CN102127507B - 生物组织工程血管发生系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物组织工程血管发生装置，包括微型直流调速电机，圆柱摩擦轮传动系统，旋转式血管反应器，血管基质支架，血管内皮种子细胞培养罐，血管壁种子细胞培养罐，恒温水浴箱，可编程脉冲蠕动泵，混合气瓶，过滤器，本装置所构建的血管要具有含成纤维细胞外膜、平滑肌细胞中膜和内皮细胞内膜的三层构造，达到或接近正常血管的力学特性和生物学活性。

Description

生物组织工程血管发生系统

技术领域

本发明属于生物组织工程制备装置，特别涉及生物组织工程血管发生系统。

现有技术

目前生物组织工程血管主要在生物反应器中构建，现有技术和装置仍在实验研究阶段，尚未出现可以工厂化生产的解决方案。现将该领域研究水平和技术难题列举如下：

(1)血管的三维培养

传统的单层细胞培养细胞呈二维方式生长，其生长状态、生物学特征和增殖代谢与体内生长差异很大，无法满足生物组织工程学的要求。因此，近年来发展起来的血管三维培养技术是血管组织工程的重要技术。目前对血管种子细胞，尤其是构成血管壁的血管平滑肌细胞，三维培养方法主要依赖细胞外基质作为支架，提供活细胞在体外生长所需的支持物，为细胞生长创造三维空间，便于细胞黏着、生长和新陈代谢。制备支架的材料包括胶原、纤维结合蛋白等天然材料和聚乙醇酸、聚乙交酯等人工合成材料。这些材料与种子细胞混合后形成胶体，置入培养板中在孵箱内培养。

这种血管种子细胞与支架材料混合培养的方式虽然解决了三维生长的问题，但仍然无法真实模拟血管在体内的生长环境。首先，由于重力原因，细胞无法在支架中均匀生长；再者，细胞融入凝胶之中会增加与培养液的接触距离，导致细胞营养供应不上，还会使代谢废物堆积，影响细胞生长；另外，如果支架材料不可分解，就会造成已成型血管与基质分离困难，不利于自动化生产。

(2)血管组织动态培养

与静态种植比较，动态培养在前者细胞附着的数量、分布的均匀度、生长情况和纤维蛋白的沉积都具有优势。目前的动态培养多采用体外模拟生物体内反应，即生物反应器内的培养。生物反应器能兼顾器官培养所需的传热、传气、营养供给和流体动力条件，当前应用较多的是旋转式器官培养装置，基本能满足血管的三维培养需要。

但现有的生物反应器本身是为细胞的动态培养设计，不能达到组织工程血管生产的要求。一是生物反应器只能培养单种细胞，而生产血管需要多种细胞共同参与；二是旋转式生物反应器无法真实模拟血管承受的流变力、切应力、脉冲压等流体动力学条件；三是器形多为竖桶或圆皿状，不利于血管支架的置入与和成品血管的取出。

(3)血管三层结构的建立

理想的血管应当具备成纤维细胞构成外膜、平滑肌细胞构成的中膜和内皮细胞构成的内膜等三层结构。目前建立组织工程血管结构的方法主要有三：一是采取在人工血管内表面种植内皮细胞的方法，以纤维蛋白胶预衬人工血管，将内皮细胞制成悬液灌入，置入孵箱内静态培养；二是在毯状血管基质上种植多层细胞，先种植血管壁细胞，再在其上层种植内皮细胞，置入生物反应器中动态培养，使用时缝合成管状；三是在血管支架材料上种植可以分化为多种血管组织的干细胞，培养装置多为自制的反应器，模拟动脉搏动等血流条件。

以当前技术构建的血管难以形成理想的三层结构，并且可能出现以下问题：一是种植的内皮细胞层不够牢固，不能耐受血流的冲刷，脱落后会引起继发性的血栓形成，降低其远期的通畅率；二是在体外静态下形成的组织工程血管缺乏足够的弹性中膜支撑，不能达到或接近正常血管的结构强度；三是需要复杂的后期加工或者诱导干细胞分化过程，不利于形成工厂化生产；四是反应装置需要置入孵箱，对器形、气路、电路限制较多，且开放式的生产环境增加污染机会。

