CN1271198C - 旋转式细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

旋转式细胞培养系统属于生物技术领域，特别涉及一种用于动物细胞大规模培养系统。本发明的技术特征是包括旋转式细胞培养反应器、培养基充氧器、培养基外循环系统及电控制系统，具有渗透供氧及反应器内外两个转筒均可单独连续调速、可同向或反向旋转，可连续或间歇换液，可在CO₂培养箱外操作等优点，有效地克服了现有生物反应器内细胞所受剪切力大、细胞生长环境不稳定及反应器须放在CO₂培养箱内操作等技术的不足。本发明的效果和益处是可使成骨细胞及造血干细胞在此系统中良好生长，十天后细胞的扩增倍数分别可达到二十三倍和四十九倍，适合细胞的大规模培养。

Description

旋转式细胞培养系统

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于动物细胞大规模培养的旋转式细胞培养系统。

背景技术

迄今为止，动物细胞培养可分为静态的二维培养和动态的三维培养两种方式。前者主要适用于实验室小规模研究使用，而大规模培养动物细胞必须依靠三维条件下的生物技术。传统的细胞培养系统主要包括气升式、搅拌式等，这些种类的培养系统主要问题在于，细胞在反应器内所受到的流体剪切力较大，使得对剪切力很敏感的细胞极易受到损坏，特别是各种干细胞更是如此。因此，干细胞等对剪切力极为敏感的细胞就难以在这些传统的细胞培养系统内得以大规模培养和扩增。

1991年美国的Schwarz等人首次发明了旋转式细胞培养技术。该技术是使反应器的外筒不断转动而使被培养的动物细胞悬浮于两个同心套筒之间，细胞代谢所需要的氧气由附加了硅胶膜的内筒提供。由于该技术不使用搅拌器械或直接通入气泡，因而可以大大减小反应器内流体的剪切力。但近十年来，这种细胞培养系统主要是用于微重力条件下动物细胞培养方法的研究，而用于地面上细胞培养的旋转式生物反应器一般均只有外筒而无内筒，因而反应器内的流体剪切力不均匀且难以调整。

1999年美国Leonid Margolis等人以及2002年K，Nakamura等人都发明了内外筒均具备且均可旋转的、放在CO₂培养箱内操作的生物反应器，2002年Vellinger也公开了类似的技术。至此，目前已有的旋转式细胞培养系统可分为间歇式和连续式换液两种类型。但他们所采用的间歇式换液是每隔一定时间将细胞与培养基分离开，置换新的培养基，因此存在操作污染且细胞生长环境不稳定等缺点，不利于细胞的生长；即使是连续式换液装置也仍须放在CO₂培养箱内操作，这也难以实现细胞的大规模培养。

发明内容

本发明的目的是提供一种全功能的旋转式细胞培养系统。它主要包括旋转式生物反应器、培养基充氧器、培养基外循环系统及电控制系统，具有渗透供氧及反应器内外两个转筒均单独连续调速、同向或反向旋转，连续或间歇换液，在CO₂培养箱外操作等优点。降低了细胞生长环境的剪切力，提高了物质传递效率，有效地克服了现有生物反应器内细胞所受剪切力大、细胞生长环境不稳定及反应器须放在CO₂培养箱内操作等技术的不足。实现了在普通实验室内就可进行三维细胞组织的大规模培养，并提高了细胞培养的效果。

实现本发明的技术方案为：

(1)细胞生长所需要的CO₂浓度为5％、温度为37℃的气体由CO₂培养箱引出，进入培养基充氧器，由美国Cole-Parmer公司生产的Platinum-CuredReinforced Silicone透氧管渗透到培养基中。

