CN1902304A - 细胞培养系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了生长细胞的新的装置，其中培养腔(1)部分填充液体培养基和细胞。通过在柱生物反应器的底部间歇产生单个大的气泡(6)实现混合和通气，单个大的气泡的宽度为槽宽度的50至99％，优选60至99％，更优选98.5％。培养基作为大气泡和生物反应器内壁之间的膜流出。上升的气泡允许培养物的混合和通气。由于本发明的设计非常简单，因此可能用柔性塑料材料制造它和用此装置作为一次性系统。此外，此种混合/通气原理将通常由于剪切力和小气泡引起的细胞损伤降到最小，允许容易和有效地从小规模放大到较大规模。此种大规模、有效和一次性细胞培养系统可以大大降低生产成本。

Description

细胞培养系统
发明领域
本发明涉及细胞培养领域。本发明提供了新的细胞培养系统，一般用于生长细胞，特别是植物细胞。由于此种装置可以是一次性的并且在大规模上是有效的，它的使用允许在不同种类的应用中大大降低生产成本。
发明背景
常规的培养系统一般由具有用于通气和混合培养内容物的工具(空气分布器、叶轮)的坚硬容器(玻璃或不锈钢)组成。这些系统是复杂的，因为大规模的生产基于不锈钢容器、原位灭菌，所以通常的设备和与无菌生物工艺相关的支持设施极端昂贵。60％以上的生产成本是由于固定成本：发酵装置的高资本成本、折旧、利息和资本消耗。由于产量低和每次培养周期后需要清洗和灭菌生物反应器，所以运行成本也高。
在植物细胞培养的特定工业应用中，已使用了不同的公知的培养系统诸如搅拌釜或气升式反应器。尽管对商业化植物代谢物做了许多努力，但是很少达到了商业成功。
一个原因是虽然可能获得高于整个植物所需要的化合物(迷迭香酸(rosmarinic acid)、紫草宁等)的较高含量，达干重的20％，但是生产力低。导致低生产力的主要限制为与细菌相比，植物细胞的低生长速率(低于每天0.7，最小20h倍增时间)。在工业发酵罐中分批培养意味着在极高成本设施中用植物细胞培养每年运行不超过10-20次。这意味着工业生产的瓶颈是经济瓶颈而不是生物瓶颈。
为了克服这些问题和降低生产成本，最近出现了基于使用多种一次性塑料袋代替不锈钢发酵罐的新技术。用预先灭菌的一次性塑料袋的这些新系统是有前景的，原因是由于塑料是低成本材料，而且它们不需要费时和费成本的清洗、灭菌、设备的验证和维修，它们降低了资本投资。由于提供的袋子是预先灭菌的，所以它可以通过非本领域技术人员操作，因此在该过程中它也具有更大的灵活性。
在此种一次性装置中提出了不同的通气/混合系统。WaveBiotech(Singh V，美国专利号6,190,913)研发了用置于振动机械装置上的膨胀袋子的系统，所述振动机械装置移动袋子，对其中含有的液体诱导波样运动。因为此种机械搅拌需要复杂的设备以达到高培养体积，所以振动机械装置限制了槽的大小。
另一建议是用机械系统搅拌或根本不搅拌的可透过气体的塑料袋。在美国专利号5,057,429中，将气体可透过的袋子旋转或振动使氧气和营养物向动物细胞扩散。美国专利号5,225,346中也描述了静止的气体可透过的袋子。至今对此类培养系统没有进行工业研发，一方面是因为放大外部搅拌装置是困难的，另一方面是由于在含有几升培养基的静止袋子中向细胞供应的氧气不充足的问题。
反应器可以由槽中具有气体喷雾的塑料袋和有接种和除去培养基样品能力的头板组成。Osmotec生产的一次性圆锥形塑料袋用于小规模使用(几升)，通过进气口用气泡通气。美国专利号6,432,698也描述了培养微生物或细胞的一次性生物反应器，所述一次性生物反应器除了在这里用塑料材料制备外，包含气体扩散器，其用于产生混合和提供气体的气泡，接近气升式生物反应器。
