骨细胞的海藻酸钠微胶囊用含15%胎牛血清的DMEM细胞培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内共培养；

5）培养5、10、15天后，用50目筛网将两种微球分离，350微米包埋有软骨细胞的微胶囊漏出，而600微米包埋有骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微球在筛网内，将筛网内的海藻酸钙微球用55mmol/L柠檬酸钠溶液液化，释放海藻酸钙微球中的骨髓间充质干细胞，1000rpm离心5min收集骨髓间充质干细胞，备用；

6）运用阿利新蓝比色法测定骨髓间充质干细胞氨基聚糖含量，具体操作如下：将回收的骨髓间充质干细胞用4℃预冷的PBS清洗；加入细胞裂解液，冰上裂解30min后，12000rpm离心5min；吸取上清，加入PBS至1ml；加入0.5ml5mg/L胰蛋白酶37℃水解24hr；加入0.5ml5mg/L木瓜蛋白酶37℃水解24hr，备用；氨基聚糖标准曲线绘制：加入1ml浓度为1、5、10、15、20、25、35、50mg/L的标准硫酸软骨素溶液，空白对照加入1ml去离子水，再加入1.5ml1.4g/L的阿利新蓝染液，混匀，10min后测定480nm的吸光度，绘制标准曲线；取样品1ml，加入1.5ml1.4g/L的阿利新蓝染液，混匀，10min后测定480nm的吸光度，并通过标准曲线计算出样品中氨基聚糖含量。结果提示氨基聚糖含量随着培养时间的延长而增加，说明关节软骨细胞可通过非直接接触方式诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。

实施例2：考察肿瘤细胞和成纤维细胞两种细胞与血管内皮细胞间的相互作用

1）将人胶质瘤细胞U87和人胚肺成纤维细胞HELF等比例以2×10⁶个/ml密度均匀分散到1.5%海藻酸钠溶液中，在0.01mol/L的CaCl₂溶液作为凝胶浴，采用静电液滴法，制备出粒径为200μm包埋有人胶质瘤细胞U87和人胚肺成纤维细胞HELF的海藻酸钙微球，再与0.05%（g/ml）聚赖氨酸水溶液反应10min成膜，之后用55mmol/L柠檬酸钠溶液使内部液化，制备出内部为液体环境的包埋有人胶质瘤细胞U87和人胚肺成纤维细胞HELF的海藻酸钠微胶囊；

2）将包埋有人脐静脉内皮细胞ECV304以2×10⁶个/ml密度共同均匀分散到1.5%海藻酸钠溶液中，在0.01mol/L的CaCl₂溶液作为凝胶浴，采用静电液滴法，制备出粒径为400μm包埋有人脐静脉内皮细胞ECV304的海藻酸钙微球，清洗后，与步骤1）制得的包埋有人胶质瘤细胞U87和人胚肺成纤维细胞HELF的海藻酸钠微胶囊，在含15%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内共培养；

3）培养1天和5天后，用50目筛网将两种微球分离，包埋有人胶质瘤细胞U87和人胚肺成纤维细胞HELF的海藻酸钠微胶囊从筛网漏出，包埋有人脐静脉内皮细胞ECV304的海藻酸钙微球留在筛网中，用55mmol/L柠檬酸钠溶液使海藻酸钙微球液化，释放海藻酸钙微球中的人脐静脉内皮细胞ECV304，1000rpm离心5min收集细胞ECV304，备用；

4）运用RT-PCR方法检测人脐静脉内皮细胞ECV304细胞周期素Cyclin E表达，具体操作如下：将回收的ECV304细胞用PBS清洗，采用Trizol法提取总RNA；按照试剂盒说明书进行反转录和PCR反应；上游引物：5’-CTG GAT GTT GAC TGC CTT GA-3’，下游引物：5’-CCG CTG CTCTGC TTC TTA C-3’；反应参数：95℃预变性5min，95℃变性40sec，53℃退火35sec，72℃延伸35sec，共30个循环，于72℃保温10min终止反应；反应产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行半定量分析。结果提示ECV304细胞Cyclin E表达上调，说明肿瘤细胞和成纤维细胞两种细胞共培养可通过非直接接触方式促进内皮细胞的增殖。

