CN114703062B - 一种大规模进行贴壁细胞培养的系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大规模进行贴壁细胞培养的系统，其包括细胞反应器和连接管，所述细胞反应器包括输入口和输出口，所述输入口和输出口均与连接管连通，所述连接管的管路上设置有循环泵和增氧器，循环泵设置在输入口的一端，增氧器设置在输出口的一端。循环泵有利于培养液在生物反应器中加速流动，培养液中的成分保持均匀，加速细胞气体交换和营养成分的供给；增氧器的使用可以大大增加气体和培养液之间气体交换率，同时避免直接通气造成的液体回路中大量气泡的产生。

Description

一种大规模进行贴壁细胞培养的系统

技术领域

本发明属于细胞培育技术领域，具体涉及为一种大规模进行贴壁细胞培养的系统。

背景技术

肝脏作为人体的重要器官之一，因其具有合成、解毒、代谢、分泌、生物转化以及免疫防御等功能，故又被称为“加工厂”。肝脏是由肝细胞组成，并有丰富的血管网，呈红褐色，质软而脆，易受暴力打击而破裂，引起致命性大出血。肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。

当受到多种因素（如病毒、酒精、药物等）引起严重损害时，造成肝细胞大量坏死，导致上述功能发生严重障碍或失代偿，进而出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群，称之为肝衰竭。临床以极度乏力、食欲下降、腹胀、恶心、呕吐、神志改变等为主要症状，由于病情进展迅速、治疗难度高，医疗费用昂贵，总体预后较差。

目前肝衰竭的临床治疗尚无特异有效的治疗手段，强调综合治疗，包括内科基础治疗、人工肝支持治疗和肝脏移植治疗三方面。

人工肝支持治疗包括种类很多，目前临床最为常用的是血浆置换，其原理是通过将肝衰竭患者血浆与新鲜血浆进行置换，达到清除有害物质，补充机体必需物质，改善内环境的作用，暂时替代衰竭肝脏部分功能，为肝细胞再生及肝功能恢复创造条件或等待机会进行肝移植。

培养具有生物活性的肝细胞是人工肝支持治疗的前提，细胞反应器是培养肝细胞的主要装置，目前的细胞反应器存在以下缺点：（1）营养物质、氧气等细胞生长所需的物质供给不足；（2）培养后的细胞不容易取出。

本发明针对上述问题，提供一种大规模进行贴壁细胞培养的系统。

发明内容

为了克服背景技术中提出的问题，本发明采用如下技术方案：

一种大规模进行贴壁细胞培养的系统，其包括细胞反应器和连接管，所述细胞反应器包括输入口和输出口，所述输入口和输出口均与连接管连通，所述连接管的管路上设置有循环泵和增氧器，循环泵设置在输入口的一端，增氧器设置在输出口的一端。循环泵有利于培养液在生物反应器中加速流动，培养液中的成分保持均匀，加速细胞气体交换和营养成分的供给；增氧器的使用可以大大增加气体和培养液之间气体交换率，同时避免直接通气造成的液体回路中大量气泡的产生。

在本申请的一些实施例中，以所述细胞反应器为起点，沿顺时针方向依次为所述增氧器和循环泵。

在本申请的一些实施例中，还包括液体流量监测结构，液体流量监测结构设置在细胞反应器的输出口端。液体流量监测结构用于监测从细胞反应器的输出口流出的培养液的容量。

进一步，所述液体流量监测结构为流量计。

在本申请的一些实施例中，还包括用于监测细胞培养液的氧气含量的氧含量监测结构。

进一步，所述氧含量监测结构包括溶氧电极A和溶氧电极B，溶氧电极A和溶氧电极B分别设置在增氧器的两侧，溶氧电极A和溶氧电极B依次沿顺时针方向分布；溶氧电极A监测从细胞反应器流出的培养液的含氧量DO1，溶氧电极B监测经过增氧器增氧后的培养液的含氧量DO2，细胞耗氧量OCR=DO2-DO1,OCR的值越大说明细胞的耗氧量越大，反应细胞的数量越多。

在本申请的一些实施例中，还包括储液器，在储液器的一端设置液体流出口，另一端设置液体回收口，液体流出口和液体回收口均与连接管连通，储液器设置在溶氧电极B和循环泵之间；储液器内的液体从液体流出口流出，经过连接管进入循环泵。储液器用于存放培养液和其他细胞培养所需的营养物质，也就是说，储液器内存放的是混合了其他营养物质的培养液。

