MXPA06005542A - Sistema de cultivo de celulas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un aparato novedoso para hacer crecer celulas cuando la camara de cultivo (1) esta llenada parcialmente con medio de cultivo liquido y celulas. Se obtiene mezclado y aireacion al generar de manera intermitente una unica burbuja (6) de gas grande en el fondo del biorreactor de columna, la anchura de la burbuja grande unica representa de 50 a 99% de la anchura del tanque, preferiblemente de 60 a 99%, de manera mas preferible 98.5%. El medio de cultivo fluye hacia fuera como una pelicula entre la burbuja grande y la pared interior del biorreactor. Esta burbuja ascendente permite el mezclado y aireacion del volumen. Dado que el diseno de la invencion es muy sencillo, es posible fabricarlo con material plastico flexible y utilizar el aparato como un sistema desechable. Ademas, tal principio de mezclado/aireacion minimiza danos a la celula debidos habitualmente a tensiones de cizallamiento y burbujas pequenas y permite un aumento de escala facil y eficaz desde una escala pequena a una grande. Tal sistema de cultivo a gran escala eficaz y desechable puede reducir en gran medida los costos de produccion.

Description

SISTEMA DE CULTIVO DE CÉLULAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de cultivo de células. Esta invención proporciona un sistema de cultivo nuevo, para hacer crecer células en general y en particular células vegetales . Dado que este aparato puede ser desechable y eficaz a gran escala, su uso permite una gran reducción en costos de producción en diferentes clases de aplicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los sistemas de cultivo convencionales generalmente están constituidos de un contenedor rígido (vidrio o acero inoxidable) que tiene un medio para aireado y mezclado del contenido de cultivo (un purgador de aire, impulsor) . Estos sistemas son complejos y el equipo habitual y las instalaciones de soporte relacionadas con bioprocedimientos asépticos son extremadamente costosos debido a que la producción en gran escala se basa en recipientes de acero inoxidable esterilizados in situ. Más de 60% de los costos de producción se deben a los costos fijos: los costos de capital elevados del equipo de fermentación, depreciación, interés y gasto de capital. Los costos de funcionamiento también son elevados debido a los bajos rendimientos y la necesidad de limpiar y esterilizar el biorreactor de cada ciclo de cultivo. En la aplicación industrial particular de cultivo de células vegetales se han utilizado diferentes sistemas de cultivo bien conocidos tales como un tanque agitado o reactores elevados con aire. Pese a los muchos esfuerzos por comercializar metabolitos vegetales, pocos han tenido éxito comercial. Una razón es la baja productividad pese a la posibilidad de obtener un contenido mayor de compuesto deseado en comparación con la planta completa (ácido rosmarínico, sikonina, etcétera) de hasta 20% del peso seco. La limitación principal lleva a una baja productividad lo que permanece con una velocidad de crecimiento baja (inferior a 0.7 día-1, min 20 h de tiempo de duplicado) en comparación con las bacterias. Utilizando un cultivo por lotes en un medio de termentador industrial para operar un máximo de 10-20 corridas al año con cultivo de células vegetales en instalaciones de muy alto costo. Esto constituye un cuello de botella para que una producción industrial sea más económica que una biológica. Para resolver estos problemas y disminuir los costos de producción aparecieron recientemente tecnologías nuevas que se basan en el uso de diversas bolsas de plástico desechables en vez del termentador de acero inoxidable. Estos sistemas nuevos utilizan bolsas de - - plástico desechables preestériles que son promisorias debido a que disminuyen la inversión de capital dado que el plástico es un material de bajo costo y además eliminan la limpieza, esterilización, validación y mantenimiento de equipo, lo cual consume tiempo y costos. También permite más flexibilidad en el procedimiento, el cual puede ser operado por personas no expertas en la técnica dado que las bolsas se proporcionan preestériles. Se han propuesto diferentes sistemas de aireación/mezclado en tales aparatos desechables. Wave Biotech (Singh V, Patente de E.U.A. No. 6,190,913) ha desarrollado un sistema utilizando una bolsa inflada colocada en un mecanismo oscilante que mueve la bolsa induciendo un movimiento similar a ola en el líquido contenido en su interior. El mecanismo oscilante limita el tamaño del