CN1837358A - 一种三维条件下扩增造血干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术与组织工程领域，特别涉及一种三维条件下两种细胞共培养的方法。其特征是用海藻酸钙微胶珠将滋养细胞包埋起来，然后在旋转壁式生物反应器中将包埋的滋养细胞与造血干细胞进行共同培养，收获造血干细胞与滋养细胞。本发明的效果和益处是，微胶珠的孔道可以使滋养细胞分泌的重要生长因子透过微胶珠滋养外部的造血干细胞，同时微胶珠有效地隔开了两种不同来源的细胞，不但起到免疫隔离的作用，还有利于分离、收获这两种细胞；旋转壁式生物反应器为造血干细胞提供了三维悬浮生长环境，有效降低了对造血干细胞的剪切力，有利于造血干细胞的扩增。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与组织工程领域，特别涉及一种三维条件下扩增造血干细胞的方法。
背景技术
细胞处于体内复杂的生长环境中，不同种类的细胞之间存在着重要的联系，有些细胞体外培养时在不同程度上需要依赖另外一些细胞对它们的滋养、支持作用，前者称为被滋养细胞，后者称为滋养细胞。这种滋养作用对于干细胞的体外培养来说尤为重要，如造血干细胞的体外培养。
造血干细胞在临床上有广泛的应用前景，它可以重建高剂量放化疗后病人的造血系统、进行基因治疗及免疫治疗、制备成熟血液产品等。但是在实际应用中存在造血干细胞的数量限制问题，需要大规模扩增。目前模拟体内微环境已经被认为是体外扩增造血干细胞的最佳方法。基质细胞是一类能够对造血干细胞起到滋养作用的滋养细胞，多种基质细胞系已经被用来支持造血干细胞的体外扩增。它们可以分泌多种已知的、未知的生长因子来维持和扩增造血干细胞，避免造血干细胞在体外培养过程中逐渐分化和凋亡。
在实现两种细胞共培养的手段上，大部分研究都采用了基质细胞与造血干细胞直接接触共培养的方法，即首先在培养器皿底部铺设基质细胞层，然后使用一定剂量的放射线照射基质细胞来抑制基质细胞的活性，再将造血干细胞在基质细胞层上进行培养。这种直接接触的培养方法能够支持滋养造血干细胞，促进造血干细胞的扩增，但还会使部分造血干细胞粘附在基质细胞上，不利于两种细胞的分离与收获；如果是异源的两种细胞接触，还存在免疫排斥问题。目前，体外培养的造血干细胞输入人体之前，基质细胞必须要完全与造血干细胞分离，以保证植入的生物安全性。尽管有的研究者使用小孔径的网膜等将共培养体系中的这两种细胞隔开，在一定程度上改善了细胞分离的问题，如Kawada等(Experimental Hematology，27，904，1999)使用一种多孔膜将脐带血CD34+细胞与鼠基质细胞隔开，但这两种细胞的绒毛还是能够通过多孔网膜直接接触，免疫问题还是存在。因此需要开发新的共培养中隔离异源细胞的方法。
另外，目前大多数基质细胞和造血干细胞的共培养都是在静态的培养条件下进行的，如使用孔板或培养瓶。静态培养尽管简便，但是存在以下弊端：
1)培养液缺乏有效混合而导致细胞因子等营养成分、溶解氧、代谢产物等物质以及pH值在培养基中形成浓度梯度；
2)静态培养系统的各种参数一般都难以在线监测和控制；
3)需要人工换液等操作，增加污染的危险性；
4)二维静态培养远离人体内的三维生长环境，在一定程度上易造成干/祖细胞的分化。
因此，需要发展适宜的三维动态共培养体系，来改善培养环境以制备出数量和质量均有保证的造血干细胞。经常用于基质细胞和造血干细胞共培养的灌注式(Palsson等，Bio/Technology，11，368，1993)及固定床式生物反应器(Meissner等，Cytotechnology，30，227，1999)，由于它们内部的流体剪切力较大，基质细胞和造血干细胞相互作用程度有限，扩增造血干细胞的效果不佳。
发明内容
本发明的目的是提供一种三维条件下扩增造血干细胞的方法。
本发明的技术方案包括以下步骤：