在本申请的一些实施例中，还包括培养液贮存器和进液泵，进液泵的其中一端与培养液贮存器连通，另一端与储液器连通。使用状态下，培养液贮存器用于存放新鲜的培养液，在进液泵的作用下，新鲜培养液从培养液贮存器进入储液器。

在本申请的一些实施例中，还包括补料组件，补料组件与所述储液器相连接。

进一步，所述补料组件包括补料泵和补料器，补料泵的其中一端与补料器连通，另一端与储液器连通。

进一步，所述补料组件还包括碱水器和碱水泵，碱水泵的其中一端与碱水器连通，另一端与储液器连通。

在本申请的一些实施例中，还包括废液回收器，废液回收器与储液器连通。

本发明的有益效果：

（1）采用了增氧器，增氧器能够大大增加气体与培养液之间的气体交换率，避免直接通气造成的液体回路中大量气泡的产生，而气泡对细胞的生长极为不利，且影响耗氧量的监测。

（2）采用了循环泵，循环泵的使用可以加速培养液在细胞反应器中的流动，使培养液中的成分保持均匀，加速细胞与气体和营养物质之间的交换；

（3）采用了两个溶氧电极监测培养液中的氧含量，可以时刻监测进出细胞反应器的培养液的氧含量，通过细胞耗氧量（OCR）值来调整需要的进气量和培养液进液量和循环泵转速以及判断反应器中细胞量。细胞耗氧量高说明细胞多，生长旺盛，应该增加进液量，加大循环泵转速，从而快速带走细胞产生的废液和二氧化碳，并且把新鲜培养液和氧气带到细胞内，供细胞使用。

本发明的使用方法：

1、人肝脏细胞C3A细胞的冷冻工作细胞库冻存管，在万级洁净室（ISO 7）下，37°C水将细胞融化，直到几乎完全融化。

2、采用细胞培养瓶以高达1:10的分裂比连续扩增C3A细胞。在细胞扩增过程中，用EDTA-胰蛋白酶将贴壁的细胞从培养瓶中消化下来，所有无菌操作均在ISO5通风层流柜内进行。

3、细胞可以在培养瓶中连续传到第8代（细胞解冻定义为第0代），在第1代取出混合样品，并进行细胞计数、细胞活力、增殖力、支原体和内毒素含量的测定。通过观察细胞形态、达到相互接触时所用时间，控制分裂比例来检测细胞扩增过程中的细胞生长，以确保细胞在6-21天内达到85%的密度。

4、当从一个共同的传代数（第3代和第8代）之间收获了足够数量的C3A细胞时，将这些细胞合并以形成接种物，使用无菌技术将细胞汇集到一个无菌容器中，合并细胞后，进行活细胞计数以计算适当容积的合并细胞，接种到空的细胞反应器中。

5、接种好C3A细胞的细胞反应器接入到生产装置中进行连续培养，每天监控细胞反应器的葡萄糖消耗量，细胞耗氧量（OCR），以此来调整新鲜培养液的进液量，循环泵的转速以及各种气体的进气量，让细胞处于最佳的生长状态。同时抽取样品并测定C3A细胞的特征蛋白（人白蛋白和人转铁蛋白）的表达生产量，以及测试反应器的无菌性，无支原体和内毒素的含量，保证生物反应的生物安全。

附图说明

图1为本发明的正视结构示意图；

图2为本发明的整体结构示意图；

图3为本发明的液体流向示意图；

图4为本发明细胞反应器的横截面示意图；

图中，1、细胞反应器；11、输入口；12、输出口；13、中空纤维管；2、流量计；3、溶氧电极A；4、溶氧电极B；5、增氧器；6、储液器；61、取样口；62、温度监测器；63、PH电极；7、循环泵；8、培养液贮存器；81、进液泵；9、补料器；91、补料泵；100、碱水器；101、碱水泵；103、废液回收器。

具体实施方式

下面结合附图，详细介绍本发明的各种具体实施方式，实施方式中所提到的“上、下、左、右、前、后”等类似的用词，是为了便于描述图示中一个元件或特征与另一个(些)元件或特征之间的关系。除了在附图中绘示的方位之外，这些空间相关用词也意欲包含使用中或操作中的装置之不同方位。装置可能被转向不同方位(旋转90度或其他方位)，而在此所使用的空间相关用词也可依此相同解释。