tanque debido a que dicha agitación mecánica necesita equipo complejo para alcanzar altos volúmenes de cultivo. Otra sugerencia es utilizar bolsas de plástico permeables al gas agitadas con un sistema mecánico o no agitadas de modo alguno. En la Patente de E.U.A. No. 5,057,429 una bolsa permeable al gas se hace girar o se agita para difundir oxígeno y nutrientes a las células animales. También se describe una bolsa permeable a gas, estática, en la Patente de E.U.A. No. 5,255,346. Hasta ahora no ha habido un desarrollo industrial para tales sistemas de cultivo debido principalmente, por un lado, a que es difícil incrementar la escala en un aparato de agitación externo y, por la otra, a que existen problemas debido a un suministro insuficiente de oxígeno a las células en una bolsa estática que contiene varios litros de medio de cultivo. Un reactor puede consistir de una bolsa de plástico purgada con gas en un tanque con una placa superior que tiene capacidades para inoculación y extracción de muestra de medio. Las bolsas plásticas cónicas desechables producidas por Osmotec son para uso a pequeña escala (algunos litros) utilizando burbujas de aire para aireación a través de la entrada. La Patente de E.U.A. No. 6,432,698 también describe un biorreactor desechable para cultivar microorganismos o células, que comprende un burbujeador de gas, generar burbujas de gas para mezclar y proporcionar gases, cerrar el biorreactor de elevación por aire excepto si se elabora el mismo de material plástico. En estas invenciones existen dos limitaciones principales: alta densidad o altos volúmenes de cultivo, existe la necesidad de crear burbujas de gas más pequeñas de circulación de fluido en la totalidad del reactor para obtener un mezclado y aireación convenientes . Esto resulta en sistemas complejos de burbujeado (difusores de gas, tanques divididos ... ) , lo cual o concuerda con la tecnología desechable sencilla. Además, las burbujas pequeñas son perjudiciales para células sensibles, incrementando la adhesión de la célula a las paredes y/o la separación de ciertos gases útiles del medio de cultivo (por ejemplo etileno para células vegetales) . Es bien conocido el uso de burbujas de gas para la aireación de biorreactor o termentador. Actualmente se utiliza un difusor que inyecta microburbujas para mejorar la transferencia del gas al interior del medio de cultivo. El biorreactor en donde la aireación y también la agitación se realizan a través de una corriente de gas sin agitación mecánica es bien conocido y actualmente se denomina biorreactor de elevación de aire por los especialistas. Por ejemplo, la Patente de E.U.A. -A-4,649,117 describe el sistema de cultivo de un biorreactor de elevación de aire, útil para llevar a cabo el cultivo y fermentación celulares . El caudal de gas adecuado está en el intervalo de 10 a 300 cc/ in, y el gas se burbujea continuamente de manera suave, sin ninguna referencia al tamaño de las burbujas o la generación periódica de burbujas grandes únicas como en nuestra presente invención. Se utilizan dos cámaras, una cámara de crecimiento y una cámara de mezclado . El uso de una burbuja única, denominada como "grande" pero inferior a 3 cm3, se conoce para mezclado y combinado de varios materiales tales como sustancias químicas, bebidas o aceites. El documento WO-A-8503458 describe un método y aparato para mezclado y combinación inducida en un gas, que no se relaciona con el crecimiento y cultivo de células vivas. En método se basa en burbujas de gas de un tamaño y frecuencia variables predeterminados inyectados en un tanque a través de una o varias entradas de aire. Los objetivos son reducir el tiempo total de combinación y mezclado, el cual no es uno de los nuestros en la presente invención. La inyección se realiza para obtener una burbuja única o varias burbujas únicas, el tamaño de la burbuja y la cantidad de aire son una determinación empírica y la burbuja no debe ser demasiado grande (28,316.8 cm3 (un pie cúbico) mencionado), no es específicamente una burbuja con un diámetro cercano a uno del tanque . Esto es muy diferente de nuestra presente invención, en donde el tamaño de la burbuja y la cantidad de aire es crítica para el crecimiento de las células vivas. En el documento WO-A-8503458, en caso de varias entradas de aire, se generan varias burbujas únicas que tienen patrones de flujo toroidal vertical circular. En el documento WO-A-8503458 la invención se utiliza para abrir o ventilar tanques, lo cual no es compatible con el cultivo de células vivas bajo condiciones estériles.

