CN1118563C

CN1118563C - 中空纤维模拟骨髓造血装置

Info

Publication number: CN1118563C
Application number: CN 00134185
Authority: CN
Inventors: 张君奎; 张永富; 张海玲; 杨少光; 田征; 黄志刚; 赵钧铭
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC; Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC; Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2003-08-20
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: CN1321741A

Abstract

中空纤维模拟骨髓造血装置，也称人工骨髓，属于一种体外造血细胞培养技术，该装置由中空纤维细胞培养管、微载体支持物及密封式灌注管道系统组成，其特征是中空纤维膜管可模拟血管输送营养物质，进行气体与物质交换，排除代谢废物；微载体与贴附的基质细胞可模拟骨髓造血微环境，支持体外造血，维持造血干细胞自我更新潜能，并刺激造血细胞增殖与分化。小鼠骨髓培养和脐带血细胞培养实验证明，在没有外加细胞因子条件下，中空纤维灌注培养方式明显优于常规方瓶及液体悬浮培养的效果。

Description

中空纤维模拟骨髓造血装置

本发明涉及一种体外造血技术，主要是为造血干、祖细胞移植进行临床前造血细胞培养与扩增提供技术设备。

骨髓以及造血干、祖细胞移植是重建造血与免疫功能、治疗某些严重血液病及恶性肿瘤的有效途径之一，也是基因治疗可供选择的方法之一。然而，造血细胞来源非常有限，为了获取这些细胞，人们寄希望于造血干、祖细胞的体外扩增和大规模培养。

目前体外培养与扩增造血细胞尚处于实验阶段。无基质细胞的培养体系加组合细胞因子配方仍然是当今的热门研究方向。这是一种液体悬浮培养体系，主要有多孔板和方瓶培养技术、可透气袋细胞培养技术以及小型生物反应器搅拌式灌注培养技术等。这类技术的缺陷在于培养造血细胞的条件与体内造血细胞生存的内环境条件相差甚远，而且各种组合细胞因子配方仍然不能阻止原始造血细胞的迅速分化与耗竭。另一方面，采用滋养层基质细胞支持造血细胞在体外培养与扩增也是当前倍受瞩目的发展方向，主要采用骨髓基质细胞或工程细胞来支持体外造血。这类技术在克服离体造血细胞迅速分化与耗竭方面有了很大的进步。但是，用消化与分散等方法转移基质细胞，将会造成不同程度的损伤，且在操作过程中容易造成污染而导致失败。

本发明所涉及的一种人工骨髓装置，主要采用中空纤维膜和微载体技术以及密封式无菌操作技术，模拟骨髓造血功能，可以有效地克服现有技术中存在的缺陷和不足，开辟体外培养和有效扩增造血细胞的新途径。经查阅血液学期刊并经计算机联网检索，在造血(Hematopoiesis)、中空纤维/膜(Membrane/Hollow Fiber)和人工器官(Artificial organ)领域内迄今未见有关报道，同时亦未见有与本发明技术特征相似的专利申请或文章发表。

本发明的要点是，该装置系由中空纤维制成的细胞培养管、微载体支持物及密封式灌注管道系统三部分组成。

一、细胞培养管：由可拆卸的部件组装而成，以便于收获培养增殖的细胞。这与现行的中空纤维生物反应器不同，后者的中空纤维细胞培养管不可拆卸，其目的是收获细胞产生的蛋白质产物。

本发明的细胞培养管由四部份组成：

1、中空纤维集束组成的柱状体(图1-5)，其两端采用树脂凝胶等(图1-7)封固并保留每根中空纤维管内腔管道的开口(图1-11)。空心的纤维外径一般为200至1000微米(μm)，是已知的醋酸纤维素或聚砜等膜材料。在两端树脂凝胶块间，沿中空纤维束柱状体的边缘，匀称地加了三条聚四氟乙烯制成的支持筋(图1-4)，柔软的中空纤维束在两个树脂凝胶块和三根支撑筋之间得到固定与保护。

2、套筒(图1-3)：可采用医用塑料等制成的两端开口的管筒，套装在中空纤维束柱状体外面。套筒与中空纤维膜管之间，形成了中空纤维膜的外腔；每根中空纤维膜的内部管道构成了中空纤维膜的内腔。

3、下盖(图1-2)：为套管下端的密封盖。盖与套筒端口之间构成了中空纤维膜内腔的共有汇集小室，并有硅橡胶O型垫圈密封(图1-10)。盖与套筒端口用法兰盘与螺栓加以连接紧固。盖的中心有支管(图1-1)接有无菌连接器，与管道系统相通，可引导管道系统的气、液流体从下盖支管汇集于小室，再进入每根中空纤维膜的内腔。