实施例3：非接触动态共培养诱导间充质干细胞体外三维定向分化为神经前体细胞

1）制备精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)多肽修饰的海藻酸钠。将海藻酸钠(分子量430kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)溶解于含有0.5M NaCl的0.1M2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中(pH值6.5)，得到1%(W/V)海藻酸钠溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和单一种类的多肽，室温搅拌反应24小时。EDC和海藻酸钠摩尔比为1:20，EDC和sulfo-NHS摩尔比为2:1，多肽和海藻酸钠质量比为1:1000。然后进行透析并冷冻干燥，从而得到多肽修饰的海藻酸钠。之后，将上述三种多肽修饰的海藻酸钠粉末分别溶解于生理盐水中，溶液浓度均为1.5%(W/V)，并配置体积比为1:1:1的三种多肽修饰海藻酸钠的混合溶液，混合溶液终浓度仍为1.5%(W/V)。

2）将人神经母细胞瘤细胞与1.5%(W/V)的RGD单独修饰海藻酸钠溶液混合，调整细胞密度为2×10⁶cells·mL^-1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100mmol·L^-1CaCl₂溶液中钙化20min，得到粒径600微米的海藻酸钙微胶珠。将海藻酸钙微胶珠与0.05%(W/V)的聚赖氨酸反应成膜10min，形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊，再与0.15%(W/V)海藻酸钠溶液反应5min，最后用55mmol·L^-1柠檬酸钠液化5min，就得到了包埋有人神经母细胞瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸/海藻酸钠微胶囊。将此微胶囊使用DMEM/F12培养基洗涤3次，之后按1:10的体积比(微胶囊:培养液)加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于培养箱培养3天。

3）将第5代人脐带间充质干细胞与上述1.5%(W/V)含有三种多肽的海藻酸钠混合溶液进行混合，调整细胞密度为4×106cells·mL-1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100mmol·L^-1CaCl₂溶液中钙化20min，得到含有干细胞的粒径300微米的海藻酸钙微胶珠，使用DMEM/F12培养基洗涤3次，再加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于培养箱培养3天。

4）将含有神经母细胞瘤细胞的微胶囊以及含有干细胞的微胶珠分别接种在反应器主体中，二者接种体积比例为2:1，即两种细胞接种数量之比为1:1。将两种微球在流化床生物反应器中动态共培养4天。同时设立对照组，使用含有10ng·mL^-1EGF和bFGF的DMEM/F12培养液诱导在微胶珠中三维培养的干细胞以及在培养瓶中二维培养的干细胞，培养4天。

5）动态共培养4天之后，用40目筛网将上述两种微球分离，筛网内是包埋有人神经母细胞瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸/海藻酸钠微胶囊，而包埋有人脐带间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠从筛网中漏出，收集漏出的海藻酸钙微胶珠，培养液洗涤3次后用55mmol·L^-1柠檬酸钠溶液溶解微胶珠，之后离心收获分化细胞，分析其神经前体细胞标志Nestin的基因表达以及Nestin阳性细胞的百分比，并将其接种到培养板中，贴壁后加入含有10%血清的DMEM/F12培养液，继续分化1周，通过进行β-tubulinⅢ和GFAP荧光染色来检测获得的神经前体细胞向神经元和星型胶质细胞分化的能力。结果显示，动态三维共培养获得的分化细胞与使用生长因子诱导的二维以及三维分化细胞相比，其Nestin的基因表达与阳性细胞百分比显著升高，Nestin阳性细胞百分比约为40%，并且具有向成熟神经细胞分化的能力，这说明此生物反应器系统能够显著促进干细胞向神经前体细胞分化并维持了其继续向成熟神经细胞分化的能力。