La Patente de E.U.A. -A-4,136,970 describe también un método y aparato para regular el tamaño y frecuencia de burbujas utilizadas para mezclas líquidos. En sí mismo no se relaciona con la oxigenación y cultivo de células vivas, no se relaciona con maximización del tamaño de las burbujas y no se relaciona con una burbuja mayor de 1.5 cm3. El método descrito en la Patente de E.U.A. -A-4,136,970 se puede utilizar para la cuenta de plaquetas en sangre pero en ningún caso se puede adaptar, utilizar o reclamar para el cultivo y crecimiento de células vivas. El objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema de cultivo de células de bajo costo vía un aparato desechable, el cual es eficaz a gran escala y fácil de utilizar.

DESCRIPCIÓN BREVE La presente invención consiste de una bolsa de plástico flexible o no flexible preesterilizada en la cual se cultivan las células, al ser agitadas/aireadas por una burbuja de gas grande y única. En la presente invención, la burbuja de gas grande y única se genera intermitentemente en el fondo de la columna rellenado parcialmente con medio líquido y células. Conforme la burbuja grande casi alcanza la sección transversal de la columna, genera un espacio delgado entre la burbuja y las paredes laterales del tanque cilindrico en donde el líquido puede fluir conforme asciende la burbuja. Esta película líquida que escurre, en contacto con la burbuja de gas, permite mezclado y aireación convenientes del volumen en el aparato durante el funcionamiento, sin dañar las células. Tal sistema de mezclado/aireación permite un incremento de tamaño eficaz dado que las reacciones de transferencia de oxígeno y de masa se producen a nivel de película líquida delgada. Además, dado que el sistema se diseña de manera sencilla, se reducen en gran medida los costos tanto de capital como de mantenimiento . Este aparato desechable se fabrica de láminas de plástico esterilizables y flexibles selladas a lo largo de sus bordes para formar una columna. Tal sistema desechable permite flexibilidad en el procedimiento y disminuye el tiempo inútil dado que no se requiere limpieza, esterilización, mantenimiento o validación como en los dispositivos tradicionales de acero inoxidable. Dado que la presente invención es desechable y eficaz a gran escala, es un buen sistema alternativo para disminuir los costos de producción en aplicaciones industriales . Este sistema de cultivo de puede aplicar para cultivo de plantas, animales, insectos o microorganismos en suspensión o inmovilizados sobre sistemas portadores diferentes . El procedimiento permite producir una gran variedad de moléculas como metabolitos (de novo o vía biotransformación) o proteínas recombinantes o multiplicar una línea de célula vegetal embriogénica a través de un cultivo por lote, de alimentación por lote o continua así como cualquier otro uso que pueda ser evidente para una persona experta en la técnica.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una vista lateral del aparato, que muestra la bolsa y los fenómenos generados por la burbuja ascendente . La figura 2 es una vista lateral de la bolsa de plástico a la conexión de tubería. La figura 3 es un esquema de los circuitos neumáticos y eléctricos útiles para la generación y control de la frecuencia y el tamaño de las burbujas. La figura 4 muestra la sección de arriba de la parte superior de un tanque en forma de un cono inverso. La figura 5 muestra la cinética de crecimiento de células de soya en matraces, en un reactor de tanque agitado y un sistema de cultivo celular, expresado en peso fresco por litro de cultivo líquido. La figura 6 muestra la cinética de crecimiento de - células de soya en matraces, un reactor de tanque agitado y un sistema de cultivo de células, expresado en peso seco por litro de cultivo líquido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención consiste en el uso de burbujas solas muy grandes, producidas periódicamente (cualquiera que sea el proceso para obtenerlas) que tienen un diámetro tan cercano como se pueda de uno del biorreactor mismo para aireación/agitación (proporcionando una oxigenación eficaz) de los cultivos de células. La consecuencia es que el medio de cultivo fluya