图1为本发明的正视结构示意图，图2为本发明的整体结构示意图，本实施例公开了一种大规模进行贴壁细胞培养的系统，其包括细胞反应器1和连接管，所述细胞反应器1包括输入口11和输出口12，所述输入口11和输出口12均与连接管连通，所述连接管的管路上设置有循环泵7和增氧器5，循环泵7设置在输入口11的一端，增氧器5设置在输出口12的一端。循环泵7有利于培养液在生物反应器中加速流动，培养液中的成分保持均匀，加速细胞气体交换和营养成分的供给；增氧器5的使用可以大大增加气体和培养液之间气体交换率，同时避免直接通气造成的液体回路中大量气泡的产生。

图3为本发明的液体流向示意图，本实施例中，以所述细胞反应器1为起点，沿顺时针方向依次为所述增氧器5和循环泵7，培养液沿顺时针方向流动，循环泵7为培养液的流动提供主要动力。图4为细胞反应器1的横截面示意图，本实施例对细胞反应器1进行具体设置：细胞反应器1包括中空的管状壳体，管状壳体的内部设置有中空纤维管13，中空纤维管13的其中一端与细胞反应器1的输出口12相连接，另一端与输入口11相连接。使用过程中，肝细胞贴附在中空纤维管13的外侧管壁上，培养液从细胞反应器1的输入口11进入，流经中空纤维管13的管腔，然后从细胞反应器1的输出口12流出，细胞在中空纤维管13的外侧管壁上生长，中空纤维管13内的培养液为细胞生长提供营养物质并进行物质交换。更具体地，管状壳体为圆柱状结构，细胞培养器的输入口11与输出口12均与连接管可拆卸连接，细胞培养完成后将细胞培养器的输入口11与输出口12分别与连接管分离，取出细胞培养器进行保存，运输至患者端进行人工肝的替代治疗。

增氧器5包括进气口和出气口，通过进气口向增氧器5内输入空气和氧气的混合气体，在增氧器5中，气体和培养液进行气体交换，最终增加循环回路中培养液中溶解氧的含量，尾气从出气口排出。更进一步地，进气口的内部设置有进气单向阀，出气口的内部设置有出气单向阀。

本实施例的储液器6为储液罐，更具体地，储液罐为规则形状的罐状结构，储液罐可以为矩形罐、圆柱状罐，优选地，储液罐为矩形罐。在储液器6上设置温度监测器62、PH电极63和取样孔，温度监测器62的一端与储液器6固定连接，另一端伸入储液器6内，温度监测器62用于监测储液器6内的培养液的温度，实时监测培养液的温度以保证细胞的正常生长；PH电极63的一端与储液器6固定连接，另一端伸入储液器6内，PH电极63用于监测储液器6内的培养液的酸碱度，实时监测培养液的PH值以保证细胞的正常生长；取样孔与储液器6的内部连通，通过取样孔抽取样品并测定C3A细胞的特征蛋白（人白蛋白和人转铁蛋白）的表达生产量，以及测试反应器的无菌性，无支原体和内毒素的含量，保证生物反应的生物安全。

本实施例中温度监测器62、PH电极63和取样孔的设置，保证为细胞生长提供最有利的环境。

培养液贮存器8为规则形状的桶状结构，更具体地，培养液贮存器8为矩形桶、圆柱状桶、锥形桶等，优选地，培养液贮存器8为矩形桶。培养液贮存器8的内部放置培养液，在培养液贮存器8的其中一端设置培养液出口，培养液出口与进液泵81通过连接管连通，进液泵81的其中一端与培养液贮存器8连通，另一端与储液器6连通；进液泵81抽取培养液贮存器8内的培养液，被抽取的培养液进入储液器6内暂存。循环泵7的其中一端与储液器6可拆卸连接，另一端与细胞反应器1可拆卸连接，循环泵7通过连接管与储液器6和细胞反应器1连通，在循环泵7与细胞反应器1之间的连接管上设置用于控制液体流动的开关，循环泵7抽取储液器6内的培养液，被抽取的培养液进入细胞反应器1，循环泵7为培养液的流动提供了动力，且加快了培养液的流动，加快了细胞与培养液之间的物质交换，为细胞生长提供足够的物质条件。

补料器9为用于装营养液的容器，补料器9通过连接管与储液器6连通，在补料器9与储液器6之间的连接管上设置用于控制液体流动的开关，补料泵91抽取补料器9内的营养液，使得该营养液进入储液器6暂存，储液器6内的营养液与培养液混合，供细胞生长使用。碱水器100通过连接管与储液器6连通，在碱水器100与储液器6之间的连接管上设置用于控制液体流动的开关，碱水泵101抽取碱水器100内的碱水，使得碱水进入储液器6，碱水在储液器6与培养液、营养液混合，使得储液器6的混合液达到合适的酸碱度，以利于细胞生长。