4、上盖(图1-8)：为套管上端的密封盖，结构同下盖，可将进入每根中空纤维内腔的气、液流体汇集于上盖小室，再从中心支管(图1-9)经无菌连接器排出，流进属于中空纤维内腔的管道系统。

二、细胞与微载体：

在细胞培养管内中空纤维膜的外腔，可接种造血细胞和骨髓基质细胞，而这些基质细胞事先被粘附在其支持物—微载体表面。微载体(图1-12)为已知的葡聚糖凝胶球体，粒珠直径约200微米，表面有变性胶原涂层。骨髓基质细胞(图1-13)可按一定比例数量接种于微载体上，待基质细胞在微载体上贴附牢固后，同将要培养的造血细胞(图1-15)混合，通过套筒的下支管(图1-14)接种进入中空纤维膜外腔。此外，亦可采用明胶微载体，它易于与纤维蛋白等细胞外基质蛋白结合。这种附有胞外基质的微载体，在与某些细胞因子结合后也具有支持体外造血的部分功能。

造血细胞是将要培养的细胞，可取自骨髓、外周血或脐带血，经过分离后取出有核细胞或单个核细胞；也可通过富集纯化取出CD34⁺(细胞分化抗原34阳性)细胞等原始造血细胞。造血细胞与微载体-基质细胞无菌混合后即可注入中空纤维培养管外腔，加培养液后可进行培养。培养期间可通过无菌连接器和下支管补充细胞所需营养物质。废培养液可通过套管的上支管(图1-6)排出。中空纤维薄膜管可模拟血管输送营养物质，进行气体与物质交换，排除代谢废物。微载体与贴附的基质细胞可模拟骨髓造血微环境，支持体外造血，维持造血干细胞自我更新潜能，并刺激造血细胞增殖与分化。最后通过无菌操作收获扩增的造血细胞；拆卸细胞培养管，取出中空纤维柱状体与细胞悬液，冲洗，分级沉降，去掉微载体，按常规操作收获细胞。再通过已知的免疫磁珠阳性选择技术等，分离出较纯净的原始造血细胞备用。

三、密封式灌注管道系统(图2)：

本发明采用改良的密封式灌注系统培养造血细胞，整个系统有两个循环回路：

1、中空纤维外腔循环回路：由火焰消毒无菌连接器(图2-2)、供液瓶/废液瓶(图2-3)、贮液瓶(图2-4)和泵(图2-5)等组成。泵驱动培养液经无菌连接器，从培养套筒下支管进入中空纤维外腔，灌注细胞后由套筒上支管排出，作为取样标本或废弃液；或用附加泵通过火焰消毒无菌连接器(图2-2)，由供液瓶(图2-3)加入新鲜培养基与试剂等，给造血细胞与基质细胞提供营养成分和添加剂，如各种细胞因子和血清等。此外，也可加入NaHCO₃等调节试剂对培养参数进行直接调控。外腔循环回路安装了火焰消毒无菌连接器(图2-2)，这是一种多功能无菌接口，实现了添加新鲜培养基、取样以及排除废液等密封式无菌操作，可使批量培养细胞操作简便，也可保证操作过程无污染。

2、中空纤维内腔循环回路：这是透析循环回路，透析液由贮液瓶(图2-9)流出，通过气体交换器(图2-8)、泵(图2-7)、pH电极监测小室(图2-6)和无菌连接器，从培养管下盖支管(图1-1)流进中空纤维内腔，通过中空纤维膜与外腔培养液进行小分子物质交换，为外腔中的细胞提供氧和生理浓度的CO₂以及小分子营养物质如氨基酸、葡萄糖和盐类等；同时可去除外腔中积聚的小分子废物如乳酸、铵离子和多余的CO₂等。透析液从上盖支管排出，流经无菌连接器和溶氧(DO)电极监测小室(图2-12)返回贮液瓶(图2-9)。当废物积聚导致pH值下降到一定指标时，可通过改良的多功能接口--火焰消毒无菌连接器(图2-11)排出废液，进入废液瓶(图2-10)再通过火焰消毒无菌连接器换上新的供液瓶。此外，也可通过该接口取样，作离线检测。

