CN101880629A - 旋转式组织应力培养系统及方法 - Google Patents

Abstract

一种旋转式组织应力培养系统及方法，包括支架，支架上安装有培养液瓶、多岐接头、氧交换器、去泡器、恒流泵、培养液压力室、多通道旋转接头、转瓶机、蠕动泵、废液瓶、转瓶液压室、单通道旋转接头、控制单元，多岐接头分别连接培养液瓶、氧交换器和废液瓶，多通道旋转接头内部设有多条通路，多通道旋转接头侧壁上的两个连接口接出两条管路，第一条管路连接多岐接头第二阀门进口，第二条管路与培养液压力室下端连接，第二条管路上设有种子细胞注入口；转瓶机两端分别设有顶盖和底盖，转瓶机顶盖与多通道旋转接头连接，转瓶机底盖与单通道旋转接头连接，转瓶液压室与单通道旋转接头连接，控制单元控制信号分别与转瓶机、蠕动泵、恒流泵、电磁阀连接。

Description

旋转式组织应力培养系统及方法

 

技术领域

本发明涉及生物组织工程，尤其涉及一种旋转式旋转式组织应力培养系统及方法，该系统设有一个培养室，可用于培养三维组织。

 

背景技术

近年来，旋转生物反应器系统（RCCS）已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体。至今，近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。

RCCS具有一定局限性。首先，RCCS的结构设计和工作原理决定了其培养对象只能是各相同性的组织和器官，如软骨、肝、肺及肿瘤等，且所培养的组织体积有限制。其次，RCCS可以选择的支架材料有限，只能选择一些质地较轻的物质，如聚合物、胶原等，较重的支架材料，如羟基磷灰石、钛合金等不能用于该系统的培养。最后，用RCCS进行较长时间的工程化组织和器官培养，其中细胞能否长期保证其表型和分化特征，以及培养“成熟”的组织和器官植入体内的营养、血供等问题都有待解决，并且RCCS中培养的组织是不能形成血管的。

 

发明内容

本发明的目的是提供旋转式组织应力培养系统，该系统对于各相异性的组织和器官的培养提供了一个微重力环境，几乎任何材料都可以作为RTSCS的支架材料，可以建立一个血管网络，作为组织培养的营养供给，它可以模仿真正的血管，并可以将不同的种子细胞种植到血管网络的不同位置。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种旋转式组织应力培养系统，包括支架，支架上安装有培养液瓶、多岐接头、氧交换器、去泡器、恒流泵、培养液压力室、多通道旋转接头、转瓶机、蠕动泵、废液瓶、转瓶液压室、单通道旋转接头、控制单元，所述多岐接头有三个阀门称为第一阀门、第二阀门和第三阀门，所述第二阀门的进口连接第三阀门的进口，所述第二阀门的出口连接第一阀门的出口并且同时连接到所述氧交换器，所述第一阀门的进口连接所述培养液瓶，所述第三阀门的出口连接所述废液瓶，所述氧交换器通过底部管路从去泡器的顶部接入去泡器，所述去泡器的底部通过恒流泵与培养液压力室连接；所述多通道旋转接头内部设有多条通路，每条通路在多通道旋转接头的一个端面和侧壁上设有对应的连接口，其中，所述多通道旋转接头侧壁上的两个连接口接出两条管路，第一条管路通过电子压力表连接到多岐接头的第二阀门的进口上，第二条管路通过另一个电子压力表、电磁阀与培养液压力室下端连接，在第二条管路上设有种子细胞注入口；所述转瓶机两端分别设有顶盖和底盖，转瓶机顶盖与多通道旋转接头连接，所述转瓶机底盖与单通道旋转接头连接，转瓶机内为一个空腔，空腔内设置有培养室，所述培养室通过密封环与多通道旋转接头主通路连接；所述转瓶液压室与单通道旋转接头连接，所述控制单元控制信号分别与转瓶机、蠕动泵、恒流泵、电磁阀连接。

所述支架包括一块平板，在平板一边折弯形成90度形成一块竖直的平板，所述支架平板上设有吊臂。

所述多通道旋转接头侧壁上另有两个连接口连接一个管路，所述管路置入蠕动泵，所述管路上设有种子细胞注入口。

所述氧交换器的顶部设有风扇，所述氧交换器的底部为漏斗形。

所述去泡器顶部设有密封盖，所述密封盖设有两个开口，一个开口为与氧交换器连接导管的入口，所述导管底部横向弯折；另一个开口与一个阀门连接，所述阀门连接一个滤膜；所述去泡器上标有刻度，所述去泡器的底部为漏斗形。

所述培养液压力室内壁为光滑圆柱形，顶部设有密封盖，所述密封盖下部连接一根弹簧，弹簧底部连接一个活塞，培养液压力室的底部为漏斗形。

所述转瓶液压室顶部设有设有排气口，排气口上设有一个顶部阀门，所述顶部阀门为排气阀门；在转瓶液压室侧面设有高低两处开口，两个开口上分别设有阀门，所述高处开口为转瓶液输入端，所述低处开口与单通道旋转接头连接；所述转瓶液压室内部设有一个活塞，所述活塞与螺杆连接，所述螺杆套有可旋转的螺母，所述螺母设置在液压室底部。

一种旋转式组织应力培养方法：包括将一个制作好的培养室放入转瓶机；将胶原加壳聚糖、胶原加粘多糖胶支架原材料灌注到培养室内；转瓶机开始转动，将种子细胞从种子细胞注入口注入；开启蠕动泵；其特征在于；所述方法还包括从转瓶液压力室通过单通道旋转接头向转瓶机的空腔内中注入转瓶液，转瓶液将培养室托住，使培养室处于悬浮状态。

本发明与已有技术相比具有如下优点：

l、本发明对于各相异性的组织和器官的培养提供了一个微重力环境。

2、本发明对支架材料的选择不受材料比重的限制，几乎任何材料都可以作为RTSCS的支架材料。

3、本发明可以建立一个血管网络，作为组织培养的营养供给，它可以模仿真正的血管，并可以将不同的种子细胞种植到血管网络的不同位置。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的描述。

 

附图说明

图1为本发明实施例一的结构示意图；

图2为本发明实施例一的转瓶机底座右视图；

图3为本发明实施例一的培养室结构意图；

图4为本发明实施例一的多通道旋转接头端部视图。

 

具体实施方式

实施例1:

一种旋转式组织应力培养系统(RTSCS)的实施例，参见图1和图2，包括支架1，支架上安装有培养液瓶2、多岐接头3、氧交换器4、去泡器5、恒流泵6、培养液压力室7、多通道旋转接头8、转瓶机9、蠕动泵10、废液瓶11、转瓶液压室12、单通道旋转接头13、控制单元14，所述多岐接头有三个阀门称为第一阀门301、第二阀门302和第三阀门303，所述第二阀门的进口连接第三阀门的进口，所述第二阀门的出口连接第一阀门的出口并且同时连接到所述氧交换器，所述第一阀门的进口连接所述培养液瓶，所述第三阀门的出口连接所述废液瓶，所述氧交换器通过底部管路从去泡器的顶部接入去泡器，所述去泡器的底部通过恒流泵与培养液压力室连接，所述氧交换器通过底部管路从去泡器的顶部接入去泡器，所述去泡器的底部通过恒流泵与培养液压力室连接；所述多通道旋转接头内部设有多条通路，每条通路在多通道旋转接头的一个端面和侧壁上设有对应的连接口，其中，所述多通道旋转接头侧壁上的两个连接口接出两条管路，第一条管路802通过电子压力表16连接到多岐接头的第二阀门的进口上，第二条管路801通过另一个电子压力表、电磁阀17与培养液压力室下端连接，在第二条管路上设有种子细胞注入口8011；所述转瓶机两端分别设有顶盖901和底盖902，转瓶机顶盖与多通道旋转接头螺接，所述转瓶机底盖与单通道旋转接头螺接，转瓶机内为一个空腔，空腔内设置有培养室15，所述培养室通过密封环18与多通道旋转接头主通路连接；所述转瓶液压室与单通道旋转接头连接，所述控制单元控制信号分别与转瓶机、蠕动泵、恒流泵、电磁阀连接，所述蠕动泵、恒流泵、电磁阀、电子压力表、多岐接头均为公知技术，在这里不在赘述。

所述支架包括一块平板101，在平板一边折弯形成90度形成一块竖直的平板102，转瓶机安装在竖直的平板上，支架可以耐受灭菌条件。所述支架平板上设有吊臂103，所述吊臂用于吊起转瓶机。

通过打开第一阀门301、第三阀门303，关闭第二阀门302，即可加入培养液和排出废液。关闭301、303，打开302，即可进行自我循环。系统的阀门应可以在正压和负压下依然具有良好的密闭性。