(2)旋转式生物反应器培养室的内外转筒均由可调速电动机经齿轮传动来带动，由电控制系统随时调控其转速及方向。

(3)反应器只有培养室的外筒采用透明且耐高温的聚碳酸酯材料，其余部分采用不锈钢材料。

(4)培养室外筒壁上开有一个直径为2mm的排气孔；外筒的法兰上有一个与培养室相通的、且与外筒壁上的排气孔呈180°的直径为2mm的培养物进样孔。

(5)内筒的中间处不连通，在这不连通处的两侧，内筒壁上开有呈对称分布的8个直径为1.5mm的孔，孔的表面覆盖一层亲水微滤膜。

(6)反应器的密封系统采用硅橡胶O型环和轴承为动密封。

(7)在反应器出料口与蠕动泵入口之间依次设有一个废液出口三通和一个新鲜培养基入口三通。

(8)培养基充氧器、旋转式生物反应器、新鲜培养基罐、废液罐及部分管线置于保温罩内，由电控制系统将保温罩内的温度控制在37℃。

本发明的效果和优点是：(1)反应器的内外筒均可旋转，显著降低了细胞生长环境的剪切力，对剪切力极为敏感的动物细胞的培养非常适用，同时细胞始终处于三维条件下生长，提高了细胞的培养效果；(2)可随时观察到培养室内培养物的生长情况，并可随时将培养基中出现的气泡由排气孔排出，避免因气泡及气泡破碎对细胞造成损伤；(3)内筒不完全连通及内筒壁上的亲水微滤膜既可防止气泡进入，又可保证培养基养分通入及细胞代谢废物排出，同时还可保证细胞不被培养基带走，而始终停留在培养室中增殖生长；(4)培养室的细胞培养空间相当于约800-1000个培养瓶的培养能力，实现了大规模培养。

(5)整个系统可置于CO₂培养箱外操作，方便易行。

利用本发明的旋转式细胞培养系统，对成骨细胞及造血干细胞进行了三维培养。结果表明，这三种细胞在此系统内均可以良好生长，十天后的扩增倍数分别可达到二十三倍和四十九倍。

附图说明

附图1是本发明所述的旋转式细胞培养系统的工艺流程图。图1中：1.CO₂培养箱；2.控制台；3.蠕动泵；4.空气泵；5.培养基充氧器；6.进液三通阀；7.排液三通阀；8.过滤器；9.新鲜培养基罐；10.废液罐；11.反应器支架；12.反应器；13.加热器；14.齿轮；15.可调速电动机；16.底座；17、保温罩。

附图2是本发明所述的旋转式细胞培养系统的反应器结构示意图。图2中：14.齿轮；18.培养基进料口；19.填料箱A；20.O型环；21.聚四氟乙烯密封压盖；22.填料压盖；23.空心轴A；24.轴承座A；25.O型环；26.轴承A；27.轴承B；28.轴承座B；29.填料箱B；30.O型环；31.垫片；32.螺栓；33.外筒；34.排气孔；35.内筒；36.填料箱C；37.空心轴B；38.培养基出料口；39.培养物进样孔。

附图3是本发明所述的旋转式细胞培养系统内筒结构示意图。图3中：40.O型圈；41.直径为1.5mm的孔；42.亲水微滤膜。A-A、B-B分别为内筒壁上直径为1.5mm的孔在不同方向的截面示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，详细叙述本发明的技术方案。

本系统工作前，先将反应器12拆卸下来，用洗涤剂及软刷将各部件清洗干净，再用超纯水冲洗15-20min。然后用超纯水浸泡12hr，捞出并晾干，用70-75％的乙醇溶液浸泡24hr后晾干并安装好(各个部件之间安装得不要太紧以备高温灭菌)，与相应的连接硅橡胶管线及其它附件分别用不同的高温灭菌布包好后，一起放入高温灭菌器中，在121℃下灭菌20min。取出上述三个布包，放入干燥箱60℃下干燥。待其完全干燥并冷却后，在超净工作台上将反应器上架，将各部件紧密连接好，然后按流程安装该旋转式细胞培养系统。安装完毕后，用PBS无菌溶液充满整个回路并循环2-3hr。之后排出PBS无菌溶液，注入培养基。细胞由培养物进样孔39注入培养室内。待整个回路充满培养基后，盖好保温罩17，打开控制台2中控制风扇、加热器13以及可调速电动机15的电源开关，同时开启蠕动泵3和空气泵4，并通过调节旋钮使反应器内外筒均以适当的转速旋转起来(约10rpm左右)，此时整个系统开始工作。