3、细胞培养环境的超滤调节：由于透析液与培养液小分子物质成分基本上是相同的，因此按照常规操作可对细胞培养条件作超滤调节。当培养管内腔回路的上盖管道加夹阀时，内腔透析液在泵的压力之下，可从内腔过滤进入外腔；相反，夹阀加在外腔回路套筒上支管管道时，外腔培养液，除被截留的大分子物质外，也可透过中空纤维膜过滤进入内腔回路中，从而可以调节高密度细胞所处的环境条件。这种调节可利用已知的电子仪器和定时器等附加装置来实现。

四、消毒与保温

中空纤维培养管的四个支管上安装了高压蒸汽消毒备用的硅橡胶管及火焰消毒无菌连接器。中空纤维培养管连同无菌连接器一道，先用40Gy中子射线照射消毒，再用1％H₂O₂灌注中空纤维培养管外腔和内腔，用消毒去离子水、10^-5mol/L巯基乙醇、Hanks盐水以及培养液依次清洗后备用。或在安装火焰消毒无菌连接器后，把中空纤维培养管用塑料封装起来，送环氧乙烷消毒室进行灭菌处理。

除中空纤维培养管外，灌注系统可从无菌连接器接口处断开，分别包装进行高压蒸汽消毒(0.1Mpa，30分钟)备用。使用时，可通过酒精灯火焰消毒无菌连接器的接口，将整个灌注系统连接起来投入运行。

整个灌注系统置于37℃培养箱中保温，5％CO₂--空气等通过管道与空气滤器从箱外输入。

本发明的优点与积极效果在于：

中空纤维膜管加微载体基质细胞可模拟骨髓造血组织中的血管与造血微环境，有利于体外造血干细胞维持自我更新潜能、抑制过度分化与耗竭；微载体的可以移动、可分割、可定量的特点，有利于基质细胞和胞外基质附着，对造血调控、细胞分离和推向临床提供了便利条件；中空纤维细胞培养管为可拆卸结构，有利于收获中空纤维之间培养扩增的造血细胞；由于该模拟造血装置采用密封式无菌操作技术，将有助于杜绝污染，为大规模培养造血细胞提供了安全保障，有助于实现体外造血的管道化和自动化。

实施例1：

中空纤维(HF)模拟骨髓造血的小鼠骨髓培养

20ml中空纤维(HF)培养管，用¹³⁷铯中子射线40Gy消毒，再用1％H₂O₂消毒，清洗后备用。实验周期为一个月。首先将小鼠骨髓基质细胞(Str)接种在微载体(MC)上，约二周时间，制成微载体—基质细胞(MC·Str)，此后再加上小鼠新鲜骨髓细胞(BM)，混匀后接种中空纤维培养管外腔，通过无菌连接器与灌注系统连接，进行间歇灌注培养二周。培养液为常规IMDM(依氏改良的杜氏培养基)培养基，加20％新生牛血清，补充谷氨酰胺等。灌注10％CO₂调节起始培养时的pH值，控制在pH 7.1～7.4范围内。为观察基质细胞支持离体造血细胞的效果，培养液中不加纯化的细胞因子。实验分组：G0：接种前的小鼠骨髓细胞(BM)G1：HF+MC·Str+BM HF培养管灌注培养二周G2：MC·Str+BM 方瓶培养二周G3：MC·Str 方瓶培养二周G4：BM 方瓶培养二周

小鼠骨髓培养二周后粒系-巨噬系祖细胞(CFU-GM/10⁵)检测结果

G0	G1	G2	G3	G4
G0	G1	G2	G3	G4	58.0±5.0	42.3±11.6	18.7±1.5	0.3	7.3±2.1

小鼠培养二周后c-kit mRNA RT-PCR检测结果-OD比率

G0	G1	G2	G3	G4
G0	G1	G2	G3	G4	1.083	0.840	0.403	0	0

OD为光密度；

小鼠实验表明：

造血祖细胞CFU-GM(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)产率，在培养二周后，中空纤维组比原始骨髓稍有点下降，但高于各方瓶培养组。其中G4组为常规液体悬浮培养体系。中空纤维组G1减去G3对照组产率后，比G4高出5-8倍。中空纤维组G1比方瓶组G2高出2-3倍。说明在没有外加细胞因子的条件下，中空纤维灌注培养方式优于常规方瓶培养和液体悬浮培养方式。

c-kit原癌基因只在原始的造血干/祖细胞中表达。采用RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)，同内参GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)引物并行测试的方法可半定量检测c-kit表达的mRNA水平。