1.提供滋养细胞。取四周龄体重2.5kg左右的新西兰大白兔，注射空气法处死，取出股骨和胫骨，浸泡在75％的酒精中30分钟，转移至无菌超净台内。用骨钳剪开骨两端，PBS冲洗骨髓腔，冲出骨髓。加无血清DMEM培养基稀释，1200rpm离心10分钟。弃脂肪层，加无血清DMEM培养基稀释。然后与Ficoll细胞分离液按1∶1体积比混合，3000rpm离心30分钟。吸取界面层，加入无血清DMEM培养基清洗2次，1200rpm离心5分钟。去上清，加入含20％胎牛血清的DMEM培养基，调整细胞浓度，以5×105cells·cm-2的密度接种于培养瓶中。三天后去除悬浮细胞，每五天半量换液。当原代兔骨髓间充质干细胞在培养瓶底达到80％融合时候，加入浓度为0.05％的胰酶(含0.02％EDTA)消化，按1∶3的比例进行传代培养。
2.海藻酸钙微胶珠包埋滋养细胞。制备密度为2.5×105cells·mL-1的第四代兔骨髓间充质干细胞悬液，与1.5％的海藻酸钠溶液以1∶4体积比混合均匀，经5#针头逐滴滴加到1.5％氯化钙溶液中，不断搅拌，反应10分钟，用20目筛网过滤得到微胶珠，PBS洗涤三次，得到直径为2毫米的包埋有兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠。制备小直径的微胶珠要增加使用高压静电发生器，其制备过程如图2所示，其中，海藻酸钙微胶珠的直径大小主要由针尖直径、电压、两极间距离以及海藻酸钠液滴流速来控制。
3.分离人脐带血单个核细胞。脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次原血采集量平均为50～100mL。脐带血采集后用密度为1.077g·mL-1的Ficoll细胞分离液密度梯度离心后获得单个核细胞，Ficoll分离液与脐带血的体积比例为1∶1～1∶2。分离后的细胞用IMDM基础培养基离心洗涤两次(1000rpm，5min)，调整细胞密度备用。
4.准备旋转壁式生物反应器。旋转壁式生物反应器(rotating wall vessel，RWV)主要由两个循环回路构成：(1)培养基循环回路；(2)气体循环回路。具体地，培养基循环为：培养基通过蠕动泵11送到充氧器10中充氧，之后由RWV左端进料口进入培养室13为细胞提供养分，氧含量降低了的培养基从RWV右端出料口进入蠕动泵11，再送入充氧器10中充氧，开始下一轮循环。气体循环为：CO2培养箱8中含5％CO2和95％空气的气体由气泵9送入充氧器10中为培养基补充氧，然后返回CO2培养箱8中，不断循环。RWV主体部分充氧器10与培养室13放置在CO2培养箱8外的保温罩15中。实验之前，使用清洗剂及软刷清洗RWV的各个部件后，超纯水冲洗三遍。然后将各个部件浸泡在75％的酒精溶液中过夜，再用超纯水冲洗三遍。装配好RWV保温罩15中的主体部分，将主体部分及连接好的外管路、充氧器分别包裹并高压灭菌(121℃，30min)，烘干备用。
5.在旋转壁式生物反应器中，三维悬浮共培养海藻酸钙微胶珠包埋的滋养细胞与造血干细胞。在超净台中无菌条件下组装RWV培养系统，注满无菌PBS循环一小时，放出PBS，注入培养液，打开控制台12中的温控开关将温度控制在37℃。将密度为2～5×105cells·mL-1的人脐带血单个核细胞和海藻酸钙微胶珠包埋的滋养细胞悬液接种至RWV培养室13中，盖好保温罩15，开启蠕动泵11和气泵9。一小时后，打开控制台12中可调速电动机14的电源开关，通过调节旋钮使RWV培养室13的内外筒同方向同角速度旋转起来，此时整个系统开始工作。培养室13的转速是逐步增加的，经过3rpm一小时，5rpm十二小时，最终达到并保持在6rpm，使细胞和微胶珠充分地悬浮起来。
6.分离造血干细胞与微胶珠，收获造血干细胞。共培养结束后，用注射器抽出反应器培养室13中的悬液，将悬液滴加在高温灭菌后的20目不锈钢筛网上，筛网下方放置无菌的小烧杯。微胶珠被截留在筛网上，而造血干细胞悬液则透过筛网进入烧杯中。将烧杯中的造血干细胞悬液1000rpm离心5分钟，弃上清，加入1毫升培养液，吹打，计数，接种至培养瓶中培养。
7.溶解微胶珠，收获滋养细胞。将收获到的微胶珠用PBS冲洗三次，浸泡在浓度为55mM的柠檬酸钠溶液中，反应10分钟，1500rpm离心10分钟，弃上清，再加入1毫升培养液，吹打，计骨髓间充质干细胞数，接种至培养瓶中培养。