在这些发明中，有两个主要限制：在高密度或大体积的培养物时，需要在整个反应器中产生较小的气泡或液体循环以实现方便的混合和通气。这导致了与简单的一次性技术不一致的复杂的鼓泡系统(气体扩散器、分配槽……)。此外，小气泡对敏感细胞是有害的，增加了细胞与壁的粘附，和/或从培养基中剥夺了一些有用的气体(例如用于植物细胞的乙烯)。
气泡用于生物反应器或发酵罐的通气是公知的。当前用扩散器注射微气泡以改善气体转移到培养基中。通过气流进行通气和搅拌而不需要机械搅拌的生物反应器也是公知的，当前被专家称为气升式生物反应器。例如美国专利-A-4,649,117描述了用于进行细胞培养和发酵的气升式生物反应器的培养系统。合适的气体流速范围在10至300cc/分钟，气体温和地连续冒泡，没有提及我们的发明中气泡的大小或定期产生单个大的气泡。使用了两个腔，一个生长腔和一个混合腔。
已知用称为“大”，但小于3cm3的单个气泡用于混合和掺和多种材料，诸如化学品、饮料或油。WO-A-8503458描述了气体诱导的混合和掺和，而不考虑活细胞的生长和培养的方法和装置。该方法基于预定可变大小的气泡和通过一个或几个进气口注射到槽中的频率。此目的是降低掺和和混合的总时间，这不是我们的发明的目的。进行注射以获得单个气泡或一些单个气泡，气泡的大小和空气的量是经验确定的，气泡不应太大(引用1立方英寸(2.54cm3))、不是特定的直径接近槽直径的气泡。这与我们的发明十分不同，在我们的发明中气泡大小和空气的量对活细胞的生长是关键的。在WO-A-8503458中，在一些进气口的情况下，产生一些具有圆形、垂直环形流型的单个气泡。WO-A-8503458的发明用于开放或开口槽，所述开放或开口槽不适合在无菌条件下培养活细胞。
美国专利-A-4,136,970也描述了用于调节混合液体所用的气泡的大小和频率的方法和装置。它自身不考虑活细胞的充氧和培养，不考虑将气泡大小最大化，并且不考虑大于1.5cm3的大气泡。在美国专利-A-4,136,970中描述的方法可以用于计数血小板但决不适合用于或要求用于培养和生长活细胞。
本发明的目的是通过一次性装置提供低成本的细胞培养系统，所述低成本细胞培养系统在大规模上有效并且易于使用。
发明概述
本发明涉及预灭菌的柔性或非柔性塑料袋，在所述塑料袋中通过单个大的气泡搅拌/通气来培养细胞。
在本发明中，在部分充满液体培养基和细胞的柱子的底部间歇产生单个大的气泡。由于该大气泡几乎充满柱子的横切面，所以它在气泡和圆柱型槽的侧壁之间形成薄空隙，在其中液体可以随气泡上升而流动。与气泡接触的此滴流液体膜允许装置中的内容物在运行期间方便的混合和通气而不损伤细胞。
由于在薄液膜水平发生氧气和质量转移反应，因此此种混合/通气系统允许有效的放大。此外，由于该系统设计简单，因此可以大大降低资本和维持成本。
此种一次性装置由沿着边缘密封以形成柱体的可灭菌和柔性塑料布制成。由于不需要常规不锈钢设备中所需的清洗、灭菌、维持或验证，因此此种一次性系统允许方法灵活性并且降低了失效时间。
由于本发明是一次性的和在大规模上是有效的，所以在工业应用中它是降低生产成本的好的备选系统。
该培养系统可用于悬浮或固定在不同载体系统中的植物、动物、昆虫或微生物培养物。该方法允许通过分批培养、补料分批培养或连续培养产生多种分子，如代谢产物(从头形成或通过生物转化)或重组蛋白质，或繁殖胚胎发生的植物细胞系，以及技术人员显而易见的任意其它用途。
附图简述
图1为装置的侧视图，显示袋子和通过上升气泡产生的现象。
图2为塑料袋至管道结合处的侧视图。
图3为用于产生和控制气泡频率和大小的pneumatic和电路的示意图。
图4显示倒圆锥形式的槽的上面部分的顶部。