工作时，培养基经蠕动泵3进入培养基充氧器5进行充氧，而后到达培养基进料口18，进入反应器12。在反应器12中，培养基经过左侧的空心轴A23，进入培养室内筒35不连通处的左侧，透过这一侧的小孔41及亲水微滤膜42进入培养室外筒33，然后经内筒35右侧的亲水微滤膜42和小孔41进入到内筒不连通处的右侧，再经右侧的空心轴B37由培养基出料口38进入蠕动泵。然后再进入培养基充氧器5进行充氧，开始下一轮循环。

在此过程中，对于细胞生长所需要的培养基，可以连续置换，也可间歇置换，具体情况视细胞的成活与生长情况而定。若换液太快，细胞会因生长环境不稳定而死亡或扩增不明显；若换液间隔时间太长，细胞就会因得不到足够的养分而死亡或扩增不明显，最后都会导致细胞培养及扩增失败。由此可见，在细胞的培养过程中，必须熟悉细胞的各种习性，熟练掌握该旋转式细胞培养系统的工作原理及操作的关键，才能确保细胞的成活及实现大规模培养。

实施例1：

本实施例为成骨细胞在本系统内的微载体培养结果。

种子细胞的准备：无菌条件下取新生3天的SD大鼠的颅盖骨，放入盛有缓冲液的培养皿中，去除骨膜及结缔组织，反复冲洗。将洗净的颅盖骨片置于培养皿中，加入0.25％的胰蛋白酶溶液，在37℃条件下恒温消化15-20min。再用1mg/mlII型胶原酶溶液在37℃条件下消化颅盖骨片90min。使细胞从骨基质中解离出来。将消化液移至离心管中并离心10min(1000rpm)以沉淀细胞。弃去上清夜，用RPMI1640培养液将沉淀物洗涤两次。再吹打骨块，以获得更多的成骨细胞。重复离心过程，沉淀细胞，制成细胞悬液。将细胞接种于培养瓶，差速粘附2次以纯化细胞。将接种好细胞的培养瓶放入CO₂培养箱内培养。

微载体的选取与准备：微载体的视密度应尽可能接近培养基的密度，以使其更好地悬浮于反应器内。采用的微载体为内心塑料外层玻璃的Bioglass型和Cytodex系列，其密度为1030kg/m³，粒径在100-200微米。在对原代成骨细胞做第一次传代时，先将灭菌处理的10μg微载体注入培养瓶，再将细胞接种在微载体的表面，制成细胞/微载体/培养液均匀混合而成的工作液。

成骨细胞在培养室内的接种及培养操作：将反应器灭好菌并按流程将系统连接好后，用PBS无菌溶液充满整个系统并循环1-2hr，排出PBS无菌溶液。然后将细胞/微载体/培养液均匀混合而成的工作液用注射器慢慢注入培养室，再将培养室中剩余的空间用培养液灌满。培养室内，细胞的初始接种密度为2×10⁴cells/ml。注意，在该过程中，培养室内不能有气泡，如有气泡，应及时去除，否则会对细胞造成损伤。之后开启控温、通气和内外筒转速的控制按钮，并调整内外筒的转速使培养室内微载体均匀悬浮。初始转速为10rpm，培养后期由于微载体上附着了更多的细胞使其尺寸变大，需要将转速加大到13-15rpm。培养液更换采用间歇式换液，自种入细胞24小时后，每48小时更换约1/3体积的培养液。