本发明的效果和优点是：
(1)能够使滋养细胞和造血干细胞在三维条件下进行共培养，以发挥滋养细胞对造血干细胞的滋养、支持作用。
(2)能够隔离开共培养的两种细胞以避免它们之间的免疫排斥作用，有利于共培养后这两种细胞的分离与收获。
(3)旋转壁式生物反应器显著降低了细胞生长环境的剪切力，使细胞始终处于三维动态条件下生长，提高了细胞的培养效果。
(4)利用本发明一种三维条件下扩增造血干细胞的方法，对海藻酸钙微胶珠包埋的兔骨髓间充质干细胞与人脐血造血干细胞进行了动态共培养。结果表明，这两种细胞在此培养体系中均生长良好，七天后有核细胞、CD34+细胞及粒单系祖细胞(colony-forming unit-granulocyte macrophage，CFU-GM)的扩增倍数分别可达170倍、24倍和14倍。
附图说明
图1是本发明所述的一种三维条件下扩增造血干细胞的方法操作流程图。
图2是本发明所述的一种三维条件下扩增造血干细胞的方法制备海藻酸钙微胶珠的示意图。
图3是本发明所述的一种三维条件下扩增造血干细胞的方法给细胞和微胶珠提供三维悬浮生长环境的旋转式细胞培养系统工艺流程图。
图4是本发明所述的一种三维条件下扩增造血干细胞的方法滋养细胞和造血干细胞共培养示意图。
图5是本发明所述的一种三维条件下扩增造血干细胞的方法静态条件下，海藻酸钙微胶珠(直径为2毫米)包埋小鼠神经干细胞的显微照片(A：Day 0；B：Day 9)。
图6是本发明所述的一种三维条件下扩增造血干细胞的方法静态条件下，海藻酸钙微胶珠(直径为2毫米)包埋小鼠颅骨成骨细胞的显微照片。
图7是本发明所述的一种三维条件下扩增造血干细胞的方法静态条件下，包埋兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠(直径为2毫米)和人脐带血造血干细胞共培养168hr时的显微照片(A：100×；B：200×)。
图中：1.注射器；2.烧杯；3.转子；4.铁架台；5.阳极；6.阴极；7.高压静电发生器；8.CO2培养箱；9.气泵；10.充氧器；11.蠕动泵；12.控制台；13.培养室；14.可调速电动机；15.保温罩；16.旋转式细胞培养系统培养室的外筒；17.旋转式细胞培养系统培养室的内筒；18.包埋有滋养细胞的海藻酸钙微胶珠和微胶珠外近距离相互作用的造血干细胞；19.微胶珠外的造血干细胞；20.包埋在微胶珠内的滋养细胞。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。
实施例1：
本实施例为海藻酸钙微胶珠包埋小鼠神经干细胞体外培养及鉴定。
为了验证细胞可以在海藻酸钙微胶珠中良好生长，采用直径为2毫米的海藻酸钙微胶珠包埋小鼠神经干细胞，进行体外培养与鉴定。具体地，制备第六代小鼠神经干细胞悬液，细胞总数为9×105个，细胞密度调整为4×105cells·mL-1。将此细胞悬液与1.5％海藻酸钠溶液以1∶4的体积比混合均匀(此时细胞密度为0.8×105cells·mL-1)，通过5#针头逐滴滴加到1.5％CaCl2溶液中，搅拌条件下反应10分钟，PBS洗涤三次，使用筛网过滤则得到微胶珠。将这些微胶珠平均分为三份，接种于装有3毫升培养液的培养瓶中培养。另取一份同样细胞总数的小鼠神经干细胞悬液，平均分成三份，不用微胶珠包埋，以1×105cells·mL-1的密度接种于装有3毫升培养液的培养瓶中，作为对照组进行静态培养。
培养7天以后，用55mM柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，反应10分钟，1500rpm离心10分钟，弃上清，加入1毫升培养基，吹打，计数，免疫组化鉴定。同时收获对照组的神经干细胞，消化，吹打，计数，免疫组化鉴定。
以上实验均重复三次。
实验结果：培养7天后，对照组细胞密度达2×105cells·mL-1，扩增倍数为2倍；海藻酸钙微胶珠包埋组细胞密度达1.58×105cells·mL-1，扩增倍数为1.98倍。免疫组化鉴定发现微胶珠内的神经干细胞与对照组神经干细胞一样，都能够表达Nestin，并且能够向神经元和胶质细胞分化。图5为海藻酸钙微胶珠(直径为2毫米)包埋小鼠神经干细胞的显微照片(A：Day 0；B：Day 9)。