hacia fuera conforme una película muy delgada entre la burbuja grande y la pared interior del biorreactor. En un diseño básico, como se muestra en la figura 1, el biorreactor (o reactor) está constituido de partes diferentes, que comprende por lo menos un tanque (1) elaborado de material, tales como hojas de plástico selladas a lo largo de sus bordes (2) , por ejemplo para crear un interior. El tanque es estacionario. En una modalidad preferida de la presente invención, uno o varios de los tanques se elaboran de polipropileno flexible por sus propiedades sellables y susceptibles de esterilización en autoclave. De manera que puede ser esterilizado en una autoclave de laboratorio pequeña o por cualquier otro medio bien conocido en la técnica. No obstante, otras clases de materiales también son adecuados tales como Pyrex1®, acero inoxidable, plásticos semiflexibles, rígidos o moldeados, entre otros y pueden ser esterilizados por cualguier método conocido por las personas expertas en la técnica, tal como radiación gamma. En una modalidad preferida de la invención, el material hermético al agua biocompatible y flexible se sella con calor a lo largo de sus bordes (2) por ejemplo con un sellador de impulso térmico. No obstante, también se pueden utilizar otras técnicas de sellado, de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica que incluyen pero que no se limitan a soldadura por ultrasonido u ondas de radio. Se pueden fabricar otras clases de plásticos de una manera diferente tal como inyección por moldes, por ej emplo . En la presente invención, como se muestra en la figura 1, el reactor puede ser cilindrico o puede tener una sección transversal ovalada, puede tener una altura de 2 m y su diámetro puede ser de 12 cm para un volumen de trabajo de 20 litros. Se pueden utilizar volúmenes mayores o menores, de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el diámetro del reactor puede ser tan pequeño como 5 cm y puede crecer hasta 40 cm o más. La altura del reactor puede variar de acuerdo a las necesidades del usuario y el diámetro seleccionado. El reactor también puede tener formas diferentes pero preferiblemente la altura de la forma es por lo menos 5 veces su anchura. Se puede poner, como ejemplo un paralelepípedo. Las dimensiones y la forma del tanque (1) se puede hacer variar para adecuarse a las necesidades del usuario; no obstante, se prefiere la forma de columna cilindrica. Es importante evitar espacio inútil, en donde no se produzca mezclado, cuando se cultivan células en suspensión. Los espacios inútiles aparecen de manera preferencial en las esquinas, y es el motivo por el cual se prefiere la elaboración de fondos redondos principalmente con células, las cuales tienden a formar agregados densos (tales como células vegetales) las cuales sedimentan más rápidamente que las células individuales . Si el tanque se fabrica de un material flexible, tal como plástico, se recomienda colocar dicho tanque en un recipiente exterior rígido para soportar la forma y peso del tanque. Este contenedor rígido se puede elaborar de cualquier material tal como policarbonato pero este material se seleccionará principalmente por sus propiedades de rigidez y tenacidad (determinado por el espesor y/o la formulación) . Este contenedor exterior puede ser translúcido para facilitar la observación del cultivo (3) si la bolsa plástica también es translúcida o mejorar la transmisión de luz cuando se hace crecer células fotoautotróficas . Por ejemplo. Las dimensiones y formas de los contenedores exteriores preferiblemente se diseñan de acuerdo con las dimensiones y formas del tanque discutido antes . -En el diseño básico que se muestra en la figura 1, se conectan al tanque por lo menos cuatro tubos. El primero, en la parte superior, se utiliza para eliminar el exceso de gases (4) . El segundo, en la parte inferior del tanque (5) se utiliza para proporcionar aire a un cultivo líquido a través de la burbuja de gas (6) . Estos tubos están equipados, en la modalidad más preferida, con filtros (7) tales como, por ejemplo, filtros de 0.22 µm para evitar contaminación transportada por el aire . La tubería de entrada de aire puede estar equipada con una válvula para