所述培养液瓶顶部设有密封盖201，所述密封盖上设有两个连接口202，一个连接口用于向培养液瓶中加入液体，另一个连接口用于在加入液体时排气，所述两个连接口分别连接滤膜19，所述连接滤膜的通道嵌有一个卡钳20，卡钳为一长条形铁片制成，可以固定滤膜，防止滤膜脱落。所述密封盖上设有导管插口203，所述导管插口下端连接伸入到瓶底的不锈钢管204。图中示意的上部的滤膜用于向培养液瓶中加入液体过滤，下部的滤膜用于在加入液体时排气过滤，因为此时阀门301、303是关闭的。

所述氧交换器的顶部设有风扇401，在清洗或对氧交换器进行灭菌时可取下。氧交换器是薄壁硅管筒，由于在培养液流通时，会使氧交换器内的压力小于外部的大气压，所以氧交换器要能够承受一定的压力差，不能因外部压力大于内部压力而塌陷，同时又不能让外部气泡进入内部。氧交换器入口位于氧交换器上部，氧交换器底部为漏斗形，出口位于漏斗的底部，这样可以使进入的细胞随培养液流出，而不至于沉入死角。

所述去泡器顶部设有密封盖501，所述密封盖设有两个开口，一个开口为导管的入口502，所述导管底部横向弯折，并伸入液面以下，有利于气泡和细胞的分离；另一个开口503与一个阀门504连接，所述阀门连接一个滤膜。种子细胞注入的体积会使去泡器的液面升高，升高的液面使气体在此排出；所述去泡器上标有刻度；所述去泡器的底部为漏斗形，去泡器可180°旋转；去泡器出口位于漏斗的底部，这样可以使进入的细胞随培养液流出，而不至于沉入死角。由于RTSCS的脉动流系统流速非常大，可能会接近器官的血流量，所以去泡器的深度要足够分离气体。去泡器内部可能会小于大气压，去泡器需要可以承受一定的压力。

在这里值得说明的是，在将去泡器顶部阀门关闭的过程中，由于恒流泵造成的去泡器和氧交换器内部压力小于大气压，如果这个压力差过大的话，就会使气体从氧交换器的薄壁硅管中进入循环通路中，并进入去泡器。在进行液体更换时，会关闭去泡器顶部的阀门，所以要注意恒流泵的速率。在进行自我循环时，也可以关闭去泡器顶部的阀门，当一定量气体由氧交换器进入后，会进入去泡器上部，这样就减小了氧交换器内部与外部的气压差，直到停止气体进入。这种情况是不利于系统脉动流模拟的稳定性的，所以对氧交换器的要求是要耐受负压。

所述培养液压力室内壁为光滑圆柱形，顶部设有密封盖701，密封盖旋紧就可以密封，以防止污染原进入。所述密封盖下部连接一根弹簧702，弹簧底部连接一个活塞703，活塞上部是空气，活塞下部是流通的培养液。当弹簧被活塞压缩到一定位置的时候，就可以达到实验需要的培养液的压力。弹簧应选择行程较长，劲度系数较小的弹簧，当弹簧被压缩到一半行程时可以达到理想压力即可。弹簧的进度系数和压力室的内径要精确，以便计算造成弹簧弹性形变的培养液体积。培养液压力室的底部为漏斗形，入口704位于漏斗的顶部，出口705位于漏斗的底部，这样可以使进入的细胞随培养液流出压力室，而不至于沉入死角。所述培养液压力室可180°旋转。

所述多通道旋转接头一端设有吊环805，所述多通道旋转接头侧壁上另有两个连接口803、804连接一个管路，所述管路置入蠕动泵，所述管路上设有种子细胞注入口25。所述多通道旋转接头为现有产品，其原理在这里就不在赘述。

所述转瓶机顶盖901中央与多通道旋转接头连接并设有密封垫圈，所述转瓶机底盖902中央与单通道旋转接头连接并设有密封垫圈，所述转瓶机壁与转瓶机顶、底盖螺接并设有密封垫圈，所述转瓶机顶盖上设有排气螺丝903，所述转瓶机内壁上设有与转轴平行的长条凸起904；所述单通道旋转接头上设有转瓶机齿轮905，所述转瓶机底盖内部设有驱动电机，所述驱动电机906与转瓶机齿轮连接，控制单元控制信号通过控制转瓶机的驱动电机驱动转瓶机工作。

所述转瓶机底座24为两端高出的底座，参见图3，所述转瓶机底座高出的两端中央设有凹槽2401，所述凹槽的中央设有小凹槽2402；所述转瓶机底座上对应所述转瓶机顶盖、底盖的位置分别设有两个滚轮凹槽2403，所述滚轮凹槽处均设有滚轮2404，所述滚轮承受转瓶的重量，这样可以减少旋转接头的磨损。所述滚轮与滚轮凹槽底部有空隙，防止异物掉入将滚轮卡死。实际尺寸的转瓶机的内部空间为一个半径10厘米，高20厘米的圆柱空腔，那么它的容积为6280毫升，重量至少为6千克。滚轮外部为橡胶，内部可以为滚针轴承，阻力和震动非常小，不会影响转瓶的转动。所述转瓶机底座内部中央设有测水平器2405，所述转瓶机通过转瓶机底座安装在支架上。

所述转瓶液压室顶部设有设有排气口，排气口上设有一个顶部阀门1201，所述顶部阀门为排气阀门；在转瓶液压室侧面设有高低两个开口1202和1203，两个开口上分别设有阀门，所述高处开口为转瓶液输入端，在本实施例中输入端连接漏斗1207，所述低处开口与单通道旋转接头连接；所述单通道旋转接头内部设计既可以使连接部分转动，又可以形成通道，使培养液能在容器转动时出入容器，进行循环。所述转瓶液压室内部设有一个活塞1204，所述活塞与螺杆1205连接，所述螺杆套有可旋转的螺母1206，所述螺母铆定在液压室底部，旋转此螺母可以将活塞拉出和推入，以通过液体对转瓶施加压力。而螺杆不旋转，可以减小活塞的磨损。

所述废液瓶顶部设有密封盖1101，所述密封盖设有导管插口1102和滤膜接口1103，所述废液瓶底部设有排液阀门1104，所述滤膜结构与同去泡器上的滤膜结构相同，在这里不在赘述。

实施例中的培养液瓶2、多岐接头3、氧交换器4、去泡器5、恒流泵6、培养液压力室7、多通道旋转接头8、转瓶机9、蠕动泵10、废液瓶11、转瓶液压室12、单通道旋转接头13都是实验室的标准设备，而通过本实施例的组合连接形成了一种性能极佳的组织培养营养供给的旋转式组织应力培养系统。

在试验过程中，所述培养室外部设有纸支架21，所述培养室内部设有支架材料22，所述培养室口径处设有多通道旋转接头8，所述培养室口径处与多通道旋转接头通过密封环连接。

所述培养室内部设有管网状的支架材料，所述培养室的内壁设有铆定结构，所述铆定结构的俯视图为圆形，所述支架材料可铆定于内壁，这些管网状的支架材料为细胞接种提供一个特定的三维空间。培养室将内部培养组织与转瓶液隔离。

所述支架由四部分拼合而成：两个近似半圆形底部、左半部分、右半部分。它们通过连接处设计的凹凸结构来牢固连接。

所述多通道旋转接头的内部主通路上设有若干通道在多通道旋转接头内部形成管网状结构。

培养室顶部插入多通道旋转接头中，培养室底部连有管网状支架材料。外部套有培养室。多通道旋转接头的每一个通道都有数字标记，便于查找。另外多通道旋转接头通道的排列也不是完全对称的，这便于对通道序号的查找。

用注射器将种子细胞由细胞接种管25注入。每一个循环通路都可以有多个细胞接种管，细胞接种管通过一个阀门与连接导管相通。实验员根据需要，在系统组装时配置一定数量的细胞接种管。

所述蠕动泵使用转臂上的滑轮来压迫导管，转臂由电机驱动，当转臂旋转时，导管的压迫处会移动并推动导管中的液体。滑轮与导管之间只有滚动摩擦，不发生相对摩擦。控制台可以对蠕动泵进行转速调节，保证培养液能正常循环。

所述恒流泵是支架材料管内循环通路的动力来源，它将培养液注入培养液压力室，维持培养液压力室内部一定的压力。恒流泵下游与培养液压力室的压力相同，上游为大气压。培养液压力室内培养液的增减会被去泡器内的培养液所补偿，以保证流动惯量容积。由于RTSCS的脉动流系统流速非常大，可能会接近器官的血流量，所以需要一个大功率恒流泵来维持培养液压力室的压力。