此实施例说明：细胞在海藻酸钙微胶珠中能够良好生长；静态培养条件下，微胶珠内培养与普通培养的细胞生长情况大致相同，同时验证了海藻酸钙微胶珠的传质性能良好；由于神经干细胞对剪切力十分敏感，提示在动态条件下，微胶珠内培养细胞可能会增殖更多。
实施例2：
本实施例为海藻酸钙微胶珠包埋小鼠颅骨成骨细胞细胞时的破囊收获率。
使用直径为2毫米的海藻酸钙微胶珠包埋小鼠颅骨成骨细胞，通过柠檬酸钠溶液溶解微胶珠来确定细胞的收获率。具体地，将1毫升密度为6×105cells·mL-1小鼠颅骨成骨细胞与4毫升1.5％海藻酸钠溶液混合均匀，通过5#针头逐滴滴加到1.5％CaCl2溶液中，搅拌条件下反应10分钟，PBS洗涤三次。加入55mM柠檬酸钠溶液作用10分钟，1500rpm离心10分钟，弃上清，加入1毫升培养基，吹打，计数，计算细胞收获率。
以上实验重复三次。
实验结果：三次实验所得细胞收获率分别为86.7％，79.2％，96.4％，平均收获率达到87.4％。此实施例说明：采用柠檬酸钠溶解微胶珠收获细胞的方法是可行的；在细胞共培养后，可以通过该方法收获大部分的滋养细胞。图6为海藻酸钙微胶珠(直径为2毫米)包埋小鼠颅骨成骨细胞的显微照片。
实施例3：
本实施例为人脐带血造血干细胞在旋转壁式生物反应器内的培养。
为了验证RWV培养系统能够培养对生长环境较敏感的干细胞，本实施例使用人脐带血造血干细胞在RWV培养系统内进行培养。
人脐带血单个核细胞的分离：脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次原血采集量平均为50～100mL。脐带血采集后用密度为1.077g·mL-1的Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心(2500r/min，25min)，离心获得单个核细胞(含有1％左右的CD34+细胞)后用IMDM基础培养基离心洗涤两次(1000rpmin，5min)备用。
实验前生物反应器的准备：使用清洗剂及软刷清洗RWV的各个部件后，超纯水冲洗三遍。将各个部件浸泡在75％的酒精溶液中过夜，再用超纯水冲洗三遍。装配好RWV的主体部分，将主体部分及连接好的外管路、充氧器分别包裹并高压灭菌(121℃，30min)，烘干备用。
造血干细胞在反应器内的接种及培养：打开温控开关，将保温罩内RWV主体部分温度控制在37℃，人脐带血单个核细胞以2×105cells·mL-1的密度接种于RWV培养室内，开启蠕动泵和气泵。培养液以IMDM为基础培养基，添加10％胎牛血清、10％马血清及下列生长因子：SCF 16ng·mL-1，FL 7.47ng·mL-1，TPO7.47ng·mL-1，IL-3 5.33ng·mL-1，G-CSF 3.33ng·mL-1，GM-CSF 2.13ng·mL-1。反应器的培养室转速经由0rpm一小时，3rpm一小时，5rpm十二小时后，保持在6rpm。
培养7天，每天取样计有核细胞数，分别在0hr，144hr及197hr进行CD34+细胞流式细胞仪分析以及集落形成(colony-forming unit-granulocyte/macrophage，CFU-GM)能力检测。当检测到培养体系中有核细胞数达到或超过1.5×106cells·mL-1时，抽取部分细胞悬液，同时补加新鲜培养液，使体系中的有核细胞密度不超过这个数值。取出的细胞同样认为仍在反应器中生长，计入扩增倍数。
培养结果：人脐带血造血干细胞在RWV培养系统内三维悬浮培养7天后，有核细胞扩增了400多倍，CD34+细胞扩增了30多倍，CFU-GM祖细胞扩增了20多倍。
此实施例说明：旋转壁式生物反应器能够给造血干细胞提供优良的三维悬浮生长环境，促进了造血干细胞的扩增；使用此反应器体外培养目的细胞是可行的。
实施例4：
本实施例为海藻酸钙微胶珠包埋兔骨髓间充质干细胞静态条件下支持、滋养人脐带血造血干细胞的体外扩增。