evitar el retroflujo del líquido en el tubo. Además, un tubo (8) de entrada que se localiza en la parte superior del tanque permite llenar el biorreactor con medio estéril e inoculo, y un tubo (9) de salida localizado cerca del fondo puede ser necesario para cosechar y/o muestrear el volumen de cultivo. En una modalidad preferida también se puede utilizar tubería semiflexible, elaborada de silicona susceptible de esterilización por autoclave, pero también se pueden utilizar otros tipos de tubería como C-flex o PVC. En una modalidad preferida de la presente invención, los diámetros interiores de la tubería son de 8 mm, excepto para la tubería de entrada, la cual es mayor: de 11 mm de diámetro. Las longitudes de la tubería son de aproximadamente 1 a 2 metros en esta invención pero los usuarios, para satisfacer requerimientos, pueden ajustar estas dimensiones. La tubería se puede conectar al tanque vía un orificio de incorporación soldado sobre la lámina de plástico, de acuerdo con técnicas estándar tales como sellado por calor. En la modalidad preferida de la presente invención, como se muestra en la figura 2, la tubería se conecta al tanque a través de un orificio en la lámina de plástico a una unión (10) de montaje de panel susceptible de esterilización por autoclave equipado con pernos (11) y costuras (12) . Se puede obtener una condición impermeable por atornillado de pernos a costuras remachadas sobre la lámina de plástico. Los diámetros interiores de la unión de montaje de panel son iguales a los diámetros interiores de las tuberías correspondientes en esta invención, pero es posible ajustar las dimensiones según se necesite. No obstante, debe entenderse que cualquier medio que permita que circule el aire o el gas se puede adaptar a la presente invención. Para los propósitos de la presente invención, es importante que la aireación y el mezclado del medio se obtengan por burbujas de gas/aire grandes y preferiblemente por una única burbuja grande generada cada pocos segundos, que tenga su diámetro determinado por el diámetro del tanque. En consecuencia, el medio preferido de mezclado y aireación de la invención consiste en una burbuja que es más larga que ancha. No obstante, el sistema también trabaja cuando las burbujas son tan grandes como anchas . Preferiblemente, la forma de la burbuja grande está determinada por la forma del tanque; en otras palabras, el espacio entre la burbuja y el tanque se limita a un mínimo: a una película de células que comprenden medio. Preferiblemente, el medio de cultivo fluye alejándose como una película muy delgada entre la burbuja grande y la pared interior del biorreactor. No obstante, el sistema también funciona cuando la película es menos delgada y la burbuja representa de 50 a 99% de la anchura del tanque, preferiblemente de 60 a 99%, y de manera más preferible de 98.5%. Mediante el término burbujas grande, debe entenderse que el volumen de cada burbuja única y grande es de por lo menos 65 cm3, de manera más preferible por lo menos 500 cm3. Por ejemplo, en reactores que tienen un diámetro de aproximadamente 20 cm, los volúmenes preferidos para las burbujas grandes pueden variar entre 2600 y 4100 cm3, de manera más preferible entre 3,000 y 4,100 cm3 o incluso de manera más preferible entre 3,500 o 3,700 y 4,100 cm3. ' Para crear burbujas grandes, un generador (13) de burbujas está unido a un tubo de entrada de aire. El generador de burbujas, como se muestra en la figura 3, es por ejemplo una electrocompuerta (17) controlada por un temporizador (18) y unida a una bomba (19) de gas. En tal configuración, la electrocompuerta, controlada eléctricamente por un temporizador, se une directamente a una entrada y una bomba de gas. Regularmente, el temporizador (programado por los usuarios) envía una señal eléctrica a la electrocompuerta por un período de tiempo muy corto. Durante este tiempo, la electrocompuerta se abre y permite que el gas suministrado desde la bomba entre al biorreactor. Cuando un flujo alto de gas es suministrado por un período de tiempo muy corto en la columna, genera una columna única y grande, la cual llena casi la totalidad de la sección transversal de la columna. En la presente invención, la