图5显示烧瓶、搅拌槽反应器和细胞培养系统中大豆细胞的生长动力学，表示为每升液体培养物的鲜重。
图6显示烧瓶、搅拌槽反应器和细胞培养系统中大豆细胞的生长动力学，表示为每升液体培养物的干重。
发明详述
本发明涉及周期性产生的(无论何种方法获得它们)具有与生物反应器之一自身尽可能接近的直径的非常大的单个气泡用于细胞培养的通气/搅拌(提供有效的充氧)的用途。结果是培养基作为大气泡和生物反应器的内壁之间的非常薄的膜流动。
在如图l中显示的基本设计中，生物反应器(或反应器)由不同部分组成，包含至少一个槽(1)，所述槽由例如沿着它们的边缘(2)密封的塑料布制成，例如以产生内部。该槽是静止的。在本发明优选的实施方案中，槽由具有可密封并且可高压灭菌性质的柔性聚丙烯制成，因此它可以用小型实验室高压灭菌器或通过本领域公知的其它方法灭菌。然而其它类型的材料诸如Pyrex、不锈钢、半柔性、硬质或模制塑料等等也是合适的，并且可以使用本领域技术人员已知的任意方法诸如γ辐射灭菌。
在本发明优选的实施方案中，柔性生物相容防水材料沿着它们的边缘(2)热密封，例如，用热脉冲密封器热密封。然而根据本领域公知的方法，也可以使用其它密封技术，包括但不限于超声或无线电波焊接。可以不同的方式例如模注射制备其它类型的塑料。
在本发明中，如图1显示地，反应器可以是圆柱状，或可以具有椭圆形横截面，对于20升的工作体积，它可以为2m高，直径可以为12cm。
根据本发明可以使用较小或较大的体积。例如反应器的直径可以小到5cm和可以大到40cm或40cm以上。反应器的高度可以根据使用者需要和选择的直径而变化。
反应器可以具有不同形状但优选形状的高度为宽度的至少5倍。例如它可以为平行六面体。槽(1)的尺寸和形状可以变化以适合使用者的需要；然而，优选圆柱形。在悬浮培养细胞时，避免死腔(dead space)是重要地，在所述死腔中不发生混合。死腔优先在角落出现，那就是为什么对于细胞培养优选将反应器制作成圆底，在角落中，细胞趋向于形成密集聚集物(诸如植物细胞)，其比单个细胞更快速沉降。
如果槽由柔性物质，诸如塑料制成，推荐将所述槽置于坚硬的外容器中以支持槽的形状和重量。此种坚硬容器可以由任意材料诸如聚碳酸酯制备，但应主要选择此种材料的硬度和强度性质(通过厚度和/或组成决定)。如果塑料袋也是透明的，此种外容器可以是透明的以利于观察培养物(3)或例如在生长光自养细胞时改善光透过。外容器的尺寸和形状优选根据以上讨论的槽的尺寸和形状设计。
在图1显示的基本设计中，至少四个管子与槽连接。第一个管子在顶部用于除去多余气体(4)。第二个管子在槽的底部(5)，用于通过气泡(6)向液体培养物提供空气。在最优选的实施方案中，这些管子装备了过滤器(7)，例如0.22μm过滤器以防止空气传播的污染。进气管可以装备阀门以防止管中液体的倒流。此外，一个入口管(8)位于槽顶部允许用无菌培养基和接种物填充生物反应器，一个出口管(9)位于底部附近可以用于培养批(culturebulk)的收获和/或取样。
在优选的实施方案中，管子是半柔性的，由可高压灭菌的硅酮制成，但也可以用其它类型的管子如C-flex或PVC。在本发明优选的实施方案中，管子的内径为8mm，而进气管较大：直径为11mm。在本发明中，管子的长度大约为1至2米，但使用者根据需要可以调整这些尺寸。
根据标准技术诸如热密封，管子与槽可以通过将结合部分焊接在塑料布上连接。在本发明优选的实施方案中，如图2中显示地，管子与槽通过塑料布中的一个孔与装有螺栓(11)和接缝(12)的可高压灭菌的嵌板固定连接器(panel mount union)(10)连接。通过旋紧螺栓以夹紧塑料布上的接缝可以使得不渗透。嵌板固定连接器的内径与本发明中对应管子的内径相同，但可以根据需要调整尺寸。