在这里值得说明的是，在将去泡器顶部阀门关闭的过程中，由于恒流泵造成的去泡器和氧交换器内部压力小于大气压，如果这个压力差过大的话，就会使气体从氧交换器的薄壁硅管中进入循环通路中，并进入去泡器。所以在进行液体更换时，要注意恒流泵的速率。系统使用两个恒流泵，如果其中一个停止工作，那么控制台会识别到其转速为0，立即开启警示灯并按相同的速率启动另一个恒流泵。

所述控制单元包括UPS电源，控制的项目有：转瓶机转速、蠕动泵转速、恒流泵转速、电磁阀开闭频率。在系统部件运转不正常的条件下，控制台会自动启用备用部件并发出警示灯和声音。控制台不能放入CO2培养箱内，与系统支架连接的扁形电缆可很轻易地穿过CO2培养箱的密封条。UPS电源可以防止意外断电的发生，由于电机消耗的功率不会很大，所以UPS电源可以在停电的情况下保持系统运转至少30小时。

本实施例旋转式组织应力培养系统的工作原理是：

1、顺次连接系统各装置，将一个制作好的培养室放入转瓶机；

2、将胶原加壳聚糖、胶原加粘多糖胶支架原材料灌注到培养室内；

3、将多通道旋转转接头放入培养室口径，并用密封环密封，将一个纸支架套在培养室外；

4、将多通道旋转接头固定在转瓶机顶盖上，并将顶盖固定在转瓶机上，此时排气螺丝尚未拧上；

5、用吊臂吊起多通道旋转接头的吊环，使转瓶机倾斜一定的角度，从转瓶液压力室的漏斗中通过单通道旋转接头向转瓶机的空腔内中注入转瓶液，注意转瓶液不要溢出，转瓶液将培养室托住，使培养室处于悬浮状态；

6、通过培养液顶部的滤膜加入培养液，使培养液压力室、去泡器、氧交换器的底部朝上，将第一阀门301、第三阀门303开启，第二阀门302关闭，电磁阀一直处于打开状态，开启恒流泵，培养液会最先注满氧交换器，这时轻弹氧交换器，使气泡上升，去泡器不能填满，当液体充满去泡器体积3分之2时，将去泡器倒过来，培养液压力室的做法与氧交换器相同，待水从801流入转瓶内时，关闭恒流泵，将倒置的部件正过来；

7、待纸支架泡软后，将转瓶机直立放在转瓶机直立放置底座上，卸下转瓶机顶盖，用镊子取出纸支架，在将转瓶机顶盖固定在转瓶机上，将转瓶机放置在倾斜放置在转瓶机底座上，待转瓶液注满后，拧紧排气螺丝，将转瓶机水平放置；

8、开启电磁阀，转瓶机开始转动，将种子细胞从种子细胞注入口注入，同时开启蠕动泵；

9、待组织培养结束后，取出培养室中的组织，进行检测。

具体步骤如下：

步骤一、设计培养室的形状和结构、培养室的支架材料铆定槽和转接头

培养室是由耐低温硅橡胶制成的透明的培养室，在外面可观察到内部培养情况。培养室与转瓶同步旋转，该培养室的外形和体积不会影响到其在转瓶中的旋转。培养室可看做由三部分组成，即喇叭状开口部、桶状的连接部和袋状的部分。前二者长度和口径是不变的，后者根据所培养组织的形状而做相应的设计。

培养室的连接部为圆桶状，其长度应为：多通道旋转接头插入转接头后，从转接头底部到套在多通道旋转接头上的密封环的距离。其内径应为多通道旋转接头的外径，所述多通道旋转接头和转接头的外径相同。通过在相应位置套两个“螺口式密封环”并旋紧螺丝将接口处密封，使培养室内部完全与转瓶机内的液体隔绝，杜绝了来自转瓶液的污染。

如果观察到两个密封环之间的这段培养室膨胀或收缩，说明转接头与多通道旋转接头的连接已经不能完全密封。不过，根据培养的要求，连接处的压力差可能不会很大，几乎为0，所以无需更换，并且不会对培养过程造成任何影响。如果即将胀破，则整个实验需要重新开始。所以转接头和多通道旋转接头的连接一定要精密。

无论是用于器官构建，还是单纯地培养血管，都首先要利用培养室作为模具来制作一整块血管支架材料，所制作的支架材料将与培养室内壁和转接头底部牢固接合。下一步，支架材料会被雕刻成管网状空间结构，类似生物体的血管网络，这个空间结构的99%由管结构连接而成，并保留有一些必要的，起连接作用的材料。它们互相支持，同一通路的管路内部相通。进而可以在支架材料内、外有计划地种植不同类型的细胞。

培养室的另一重要作用就是传递应力。转瓶液压室可对转瓶机内的转瓶液进行吸取和加入，即对转瓶机造成负压和正压。由于培养室具有弹性且其内部为恒定的大气压，所以在负压下培养室膨胀，正压下培养室收缩。而其外形和结构上特殊的设计将会影响到其在转瓶机内正、负压下不同部位的伸缩率，从而影响应力传递的方向性和分布。

1、培养室内壁和接口处设计

培养室内壁应被设计成一定的铆定结构，其目的就是将经过冷冻干燥法制备的支架材料铆定在培养室内壁，转瓶机内的负压会保持培养室一定的形状，从而撑起支架材料，使支架材料保持一定的形状而不致塌陷。这种铆定结构可以为丁字形突起。

铆定结构的设计首要考虑的就是连接的牢固性，要能够承受一定强度的拉力，在制作工艺上应该不会有什么问题。至于培养器官上皮的形成和培养室的剥离在培养后期将是可以做到的事情。铆定在培养室内壁上的支架材料有一定厚度，到了培养后期，这一厚度将一直变薄，直到细胞与培养室接触。而硅橡胶这类物质会促进细胞分泌物质，形成包膜。所以在设计培养室的铆定结构的厚度时，应考虑到其降解速率。

开口处的一段桶形培养室无需凹陷。喇叭形的开口的长度2厘米即可，直径为桶形培养室直径的1.5倍，其在组装系统时有排除气泡的作用。

2、转接头设计

转接头的作用不容忽视：（1）牢固地拉住支架管网络，防止与转接头相连的支架材料发生脱落；（2）在制作工艺和系统组装上提供极大便利；（3）在转瓶机转速发生变化时提供一定的扭力；（4）培养液灌注和种子细胞灌注的通道。

当转接头插入多通道旋转接头即可以密封，使管道中的培养液不会泄露，管外的液体也不会进入造成污染。

转接头的上部的一段是实心的。当外部套有培养室时，在实心处需要套一个密封环以达到密封作用，密封环由螺丝锁紧，实心可以防止密封环的压力而变形。

与血管支架材料连接端的设计非常关键，一定要可以牢固地拉住血管支架材料。培养后形成的血管是套在此接口处的，血管具有弹性，而流动的培养液具有一定压力，很容易造成血管脱落。所以要设计一定的铆定结构，防止脱落发生。参见图4，其结构为，连接通道包围有一圈外壁，这圈外壁与连接通道有一定间隔。这圈外壁上有许多穿孔，穿孔将支架材料铆定于转接头内，不会脱落。在灌注支架材料后，需要将气体用离心机甩出去，孔2301就是个排气孔。

还有一点就是对转接头材料的性能要求，其需要可以耐受-40度低温，即冻干成形制备过程中的最低温度。

3、用于培养血管的培养室设计

其培养室可以被设计成白炽灯泡状，内部可容纳单条或多条血管的折返回路。

与RCCS不同之处是，RTSCS的灌流入口与出口被设计在同一侧，这是考虑到生物某些器官的动脉与静脉相互靠近，而不是在两端。在目前的血管组织工程培养中，血管是直的。而通过RTSCS培养出的血管既可以是任意弧度的。并且血管的弧度不会显著地增加脉动流的阻力，只要将转弯处的血管支架材料口径增大即可。前种方法与培养器官的支架材料设计理念不同，后者是模仿真实的器官，设大量的毛细血管和血窦，从而减小循环阻力，好比为了防洪而将大河引出分支河流。

4、用于培养器官的培养室设计

如果所培养的器官用于移植，那么它的形状最好与生物体自身的器官相同。首先根据原器官外形来设计培养室的形状，这将决定培养出的器官的形状。由于培养室使用弹性材料，在转瓶机负压下会发生一定膨胀，而由培养室培养出的器官体积不能超过原始器官的体积。所以培养室的外形应与原始器官相同，而体积应为原始器官的五分之四。比例稍小的移植物一般不会影响到功能的发挥，此外，器官在受体内会进行自我增生来进行功能补偿。

培养室的整体形状应与原始器官外形相同，如果是部分器官移植就应与部分器官外形相同。在这里，最好的办法就是通过对原始器官进行断层扫描，计算机建模分析，对于器官的大小、组成部分、血管分布等情况有明确的了解。而开发相应的软件也是必须的，它将在支架材料的管网络设计和数控超声聚焦刀切割中发挥作用。