小鼠实验表明，在中空纤维管培养二周后，仍然保留了大量的原始造血细胞。在不加细胞因子的条件下，中空纤维组G1的c-kit表达比原骨髓有所降低，但比方瓶组G2高出一倍，而常规液体悬浮培养体系G4与G3组，在没有外加细胞因子的条件下，基本上没有c-kit基因表达。说明原始造血干/祖细胞全部分化耗竭尽了。实验表明，中空纤维模拟骨髓造血装置确实能维持部分造血干/祖细胞的自我更新潜能，可抑制造血细胞过度分化与耗竭。

实施例2：

脐带血细胞培养实验

微载体(MC)20mg用胞外基质蛋白-纤连蛋白(FN)涂层，在无菌条件下将脐带血单个核细胞与MC·FN混合，加入富含细胞因子的条件培养液，共同注入中空纤维培养管外腔，其内腔灌注由10％CO₂-空气调节的透析液。用流式细胞仪每次检测10⁴个细胞。脐血单个核细胞在接种前其造血干/祖细胞CD34⁺细胞含量为1.2％；中空纤维管培养二周后，CD34⁺细胞百分含量为20％，常规方瓶液体悬浮培养对照为4.9％。结果显示：中空纤维管灌注培养后，CD34⁺细胞含量比液体悬浮培养对照组高4倍。实验说明，中空纤维灌注结合微载体胞外基质在条件培养液刺激之下，较有利于原始造血细胞增长。

附图说明：

图1 ：中空纤维模拟骨髓造血的细胞培养管示意图

其中：1-下盖支管

2-下盖

3-套筒

4-支撑筋

5-中空纤维束柱状体

6-套筒上支管

7-树脂凝胶块

8-上盖

9-上盖支管

10-O型垫圈

11-中空纤维管道及开口

12-微载体

13-骨髓基质细胞

14-套筒下支管

15-造血细胞

图2：密封式灌注管道系统示意图

其中：1-中空纤维细胞培养管

2-火焰消毒无菌连接器

3-供液瓶/废液瓶

4-贮液瓶

5-泵

6-PH电极在线监测小室

7-泵

8-气体交换器

9-贮液瓶

10-液瓶/废液瓶

11-火焰消毒无菌连接器

12-溶氧电极在线监测小室

Claims

1、中空纤维模拟骨髓造血装置，其特征是所说的装置系由中空纤维细胞培养管、微载体支持物和密封式灌注管道三部分连接组成一个循环系统，其中所说的中空纤维细胞培养管由中空纤维束造成的柱状体(1-5)、套管(1-3)、下盖(1-2)和上盖(1-8)四个可拆卸部件组成；所说的微载体支持物为葡聚糖凝胶球体，粒珠直径均值200微米，表面有变性胶原涂层，或者是附有胞外基质的明胶微载体；所说的密封式灌注管道由中空纤维外腔循环回路和中空纤维内腔循环回路组成，中空纤维外腔循环回路包括火焰消毒无菌连接器(2-2)、供液瓶/废液瓶(2-3)、贮液瓶(2-4)和泵(2-5)，中空纤维内腔循环回路，也称透析循环回路，包括溶氧电极在线监测小室(2-12)、火焰消毒无菌连接器(2-11)、供液瓶/废液瓶(2-10)、贮液瓶(2-9)、气体交换器(2-8)、泵(2-7)和pH电极在线监测小室(2-6)。

2、按照权利要求1所述的中空纤维模拟骨髓造血装置，其特征是为便于收获培养增殖的细胞，所说的细胞培养管由可拆卸的相关部件组装而成：

(1)、由醋酸纤维素或者聚砜膜材料制造的中空纤维集束柱状体(1-5)，在两端树脂凝胶块(1-7)和三根用聚四氟乙烯制成的支持筋(1-4)之间得到固定与保护；

(2)、选择医用塑料制成的套管(1-3)，两端开口，套装在中空纤维束柱状体外面，形成中空纤维膜的外腔；每根中空纤维膜的内部管道构成其内腔；

(3)、下盖(1-2)与套筒端口之间构成了中空纤维膜内腔的共有汇集小室，并由硅橡胶O型垫圈进行密封(1-10)，通过盖的中心支管(1-1)、无菌连接器与管道系统相连，可引导该系统的气、液流体从下盖支管汇集于小室，再进入每根中空纤维膜的内腔；

(4)、上盖(1-8)结构同下盖，将进入每根中空纤维膜内腔的气、液流体汇集于上盖小室，再经中心支管(1-9)、无菌连接器排除，流进属于中空纤维内腔的管道系统。

3、按照权利要求1所述的中空纤维模拟骨髓造血装置，其特征是将微载体(1-12)置于细胞培养管中空纤维膜的外腔，作为骨髓基质细胞和培养造血细胞赖以依附的支持物。