废液回收器103通过连接管与储液器6连通，用于回收储液器6的废液，在废液回收器103与储液器6之间的连接管上设置用于控制液体流动的开关；更具体地，废液回收器103为桶状结构。

本实施例还设置了电源结构，电源结构为整体系统供电。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

本申请所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种大规模进行贴壁细胞培养的系统，其包括细胞反应器和连接管，其特征在于，所述细胞反应器包括输入口和输出口，所述输入口和输出口均与连接管连通，所述连接管的管路上设置有循环泵和增氧器，循环泵设置在输入口的一端，增氧器设置在输出口的一端；还包括用于监测细胞培养液的氧气含量的氧含量监测结构，所述氧含量监测结构包括溶氧电极A和溶氧电极B，溶氧电极A和溶氧电极B分别设置在增氧器的两侧；还包括储液器，在所述储液器的一端设置液体流出口，另一端设置液体回收口，所述液体流出口和液体回收口均与所述连接管连通；以所述细胞反应器为起点，沿顺时针方向依次为所述增氧器和循环泵，培养液沿顺时针方向流动，循环泵为培养液的流动提供主要动力；所述细胞反应器包括中空的管状壳体，管状壳体的内部设置有中空纤维管，所述中空纤维管的其中一端与所述细胞反应器的输出口相连接，另一端与所述输入口相连接；肝细胞贴附在中空纤维管的外侧管壁上，培养液从细胞反应器的输入口进入，流经中空纤维管的管腔，然后从细胞反应器的输出口流出，细胞在中空纤维管的外侧管壁上生长，中空纤维管内的培养液为细胞生长提供营养物质并进行物质交换；增氧器包括进气口和出气口，通过进气口向增氧器内输入空气和氧气的混合气体，在增氧器中，气体和培养液进行气体交换，最终增加循环回路中培养液中溶解氧的含量，尾气从出气口排出；在储液器上设置温度监测器、PH电极和取样孔，温度监测器用于监测储液器内的培养液的温度，PH电极用于监测储液器内的培养液的酸碱度，取样孔与储液器的内部连通，通过取样孔抽取样品并测定C3A细胞的人白蛋白和人转铁蛋白的表达生产量，以及测试反应器的无菌性，无支原体和内毒素的含量；培养液贮存器的内部放置培养液，在培养液贮存器的其中一端设置培养液出口，培养液出口与进液泵通过连接管连通，进液泵的其中一端与培养液贮存器连通，另一端与储液器连通；进液泵抽取培养液贮存器内的培养液，被抽取的培养液进入储液器内暂存，循环泵的其中一端与储液器可拆卸连接，另一端与细胞反应器可拆卸连接，循环泵通过连接管与储液器和细胞反应器连通，在循环泵与细胞反应器之间的连接管上设置用于控制液体流动的开关，循环泵抽取储液器内的培养液，被抽取的培养液进入细胞反应器。

2.根据权利要求1所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，还包括液体流量监测结构，液体流量监测结构设置在细胞反应器的输出口端。

3.根据权利要求1所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，所述溶氧电极A和溶氧电极B依次沿顺时针方向分布；溶氧电极A监测从细胞反应器流出的培养液的含氧量DO1，溶氧电极B监测经过增氧器增氧后的培养液的含氧量DO2，细胞耗氧量OCR=DO2-DO1,OCR的值越大说明细胞的耗氧量越大，反应细胞的数量越多。

4.根据权利要求1或3所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，所述储液器设置在溶氧电极B和循环泵之间；储液器内的液体从液体流出口流出，经过连接管进入循环泵。

5.根据权利要求4所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，所述温度监测器的一端与储液器固定连接，另一端伸入储液器内，实时监测培养液的温度以保证细胞的正常生长；PH电极的一端与储液器固定连接，另一端伸入储液器内，实时监测培养液的PH值以保证细胞的正常生长。

6.根据权利要求1所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，还包括培养液贮存器和进液泵，进液泵的其中一端与培养液贮存器连通，另一端与储液器连通。

7.根据权利要求1所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，还包括补料组件，补料组件与所述储液器相连接。

8.根据权利要求7所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，所述补料组件包括补料泵和补料器，补料泵的其中一端与补料器连通，另一端与储液器连通。

9.根据权利要求7所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，所述补料组件还包括碱水器和碱水泵，碱水泵的其中一端与碱水器连通，另一端与储液器连通。

10.根据权利要求1所述的大规模进行贴壁细胞培养的系统，其特征在于，还包括废液回收器，废液回收器与储液器连通。

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