对于应力培养的特殊要求，首先要决定应力的方向和作用范围。如果是整体应力，那么培养室的厚度就是均匀的。如果需要局部的、特定方向的应力，则可以对培养室的不同部位的材料厚度和成分进行调整，以使其在不同负压或正压下，不同部位的伸缩率有差异，这将造成局部应力增加，增加的局部应力会传给内部培养的组织。例如需要对一段韧带沿纵轴方向施加张应力，那么可以将培养室设计成杆形，使杆两端的厚度相对变薄，当转瓶机内负压增大时，杆两端便会牵拉内部的韧带做伸长运动，硅橡胶的弹性极好。

选择好培养室的形状后，就需要选定与桶状接口的连接位置，这需要注意的是，排气口必须位于培养室的最高点，以便离心可以将气体挤出。

步骤二、培养室制备和培养室的纸支架制做

1、培养室制作

在确定培养室的三维模型后，制造商会根据提供的三维模型来设计模具，一般通过模压工艺制成。为满足冷冻干燥法制备血管支架材料的低温（-40度甚至更低）需求以及观察需要，培养室的材料采用无细胞毒性的透明的耐低温硅橡胶。例如美国道康宁公司的硅弹性体透明度可达94%，而成都森发橡塑有限公司的耐低温硅橡胶性能也可满足实验要求。普通种类的硅橡胶已经被实验证明无细胞毒性。

硅橡胶所需性能：低温、高透明度，应力分布均匀。

2、纸支架制作

要求如下：

（1）在整个实验中需要一个纸做的支架来保持培养室的形状，其内部的空间与培养室相同。这个纸支架可以对折，可以很容易地取出和放入培养室。其底部是平的，可以独立放在桌子上。

（2）在纸支架的内部空间中，应留有两个密封环的凹槽，可以将密封环的方位固定。并留有孔隙可以伸入螺丝刀。此凹槽的位置应正好在多通道旋转接头和转接头固定密封环的相应位置，以方便实验操作。

（3）纸支架由四部分拼合而成：两个近似半圆形底部、左半部分、右半部分。它们通过连接处设计的凹凸结构来牢固连接。

（4）另外，纸支架要做得尽可能薄，在浸入水中后应变得稍软。其至少可以耐受10分钟的水浸，但不能使纸支架中的污物溶解到水中，或是纸支架在水中分解。

（5）纸支架的外直径要小于转瓶机的内径，保证纸支架可放入转瓶机内。

（6）纸支架要高于转瓶3厘米，这是为了在转接头插入多通道旋转接头后拧紧密封环，这需要将纸支架的两个近似半圆形的底部加厚。

（7）纸支架的开口应与培养室的开口齐平，并且很容易被弯下。

以上要求在纸支架的使用和系统组装的过程中是必须的。纸这种材料可以满足实验的所有要求，经济且易成形。纸对超声焦点刀的影响要比其他材料小，且纸可以耐低温和辐射，支架材料的灭菌用钴60照射12小时。

步骤三、用培养室做模具灌注支架材料原料、离心法去除培养室内的气体

1、一种支架材料的制作方法称为“模具浇铸冻干成形技术”。目前血管组织工程制备血管支架采用“夹心法”，即用一只管子套住另一支管子，在两个管壁的中间灌注支架原材料，然后冻干成形。这样一次只能做一段血管且血管壁较厚（2毫米）。本方法依然采用“夹心法”，不同之处是成形后的支架材料不是管状的，而是一个与培养室形状相同的块状支架材料，就是说还不能用于细胞接种。它需要在计算机控制下，利用超声焦点刀将模块切割成复杂的血管网络方可用于细胞接种。

（1）对制成的培养室用乙醇进行漂洗以去除有害物质，干燥备用。

（2）配制一定体积的胶原加壳聚糖、胶原加粘多糖胶冻状支架原材料。

（3）先将培养室套上两个密封环，再放入纸支架中，将每个密封环与纸支架的密封环凹槽处对齐，使密封环的螺丝对准纸支架的螺丝刀插入孔。然后将配好的支架原材料倒入培养室中，直到没过转接头的安装位置即可（离心后支架材料的液面会下降）。放入离心机时，应使出气孔置于内侧。

（4）置于离心机中离心，低速离心即可将气体挤出。打开培养室的纸支架，透过透明的培养室观察气体是否被排出。如果没有排出，则再一次离心。

（5）再按上述方法添加一次支架原材料，离心，使离心后支架原材料的液面没过转接头的接口位置。

（6）在插入转接头之前，先标记转接头的方位，可以在纸支架上标记两个通道的序号。以便在转接头和多通道旋转接头连接的时候对齐。在使用超声聚焦刀对支架材料进行雕刻前，方位的确定也是必须的。

（7）用完全灭菌的镊子按照标记的方位将转接头插入，使其底部到达培养室柱形通道的底部，密封环固定。在这里，当转接头插到柱形通道的底部时会被丁字形突起的内壁铆定结构阻挡，而不能继续伸入。这时的支架原材料应被转接头挤出，液面应没过转接头的通道。

（8）进行离心。

（9）离心后，一定要使支架原材料的液面没过转接头的通道，这可以证明内部充满了支架原材料，没有气体。同时，要用目测。

（10）填充完毕，置于-20度冰箱中，均匀冷冻24小时。

步骤四、将支架材料置于序列冻干机中冷冻

冷冻干燥技术是医药和食品工业中常用的制备方法。通过冷冻干燥的过程可以制备具有高互穿性的开放多微孔结构。

其基本原理为：将聚合物溶液或凝胶在低温下进行冷冻，溶剂结晶形成冰晶，在低于冰点的温度下抽真空，溶剂升华后形成多孔结构。水在这里起到制孔剂的作用，形成的冰晶成为多孔结构的形状模板。支架的多孔状结构主要由所形成的冰晶的形状和大小决定，而冷冻的温度对冰晶的大小和形状起到决定性的作用。通过降低冷冻的温度，提高冷冻的速度可以得到孔径较小的支架。耐低温硅橡胶最低可以耐受-70度，可以选择不同性能的硅橡胶制作培养室。

冻干成形的实验方法各有差异，在这里只举一例：

1、将纸支架从-20度冰箱取出，置于真空序列冻干机中冻干。

2、程序设定为：-40度24h，-20度24h，0度24h，20度24h。

步骤五、将培养液通过离心法注回培养室内，使其充满支架材料，再插入密封塞

在使用超声聚焦刀对支架材料整体模块进行切割时，需要一个水环境。水可以导热，防止材料被产生的高温烧焦。交联在一起的支架材料在超声作用下下会解交联，成为单分子，水本身又是这些单分子的良好溶剂。

1、注水的实验步骤与“步骤三”类似，依然要求培养室内不能存有气体，由于培养室内部空间充满了支架材料，水只能倒在出口处。先将培养液到至培养室喇叭形开口以下，然后用手持纸支架的中部，手臂伸直，做钟摆样摆动，利用动作产生的离心力使水进入培养室内。重复操作，直至水不能再被甩进。

2、用上述方法将水灌入培养室后，就可以用离心方法将气泡排除。此步骤需要重复多次才可以将培养室完全填满水。也要注意离心转速不能太大，否则支架材料会被离心力撕裂。

3、添水结束后，用密封盖塞住接口处。首先将水填满开口处，用完全灭菌的镊子将密封盖倾斜地浸入开口的水中，排除密封盖下部的气泡，伸入到一定位置。密封环固定。

步骤六、使用数控超声聚焦刀将支架材料模块切割成适于细胞贴附的管网络

超声波具有如下特性：（1）超声波可在气体、液体、固体、固熔体等介质中有效传播。（2）超声波可传递很强的能量。（3）超声波会产生反射、干涉、叠加和共振现象。（4）超声波在液体介质中传播时，可在界面上产生强烈的冲击和空化现象。

经过冻干成型技术制作的支架材料主要是由胶原单分子经过非共价交联聚合而成。而这种交联在超声作用下可发生解交联。超声波具有四大效应：机械效应（剪切大分子）、空化作用、热效应、化学效应。空化作用是当超声波在液体中传播时，由于液体微粒的剧烈振动，会在液体内部产生小空洞，这些小空洞迅速胀大和闭合，会使液体微粒之间发生猛烈的撞击作用（机械效应），从而产生几千到上万个大气压的压强。微粒间这种剧烈的相互作用，会使液体的温度骤然升高（热效应），高温起到了很好的搅拌作用，从而使两种不相溶的液体（如水和油）发生乳化，并加速溶质的溶解，加速化学反应（化学效应）。