现有的生物组织工程血管生产方案具有如下不足：一是无法满足生产血管所具备的三维空间构造，生产过程无法模拟血管在体内承受的流体动力学环境，因此难以在体外构建出理想的组织工程血管；二是无法承载两种以上种子细胞同时生长，因此也就无法生成包含三层结构并各具活性的血管组织架构；三是生产过程整合程度不高，往往包含数个独立的操作，既不利于形成工厂化生产，也给不便于标准化控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物组织工程血管的反应系统，能提供生物组织工程血管构建实验室生产的全过程解决方案，并有放大形成工厂化生产的潜力。所构建的血管要具有含成纤维细胞外膜、平滑肌细胞中膜和内皮细胞内膜的三层构造，达到或接近正常血管的力学特性和生物学活性。

本发明的技术方案是这样实现的：

微型直流调速电机通过齿轮与圆柱摩擦轮传动系统连接，圆柱摩擦轮传动系统与旋转式血管反应器紧贴，带动其旋转；血管基质支架在旋转式血管反应器的中间，与其构成同心圆筒关系；血管内皮种子细胞培养罐和血管壁种子细胞培养罐嵌入进恒温水浴箱；血管内皮种子细胞培养罐的吸液管道与血管基质支架的进液口、出液口与回流管道连接；血管壁种子细胞培养罐的吸液管道与旋转式血管反应器的外圈进液口、外圈出液口与回流管道连接；两个可编程脉冲蠕动泵分别搭载在血管内皮种子细胞培养罐的吸液管道与血管基质支架的进液口、血管壁种子细胞培养罐的吸液管道与旋转式血管反应器的外圈进液口的硅胶管道上；混合气瓶与过滤器连接，过滤器分别与血管内皮种子细胞培养罐和血管壁种子细胞培养罐的进气管道连接。

血管内皮种子细胞培养罐的吸液管道与血管基质支架的进液口、出液口与回流管道用硅胶管连接。

血管壁种子细胞培养罐的吸液管道与旋转式血管反应器的外圈进液口、外圈出液口与回流管道用硅胶管连接。

混合气瓶与过滤器用加强软管连接。

在初步试验中，我们以兔腹主动脉脱细胞基质作为血管基质材料，以培养的大鼠主动脉内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞作为种子细胞，经过15～20天的反应，生产除了生物组织工程血管。经检测表明，具备以下特征：

(1)石蜡切片、HE染色、光镜观察表明具备外膜、中膜、内膜三层结构，与天然血管结构相似；

(2)所制备的血管爆破压达到天然血管(兔腹主动脉)的43％，断裂强度达到38％，应变率为比天然血管高出28％，基本达到体内移植的要求；

(3)血管对乙酰胆碱的最大收缩率为19.23％、肾上腺素最大收缩率为34.13％，表明具有一定的生物学活性。

附图说明

图1是本发明生物组织工程血管发生系统结构示意图；

图2是本发明旋转式血管反应器；

下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。

具体实施方式

参照附图所示，微型直流调速电机1、圆柱摩擦轮传动系统2、旋转式血管反应器3均固定于平板上，按图示安装齿轮，组装传动系统的三个摩擦轮，调整反应器圆筒高度，使之与摩擦轮紧密接触；

分别安装血管内皮种子细胞培养罐5和血管壁种子细胞培养罐6顶端的三根管路，拧紧罐盖后反向旋1/4圈(留出进气缝隙)，然后将两个罐子放入恒温水浴箱中7；

用加强硅胶软管将气体由混合气瓶9的减压阀处引出，连接到过滤器10上，除菌后的气体经软管分别连接到两个培养罐的气体管路上；

液体管路均为专用硅胶软管，构成两个循环：一是从血管内皮种子细胞培养罐5的吸液管路引出，连接到反应器左端的血管支架进液口，液体经过血管基质后从右侧出液口引至该罐的回流管路；二是从血管壁种子细胞培养罐6的吸液管路引出，连接到反应器左端底侧的进液口，液体经过反应器外筒后，从右侧顶端的出液口引至该罐的回流管路；