sección de la electrocompuerta es de 15 mm, la presión de aire en la bomba de gas es de 0.5 bar y la señal eléctrica, durante 0.1 segundos, es enviada cada 5 segundos con lo que se genera una burbuja grande cada 5 segundos. Los usuarios, en base en sus necesidades, pueden ajustar estos parámetros. Esta clase de generador de burbuja se prefiere, pero también se pueden utilizar otros dispositivos que permitan la creación de una burbuja de gas grande en la columna. En la presente invención, el gas utilizado es aire, pero se pueden utilizar otros gases, solos o mezclados, o reciclados del biorreactor, para satisfacer los requerimientos de las células, por ejemplo C02 para células vegetales fotoautotróficas . Cuando la burbuja llega a la parte superior de la columna, de alguna manera explota y parte del medio/células se pueden perder en las paredes del tanque (1) . Para evitar esta desventaja, en una modalidad de la presente invención, la parte superior del tanque está ahusada o abocardada, por ejemplo en la modalidad preferida está en forma de un cono inverso, de manera que el medio/células puedan descender de regreso nuevamente al tanque (simbolizado en la figura 4 por flechas 20) . Durante la operación se produce evaporación, lo que reduce el volumen de cultivo y concentra diferentes compuestos en el medio, lo cual puede ser perjudicial para las células. Para evitar estos problemas, es posible agregar dispositivos tales como condensadores para gas de escape o humidificadores para suministro de gas. Además, es posible conectar más tubería de entrada y/o salida a la columna, lo cual puede ser útil, por ejemplo, para agregar soluciones acidas, bases, antiespumantes o de elicitation. Los dispositivos opcionales se pueden agregar a este sistema de cultivo para control o regulación de las condiciones de cultivo tales como (pero sin limitarse a) termómetro, medidor de pH, sistemas de evaluación de gas, densidad celular, control de presión y control de masa. También es posible colocar un aparato generador de luz alrededor del biorreactor, por ejemplo, para células vegetales fotoautotróficas . La regulación de temperatura en el biorreactor se puede obtener por diferentes sistemas tales como (pero sin limitarse a) colocar el biorreactor en un cuarto en donde la temperatura esté controlada vía un acondicionamiento adecuado de aire, utilizando contenedores exteriores con chaqueta en donde se proporciona circulación de agua o aire con temperatura regulada, o cualquier otro medio conocido por una persona experta en la técnica . La presente invención se basa en el hecho de que el cultivo líquido se escurre entre la burbuja de gas (6) ascendente y las paredes laterales del biorreactor (como se muestra por las flechas (14) en la figura 1) . Esto resulta en remolinos (15) para mezclar el volumen, evitando que las células sedimenten y en una película (16) líquida delgada en contacto con las burbujas (6) de gas en donde se puede obtener con facilidad la transferencia de masa para aireación. Este sistema de cultivo es fácil de operar dado que un usuario puede seleccionar el volumen y la frecuencia de las burbujas al programar el generador de burbujas como se ha descrito previamente . El sistema de la invención se puede utilizar para hacer crecer células vivas tales como, por ejemplo, células vegetales, células animales y microorganismos tales como células de levadura, por ejemplo. Las células pueden producir, por ejemplo, células en biomasa, células vegetales embriogénicas, metabolitos, metabolitos vegetales secundarios o moléculas recombinantes.

Ejemplo El siguiente ejemplo es ilustrativo de algunos de los productos y métodos para elaborar los mismos, que se encuentran dentro del alcance de la presente invención. De ninguna manera se considera como limitante de la invención. Pueden realizarse cambios y modificaciones con respecto a la invención. Esto es, una persona experta en la técnica reconocerá muchas variaciones en este ejemplo para cubrir una amplia gama de fórmulas, ingredientes, procesamiento y mezclas para ajustar de manera razonada los niveles como se encuentran en la naturaleza de los compuestos de la invención para una diversidad de aplicaciones.