超声聚焦刀就是把许多束效应微弱的超声波相交到一个点，在这个点的超声效应非常强，从而达到切割支架材料模块的作用。

对超声聚焦刀和数控设备的要求是：1）精度高，最好可以达到微米级。2）焦点小，利于高精度和高质量雕刻。3）具有可以实时定位支架材料内部结构的功能，可以是超声定位。这可以防止由于支架材料自身的位置变动，和因外界的位置变动造成的雕刻不准确。4）可以长时间工作。5）可以根据计算机建立的模型来进行雕刻。

几种提高雕刻速度的方法：1）在高压下雕刻，这样可以提高水的沸点，升高超声焦点的温度。2）可以在“步骤五”中灌入的水中加入促进解交联的试剂。3）可以通过蛋白质工程，制造出某种高热不稳定的胶原，但这可能会影响到细胞的贴附和降解速率。

实验概要：

1、在雕刻过程中要注意对培养室的降温，以防止支架材料发生不必要的高温分解。

2、切割会使培养室失去内部支架材料的支撑，从而变形。密封盖可以防止水溢出，在纸支架的协助下，培养室仍可以保持一定的形状，便于切割。

3、将包着纸支架的培养室放在数控超声聚焦刀的工作台上或者通过密封盖上的把手悬空，利用设计好的软件对其进行自动切割。超声聚焦刀带有超声定位功能，可以探测所切割物体的内部结构，已达到切割相对位置的精确。

4、按照设计好的程序对支架材料进行切割。

首先确定转接头的方位，然后按照设计好的程序进行切割。切割应由下至上，因为切割会产生小的支架材料碎削，向下沉，由下向上切割不会受到这些碎削的干扰；温度较高的液体处于切割面，温度较低的液体处于下方，防止了对流造成的支架材料的扰动，影响切割精度。此外，由于培养室内部密闭着水，水就可以起到内压的作用，以抵消培养室失去支架材料支撑所产生的塌陷。

步骤七、器官管网络的计算机建模与处理

对于形成毛细血管和血窦位置应设计特别的空间。对于将来诱导腺上皮特别的，利于诱导因子到达位置的管路。对于需要细胞复合不同次序接种的，应留有空间。

1、构建器官的血管三维网络模型。一般通过高分辨率断层扫描，再合成三维图像，然后提取血管网络和所有其他的管路网络，如腺腔网络、血窦网络、微结构网络。

2、对提取的血管网络进行逐级简化处理。包括：减小血管网络分布密度，以适应切割条件、培养条件和培养方案。

在简化处理过程中就会发现，越来越多的管状支架材料将失去支持而在一定空间内摆动。为了保证切割后血管网络中每条管路相对位置的稳定性，在简化过程中，应保证简化后的血管网络的管路之间仍可以互相支持，自身维持空间上的稳定。并可以对某些管路进行管壁厚度口径的调整。必要时可以留有用于连接的非管状支架材料，但它们不易过多，培养室内的任何地方都会成为种子细胞的贴附位点，所以培养室内部空间的所有贴附位点都应该是有用的，并有利于组织结构的形成。一定要避免无用的贴附位点的设计。

3、对简化后真实的血管网络进形管壁厚度和管径的调整，以适应血管的培养。对需要促使某些结构发生的地方应增加特别的空间，以适应细胞接种、组织培养和细胞自发形成一定结构，比如毛细血管和血窦。

4、管路设计的核心思想就是，在血管网络形成后，血管网络内的培养液不再渗透到管外的空间，所以接种到管外空间的细胞完全依靠紧贴的血管组织汲取养分以生存和增殖。所以在管路设计中，要利于接种到管外的细胞贴附到微血管和血窦处，以汲取养分；也要利于所培养组织自动形成新的血管和血窦。

5、靠近转接头处的管路设计：此处应仅仅雕刻出供培养液出入的管内腔，而保留原始的支架材料模块，以增加此处的强度。并保证细胞不会很早地侵入到转接头的铆定结构，并降解那里的支架材料；否则，此处支架材料的连接将容易脱落。

6、培养血管网络需要将不同类型细胞接种于支架材料的内壁、外壁及外壁之间的空间。多通道旋转接头提供了多灌注通道，即可进行管网络的管内循环和管网络的管外循环，这就为接种创造了条件。而在支架材料的切割设计时，应考虑到外部循环的循环方向问题，使外部循环尽可能全面。所以外部循环中，种子细胞的进入端不能单一，可以添加一个通到培养室底部的支架管路，使其到达培养室最深部，并带有喷泉状分支，这样利于细胞分布。

7、在构建复杂组织过程中，需要多条灌注通路将不同种的细胞按不同的时间和空间顺序接种。例如，需要将血管内皮细胞接种到管腔内而将血管平滑肌细胞和肌细胞接种到管腔外。为满足此需求，需设计双灌注通路，以创造不同的循环路径，使种子细胞可以分布到支架管网络的管内空间和管外空间。

参见图2，为典型双灌注通路，其中一条为封闭循环，种子细胞由801注入，从管进入支架管网络中的管腔内，贴附于支架管路的内壁；而802为流出管，其中可能含有未贴附的种子细胞，进行重复循环。而另一条为开放循环，种子细胞由803进入管网络中，由于此灌注通路开放与培养室内部空间，种子细胞可以在此空间中扩散，并贴附在血管支架材料的外壁。未贴附的种子细胞进入804管，重复循环。

8、在简化处理后的模型上添加额外的管路，为的是建立新的灌注通道，以接种特殊的种子细胞。如建立生成腺腔的管路，需要通路的末端是封闭的。

9、如果以上方案不能解决细胞接种的时间和空间顺序问题，RTSCS还可以添加额外的通路，并据此对管网络模型进行修改。根据实验要求，还可将上述方案简化。

10、支架管网络的设计是一件颇有挑战性的工作，它涉及到局部解剖学、流体力学、生物力学、血液动力学等许多知识，没有缺陷的设计将决定器官培养的成败。

优良的设计可以具有如下优点：1）使灌入的种子细胞均匀扩散到支架管网络中，并很好地贴附在支架材料上。2）使如此大的组织可以很好的养分供给，可比真正的血管网络。3）促进自发形成微结构，如毛细血管和血窦。4）防止血栓的形成等等。

11、铆定在培养室上的支架材料厚度与降解。

这一层支架材料应一直保持到培养末期才被完全降解，就是说它的降解时间要可以持续几个月甚至更长时间，细胞通常会先降解与其相接触的支架材料。所以这一层材料的厚度很重要。细胞会一直贴附在这一层材料上，并通过这层材料的支撑维持一个应力均匀分布的环境。

12、在管网络中起支撑作用的支架材料的厚度与降解。

这类结构从靠近培养室的那层支架材料起始，犹如血管网络布满培养室内部空间一样，这类支撑材料也要连接所有的血管网络，以维持血管网络在空间的相对位置保持不变。这类支撑材料同时也为管外循环的细胞提供了附着空间，会随着贴附细胞的增多而被逐渐降解，所以其降解时间非常重要，如果提早降解，则可能造成支架管网络内部空间上的混乱，从而影响循环和下一步细胞接种。如果细胞已经填充满这些支撑材料，而支撑材料还远不能被彻底降解，这将会影响到细胞分泌自身的ECM（细胞外基质），并影响到细胞自发形成微结构，包括血管，血窦，结缔组织等。

13、血管管网络的管径、管壁厚度和降解。

血管支架材料对于细胞贴附，促进血管成形是必不可少的，但人工的血管支架材料与细胞自身分泌的ECM（细胞外基质）有很大差异，这会造成血管性能的下降。而在数字控制下采用超声聚焦雕刻出的血管支架材料厚度远远小于毫米级，而常规血管组织工程实验中，夹心法制作出的血管支架材料的厚度为2毫米，支架材料管壁厚度的减小将加速其降解并促进局细胞合成的自身ECM，极大影响到血管的生物力学性质和管径的大小。所以通过超声聚焦雕刻出的血管支架，培养出的血管，有望突破组织工程血管直径的瓶颈。

步骤八、系统的清洗与灭菌、培养室和支架材料的灭菌

1、培养室和内部的支架材料不能高压蒸汽灭菌，将培养室连同纸支架放入无菌袋中，钴60照射12h灭菌，移入超净台，应防止无菌袋外表面污染。

2、系统拆解。拆解前请注意原先的安装顺序，以便以后重装。对于可消毒的进行清洗，对于不可消毒的更换。电器部件不能够清洗，需用医用酒精来消毒。尽可能地将每个部件拆卸，某些部件内部不能拆卸。将拆卸的部件投入装有中性的热肥皂水的超声清洗机中。对于不能拆卸的部件，要用注射器将其内部注满中性的热肥皂水，再放入超声清洗机中。