在两个循环的培养罐吸收管路与进液口之间的软管上，各搭载一个可编程脉冲蠕动泵8，软管按照蠕动泵使用说明绕于泵头之中。

应用该系统生产生物组织工程血管的流程如下：

(1)选择或制备血管基质，可以为适合细胞生长的人工合成材料，也可以为经脱细胞处理的天然血管基质，部分市售人工血管亦可作为基质；

(2)选择种子细胞，一般血管内皮种子细胞为成熟的内皮细胞、内皮祖细胞等，血管中膜种子细胞为成熟平滑肌细胞或平滑肌祖细胞，外膜种子细胞为成纤维细胞，或其他细胞经诱导分化而成。将种子细胞与相应的培养液混合后，分别放入对应的培养罐；

(3)接通混合气体，调整出减压阀压力位0.01MPa；

(4)用辅助穿越杆贯穿血管基质，一端穿过左侧活动销，先将基质左端绑缚固定在支架上，然后右推活动销以增加空间，方便连接血管基质与右侧支架。固定完成后抽出辅助穿越杆，连接固定轮与旋转筒，接通两路液体管道；

(5)开启蠕动泵，参考预实验结果调整血流动力学参数；

(6)开启反应器动力装置，调整转速为5RPM，亦可根据预实验改变转速；

(7)每隔5天换培养液，可提升吸收管，待细胞完全回收后离心、换液、重新悬浮细胞，安装完毕后启动系统到工作状态；

(8)按照预实验结果，在运行15～20天后停止系统，取出血管进行检测或移植。

本系统由细胞供给、气体供应、动力装置和血管反应等四个单元构成，同时提供两种类型的血管种子细胞，细胞流经过模拟体内环境的血管反应器，闭路循环，约需15～20天形成血管。生产过程应放置无菌车间进行。现依照细胞流方向将该系统构成和工作原理介绍如下：

(1)气体供应单元

由混合气瓶9、过滤器10和加强硅胶软管构成。混合气体的成分为CO₂5％，O₂21％，N₂ 74％，经过无菌过滤器后接入细胞培养罐。

(2)种子细胞供给单元

主要由血管内皮种子细胞培养罐5、血管壁种子细胞培养罐6、恒温水浴箱7三个装置构成。两个培养罐内为相应的血管种子细胞，液体为细胞所对应的专用培养液；培养罐顶部设置三根管路，细胞吸取管深入瓶底，细胞回收管稍低于液面，气体供应管高于液面；罐口为螺纹锁紧方式。两个培养罐均嵌入在恒温箱内，保持37℃，并通过循环使整个系统内部保持相同温度。

种子细胞在37℃、5％CO₂的适宜环境下生长和蓄存，并有相应的培养液提供营养；种子细胞在底部被吸取，经过循环后在液面上回流，罐内时刻保持涡流，因此细胞不会大量贴附在瓶壁或瓶底；每隔5天换培养液，可提升吸收管，待细胞完全回收后离心、换液、重新悬浮。

(3)动力装置

由可编程脉冲蠕动泵8及专用硅胶管道构成。该蠕动泵为成品设备，可通过编程控制流速、选择脉冲方式。由此装置提供动力，将两种细胞悬液分布由培养罐中吸出，通过管道泵入血管反应器。此装置还为血管反应器创造脉冲压环境，模拟体内动脉搏动对血管产生的张力。流体动力学的具体参数由血管长度、管壁厚度及液体粘滞度等决定，可根据预实验确定。