然而，应当理解可以将允许空气或气体循环的任意方法适合本发明。对于本发明的目的重要的是通过大的气体/空气泡，和优选地通过每几秒产生的、直径由槽直径决定的单个大的气泡实现培养基的通气和混合。因此本发明优选的混合和通气方法在于长度大于宽度的气泡。然而，当气泡长度与宽度相同时，此系统也是可行的。
优选地，大气泡的形状由槽的形状确定；换言之，气泡与槽之间的空隙限制在最低：限制到包含细胞的培养基膜。优选地，培养基作为大气泡和生物反应器内壁之间的非常薄的膜流出。然而，当膜较不薄并且气泡占槽宽度的50至99％，优选60至99％，更优选98.5％时，系统也工作。
对于大气泡，应当理解每个单个的和大的气泡的体积至少为65cm3，更优选至少为500cm3。例如，在直径大约20cm的反应器中，对于大气泡优选的体积可以为2600到4100cm3，或更优选3000到4100cm3，或甚至更优选3500或3700到4100cm3变化。
为产生大气泡，气泡发生器(13)与进气管连接。如图3显示地，气泡发生器例如为通过定时器(18)控制并与气泵(19)连接的电门(electro-gate)(17)。在此种结构中，通过定时器用电控制的电门，直接与进气口和气泵连接。定时器(通过使用者变成)在非常短的时间内向电门有规律地发送电信号。在此期间，电门开放，允许泵供给的气体进入生物反应器。在柱子中非常短的时期供给高流量的气体时，产生几乎充满柱子横截面的单个大的气泡。在本发明中，电门的截面为15mm，气泵的气压为0.5巴，电信号每5秒发送一次，持续0.1秒，因此每5秒产生一个大气泡。使用者可以根据需要调整这些参数。
此类气泡发生器是优选的，但也可以使用允许在柱子中产生大气泡的其它设备。在本发明中，使用的气体为空气，但可以使用单独或混合或自生物反应器回收的其它气体来满足细胞的需要，例如用于光自养植物细胞的CO2。
当气泡达到柱子顶部时以某种方式破裂，一些培养基/细胞可以在槽的壁上(1)损失。为避免此种缺点，在本发明的一个实施方案中，槽的上部向外展开(flare)，例如在优选的实施方案中，它为倒圆锥形的形状，使培养基/细胞可以再落回到槽中(图4中通过箭头20表示)。
在运行期间发生蒸发，降低了培养物体积并在培养基中浓缩了不同化合物，这对细胞可以是有害的。为避免这些问题，可能加入设备，诸如用于废气的冷凝器或用于气体供应的增湿器。此外，可能向柱子连接更多的入口和/或出口管，它可用于，例如加入酸、碱、消泡剂或导出溶液。可以向此培养系统中加入用于控制和/或调节培养条件的任选设备，诸如(但不限于)温度计、pH计、气体评估系统、细胞密度、压力控制和质量控制……也可能在生物反应器周围放置例如光发生器用于光自养植物细胞。通过不同的系统可以实现生物反应器中温度的调节，所述系统为诸如(但不限于)在温度通过合适的空气调节控制的房间中放置生物反应器、使用外套外容器，其中提供温度调节的水或空气循环或本领域技术人员已知的任意其它方法。
本发明基于液体培养物在上升的气泡(6)和生物反应器侧壁之间滴流(如图1中通过箭头(14)显示)这一事实。这导致旋涡(15)以混合培养物，避免了细胞沉积，并导致在薄液体膜(16)与气泡(6)接触，其中容易地实现了质量转移用于通气。
由于使用者可以通过程序设计前面描述的气泡发生器选择气泡的体积和频率，因此此培养系统易于操作。
可以用本发明的系统生长活细胞，诸如植物细胞、动物细胞或微生物，例如酵母细胞。所述细胞可以产生例如生物量细胞、胚胎发生的植物细胞、代谢物、次生植物代谢物和/或重组分子。
实施例
以下实施例用于阐明本发明范围内的一些产物和制备所述产物的方法。不将该实施例认为是以任意方式限制本发明。可以对本发明进行改变和修改。即，技术人员将认识到该实施例中的许多变化以覆盖宽范围的配方、成分、加工和混合物以对多种应用合理地调节本发明化合物的天然存在的水平。