3、清洗。用中性热肥皂水超声清洗后，将部件的肥皂水倒去，用去离子水来漂洗四次。每次漂洗前，用注射器将去离子水注入氧交换器和去泡器。

4、组装被拆解的部件。清洗结束后，组装被拆解的部件。所有要灭菌的部件的阀门打开，螺丝旋松一圈，用铝箔纸包裹（将导管和连接的部件包裹在一起），并且用蒸汽灭菌用袋封住。

对于一次性注射胶管包裹说明：连在阀门上的注射胶管长6厘米，首先中部180度弯折，然后套一个2mLEP管。将胶管的阀门开启以备灭菌，再用新的卷状纱布将EP管、三通、开关一起包裹至少6层，然后用白纸包裹纱布，用皮套固定。

5、灭菌。120degC高压蒸汽灭菌20分钟。不建议升高温度灭菌，可以延长灭菌时间。

6、灭菌后，把所有已灭菌的部件拿到层流的生物安全柜中。组装所有部件。组装时使培养液压力室、去泡器、氧交换器颠倒180度，为的是在灌注时排除气体。

步骤九、培养室链接到系统

1、将培养液瓶装入培养液。确保培养液压力室、去泡器、氧交换器处于倒置180度状态。将第一阀门301、第三阀门303开启，第二阀门302关闭。使电磁阀处于一直打开状态，开启恒流泵。水会最先注满氧交换器，这时轻弹氧交换器，使气泡上升。去泡器不能填满，当液体充满去泡器体积3分之2时，将去泡器倒过来。培养液压力室的做法与氧交换器相同，待水从801孔流入转瓶机内时，关闭恒流泵，将倒置的部件正过来。

2、将转瓶机直立放置底座置于一个灭菌解剖盘中，解剖盘是用于盛接从转瓶溢出的水。将转瓶机从转瓶底机座取下，底盖向下，直立于底座上。将吊臂抬到最高处，拧紧吊臂螺丝。卸下顶盖。将吊环挂在吊臂上。将转瓶中的水倒掉。

3、在顶盖的下部查找多通道旋转接头的803和805通道位置，应记住它们的方位。在排气泡的步骤中，需要将此方位抬高，以避免溢出的气泡被吸入。（通道的序号选择是根据图示的连接方式）由于记号笔可能存在污染，所以在系统组装时应尽量避免接触任何污染原。

继续查找（步骤三-6）中标记在纸支架上的两个通道，记住方位。这是为了在转接头和多通道旋转接头连接时，使通道一一对应。

4、将纸支架的无菌袋取下，将纸支架插入直立放置的转瓶中。在这里需注意的是，不要污染培养室的开口处和其他无菌物品。

5、用螺丝刀松开密封盖处的密封环，用完全灭菌的镊子将密封盖倾斜地取出。此时转接头的接口应该位于液面以下。

6、将直立的转瓶置于悬吊着的顶盖下方，将培养室的开口对准多通道旋转接头的出水口处，降低吊臂，使出水口伸入培养室喇叭状开口。

7、再次开启恒流泵，让恒流泵一直开着。这时水会从多通道旋转接头的801通道出口流出，让水轻轻流入培养室接口，待水即将从喇叭状开口溢出时，将顶盖倾斜，放出压在多通道旋转接头出水口处的气泡。

8、这时调整顶盖的倾斜，使多通道旋转接头下方的805通道高于806号通道。

9、以低转速开启此通路的蠕动泵，可见有气泡冒出，待气泡不再冒出时，确认此通路已被水灌满，关闭蠕动泵。

10、用相同的办法灌满其他通路。

11、在排净系统循环通路中的气体后，便可以将转接头与多通道旋转接头连接。连接时，按标记的通道序号调整二者的方位，使通道一一对应。然后，一只手掐住纸支架的转接头处，另一只手持住多通道旋转接头，向下拉（吊臂会跟着移动），双手共用力将其插入连接。旋紧密封环。这时，由于恒流泵一直开着，水会从多通道旋转接头802通道流出。

12、待水从废液瓶口流出时，关闭恒流泵。关闭第一阀门301、第三阀门303，开启第二阀门302。关闭去泡器顶端的阀门，并用彩色贴条标记去泡器内液面的高度，此页面高度可以显示培养室的受力情况。当去泡器顶端的阀门开启时，如果培养室被转瓶液挤压，培养室减小的体积会造成去泡器内液面的升高；如果培养室受到负压而膨胀，去泡器内的液面就降低，去泡器内减小的体积进入培养室。

13、去泡器液面的降低。在灌注液体时，去泡器的液面不能到达顶部，这样在后面步骤就无法看出液面的升高。如果去泡器液面太高，可以关闭第一阀门301，开启去泡器顶部阀门，开启第三阀门303，慢速开启恒流泵，这样去泡器液面就会下降。待液面下降至2分之3时，关闭恒流泵。

14、到这一步，无菌循环通路已经完成。其他污染原可能是通过培养瓶盖上的滤膜加入的冲洗液和培养液或接种的细胞。

步骤十、纸支架的拆解、添加转瓶液、调试转瓶液的压力和转瓶转速

转瓶机中如果存留有气体，可能扰乱转瓶内液体与转瓶的同步旋转。

1、配制一定密度的转瓶液

溶质：食盐等经济的溶质。

密度算法一：根据开始培养时培养室内的整体密度（培养液+支架材料+培养室）和培养结束时培养室内的整体密度（培养液+支架材料+培养室+细胞），取一个中间值。然后通过调整转速来保持培养室的悬浮状态，其转速设置大致是：刚开始培养时，培养室的密度小于转瓶液，为防止培养室上浮，使用较大的转速；培养结束时，培养室的密度大于转瓶液，仍需增加转速来补偿增加的沉降系数。所以整个培养过程的转速调节是：由快到慢，再由慢到快。

据此原理，通过计算就可以得出，培养后期，一定转速对应着组织的培养密度状态。当然组织中有血管分布，这是不确定因素，但可以通过统计学来估算。从逻辑上讲，只要培养液的营养组成和营养含量接近生物的血液，那么所培养的组织的血管与组织的比例就应该接近生物的真实的组织，因为血管的功能就是输送营养物质。

密度算法二：对于较轻的培养物，也可采用与培养液等密度的溶液。

根据算好的密度，配置转瓶液。

2、将顶盖连同纸支架推入一侧，确定去泡器上的阀门和第一阀门301、第三阀门303关闭，用彩色贴条标记去泡器液面的位置。向转瓶内添加转瓶液，直至即将填满转瓶，不要让转瓶液溢出。

3、在水中用两个长夹子拆解纸支架，并取出。如果纸支架太硬或体积太大无法取出，就等其泡软后取出。

4、将顶盖与转瓶级接合，不要使排气螺丝与转瓶机内壁的突起相对以影响排气。拧紧螺丝。将安装好的转瓶固定于转瓶支架上。注意转瓶齿轮与驱动电机齿轮的咬合，注意转接头的突出插入转瓶支架的铆定凹槽内。

5、向漏斗中加入转瓶液，将转瓶液压室的活塞旋到中部，用废液缸接住排出的转瓶液。将漏斗阀门和排气阀门打开。这时水会注满液压室，轻弹液压室，使附于液压室壁上的气泡上升。转瓶液注满液压室后，关闭排气阀门。

需要注意的是，漏斗可能被设计得很小，所以需要及时添加转瓶液以维持漏斗中液面的高度，防止气体进入导管。一旦漏斗中体液即将流光时，可以先关闭漏斗阀门，再添加转瓶液。建议选用一个大漏斗，使用结束后再卸下。

6、将系统支架的左侧垫高，转动转瓶机，使顶盖上的排气螺丝处于最高位置。在下方垫一块吸水布，旋开排气螺丝。由于转瓶液不断由漏斗添加，转瓶内液面继续升高，而上部的气体会从此孔排出。排气过程可以轻弹转瓶以加速气泡的移动。排气结束后，关闭漏斗阀门，旋紧排气螺丝。

7、用彩色贴条标记去泡器液面位置，打开去泡器顶部阀门。这时去泡器液面高度可能会有所改变，转动液压装置底部的把手，使去泡器的液面回到标记的高度。开启旋转装置，设定转速，使培养室旋转于转瓶中部。

去泡器通过一个滤膜与大气相通，所以培养室内部的压力为大气压。移动转瓶液压室，抽出转瓶机中的转瓶液，这时培养室就会膨胀，且膨胀的体积等于抽出转瓶液的体积。培养前，培养室的密度小于转瓶液，而培养室膨胀将会使其密度更小，这时需要增加转速才能是保持培养室处于转瓶机中部转动。在培养后期，培养室的密度要大于转瓶液，而培养液的密度小于转瓶液，培养室膨胀依然会使培养室的密度减小，这时就需要减小转速来保持培养室在转瓶中部转动。所以整个培养过程的转速调节是：由快到慢，再由慢到快。