实施例4多种肝基质细胞与MSC共培养，促进MSC向肝细胞的分化

1）采用灌注结合梯度离心的方法分离大鼠原代肝实质细胞和内皮细胞等非实质细胞（方法参考“昆明医学院学报，2011,7:22-25）。

2）采用成纤维细胞原代培养法获得大鼠肝组织的成纤维细胞。

3）参考实施例1中步骤1）获得大鼠骨髓间充质干细胞。

4）将步骤1）获得的原代肝实质细胞按照实施例1步骤3）的方法，以5×10⁶/ml密度包埋在粒径为500微米的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊中。

5）将步骤1）获得的原代内皮细胞等非实质细胞，以5×10⁶/ml密度包埋在粒径为100微米的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊中。

6）将步骤2）获得的成纤维细胞，以2×10⁵/ml密度包埋在粒径为700微米的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊中。

7）将步骤3）获得的骨髓间充质干细胞，以5×10⁶/ml密度包埋在粒径为300微米的海藻酸钠微胶囊中。

8）将步骤4)、5)、6)、7）获得的四种含有不同细胞的微胶囊用含15%胎牛血清的DMEM细胞培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内共培养，四者体积比为1:1:1:1(微囊共培养示意图见附图)。

9）分别在共培养5、14、21天后，分别收集各种微胶囊，并用60目和30目两种筛网分离三种微胶囊。将在30目筛网漏出但留在60目筛网上的微胶囊收集起来，55mM柠檬酸钠液化后，分离清洗，即获得分化后的MSC。结果显示共培养5天后，长梭形的细胞突起变短、变粗，并有卵圆形细胞出现。共培养14天，细胞呈现多角形、卵圆形或圆形，共培养21天时，细胞白蛋白mRNA的表达量显著增加，甲胎蛋白mRNA的表达检测不到。结果均说明MSC分化成肝细胞。

Claims

1.一种用于细胞共培养的生物反应器系统，其特征在于：该生物反应器系统中含有两种或三种以上规格粒径的包埋型载体，每种粒径规格载体包埋一种细胞，不同粒径规格载体中分别包埋不同种类细胞，将包埋有不同种类细胞的不同规格载体在同一生物反应器中培养，从而在同一体系中实现了两种或三种以上细胞在三维生长条件下的动态共培养，在培养结束后，借助粒径筛分系统分别获得包埋在不同粒径规格载体中的各种细胞。

2.按照权利要求1所述生物反应器系统，其特征在于：所述生物反应器系统中的包埋型载体粒径规格在100μm到2000μm范围内，各规格之间平均粒径相差大于等于200μm，且每个规格的载体微球粒径偏差±50μm之内。

3.按照权利要求1所述生物反应器系统，其特征在于：所述生物反应器系统中的生物反应器可以是旋转生物反应器、流化床或固定床型生物反应器、或搅拌式生物反应器。

4.按照权利要求1所述生物反应器系统，其特征在于：所述生物反应器系统中的包埋型载体为海藻酸钠基的球形载体；

5.按照权利要求1所述生物反应器系统，其特征在于：所述生物反应器系统用于一种或两种以上基质细胞与目的细胞之间通过非直接接触方式由化学信号传递进行相互作用的不同细胞组合，通过细胞组合间的三维共培养可以相互影响细胞的增殖、凋亡、分化、细胞外泌功能中的一种或二种以上。

6.按照权利要求5所述生物反应器系统，其特征在于：所述基质细胞为对目的细胞定向分化、增殖、组织化或凋亡等多种行为具有调控作用的多来源体细胞、转基因细胞或细胞株；

所述目的细胞为多来源干细胞、体细胞、肿瘤细胞、转基因细胞或细胞株；

7.按照权利要求5所述生物反应器系统，其特征在于：所述基质细胞和目的细胞可以是同源同种细胞、同源异种细胞、或异源异种细胞。

8.按照权利要求4所述生物反应器系统，其特征在于：

9.按照权利要求1所述生物反应器系统，其特征在于：所述生物反应器系统中的粒径筛分系统可以是不同目数的筛网分离不同粒径规格的载体，也可以通过流化床体系，实现不同粒径规格载体的分离。