实施例：用大豆细胞培养物比较生长
本发明的生长大豆细胞的能力用分批培养得到证实。甚至在较大规模时，这比得上或好于锥形瓶或搅拌釜生物反应器。
Glycine max(L.)Merr.的组织培养株最初来自用Gamborg等人的培养基(1968)培养的不同品种，所述培养基添加20g.L-1蔗糖、7g.L-1琼脂(bacto-agar Difco)和lmg.L-12，4-二氯苯氧基乙酸。将pH调整到5.8，然后高压灭菌(115℃，30分钟)。将一株(13406，cv.Maple arrow)转移到液体培养基中(与无琼脂和30g.L-1蔗糖的组织培养物相同的培养基)，在与组织培养物中心相同的条件下，每两周在250mL锥形瓶(100mL培养基具有3g.L-1鲜重)中传代培养。将锥形瓶置于100转/分钟(摇动直径20mm)的定轨摇床上。
用与以上谈及的相同培养基和温度和pH条件，使用具有两个叶轮(每个叶轮有六个平面叶片)的14L搅拌釜生物反应器(New BrunswickScientific)。将含有9L新鲜培养基的生物反应器在115℃高压灭菌40分钟。将十四日龄大豆细胞从两个1L锥形瓶(500ml培养基)过滤。将300g鲜重的大豆细胞放到无菌槽的1L新鲜培养基中，所述无菌槽具有与生物反应器无菌连接用于接种的特定输出装置。将搅拌器速度调整到100转/分钟。用装备可灭菌氧探针(Ingold)和质量流速计的生物传感器，通过升高或降低空气流速将溶解氧维持在30％。
将称为大气泡柱(如以上描述)的25L细胞培养系统置入坚硬的外容器中，填充新鲜培养基中的20L大豆细胞(30g/L鲜重)。将室温调整到25℃，(如以上谈及的通过程序设计气泡发生器)每5秒产生一个12cm直径的气泡(大约10cm高)。
生长测定：在特定生长期从锥形瓶、搅拌釜生物反应器和大气泡柱取培养批的样品并测定样品体积。然后通过过滤将细胞从液体培养物中除去。对生物量称重(鲜重)。将此生物量的等分试样精确称重(大约1g)，置于100℃的干燥室24小时，然后再精确称重(干重)。
此实施例显示20L规模的柱子对细胞提供了温和的环境，比得上锥形瓶并且好于搅拌釜反应器。细胞损伤是有限的，在操作条件下质量和气体转移是有效的。
如以上已经谈及地，本发明提供了许多优点，所述优点又对于经济利益是关键的：
它提供了生长植物细胞的温和环境；
容易放大；
它是一次性的；
它易于操作。

Claims (9)

1.用于在液体培养基中培养活细胞的生物反应器，其包含：
-至少一个包围细胞和液体培养基的固定槽，和
-至少一种用于在容器底部导入单个大的气泡的工具，其中单个大的气泡的宽度为槽宽度的50至99％，优选60至99％，更优选98.5％。
2.根据权利要求1的生物反应器，其中单个大的气泡具有至少65cm3的体积。
3.根据权利要求1和2的生物反应器，其中生物反应器还包含至少一种用于程序设计大气泡体积和频率的工具。
4.根据权利要求1至3的生物反应器，其中槽为柔性的或非柔性的塑料袋。
5.根据权利要求1至4的生物反应器，其中固定槽由坚硬的外容器包围。
6.根据权利要求1至5的生物反应器，其中槽的上部分向外展开。
7.根据权利要求1至6的生物反应器，其中槽为圆柱状或具有椭圆形横截面。
8.根据权利要求1至7的生物反应器的用途，其中细胞为植物、动物细胞或微生物。
9.根据权利要求1至8的生物反应器的用途，其中细胞为产生生物量的细胞、胚胎发生的植物细胞、代谢物、次生植物代谢物和/或重组分子。
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