Ejemplo: Comparación del crecimiento con cultivos de célula de soya La capacidad de la invención para hacer crecer células de soya se ha demostrado utilizando cultivos en lote. Esto es comparable o mejor que un matraz Erlenmeyer o un biorreactor de tanque agitado, incluso a una escala mayor. Las cepas de cultivo de tejido de Glycine max (L:) Merr. Se inician de diferentes productores en medio Gamborg et al. médium (1968) suplementado con 20 g/1 de sacarosa, 7 g/1 de agar (bacto-agar Difco) y 1 ml/1 de ácido 2, 4-diclorofenoxiacético. El pH se ajusta a 5.8 antes de esterilización en autoclave (30 min a 115°C) . Se transfiere una cepa (13406, cv. Maple arrow) en medio líquido (el mismo medio que para los cultivos de tejido sin agar y 30 g/1 de sacarosa) y se subcultiva en un matraz Erlenmeyer de 250 ml (3 g/1 de peso fresco con 100 ml de medio) cada dos semanas . En las mismas condiciones que la recolección de cultivo de tejido. Los matraces Erlenmeyer se colocan en un agitador orbital a 100 rpm (diámetro de agitación, 20 mm) . Se utiliza un biorreactor de tanque agitado de 14 1 (New Brunswick Scientific) con dos impulsores de seis aspas planas, con el mismo medio y condiciones de temperatura y pH que los mencionados antes. El biorreactor que contiene 9 1 de medio fresco se esteriliza en autoclave durante 40 min a 115°C. Se filtran células de soya de 14 días de edad de dos matraces Erlenmeyer de 1 1 (500 ml de medio) . Se colocan 300 g de peso fresco en 1 1 de medio fresco en un tanque estéril con una salida específica que se va a conectar asépticamente al biorreactor para inoculación. Se ajusta la velocidad del agitador a 100 rpm. El oxígeno disuelto se mantiene a 30% por aumento o disminución del caudal de aire, utilizando un biocontrolador equipado con una sonda de oxígeno esterilizable (Ingold) y un flujómetro de masa. Un sistema de cultivo de célula de 25 1, denominado columna de burbuja grande (como se ha descrito previamente) , colocado dentro del recipiente exterior rígido, se llena con 20 1 de células de soya en medio de cultivo fresco (30 g/1 de peso fresco) . Se regula la temperatura de la habitación a 25°C y se genera una burbuja de 12 cm de diámetro (aproximadamente 10 cm de altura) cada 5 segundos (al programar el generador de burbuja como se menciona en lo anterior) . Mediciones de crecimiento: las muestras del volumen de cultivo se toman en ciertos períodos de crecimiento a partir de matraces, biorreactor de tanque agitado y una columna de burbuja grande y se mide el volumen de muestra. Las células después se separan del cultivo líquido vía filtración. Se pesa la biomasa (peso fresco) . Una alícuota de esta biomasa (aproximadamente 1 g) se pesa con precisión y se coloca en un cuarto de secado a 100°C durante 24 horas y después se pesa con precisión nuevamente (peso seco) . Este ejemplo muestra que la columna de escala de 20 1 proporciona un ambiente suave para las células, comparable con los matraces y mejor que un reactor de tanque agitado. Los daños a las células son limitados y las transferencias de masa y de gas son eficaces en las condiciones operadas . Como se ha mencionado ya en lo anterior, la presente invención proporciona numerosas ventajas las cuales a su vez son claves para beneficios económicos: Proporciona una mejoría suave para el crecimiento de células vegetales . Es fácil el aumento de tamaño Es desechable Es fácil de operar.

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Biorreactor para cultivar células vivas en un medio de cultivo líquido, que comprende: por lo menos un tanque estacionario que encierra a las células y al medio de cultivo líquido, y por lo menos un medio para introducir burbujas de gas grandes y únicas en el fondo del recipiente, en donde la anchura de la burbuja grande y única representa 50% a 99% de la anchura del tanque, preferiblemente 60 a 99%, y de manera más preferible 98.5%.

2. Biorreactor como se describe en la reivindicación 1, en donde la burbuja grande y única tiene un volumen de por lo menos 65 cm

3. 3. Biorreactor como se describe en las reivindicaciones 1 y 2, en donde el biorreactor también comprende por lo menos un medio de programar volumen y frecuencia de burbujas grandes. . Biorreactor como se describe en las reivindicaciones 1 a 3 , en donde el tanque es una bolsa de plástico flexible o no flexible. 5. Biorreactor como se describe en las reivindicaciones 1 a 4, en donde el tanque estacionario está rodeado por un recipiente exterior rígido. 6. Biorreactor como se describe en las reivindicaciones 1 a 5, en donde la parte superior del - - tanque está abocardada. 7. Biorreactor como se describe en las reivindicaciones 1 a 6, en donde el tanque es cilindrico o tiene una sección transversal ovalada. 8. Uso del biorreactor como se describe en las reivindicaciones 1 a 7, en donde las células son células vegetales, animales o microorganismos. 9. Uso del biorreactor como se describe en las reivindicaciones 1 a 8, en donde las células son células productoras de biomasa, células vegetales embriogénicas, metabolitos, metabolitos de plantas secundarias o molécula recombinante .