培养结果：成骨细胞在本旋转式细胞培养系统内连续培养10天后，细胞从初始的1.8×10⁶cells/ml扩增到4.2×10⁷cells/ml。细胞经碱性磷酸酶ALP检验均为正常成骨细胞。

实施例2：

本实施例为造血干细胞在本系统内的培养结果。

脐血造血干细胞的制备：脐血标本取自正常分娩足月儿的胎盘组织，以采血针从脐静脉取血约60-80ml，注入肝素抗凝的离心管中。然后将脐血用等体积的IMDM培养基稀释均匀，离心沉降弃去含脂肪的混浊液，再以IMDM稀释。然后吸取细胞悬液，沿管壁小心加入到等体积的淋巴细胞分离液液面上，以1500rpm离心20min后，收集白细胞层，再加入IMDM液反复洗涤，再以1000rpm离心10min。之后应用免疫磁株法分离纯化脐血CD₃₄ ⁺造血干细胞。

使用IMDM培养基在24孔板中进行培养，添加20％胎牛血清和细胞因子，每孔1ml，接种密度5×10⁵cells/ml，放入CO₂培养箱中培养，每48小时换半量培养基。

造血干细胞在培养室内的接种及培养操作：将反应器灭好菌并按流程将系统连接好后，用PBS无菌溶液充满整个系统并循环1-2hr，排出PBS无菌溶液。然后CD₃₄ ⁺细胞以1.1×10⁵cells/ml的密度接种于本生物反应器的培养室内。培养基为IMDM，添加的细胞因子包括干细胞因子SCF，白细胞介素IL-3，IL-6，粒-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF，促红细胞生成素EPO及flt-3配体FL。反应器内、外筒转速均为10rpm，培养液更换采用间歇式换液，自种入细胞24小时后，每48小时更换约1/2体积的培养液。

培养结果：CD₃₄ ⁺细胞在本旋转式细胞培养系统内悬浮培养15天后，CD₃₄ ⁺细胞扩增到5.4×10⁶cells/ml，扩增倍数达到49倍。

Claims (2)

1、一种旋转式细胞培养系统，主要包括旋转式生物反应器(12)、培养基充氧器(5)、培养基外循环系统及电控制系统(2)，其特征在于：

(1)细胞生长所需要的CO₂浓度为5％、温度为37℃的气体由CO₂培养箱(1)引出，进入培养基充氧器(5)，由透氧管渗透到培养基中；

(2)旋转式生物反应器培养室的内筒(35)和外筒(33)均由可调速电动机(15)经齿轮(14)传动来带动，由电控制系统(2)随时调控其转速及方向；

(3)在反应器(12)的出料口(38)与蠕动泵(3)入口之间依次设有一个废液出口三通(7)和一个新鲜培养基入口三通(6)；

(4)培养基充氧器(5)、旋转式生物反应器(12)、新鲜培养基罐(9)、废液罐(10)及部分管线置于保温罩(17)内，由电控制系统控制罩内温度为37℃；

(5)整个系统放在CO₂培养箱外操作，连续换液或间歇换液。

2、根据权利要求1所述的一种旋转式细胞培养系统，其特征还在于：

(1)旋转式生物反应器(12)培养室的外筒壁上开有一个直径为2mm的排气孔；外筒(33)的法兰上有一个与培养室相通的、且与外筒壁上的排气孔(34)呈180°的直径为2mm的培养物进样孔(39)；

(2)旋转式生物反应器(12)培养室内筒(35)的中间处不连通，在这不连通处的两侧，内筒壁上开有呈对称分布的8个直径为1.5mm的孔(41)，孔的表面覆盖一层亲水微滤膜(42)；

(3)反应器(12)采用硅橡胶O型环(20)和(25)及轴承(26)和(27)为动密封；

(4)反应器(12)的进料口(18)与出料口(38)固定不动。

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