为了验证海藻酸钙微胶珠包埋的滋养细胞能够对外部的造血干细胞起到支持、滋养的作用，将海藻酸钙微胶珠包埋的兔骨髓间充质干细胞与人脐带血造血干细胞在六孔培养板中静态条件下进行了共培养。
兔骨髓间充质干细胞的分离和培养：取四周龄体重2.5kg左右的新西兰大白兔，注射空气法处死，取出股骨和胫骨，浸泡在75％的酒精中30分钟，转移至无菌超净台内。用骨钳剪开骨两端，PBS冲洗骨髓腔，冲出骨髓。加无血清DMEM培养基稀释，1200rpm离心10分钟。弃脂肪层，加无血清DMEM培养基稀释。然后与Ficoll细胞分离液按1∶1体积比混合，3000rpm离心30分钟。吸取界面层，加入无血清DMEM培养基清洗2次，1200rpm离心5分钟。去上清，加入含20％胎牛血清的DMEM培养基，调整细胞浓度，以5×105cells·cm-2的密度接种于培养瓶中。三天后去除悬浮细胞，每五天半量换液。当原代兔骨髓间充质干细胞在培养瓶底达到80％融合时候，加入浓度为0.05％的胰酶(含0.02％EDTA)消化，按1∶3的比例进行传代培养。
海藻酸钙微胶珠包埋兔骨髓间充质干细胞：制备密度为2.5×105cells·mL-1的第四代兔骨髓间充质干细胞悬液，与1.5％的海藻酸钠溶液以1∶4体积比混合均匀，经5#针头逐滴滴加到1.5％氯化钙溶液中，不断搅拌，反应10分钟，用筛网过滤得到微胶珠，PBS洗涤三次，得到直径为2毫米的包埋有兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠。
人脐带血单个核细胞的分离：同实施例3。
六孔培养板中兔骨髓间充质干细胞与人脐带血单个核细胞共培养：将包埋兔骨髓间充质干细胞的微胶珠按每孔30个分配于6孔培养板中与密度为3×105cells·mL-1的人脐带血单个核细胞混合，置在37℃，5％ CO2培养箱中培养。培养液以IMDM为基础培养基，添加20％FBS，并补充下列低剂量的生长因子，SCF 16ng·mL-1，FL 7.47ng·mL-1，TPO 7.47ng·mL-1，IL-3 5.33ng·mL-1，G-CSF3.33ng·mL-1，GM-CSF 2.13ng·mL-1。
初始时微胶珠包埋的兔骨髓间充质干细胞与微胶珠外人脐带血单个核细胞数量之比约为4∶100，即间充质干细胞与CD34+细胞之比约为4∶1(初始时CD34+细胞约占单个核细胞的1％)，每孔添加2mL培养液。每天换液10％，计有核细胞密度，并分别在0hr，72hr，120hr以及168hr进行CD34+细胞流式细胞仪分析及CFU-GM集落检测。
培养结果：在七天的培养过程中，共培养体系中有核细胞、CD34+细胞以及CFU-GM扩增倍数分别达到9倍、20倍和9倍。图7为此共培养体系培养至168hr时的显微照片(A：100×；B：200×)。
此实施例说明：海藻酸钙微胶珠是一种有效的细胞共培养手段，能够起到免疫隔离的作用，并且有利于共培养后间充质干细胞和造血干细胞的分离；包埋在微胶珠中的兔骨髓间充质干细胞能够在体外静态条件下有效地支持人脐带血造血干/祖细胞的扩增，说明使用微胶珠包埋滋养细胞并没有阻碍这种滋养作用；如果配合RWV培养系统的三维悬浮生长环境，微胶珠包埋滋养细胞将能够更好地支持、滋养造血干细胞的体外扩增。
实施例5：
本实施例为海藻酸钙微胶珠包埋兔骨髓间充质干细胞动态条件下支持、滋养人脐带血造血干细胞的体外扩增。
为了验证海藻酸钙微胶珠包埋的滋养细胞能够对外部的造血干细胞起到支持、滋养的作用，将海藻酸钙微胶珠包埋的兔骨髓间充质干细胞与人脐带血造血干细胞在旋转壁式生物反应器内动态条件下进行了共培养。
兔骨髓间充质干细胞的分离和培养：同实施例4。
海藻酸钙微胶珠包埋兔骨髓间充质干细胞：同实施例4。
人脐带血单个核细胞的分离：同实施例3。
实验前生物反应器的准备：同实施例3。