8、转瓶将保持旋转，直到培养结束。

步骤十一、冲洗支架材料、接种前处理和润洗

支架模块经过雕刻后，会产生无用的胶原残片，这些残片会影响细胞贴附，所以需要将这些胶原残片冲洗出培养室。另外，在支架原材料组分中，可能根据性能要求添加某些试剂，这些试剂可能具有细胞毒性，需要在冲洗后再进行处理，一般处理液呈酸性或碱性，使这些试剂很容易溶于处理液。

1、在培养瓶盖上的较高的滤膜上再插入一个滤膜，并防止两个滤膜的接口处挣裂，向培养瓶中泵入培养液，泵入的水最好不含有气体，待液面远离底部时再开始清洗，防止气泡被吸入。

2、开启第一阀门301、第三阀门303，关闭第二阀门302和去泡器的阀门。开启恒流泵、蠕动泵、反向开启（此通路为盲端通路）蠕动泵，即同时冲洗支架管网络的管路内部和外部。根据管网状支架材料结构的复杂性选择相对应体积的水。

冲洗的效率实际上，与接种细胞的效率相似，如果支架材料管路的设计非常有利于细胞分布的话，就意味着冲洗液可以很好的分布，而清洗就很全面。

3、清洗废液会填满废液瓶，废液瓶底部安装了一个开关，以放出废液，废液面不应低于开关，以防止外界污染源进入废液瓶。

4、处理。冲洗后可能要对支架材料进行处理，其处理液与支架材料的具体成分相关。处理方法可以与冲洗相同，也可与培养液润洗的方法相同。

5、再次清洗以去除处理液，清洗方法与冲洗方法相同。

6、培养液润洗。将一定体积的培养液泵入循环通路中（体积应与循环通路中液体体积相同）。先关恒流泵，另两个蠕动泵可以开着，再关闭第一阀门301、第三阀门303，开启第二阀门302，保持去泡器的阀门关闭，再开启恒流泵。待自我循环一定时间后，再重复操作。应至少润洗六次，最后的润洗液就是培养液。

7、润洗结束，保持恒流泵开启并设定一定流速，关闭所有蠕动泵，关闭第一阀门301、第三阀门303，保持去泡器阀门关闭，保持转瓶旋转，开启第二阀门302。

步骤十二、种子细胞的注入

在各个循环通路，设计有细胞接种管，使用注射器将种子细胞由此注入，进入管网络支架。

1、细胞接种密度。依据细胞接种在培养室内部空间位置的不同和此空间表面积，实验员自己决定接种密度。在接种时应考虑到细胞损失的因素。另外，在接种细胞（如血管内皮）进入管网状支架管内空间时，没有立即贴附的细胞会二次循环，此过程要经过氧交换器、去泡器和压力室，这必然会损失一些细胞，所以在接种时应考虑到这些因素而增加细胞接种的数量。

2、打开去泡器顶部的阀门。打开种子细胞注入通路的相应的蠕动泵，设定一定速率。主通路的恒流泵是一直开启的，如果向主通路中注射细胞，则仅仅需调整速率，以利于细胞贴附。

3、首先打开包装，拔下2mLEP管。将注射器由折弯处扎入管内，先拉动注射器，使管内产生负压。开启阀门，培养液就会由于负压而进入注射胶管内。

4、使进入胶管的培养液没入注射器针尖（如果没有没入针尖，则将注射器扎深一点），继续拉动针头，以使吸入的培养液赶走针头内的气体。当针头内的气体都跑出来后，待其上升到针头上部，便可推动注射器，注入种子细胞。

当注射器注射时，针尖最好靠近阀门，这样浪费的种子细胞较少。操作中重要的是不能将气泡带入通路中。

5、接种后，首先将胶管阀门关闭，再拔出针头。将用过的注射胶管，按灭菌时的方法包裹，打上标记。

6、关闭去泡器顶部的阀门。

7、由于去泡器顶部的阀门是开启的，所以注射器注入液体的体积会造成去泡器内液面的升高。如果去泡器液面太高的话，注射时就有可能使液体从去泡器顶部冒出，冒出的培养液可能使病原菌生长。降低去泡器液面的方法很简单，只要保持去泡器顶部的阀门开启，保持恒流泵的流动，开启第三阀门303（无需动其他阀门，这时第一阀门301关闭，第二阀门302开启），液体就会流进废液瓶而去泡器液面降低，再关闭第三阀门303。

步骤十三、脉动流模拟的设置

在培养初期没必要采用脉动流培养，当细胞贴附到血管支架材料的内外表面后，就可以进行脉动流模拟培养，以使人工血管的各种性质更接近生物体。正压是由培养液压力室产生，而负压是由去泡器上方的空气产生，产生这两个压力的动力就是培养液压力室和去泡器之间的恒流泵。对正压的调节会影响到负压，对负压的调节会影响到正压。用下面的方法可以一次调节成功。另外，随着实验进程，动脉压力表和静脉压力表的读数可能会发生自动变化，这还需要稍微的调节。在培养室上游的为动脉压力表，在培养室下游的为静脉压力表。

1、设实验设计的动脉压力表读数为P₁，静脉压力表读数为P₂。根据已知弹簧的进度系数k和培养液压力室的内半径r₁。则当压力表读数为P₁时，弹簧被压缩了(P₁/k),那么为达到动脉压力表的读数，需要向培养液压力室泵入的体积为??V={π(r₁)²×(P₁/k)}。由上面的公式，P₁是实验员自定的，而其它量都已知，就可以求出??V。下面就利用查理方程，利用??V求如何在达到P₁的同时达到P₂。假设去泡器中的体积为x，而这个体积正好可以使两个表同时到达试验设定的读数。初始状态下，静脉压力表为大气压P₀，由查理方程得：xP₀=P₂（x+??V），可求得x。那么就可以通过一定方式，使去泡器上部的气体体积为x，以使两表的读数同时达到要求。这应该是最简单的实验步骤，但实际上，由于系统的部件具有弹性，会造成误差，实验员根据实际，在对x进行增减。

2、首先求出x，根据去泡器上的刻度，如果去泡器上部气体小于x，则1）先将去泡器顶部阀门打开，再缓慢开启废液瓶第三阀门303。2）待去泡器液面下降，上部气体增加到x时，关闭第三阀门303，关闭去泡器阀门。此时应留意废液瓶连接管是否有液体倒流现象，如果有，则需要关闭第二阀门302，在系统的组装方案中，特意把废液瓶连接管安装成下凸形，防止液体倒流。

如果去泡器上部气体大于x，只能通过去泡器顶部的滤膜抽出一定的气体。1）首先在去泡器顶部的滤膜上轻轻插入一个注射器，先开启去泡器阀门，开启培养液瓶阀门第一阀门301。2）立即缓慢拉动注射器，待去泡器上部气体减小为x时，先关闭培养液阀门第一301，关闭去泡器阀门。

3、开启电磁阀，设置频率。

4、逐渐增加恒流泵的转速，直到动脉压力表的读数到达实验所设计的数值P₂。

此时，1）如果静脉压力表的数值也到达（或在误差范围内）P₂，那么设置结束。2）如果静脉压力表的数值（负压）小于P₂（更大的负压），就需要增大x。3）反之，减小x。

5、将恒流泵转速降低到初始的转速，关闭电磁阀，按上述方法重新调整去泡器上部气体体积。

6、关于流速的调整。当两表读数到达实验设定时，可以利用设备来测定的流速：1)如果流速过高可以将静脉压力表下游的连接导管折成一定弧度或任意形状，用胶带固定，这样就可以增加循环阻力，从而降低流速。2)如果流速过低，则需要更换更大口径的连接导管。3）重新调整压力。

7、关于培养室内部的循环阻力。在未接种细胞前，循环阻力很小，大部分液体可以由入口端进入，透过支架材料，由出口端流出培养室，循环阻力很小。从细胞接种开始，培养室内的管网络的管内部分逐渐被血管内皮细胞贴附，这会使管网络由开放式循环逐渐转变为封闭式循环，这样就增大了循环阻力。如果组织自发生成血管，就会减小循环阻力。

步骤十四、血管网络的培养、管路设计与阻塞的讨论

1、血管网络的培养

系统多灌注通道的硬件设计和培养室管网络切割的软件设计，为在培养室内部的不同空间接种创造了条件。RCCS是通过注射器将种子细胞注入到转瓶内；而在RTSCS中，种子细胞首先进入某一循环通路，随循环液体进入培养室，并分布于空间，逐渐贴附到支架材料上。脉动流模拟装置只与支架管网络的管内循环路径相通，以模拟血液动力学，这对培养的血管性能是必要的。