(4)血管反应单元

主要部件为圆筒状的旋转式血管反应器3，内置血管基质支架4，使血管基质与反应器呈同心圆。外圈与血管壁种子细胞培养罐接通，内圈与血管内皮种子细胞培养罐接通，构成独立的两个环路。该装置及附件均由医用级TPX塑料制成。反应器可沿长轴旋转，由微型直流调速电机1提供动力，通过齿轮传递给圆柱摩擦轮传动系统2的主动轮，继而传递给一对橡胶质地的从动轮，通过摩擦阻力驱动反应器旋转。电源系统均采用24V输入，由统一电源供电。

该反应器工作时外圈充满血管壁种子细胞(合成初期用平滑肌种子细胞构建中膜，后期用成纤维细胞构建外膜)，血管基质支架中间流过内皮种子细胞。设置反应器以5RPM速度旋转，可使细胞均匀地在血管基质上三维生长，并由动力装置创造血流动力学环境。经过15～20天左右反应即可形成人造血管。

(5)旋转式血管反应器的详细结构

该装置由两侧的固定轮11和中间的旋转筒13构成，两端固定轮上分别有外圈液体的出入口，固定轮内套于旋转筒，连接处密封良好且可自由转动，当旋转筒由摩擦轮带动旋转时，两端固定轮不会活动，由此避免了液体出入口移位。由各三根随动辐条12连接旋转筒与血管支架两端，使血管基质随之旋转。两侧血管支架的硬管均有两段活动套管，以使液体的进出口管道不随血管旋转。

(6)血管基质安装解决方案

血管基质可以为适合细胞生长的人工合成材料，也可以为经脱细胞处理的天然血管基质。用塑料材质的辅助穿越杆14贯穿血管基质16，一端穿过左侧活动销15，先将基质左端绑缚固定在支架上，然后右推活动销以增加空间，方便连接血管基质与右侧支架。固定完成后抽出辅助穿越杆，连接固定轮与旋转筒，接通两路液体管道，装置即可开始工作。

Claims (4)

1.生物组织工程血管发生系统，包括微型直流调速电机(1)，圆柱摩擦轮传动系统(2)，旋转式血管反应器(3)，血管基质支架(4)，血管内皮种子细胞培养罐(5)，血管壁种子细胞培养罐(6)，恒温水浴箱(7)，可编程脉冲蠕动泵(8)，混合气瓶(9)，过滤器(10)，其特征在于，微型直流调速电机(1)通过齿轮与圆柱摩擦轮传动系统(2)连接，圆柱摩擦轮传动系统(2)与旋转式血管反应器(3)紧贴，带动其旋转；血管基质支架(4)在旋转式血管反应器(3)的中间，与其构成同心圆筒关系；血管内皮种子细胞培养罐(5)和血管壁种子细胞培养罐(6)嵌入进恒温水浴箱(7)；血管内皮种子细胞培养罐(5)的吸液管道与血管基质支架(4)的进液口、出液口与回流管道连接；血管壁种子细胞培养罐(6)的吸液管道与旋转式血管反应器(3)的外圈进液口、外圈出液口与回流管道连接；两个可编程脉冲蠕动泵(8)分别搭载在血管内皮种子细胞培养罐(5)的吸液管道与血管基质支架(4)的进液口、血管壁种子细胞培养罐(6)的吸液管道与旋转式血管反应器(3)的外圈进液口的硅胶管道上；混合气瓶(9)与过滤器(10)连接，过滤器(10)分别与血管内皮种子细胞培养罐(5)和血管壁种子细胞培养罐(6)的进气管道连接。

2.根据权利要求1所述的生物组织工程血管发生系统，其特征在于，血管内皮种子细胞培养罐(5)的吸液管道与血管基质支架(4)的进液口、出液口与回流管道用硅胶管连接。

3.根据权利要求1所述的生物组织工程血管发生系统，其特征在于，血管壁种子细胞培养罐(6)的吸液管道与旋转式血管反应器(3)的外圈进液口、外圈出液口与回流管道用硅胶管连接。

4.根据权利要求1所述的生物组织工程血管发生系统，其特征在于，混合气瓶(9)与过滤器(10)用加强软管连接。

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