旋转壁式生物反应器内兔骨髓间充质干细胞与人脐带血单个核细胞共培养：打开温控开关控制保温罩内RWV主体部分温度在37℃，将450个包埋兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠与密度为3×105cells·mL-1人脐带血单个核细胞接种于RWV培养室内，开启蠕动泵和气泵。培养液以IMDM为基础培养基，添加下列生长因子：SCF 16ng·mL-1，FL 7.47ng·mL-1，TPO 7.47ng·mL-1，IL-35.33ng·mL-1，G-CSF 3.33ng·mL-1，GM-CSF 2.13ng·mL-1。反应器的培养室转速经由0rpm一小时，3rpm一小时，5rpm十二小时后，保持在6rpm。
培养7天，每天取样计有核细胞数，分别在0hr，144hr及197hr进行CD34+细胞流式细胞仪分析以及CFU-GM检测。当检测到培养体系中有核细胞数达到或超过1.5×106cells·mL-1时，抽取部分细胞悬液，同时补加新鲜培养液，使体系中的有核细胞密度不超过这个数值。取出的细胞同样认为仍在反应器中生长，计入扩增倍数。共培养结束后，分离造血细胞和微胶珠。再将包埋兔骨髓间充质干细胞的微胶珠用PBS冲洗三次，浸泡在55mM的柠檬酸钠溶液中，反应10分钟，收获兔骨髓间充质干细胞，接种至培养瓶中培养。
培养结果：在七天的培养过程中，共培养体系中有核细胞、CD34+细胞以及CFU-GM扩增倍数分别达到170倍、24倍和14倍。滋养细胞——兔骨髓间充质干细胞破囊收获率达到约90％。
此实施例说明：在旋转壁式生物反应器中包埋在海藻酸钙微胶珠中的兔间充质干细胞有效地滋养、支持了造血干细胞的体外扩增。尽管本实施例中造血干细胞的扩增倍数不及实施例3中的高，但本实施例中使用包埋滋养细胞替代了动物血清，更加靠近临床，更加具有医学价值。
尽管本发明是以兔骨髓间充质干细胞滋养人脐带血来源的造血干细胞为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，其它种类的滋养细胞、被滋养细胞以及实施例的其他变形，对于本领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。
Claims (1)
1.一种三维条件下扩增造血干细胞的方法，其特征在于以下步骤：
(1)提供滋养细胞：滋养细胞为兔股骨与胫骨骨髓间充质干细胞，以5×105cells·cm-2的密度接种于含20％胎牛血清的DMEM培养基中培养，当细胞在培养瓶底达70％融合时，加入含0.02％EDTA浓度为0.05％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行常规传代培养；
(2)海藻酸钙微胶珠包埋滋养细胞：采用1.5％海藻酸钠溶液与密度为2.5×105cells·mL-1的滋养细胞悬液以4∶1体积比混合后，经5#针头逐滴滴加至1.5％氯化钙溶液中，反应10分钟，20目筛网过滤制得直径为2毫米的包埋有滋养细胞的海藻酸钙微胶珠；
(3)分离人脐带血单个核细胞：脐带血来自健康产妇足月分娩和足月剖腹产婴儿，每次原血采集量平均为50～100mL，密度梯度离心分离得到单个核细胞，用IMDM基础培养基1000rpm，5min离心洗涤两次，调整细胞密度备用；
(4)准备旋转壁式生物反应器：旋转壁式生物反应器采用申请号为CN200310105054.6、公开(公告)号为CN1542122的旋转式细胞培养系统；
(5)在旋转壁式生物反应器中，三维悬浮共培养海藻酸钙微胶珠包埋的滋养细胞与造血干细胞：旋转壁式生物反应器培养室的内外筒同方向同角速度旋转，转速从静止逐步增加，经过0rpm一小时、3rpm一小时和5rpm十二小时后，最终达到并保持在6rpm；人脐带血单个核细胞在RWV培养室中的接种密度为2～5×105cells·mL-1；
(6)分离造血干细胞与微胶珠，收获造血干细胞：采用20目不锈钢筛网截留包埋骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠，收集滤过液——造血干细胞悬液，1000rpm离心5分钟，收获造血干细胞；
(7)溶解微胶珠，收获滋养细胞：采用浓度为55mM的柠檬酸钠溶液溶解包埋有滋养细胞的海藻酸钙微胶珠10分钟，1500rpm离心10分钟，收获滋养细胞。
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