对支架管网络材料接种的时间和空间顺序与单血管培养类似，试验室可以根据自己的培养方案进行培养。

关于组织和血管同步构建方法。这样的方法尤其适合本系统，因为本系统管网络支架材料结构复杂，完全适合大批量高密度复合接种，选择更合理的接种方法将会缩短实验时间，优化培养组织的结构。

2、脉动流管路设计

脉动流系统可以模拟血液动力学特性，已是血管组织工程必不可少的仪器。RTSCS的主循环通路就是由脉动流系统组成的，并且，此循环通路中的培养液是整个培养过程的营养来源，从培养初期到结束需要一直保持流通，否则组织就会因缺氧和缺乏营养而死。而其它管路只在接种细胞时开启，接种后就关闭。

脉动流使营养液产生了强弱变化的灌注动力，这种培养方式在影响血管细胞自身生化特性的同时，会使培养液以波的方式灌注，这种波动的能量可以扩张血管，从而减小局部区域的循环阻力，最后流经最细小的血管。例如，一部分毛细血管处于弹回状态时，另一部分正处于液压造成的膨胀状态，这对于培养组织的微循环的畅通尤为重要。这种波动式的灌注也会使整个循环通路网络发生简谐震动，就好比在水中上升的一个气泡，自身在做简谐震动。

3、适于诱导腺腔的管路设计

腺腔由腺上皮组成，为内部封闭的开口于器官外的管状结构。设计也将支架材料做成内部封闭的管状。细胞的注入方法同上，在开启蠕动泵后，蠕动泵将液体推向管腔内，腺腔管状支架内液体将透过支架管路的孔隙，而细胞被拦截在管腔内，如此进行短暂的循环来接种细胞。为了使接种覆盖整个管腔，应放慢蠕动泵的转速，这样利于液体从阻力较小处流出，同时承载细胞贴附于流出处。

阻塞的讨论：血管网络中，管内细胞为血管内皮细胞，而其它类型的细胞可进入管内循环通路中，并可在流速最慢处贴附到血管内壁。这里的营养可以满足其生长。增殖的细胞会阻塞血管，也可能长成瘤状结构，至于这个瘤状结构能否自发血管生成，还需要解剖观察。阻塞血管就意味着营养的匮乏，细胞将停止增殖，除非诱导自发生成血管，对于阻塞的预防值得在试验中总结经验并对管路设计和培养方案进行修改。

步骤十五、完整的器官培养

1、器官组织培养——RTSCS包含着一个简单的培养器官的思路——通过在建立的血管网络上，接种不同种类的细胞，来模拟器官发育中的微环境，在种子细胞自身的互相识别和人工干预的条件下，促成器官结构及功能的形成。包括神经组织的形成，神经调节在器官行驶正常功能上发挥着重要的作用。而所形成的组织的营养来源是依靠血管网络而不是培养液，这是一种间接地获取营养的方式，它更接近于生物体，但对培养条件要求也更苛刻。

2、腺上皮诱导方案——RTSCS的多通道旋转接头可以提供多条独立的灌注通道，也可以是一条盲端（一般腺体都是盲端）。在支架材料管网络设计时，可以根据器官的建模，分析其中分泌腺腔及管道的布局，然后在支架材料雕刻的过程中完成独立的管腔设计。与血管管腔不同，一般腺腔是盲端，所以当通过蠕动泵将细胞推进盲端管腔后，即需要关闭蠕动泵，否则会对推入的细胞造成压力。而诱导因子注入后可以通过扩散进入盲端管腔内。

器官外表皮的形成——与培养室相连的支架材料有一定厚度，这一层支架材料会被贴附的细胞缓慢降解。按照实验设计，在培养即将结束时，这层支架材料将被降解完全，使细胞于硅橡胶接触，这种接触将有可能促使细胞形成上皮结构。

 步骤十六、培养组织的取出、保存、培养室的剥离

1、将电磁阀和恒流泵关闭，将转瓶底盖向下，直立于特制的底座上。将吊臂挂在多通道旋转接头上。

2、卸下顶盖，慢慢提起吊臂，使两个密封环高于转瓶壁5厘米。

3、不要旋开密封环，将转接头从多通道旋转接头拔出。将两个密封环之间的培养室拉长一小段，旋转下面的密封环，使这一小段培养室扭成很细的麻花状。用结实的绳子在此处缠几圈，打结。

4、在确定打结结实后，提升吊臂，把培养室吊出转瓶机。用吸水布擦干培养室表面的水，套上一个新的，剪短的纸支架。

5、用剪刀，在打结的上方将培养室剪断。

6、低温保存。

7、在需要将培养室剥离时，先卸下密封环，将培养室防止解剖盘中（用于接水）。

用钝头的解剖剪刀将培养室由打结处处向底部剪开。注意，可能会有液体从剪口喷出。

步骤十七、组织检测

通过生化、免疫组织化学、局部解剖学等手段对器官的功能和组成进行检验，以及血小板粘附实验、抗血栓检测等检验。

Claims (9)

1.一种旋转式组织应力培养系统，包括支架，支架上安装有培养液瓶、多岐接头、氧交换器、去泡器、恒流泵、培养液压力室、多通道旋转接头、转瓶机、蠕动泵、废液瓶、转瓶液压室、单通道旋转接头、控制单元，其特征在于，所述多岐接头有三个阀门称为第一阀门、第二阀门和第三阀门，所述第二阀门的进口连接第三阀门的进口，所述第二阀门的出口连接第一阀门的出口并且同时连接到所述氧交换器，所述第一阀门的进口连接所述培养液瓶，所述第三阀门的出口连接所述废液瓶，所述氧交换器通过底部管路从去泡器的顶部接入去泡器，所述去泡器的底部通过恒流泵与培养液压力室连接；所述多通道旋转接头内部设有多条通路，每条通路在多通道旋转接头的一个端面和侧壁上设有对应的连接口，其中，所述多通道旋转接头侧壁上的两个连接口接出两条管路，第一条管路通过电子压力表连接到多岐接头的第二阀门的进口上，第二条管路通过另一个电子压力表、电磁阀与培养液压力室下端连接，在第二条管路上设有种子细胞注入口；所述转瓶机两端分别设有顶盖和底盖，转瓶机顶盖与多通道旋转接头连接，所述转瓶机底盖与单通道旋转接头连接，转瓶机内为一个空腔，空腔内设置有培养室，所述培养室通过密封环与多通道旋转接头主通路连接；所述转瓶液压室与单通道旋转接头连接，所述控制单元控制信号分别与转瓶机、蠕动泵、恒流泵、电磁阀连接。

2.根据权利要求1所述的旋转式组织应力培养系统，其特征在于，所述支架包括一块平板，在平板一边折弯形成90度形成一块竖直的平板，所述支架平板上设有吊臂。

3.根据权利要求1所述的旋转式组织应力培养系统，其特征在于，所述多通道旋转接头侧壁上另有两个连接口连接一个管路，所述管路置入蠕动泵，所述管路上设有种子细胞注入口。

4.根据权利要求1所述的旋转式组织应力培养系统，其特征在于，所述氧交换器的顶部设有风扇，所述氧交换器的底部为漏斗形。

5.根据权利要求1所述的旋转式组织应力培养系统，其特征在于，所述去泡器顶部设有密封盖，所述密封盖设有两个开口，一个开口为与氧交换器连接导管的入口，所述导管底部横向弯折；另一个开口与一个阀门连接，所述阀门连接一个滤膜；所述去泡器上标有刻度，所述去泡器的底部为漏斗形。

6.根据权利要求1所述的旋转式组织应力培养系统，其特征在于，所述培养液压力室内壁为光滑圆柱形，顶部设有密封盖，所述密封盖下部连接一根弹簧，弹簧底部连接一个活塞，培养液压力室的底部为漏斗形。

7.根据权利要求1所述的旋转式组织应力培养系统，其特征在于，所述转瓶液压室顶部设有设有排气口，排气口上设有一个顶部阀门，所述顶部阀门为排气阀门；在转瓶液压室侧面设有高低两处开口，两个开口上分别设有阀门，所述高处开口为转瓶液输入端，所述低处开口与单通道旋转接头连接；所述转瓶液压室内部设有一个活塞，所述活塞与螺杆连接，所述螺杆套有可旋转的螺母，所述螺母设置在液压室底部。

8.根据权利要求1所述的旋转式组织应力培养系统，其特征在于，所述转接头内部为管网状结构。

9.一种旋转式组织应力培养方法：包括将一个制作好的培养室放入转瓶机；将胶原加壳聚糖、胶原加粘多糖胶支架原材料灌注到培养室内；转瓶机开始转动，将种子细胞从种子细胞注入口注入；开启蠕动泵；其特征在于；所述方法还包括从转瓶液压力室通过单通道旋转接头向转瓶机的空腔内中注入转瓶液，转瓶液将培养室托住，使培养室处于悬浮状态。

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